（微生物学专业论文）黑曲霉木聚糖酶基因克隆、表达与热稳定性改造研究.pdf

华中农业大学2 0 0 8 屈硕士毕业论文 摘要 木聚糖广泛存在于植物细胞壁中，是自然界中含量仅次于纤维素的可再生资源。 木聚糖的来源不同，分枝程度不同，其主链和支链带有的基团也不同。由于木聚糖 结构的复杂性，它的完全降解需要多种水解酶的参与共同作用完成。木聚糖酶 ( p 1 ，4 x y l a n a s e ，e c3 2 1 1 8 ) 能够以内切方式作用于木聚糖分子中的p 1 ，4 糖苷键产 生不同长度的木寡糖和少量的木糖，因此是木聚糖降解酶中最关键的酶。 本文以1 株木聚糖酶产生菌黑曲霉( a s p e r g i l l u sn i g e r ) f 1 9 为实验菌株，系统地 研究了黑曲霉木聚糖酶基因x y n a 与x y n b 的克隆以及在大肠杆菌( e s c h e r i c h i ac o l i ) 中的表达、重组木聚糖酶x y n b 的纯化及其酶学性质研究，并进行了木聚糖酶x y n b 的热稳定性改造，得到了s s 2 、s t 5 、s s t 7 共3 个突变体，主要结论如下： 1 x y n a 与x y n b 的克隆以及在大肠杆菌中的表达 以黑曲霉( 彳n i g e r ) f 1 9 的基因组d n a 为模板，根据g e n b a n k 报道的黑曲霉 x y n a 与x y n b 的全序列设计两对引物，p c r 扩增得到木聚糖酶基因x y n a 和x y n b 。将 不带原基因信号肽编码序列的x y n a 和x y n b 以正确的阅读框架克隆到大肠杆菌汜 c o l o 表达载体p e t - 2 8 a ( + ) 上，并转化ec o l ib l 2 1 ，获得重组工程菌b l x l 和b l x 2 。 经过i p t g 诱导，x y n a 和x y n b 都获得特异性表达，x y n a 以包涵体和胞内可溶性 蛋白2 种形式存在，而x y n b 表达的蛋白全部以胞内可溶性蛋白形式存在。 2 木聚糖酶x y n b 的纯化 木聚糖酶x y n b 重组表达蛋白以胞内可溶性蛋白的形式存在，且木聚糖酶基因 x y n b 是和p e y - 2 8 a ( + ) 融合表达，木聚糖酶x y n b 的羧基端带有6 x h i s 蛋白表达标签， 所以我们用n i n t a 亲和层析柱对木聚糖酶x y n b 进行了纯化，并使其纯度达到了 电泳纯水平，在s d s p a g e 上呈现出清晰的单一条带。 3 木聚糖酶x y n b 的酶学性质分析 利用纯酶分析x y n b 的酶学性质，木聚糖酶x y n b 的比活达到1 3 5 0 0 1 2 8 4 i u m g ，其和a ) 【分别为1 2 5 + 0 0 8m g m l ，2 8 9 + 1 0 8p m o l m i n m g 。它的最适反 应p h 为5 0 ，在p h4 o 7 0 之间保持最高活力的7 5 以上。该重组酶表现出很高 的p h 稳定性，在p h3 0 - - - 8 0 内常温环境下放置6h ，残余酶活保持在6 8 以上。 x y n b 的最适反应温度为5 0 ，反应温度小于3 0 或大于6 0 的情况下重组木聚 黑曲霉木聚糖酶基因克隆、表达与热稳定性改造研究 糖酶表现出较低的活性。该酶热稳定较差，在4 0 以下较为稳定，6 0 以上重组 酶活性下降很快，6 0 条件保温3 0m i n 后残余酶活为2 0 。在1 0m m o l l 浓度下不 同金属离子对酶活力的影响研究表明，z n 2 + 、c 0 2 + 离子对重组酶有激活作用，分别 使重组酶活性提高了8 和1 5 ，m n 2 + 使重组酶的相对活性降低了2 1 ，体现出对 该酶活性一定的抑制作用，其他金属离子对重组酶活性的影响不大。 4 木聚糖酶x y n b 的热稳定性改造 由于x y n b 的比活较高，但是其热稳定性较差，这在一定程度上限制了木聚糖酶 x y n b 在工业水平上的推广应用。为了提高x y n b 的热稳定性，我们采用了两种定点 诱变的策略：一种是将木聚糖酶表面的s e r t h r 替换为a r g ，提高x y n b 表面蛋白的 正电荷数及其电解常数以提高蛋白的热稳定性；另外一种是在木聚糖酶的非催化区 域引入二硫键，使其结构更加紧密从而提高其热稳定性。将正确的突变体s s 2 、s t 5 、 s s t 7 基因x y n b 构建到表达载体p e y - 2 8 a ( + ) 上，并转化b l 2 1 表达突变蛋白，但是 表达的蛋白大部分形成了包涵体，而且菌体破碎液离心后的上清液没有检测出木聚 糖酶活性。目前，实验室正在构建x y n b 野生型和突变型的高效分泌型酵母表达系 统以确定定点突变对该重组酶的热稳定性影响，为该酶的大规模工业应用提供基础 资料。 