（微生物学专业论文）巢湖水体浮游细菌群落结构时空差异的分子生态学研究.pdf

摘要 巢湖，我国五大淡水湖之一，是典型的浅水湖泊，近几年已成为我国污染和富营 养化最严重的三个淡水湖泊之一。在湖泊生态系统中，水体营养物质的数量或种类的 改变，皆能导致浮游细菌多样性的改变。微生物多样性常被用作监测和预测一个水生 生态系统健康与否的标准。本文就是从分子生物学水平上分析巢湖水体浮游细菌时空 差异与其相应环境因子的关系，从而为巢湖富营养化的生态修复提供理论依据。 本研究在巢湖设置五个取样点，取样点分布于湖区的不同水质环境。采样从2 0 0 6 年秋季到2 0 0 7 年夏季持续一年，每个季度取样一次，总共采集2 0 个样品。通过d a p i 荧光染色法和p c r - d g g e 分子方法分别对这2 0 个水样进行细菌计数和细菌多样性的 时空差异研究，并结合典型对应分析( c c a ) 法，探讨了浮游细菌群落组成与相关环 境因子的对应关系。 主要结果表明： 。 ( 1 ) 巢湖水体温度的水平变化不明显，而季节间变化剧烈，夏季温度最高，冬 季温度最低，水体的总体p h 值在6 9 1 8 8 4 之间，呈弱碱性；水环境理化参数随着 不同采样点与季节的变化而不同，总体上巢湖西区水质较差。 ( 2 ) 不同采样点四个季节的浮游细菌总数在7 5 1 0 4 6 7 5 1 0 6c e l l sm l 1 之间， 且有明显的时空差异。每个采样点的最低值皆出现在冬季，除了采样点忠庙，其它四 个采样点的最高值均出现在夏季。而就四个季节的平均值来说，采样点马尾河的浮游 细菌数量最高，忠庙与东湖心次之，最低出现在中埠。 ( 3 ) 不同采样点的浮游细菌种群丰度与多样性的季节间变化趋势基本相同。通 过多样性分析表明，巢湖水体浮游细菌群落多样性随采样点与季节的变化而异，具体 表现为绝大多数采样点的多样性在秋季最低，春季最高，而同一季节的不同采样点的 多样性高低相比较，没有明显的规律性。聚类分析结果表明，巢湖水体环境的季节间 差异对其浮游细菌群落组成的影响要大于不同采样点间的差异。 ( 4 ) c c a 分析的结果表明，b o d 5 、n h 3 - n 、c o d m 、t p 、t n 和d o 浓度 以及水温的共同作用，对巢湖水体浮游细菌的群落组成有明显的影响。 ( 5 ) 系统进化的初步分析得出，巢湖浮游细菌群落中，蓝细菌与放线菌中的一 部分菌群的出现与否没有时空差异，另一部分具有时空差异，而拟杆菌和绿弯菌的出 现与否均表现出时空差异。 关键词：巢湖，d g g e ，浮游细菌组成，多样性，时空变化，典型对应分析 a b s t r a c t c h a o h ul a k e ，蠲o n eo ft h ef i v el a r g e s tf r e s h w a t e rl a k e si nc h i n a , i sat y p i c a l ，l a r g e ， s h a l l o wa n ds u b t r o p i c a lf r e s h w a t e rl a k e i nr e c e n ty e a r s ，c h a o h ul a k eh a sb e e nw e l l k n o w na so n eo ft h et h r e em o s tp o l l u t e df r e s h w a t e rl a k e si nc h i n a i nt h ee c o s y s t e m so f l a k e s ，t h ec h a n g e so ft h et r o p h i cm a t e r i a li nq u a n t i t ya n dk i n d sc o u l dr e s u l ti nt h ec h a n g e o fb a c t e f i o p l a n k t o nd i v e r s i t y 1 1 圯m i c r o b i a ld i v e r s i t yi sa l w a y su s e da st h ec r i t e r i o nw h i c h c o u l dm o n i t o ra n de x p e c tt h eh e a l t h ys t a t u so fa q u a t i ce c o s y s t e m s i nt h i ss t u d y , w e a n a l y s e d h o r i z o n t a la n ds e a s o n a ld y n a m i c so ft h e b a e t e r i o p l a n k t o nc o m m u n i t y c o m p o s i t i o ni n c h a o h ul a k eo nt h em o l e c u l a rl e v e l ，a n dt h e r e l a t i o n s h i p t ot h e e n v i r o n m e n t a lp a r a m e t e r s mo b j e c t i v ew a st op r o v i d et h eb a s i ci n f o r m a t i o nf o r e c o l o g i c a lr e s t o r a t i o no fc h a o h ul a k e i nt h i ss t u d y , s a m p l e sw e r ec o l l e c t e df r o ma u t u m no f 2 0 0 6t os