关键词：黑曲霉；木聚糖酶；x y n a 基因；x y n b 基因；原核表达；酶学性质； 定点诱变 i i 华中农业大学2 0 0 8 届硕十毕业论文 a b s t r a c t x y l a ni st h em o s ta b u n d a n tr e n e w a b l ep o l y s a c c h a r i d ef i b e r si nn a t u r es e c o n d a r yo n l y t oc e l l u l o s e w h i c hi sm a i n l yf o u n di nt h ep l a n tc e l lw a l l s d i f f e r e n tx y l a n sh a v ed i f f e r e n t o r i g i n s ，b r a n c h e sa n dt h e r ea r em a n ys u b s t i t u t eg r o u p so nt h eb a c k b o n ea n ds i d ec h a i n s f o rt h ec o m p l e x i t yo ft h es t r u c t u r eo ft h ex y l a n ，t h ed e g r a d a t i o no fx y l a nn e e d sm a n y k i n d so fh y d r o l a s e s x y l a n a s e s ( e c3 2 1 18 ) c a nc a t a l y z et h eh y d r o l y s i so fi n t e r n a lp 一1 ，4 b o n d so fx y l a ni n t ox y l o o l i g o s a c c h a r i d e sa n dd x y l o s e ，t h e r e f o r e ，x y l a n a s ei st h ek e y h y d r o l a s e sf o rt h ed e g r a d a t i o no fx y l a n i nt h i sp r e s e n td i s s e r t a t i o n ，x y l a n a s eg e n ex y n aa n dx y n bw e r ec l o n e da n de x p r e s s e d i nec o l i a n dt h ep u r i f i c a t i o na n dc h a r a c t e r i z a t i o no fr e c o m b i n a n tx y n bw e r e i n v e s t i g a t e d ，u s i n ga s p e r g i l l u sn i g e rf 19a st h ee x p e r i m e n t a lm a t e r i a l a f t e rt h i s ，w et r i e d t oi m p r o v et h et h e r m a ls t a b i l i t yo ft h er e c o m b i n a n tx y n b ，t h er e s u l t ss h o w e dt h a t ： 1 t h ec l o n i n g e x p r e s s i o no f x y n aa n dx y n bg e n ei nec o l i t h e 砂剃a n dx y n bg e n ew e r ei s o l a t e df r o mt h eg e n o m i cd n a o fa n i g e rf19 ， c l o n e da n de x p r e s s e di ne c o l i t w op a i r so fp r i m e r sw e r ed e s i g n e da c c o r d i n gt ot h e r e p o r t e df u l ls e q u e n c e so f x y n aa n dx y n bg e n ef r o ma n i g e ri ng e n b a n k 叫剃a n dx y n b g e n ef r a g m e n t sw e r es u c c e s s f u l l ya m p l i f i e db yp c rr e a c t i o n s u n d e rt h es u i t a b l e c o n d i t i o n s t h ex y n aa n dx y n bg e n ew i t h o u to r i g i ns i g n a lp e p t i d es e q u e n c e sw e r ef u s e d i n t ot h eec o l ie x p r e s s i o nv e c t o rp e t - 2 8 a ( + ) w i t hc o r r e c to p e nr e a d i n gf r a m e ，t h e n t r a n s f e r e di n t oec o l ib l 2 1 ，f i n a l l yt h er e c o m b i n a n ts t r a i n b l x1a n db l x 2w e r e o b t a i n e d a f t e ri n d u c e db yi p t g , t h ex y n ag e n ew a ss u c c e s s f u l l ye x p r e s s e di nt h e r e c o m b i n a n ts t r a i nb l x1 ；t h ee x p r e s s i o np r o d u c te x i s t e da si n c l u s i o nb o d i e sa n d i n t r a c e l l u l a rs o l u b l ef o r m ，a n dx y n bg e n ei nb l x 2a si n t r a c e l l u l a rs o l u b l ef o r m 2 p u r i f i c a t i o no fx y n b m o s to ft h ep r o d u c to fr e c o m b i n a n tx y n be x i s t e da st h ei n t r a c e l l u l a rs o l u b l ef o r m ， a n dt h ex y n bg e n ew a se x p r e s s e di np e t - 2 8 a ( + ) ，t h e r e f o r et h ec - t e r m i n a lo ft h ex y n b h a s6 x h i sp r o t e i nt a g ，t h u sw ep u r i f i e dt h ex y n bw i t ht h en i - n t aa f f i n i t yc o l u m n t h e p u r i t yo fr e c o m b i n a n tx y n bw a sf i n ea n das i n g l eb a n dw a sf o u n d e di nt h es d s p a g e a n a l y s i s 3 t h ec h a r a c t e r i z a t i o no fx y n b t h ep u r i f i e dx y n bh a da o f12 5 + 0 0 8m g m l ，a a xo f2 8 9 + 10 8g m o l m i n m g a n das p e c i f i ca c t i v i t yo f1 3 5 0 0 - a ：1 2 8 4i u m g ，u s i n go a ts p e l tx y l a na sas u b s t r a t e t h e o p t i m a lp ho fx y n bw a s5 0 ，i ts u s t a i n e da b o v e7 5 o f t h ee n z y m ea c t i v i t yo fx y n b a m o n gt h ep hf r o m4 0t o7 0u s i n gt h ep u r i f i e dx y n bf o ra s s a y t h ex y n bs h o w e dh i g h p hs t a b i l i t yi nr o o mt e m p e r a t u r ef o r6ha m o n gt h ep hf r o m3 0t o8 0 ，m o r et h a n6 8 o f i i i 黑曲霉木聚糖酶基因克隆、表达与热稳定性改造研究 t h ee n z y m ea c t i v i t yr e m a i n e d t h eo p t i m a lt e m p e r a t u r eo fx y n bw a s5 0 ，t h e r e c o m b i n a n tx y n bs h o w e dl o we n z y m ea c t i v i t ya tt h et e m p e r a t u r ea b o v e6 0 o rb e l o w 3 0 t h et h e r m a ls t a b i l i t yo fx y n bi sl o w , a n dt h er e s i d u a la c t i v i t yo ft h ex y n ba f t e r i n c u b a t e da t6 0 f o r3 0m i ni s2 0 i tw a ss t a b l ea tt h et e m p e r a t u r eb e l o w4 0 t h e e f f e c to f10m m lm e t a l l i ci o n so nx y n bs h o w e dt h a tz n 肿a n dc o 肚a c t i v a t e dt h e r e c o m b i n a n tx y l a n a s eb y8 a n d15 ，r e s p e c t i v e l y t h em n + r e s t r a i n e dt h ex y n bb v 21 a n do t h e rm e t a l l i ci o n ss h o w e dn oe f f e c to ni t 4 t h ei m p r o v e m e n to ft h e r m o s t a b i l i t yo nx y n b x y n bh a dah i g hs p e c i f i ca c t i v i t yb u tl o wt h e r m o s t a b i l i t y , s oi t sd i f f i c u l tt op u ti t i n t oi n d u s t r i a la p p l i c a t i o n t oi m p r o v et h et h e r m a ls t a b i l i t yo fx y n b t w os i t e d i r e c t e d m u t a g e n e s i ss t r a t e g i e sw e r ea p p l i e d 1 1 1 ef i r s to n ew a st os u b s t i t u t et h es u r f a c es e r i n ea n d t h r e o n i n ei n t oa r g n i n e t h es e c o n do n ew a si n t r o d u c et h ed i s u l f i d eb r i d g ei n t od i s c a t a l y t i c d o m a i no fx y n b t h e nt h em u t a t e dg e n ec o n s t r u c t e dt op e t - 2 8 a ( + ) a n dt r a n s f o r m e di n t o b l 21f o rt h ee x p r e s s i o no fm u t a t e dx y n b h o w e v e r , i n c l u s i o nb o d i e sf o r m e dd u r i n gt h e p r o c e s so fe x p r e s s i o na n dn oe n z y m ea c t i v i t yd e t e c t e do nt h es u p e m a t a n to fc e l l d i s r u p t i o nl i q u i d t od e t e r m i n et h ee f f e c to ft h es i t e d i r e c t e dm u t a g e n e s i so nt h et h e r m a l s t a b i l i t yo fx y n b ，h i g he x c r e t i v ee u k a r y o t i ce x p r e s s i o ns y s t e mo f w i l dt y p ea n dm u t a t e d t y p eo fx y n bi sc o n s t r u c t i n g s t i l l ，l a r g e s c a l ei n d u s t r i a la p p l i c a t i o nr e s e a r c ho ft h i s e n z y m ei si np r o g r e s s k e y w o r d s ：a s p e r g i l l u sn i g e r ；x y l a n a s e ；砂剃g e n e ；x y n bg e n e ；p r o k a r y o t i ce x p r e s s i o n ； e n z y m a t i cc h a r a c t e r i z a t i o n ；s i t e d i r e c t e dm u t a g e n e s i s i v 华中农业大学2 0 0 8 届硕士毕业论文 缩略语表 简写符号英文全称 中译名 a m p a m p i c i l l i n b l a s tb a s i cl o c a la l i g n m e n ts e a r c ht o o l b p b a s ep a i r 氨苄青霉素 局部比对基本检索工具 碱基对 b s ab o v i n es e r u ma l b u m i n 午血清垡臼 d d h 2 0 d o u b l ed i s t i l l e dw a t e r双蒸水 d n t p s d e o x y r i n e g i a m i n el r i p h o s h a t e 脱氧核糖核菅酸混合物 d m s o d i m e t h y ls u l f o x i d e 二甲基砜 d n a d e o x y r i b o n u c l e i ca c i d 脱氧核糖核酸 e d t a e t h y l e n e d i a m i n e t e t r a a c e t i ca c i d 乙二胺四乙酸 e t b re t h i d i u mb r o m i d e溴化乙锭 i p t g i s o p r o p y l1 - t h i o b d g a l a c t o p y r a n o s i d e 异丙基硫代一1 3 一d 一二卜乳糖苷 k a n k a n a m y c i n 卡那霉素 k mm i c h a e l i sc o n s t a n t米氏常数 l bl u r i a - b e r t a n i ( m e d i u m ) l b 培养基 m rr e l a t i v em o l e c u l a rw e i g h t相对分子量 o r f o p e nr e a d i n gf r a m e 开放读码框架 r t p c rr e v e r s et r a n s c r i p t i o np o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n反转录- 聚合酶链式反应 s d s p a g es o d i u m d o d e c y l s u l p h a t e - p o l y a c r y l a m i d e 十二烷基磺酸钠一聚丙烯酰胺 g e le l e c t r o p h o r e s i s 凝胶电泳 t m m e l t i n gt e m p e r a t u r e 解链温度 t et r i s e d t a ( b u f f e r ) t r i s e d t a ( 缓冲液) t r i s t r i s h y d r o x y m e t h ) r l a m i n om e t h a n e 三羟甲基氨基甲烷 x g a l 5 - b r o m o - 4 - c h l o r o 一3 一i n d o l 1 3dg a l a c t o s i d e5 一溴一4 一氯一3 一吲哚半乳糖苷 x y n ag e n ee n c o d i n gx y l a n a s ea 木聚糖酶a 基因 x y n ax y l a n a s ebf r o ma s p e r g i l l u sn i g e r 黑曲霉木聚糖酶a x y n bg e n ee n c o d i n gx y l a n a s eb 木聚糖酶b 基因 x y n b x y l a n a s ea f r o ma s p e r g i l l u sn i g e r黑曲霉木聚糖酶b v 华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书 学位论文 是否保密 雹 如需保密，解密时间年月日 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构的学位或证书 而使用过的材料，指导教师对此进行了审定。与我一同工作的同志对本研究所做的任 何贡献均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意。 研究生签名：在歹蔓时间：占叫蚤年 占月日 学位论文使用授权书 糊姗鲐崔多菱黜各犯硐 签名日期：矽为年6 月6 日 签名日期：御年莎月舌 日 注：请将本表直接装订在学位论文的扉页和目录之间 华中农业大学2 0 0 8 届硕士毕业论文 第一章文献综述 1 1 木聚糖的结构及其功能 1 1 1 木聚糖及其结构 植物细胞壁主要是由纤维素( c e l l o s e ) 、半纤维素( h e m i c e l l o s e ) 和木质素( 1 i g n i n ) 等 物质组成。半纤维素是仅次于纤维素含量第二丰富的可利用自然资源，其主要成分 是木聚糖( x y l a n ) ，约占植物细胞干重的1 5 - - 3 5 。纤维素组成微细纤维，构成植物 细胞壁的网状骨架，而半纤维素和木质素则是填充在纤维之间和微细纤维之间的“粘 合剂 和“填充剂，一般植物中这3 种成分的质量约占植物干重的8 0 9 5 ( b e ge t a 1 ，2 0 0 1 ) 。 木聚糖是1 种带有多种取代基团的复杂多糖，主链由多个吡喃木糖基通过木糖 苷键相连。根据糖苷键的类型，木聚糖可分为2 种：p 1 ，4 一木聚糖和p 一1 ，3 一木聚糖。 前者存在于陆生植物细胞壁中，它的主链是由d 1 ，4 糖苷键相连的b d 吡喃木糖残 基聚合而成；而后者存在于海洋藻类的细胞壁中，其主链由p d 毗喃木糖残基通过 p 1 ，3 糖苷键聚合而成( j o s e l e a ue ta 1 ，1 9 9 2 ) 。自然界中的木聚糖多为异聚多糖，侧 链上连着多种不同大小的短取代基，主要有o 乙酰基、4 o 甲基d 葡糖醛酸残基、 l 阿拉伯糖残基( 可进一步与香豆酸、阿魏酸等酚酸相连) 等。这些侧链与植物细 胞中其它几种结构性多糖( 如木质素、纤维素、果胶、葡聚糖等) 以共价或非共价链 连接，组成植物细胞重要的结构一细胞壁。而同型木聚糖分布很少，仅见于烟草、 茅草和某些种子的外壳中。不同植物或同一植物不同的生长阶段，木聚糖的组成成 份及其多聚程度都有所不同：硬木木聚糖由o 乙酞基4 o 甲基葡糖醛酰木糖聚合而 成，聚合度为1 5 0 - - 2 0 0 ，且具有高度的乙酰化；软木木聚糖是非乙酰化的，由阿拉 伯4 o 甲基葡糖醛酰木糖聚合而成，聚合度为7 0 - - 1 3 0 ( 付丹丹，2 0 0 5 ) 。 图1 1 为木聚糖的分子结构图( b e ge ta 1 ，2 0 0 1 ) ，其主链和纤维素的主链很类似， 只是其单体为d 木糖而非d 葡萄糖。组成木聚糖的单体d 木糖的c 2 ，c 3 位往往 带有许多侧链，这些侧链类型及杂和程度的不同直接影响木聚糖的溶解性、天然构 象及于其他结构多糖分子的结合情况，因而也极大影响了木聚糖酶的作用方式及效 率。 黑曲霉木聚糖酶基因克隆、表达与热稳定性改造研究 1 1 2 木聚糖的功能 半纤维素的主要生理功能是参与细胞壁结构的构建和调节细胞的生长过程。( 1 ) 参与细胞壁结构的构建。存在于葡聚糖、木聚糖、葡萄糖和阿拉伯木聚糖等半纤维 素分子上的阿魏酸在过氧化物酶的催化下，既可以在半纤维素分子之间形成二阿魏 酸键使它们成为二聚体或多聚体，又可以和木质素、纤维素等细胞壁组成成分结合， 形成特定的复合结构。除了共价结合方式以外，半纤维素分子还以氢键和细胞壁其 他组成成分相结合。例如葡聚糖和木聚糖等都能以氢键和纤维素结合，阿拉伯木聚 糖以及其他多糖构成谷物细胞壁的骨架，维持细胞的完整性( 刘辉，2 0 0 7 ) ；( 2 ) 半 纤维素对细胞生长的调节作用可以分为两种方式。第一是通过改变细胞壁的结构来 调节细胞的生长；第二是通过半纤维素降解后的片段来改变细胞的生理状态，进而 调节细胞的生长( 李雄彪，张金忠，1 9 9 4 ) 。另外，由于这些多糖能够吸收大量的水， 可以减轻细胞的破碎、增加细胞的弹性和植物组织抗弯曲的能力。它们也能协助代 谢产物和营养物质通过它们在纤维素晶体周围建立的多孔含水的分子网络进行运 输。在阿拉伯木聚糖主链上存在的阿魏酸能够形成多糖多糖或多糖一蛋白复合体 ( f i n c h e ra n ds t o n e ，1 9 8 6 ) 。另外一种关于谷物细胞壁中阿拉伯木聚糖的功能的假说 认为，阿拉伯木聚糖抑制了细胞问冰晶的形成，保证了谷物正常过冬，这是由于木 聚糖提高了粘度，阿拉伯木聚糖形成的胶状网络阻止了冰的形成( k i n d e le ta 1 ， 】9 8 9 ) 。 1 2 木聚糖酶的理化性质及其分类 1 2 1 木聚糖酶的理化性质 木聚糖酶的性质主要来源于对细菌和真菌木聚糖酶的研究。大多数微生物木聚 糖酶都是单亚基蛋白，已报道的木聚糖酶中，分子量大约为8 - - 一1 4 5k u 之间，而绝 大多数木聚糖酶的分子量在2 0 - - 一3 0k u 之间。不同微生物来源的木聚糖酶等电点各 不相同，等电点p i 一般在3 l o 之间。大多数p 1 ，4 内切型木聚糖酶的最适p h 值 为4 7 ，p h 稳定范围为3 1 0 ；最适反应温度在4 0 - 7 5 之间。通常真菌木 聚糖酶比细菌木聚糖酶的温度稳定性差。但也有例外，如嗜热真菌c e r a t o c y s t i s p a r a d o x a 能产生耐热木聚糖酶，8 0 稳定lh 。另外，真菌木聚糖酶的最适p h 值 2 华中农业大学2 0 0 8 届硕士毕业论文 更偏酸性，如真菌a n i g e a k a w a c h i i 产生的木聚糖酶最适p h 值为2 6 。不同来 源的木聚糖酶其氨基酸组成主要是天冬氨酸( a s p ) 、谷氨酸( g l u ) 、甘氨酸( g l y ) 、丝 氨酸( s e r ) 和苏氨酸( t h r ) 等。大多数细菌产生2 类木聚糖酶：高分子量偏酸性木聚糖 酶和低分子量基本木聚糖酶。真菌不具有这一规律，其普遍产生低分子量基本木聚 糖酶。 0 图1 - 1 木聚糖的分子结构 f i g 1 - 1t h em o l e c u l a rs t r u c t u r eo fx y l a n 许多真核微生物产生的木聚糖酶都含有糖蛋白。糖蛋白是碳水化合物以共价键 与蛋白质结合在一起，或者碳水化合物与蛋白质一起形成能够分离的混合物。糖基 化对糖苷键水解酶在极端环境中的稳定性起着重要作用，例如在大肠杆菌中表达碱 性嗜热菌b a c i l l u ss p 木聚糖酶基因，表达产物重组酶的温度稳定性、与木聚糖的结 合能力都比野生型木聚糖酶差，这主要因为去掉了糖基。参与木聚糖酶糖基化的糖 有多种，例如t a l a r o m y c e sb y s s o c h l a m y d o i d e sy h 5 0 产生的木聚糖酶中碳水化合物残 基有甘露糖、葡萄糖和果糖。此外，糖基化作用也是导致微生物木聚糖酶多样性的 主要因素之一( 李煜生等，2 0 0 7 ) 。木聚糖酶的理化性质往往与其产生微生物所在的 环境密切相关，极端环境来源可以产生具有较好耐热、耐酸碱特性的木聚糖酶，成 为研究的热点。 黑曲霉木聚糖酶基因克隆、表达与热稳定性改造研究 1 2 2 木聚糖酶的分类 广义木聚糖酶是指能够降解半纤维素木聚糖的一类酶的总称，主要包括以下3 类：( 1 ) 内切p 一1 ，4 一木聚糖酶( 1 ，4 p d 。木聚糖木聚糖水解酶，e c 3 2 1 8 ) ，它在不同位 点上优先作用于木聚糖和长链木寡糖，从d 1 ，4 一木聚糖主链的内部切割木糖苷链， 水解产物主要为木二糖与木二糖以上的寡聚木糖，也有少量的木糖和阿拉伯糖产生。 ( 2 ) 外切p 1 ，4 木聚糖酶( 1 ，4 一p d 木聚糖木聚糖水解酶，e c 3 2 1 9 2 ) ，作用于木聚糖 和木寡糖的非还原端，产物为木糖；( 3 ) 1 3 木糖苷酶( 1 ，4 p d 木聚糖木聚糖水解酶， e c 3 2 1 3 7 ) ，该酶作用于木寡糖的末端，产物为木糖。狭义的木聚糖仅限于第一类 ( k e ne ta 1 ，1 9 8 8 ；n e e t ae ta 1 ，1 9 9 9 ) 。 根据催化结构域氨基酸的同源性和疏水族分析法可将木聚糖酶划分为f 1 0 家族 和g l l 家族。f 1 0 家族和g 1 l 家族之间在氨基酸序列上无明显的同源性，同一家 族的木聚糖酶有较高的同源性，分子结构和一些起重要催化作用的氨基酸残基高度 保守。所有的木聚糖酶都属于f 1 0 或6 1 1 族，不同木聚糖酶分子在其氨基酸组成 的数目上相差很大，但它们的催化区在大小上比较一致，同一族中的木聚糖酶催化 区域具有较高的同源性，根据己知酶可以推测未知酶的催化特性。高分子量木聚糖 酶( 一般分子量大于3 0k u ) 多属于f 1 0 族，对木聚糖的水解速度快，水解产物为低分 子量的寡糖( 聚合度1 - 一5d p 左右) ，该族还包括对纤维素和木聚糖都有水解作用的非 特异的葡聚糖酶；低分子量木聚糖酶属于g 11 族，对木聚糖的水解速度慢，水解产 物为聚合度5 1 0d p 左右的木寡糖。因此，f 1 0 族的木聚糖酶比较适合工业应用 ( h e n r i s s a ta n db a i r o c h ，19 9 3 ；c o l l i n se ta 1 ，2 0 0 5 ) 。 1 。3 木聚糖酶的研究进展 从二十世纪八十年代以来，数百种来自细菌、真菌和酵母的木聚糖酶基因己被 克隆并在各种合适的宿主菌中进行了表达。克隆的方法一般有2 种：一种是采用传 统的鸟枪法克隆，即提取染色体d n a ，用不同的限制性内切酶进行完全或部分酶切， 再与质粒载体构建重组质粒，转入受体菌；另一种是根据已知的氨基酸序列或已发 表的基因序列设计引物，以产木聚糖酶菌株的总d n a 为模板扩增出目的片断，构 建重组载体并转化，在转化子中筛选出阳性克隆。 目前木聚糖酶基因克隆的主要供体菌是真菌和细菌，而且基因的表达宿主大多 4 华中农业大学2 0 0 8 届硕士毕业论文 数是大肠杆菌和毕赤酵母。大肠杆菌和毕赤酵母目前是外源基因表达最普遍采用的 2 种表达系统。大肠杆菌表达系统具有遗传背景清晰，培养条件简单，培养周期短， 蛋白表达量大，操作工艺成熟等特点，但表达的蛋白容易形成包涵体，不利于后期 分离纯化；酵母表达系统因为表达蛋白的可分泌性越来越受到研究者的青睐，但酵 母表达系统表达效率不高，表达出的重组酶活性、比活等数值均偏低( d e n ge ta 1 ， 2 0 0 6 ) 。一般重组的木聚糖酶基因在大肠杆菌中表达量要比在亲本中低，即便是有所 提高，其表达的蛋白也难以分泌到培养基中，往往被限制在细胞质或周质腔内，给 后期纯化、利用带来操作困难。通常认为大肠杆菌中重组木聚糖酶低水平的主要原 因是蛋自在细胞内的大量累积以及缺少蛋白质的翻译后修饰。从有利于生产及进一 步提高表达量水平的角度出发，许多研究者利用改变宿主菌和使用具有强启动子的 载体构建新型高效表达基因工程菌，不仅提高了酶活，而且有些木聚糖酶能分泌到 胞外。l a p i d o t 等根据1 个已知序列的芽孢杆菌木聚糖酶基因，重新设计引物，利用 p c r 方法，只克隆起始密码子a t g 以后的结构基因( 不带前导序列) ，转到t 7r n a 多聚酶表达载体p f l 3 d 上，在i p t g 诱导下表达的木聚糖酶高达1 4 0u m l ( l a p i d o te t a 1 1 9 9 6 ) 。w a n gy a l u 等人利用纯化的木聚糖酶b 进行n 端测序，根据n 端测序结 果设计引物，p c r 扩增得到5 7 6b p 的x y n b 基因，分别构建到大肠杆菌表达载体 p e t - 2 2 b ( + ) 和毕赤酵母表达载体p p i c 9 k 上，实现高效表达，x y n b 的分子量为2 0 8 k u ，比活高达28 6 9 7 8u m g 。在毕赤酵母表达的累积量到达7m g m l ，木聚糖酶活 性到达1 50 0 0i u m l ( w a n ge t a l ，2 0 0 7 ) 。蛋白质在同源宿主表达系统中的表达水平 相对较高，同源宿主枯草芽孢杆菌能使短小芽孢杆菌的木聚糖酶基因高效表达，且 产物可分泌至胞外( p a n b a n g r e de ta 1 ，1 9 8 5 ) 。另外，在酵母和链霉菌等中的异源表 达也有报道。n a y e n s 等将短小芽孢杆菌p l s 的x y n a 基因在酿酒酵母中表达，得到 有活性的分泌型木聚糖酶，最适温度和p h 都没有发生变化，分别为5 8 ，p h 6 2 ( n u y e n se ta 1 ，2 0 0 1 ) 。c h e n gy i f a n g 等用p c r 方法从t h e r m o b i f i d af “s c a 中得到 x y l l i ，并在毕赤酵母高效表达，得到有活性的分泌型木聚糖酶，经1 4 4h 甲醇诱导表 达后最高酶活可达3 2 4 2u m l ，其最适反应温度为7 0 ，最适反应p h 为7 0 ，该 酶热稳定较高，在7 0 条件下保温3h 后的残余酶活为7 0 ( c h e n ge ta 1 ，2 0 0 5 ) 。 r u a n g l e k 等人采用p c r 方法从a n g e ，e d n a 中扩增得到x y n b ，构建到毕赤酵母表 达载体p p i c z a a 上，实现木聚糖酶的分泌表达，培养基中最高酶活达3 6 7 6u m l 。 将酶纯化后其比活为8 0 0 7u m g ，最适反应p h 为5 0 ，最适反应温度为5 5 黑曲霉木聚糖酶基冈克隆、表达与热稳定性改造研究 ( r u a n g l e ke ta 1 ，2 0 0 7 ) 。d e n gp i n g 等根据g e n b a n k 发表的木聚糖酶x y n b 全序列设 计引物，从a n i g e r 中得到7 4 5b p 的x y n b ，构建到酵母表达载体p g a p z a a 上，经 诱导表达后酶活达6 2i u m l ，纯化后该木聚糖酶的比活2 2 6 5 3i u m g ，最适反应p h 为5 0 ，最适反应温度为5 0 ( d e n ge ta 1 ，2 0 0 6 ) 。w h i t e h e a d 等使用大肠杆菌一类 菌体穿梭载体，将瘤胃拟杆菌的木聚糖酶基因接合转移到脆弱拟杆菌和单体拟杆菌 中，该基因在这两种菌中都能表达，粗酶液的比活分别是原始杆菌的1 4 0 0 倍和1 6 0 0 倍( w h i t e h e a da n dh e s p e l l ，19 9 0 ) 。 1 4 木聚糖酶的应用 1 4 1 木聚糖酶在造纸工业方面的应用 木聚糖酶在造纸工业中主要应用于生物制浆和生物漂白，也可应用于废纸脱墨 处理、树木脱皮处理、抑制纸浆返黄、打浆处理、去除树脂、二次纤维改性、可溶 性纤维浆生产等( 毛连山，余世袁，2 0 0 6 ) 。目前国内的造纸工业仍以硫酸盐法制浆 为主，用大量的氯和含氯化合物( 如次氯酸钙，次氯酸和二氧化氯) 作为漂白剂。这 种方法存在许多问题；1 ：漂白过程中生成大量的有毒有机氯化物，多是致变剂或潜 在的致变剂，对环境危害极大；2 ：漂白废液c o d 值很高，也会造成严重的环境污 染；3 ：该法对纤维素降解较为严重，而降低了纸张的强度；4 ：漂白废液对设备的 腐蚀也比较严重，不利于水的循环利用。木聚糖酶应用于纸浆生物漂白工艺中，在 减少化学药品的使用量，减少致癌物质二恶英以及a o x 的排放，减轻环境污染的 同时，显著改进了纸浆漂白度，纸浆的滤过性、脆性，增加纤维的分离度、并且可 使具较高价值的副产品一高分子量木质素得到有效回收，降低能耗，降低了生产成 本( 孙显慧，2 0 0 6 ；张爱萍，秦梦华，2 0 0 6 ) 。 j u r a s e k 和v i i k a r i 等人1 9 8 6 年首次提出，半纤维素酶被用于造纸和制浆过程， 可以减少后道工序漂白过程中氯的需求量。即如果在化学漂白之前，用木聚糖酶对 纸浆进行预处理，可增加纤维的分离度，使氯气等化学漂白剂更好地渗透到纸浆里， 从而大大减少化学漂白剂的用量。同时通过酶法预处理可以回收该行业中有用的副 产物，并且改善对纸的漂白效果( j u r a s e k , 19 8 6 ；v i i k a r i ，19 8 6 ) 。在对纸浆漂白的过程 中，由于在利用木聚糖酶对纸浆进行预漂白时，硫酸盐蒸煮的纸浆为温度较高的碱 性浆，这就需要所用木聚糖酶具有耐高温和耐碱性的特性。因此具有较高的最适反 6 华中农业大学2 0 0 8 届硕十毕业论文 应p h 值( p h 值为1 0 ) 和最适反应温度( 大于9 0 ) 的木聚糖酶是很重要的。当 前，通过蛋白质工程可以改善木聚糖酶的水解效率、水解特异性和酶的热稳定性， 获得产生更高活性木聚糖酶的菌株和相应的工艺也成为木聚糖酶应用研究的新热 点。 目前，北美和欧洲的许多造纸公司己经将该技术用于生产实践，如：欧洲的8 家大型造纸公司和加拿大的5 家大型造纸公司己经将木聚糖酶预漂白作为常规技术 应用。在我国，造纸工业用酶法处理纸浆的研究也已开展多年。山东大学、中国制 浆造纸