u m m e ro f2 0 0 7a tf i v e s a m p l i n gp o s i t i o n sw i t hd i f f e r e n tt r o p h i cs t a t u s 明1 et o t a lb a c t e r i a lp o p u l a t i o na b u n d a n c e i ne a c hs a m p l ew a sd e t e r m i n e db yd i r e c tm i c r o s c o p i c a lc o u n t s ，u s i n gt h ed a p is t a i n i n g t e c h n i q u e b a c t e r i o p l a n k t o nc o m m u n i t yc o m p o s i t i o n ( b c c ) w a sd e t e r m i n e du s i n ga c o m b i n a t i o no fp c ra m p l i f i c a t i o no f16 sr d n ag e n ea n dd e n a t u r i n gg r a d i e n tg e l e l e c t r o p h o r e s i s ( d g o e ) c a n o n i c a lc o r r e s p o n d e n c ea n a l y s i s ( c c a ) ，ad i r e c tg r a d i e n t a n a l y s i sm e t h o d ，w a sc a r r i e do u tt oi n v e s t i g a t er e l a t i o n s h i p sb e t w e e nb c c a n dm e a s u r e d e n v i r o n m e n t a lv a r i a b l e si n c l u d i n gt h ep h y s i c a la n dc h e m i c a lp a r a m e t e r s 耶1 er e s u l t si n d i c a t e dt h a t ，t h e r ew a sl i t t l ev a r i a t i o ni nt e m p e r a t u r ea tt h ef i v es a m p l i n g p o s i t i o n si nt h es r l n es e a s o n , t h es e a s o n a lt e m p e r a t u r ev a r i a t i o na tt h ef i v es a m p l i n g p o s i t i o n ss h o w e dat y p i c a lt r e n d ，丽mt h eh i g h e s tv a l u e si ns u m l n e ra n dt h el o w e s tv a l u e s i nw i n t e r 1 1 1 ep hr a n g e di n6 9 1 - 8 8 4 ，a n dt h el a k ew a sa l m o s ta l k a l i n e ，n l ev a l u e sf o r b o d 5 ，c o d m ，t n ，n h 3 - n ，a n dt pc o n c e n t r a t i o n sa ts h i k o uw e r ea l m o s ta l w a y s s i g n i f i c a n t l yh i g h e rt h a nt h o s ei nt h eo t h e rf o u rp o s i t i o n s ，e x c e p tf o rt n c o n c e n t r a t i o ni n s u m m e ra ts h i k o u t o t a ln u m b e r so fb a c t e r i o p l a n k t o ni nc h a o h ul a k ew e r eo b t a i n e db yc o u n t i n g d a p i s t a i n e dc e l l s c e l lc o u n t sr a n g e df r o m7 5 l0 4t o6 7 5 l0 6c e l l sm l 。1a tt h ef i v e p o s i t i o n sd u r i n gf o u rs e a s o n s ，n l eh i g h e s ta n dt h el o w e s tv a l u e sf o rt h e2 0s a m p l e sw e r ea t p o s i t i o nd o n g h u x i ni ns u m m e ra n dw i n t e r , r e s p e c t i v e l y s p a t i a l l y , m a w e i h es h o w e dt h e h i g h e s ta v e r a g ea b u n d a n c eo fb a c t e f i o p l a n k t o no v e rt h ef o u rs e a s o n s ，a n dz h o n g h a n s h o w e dt h el o w e s t n 圮a b u n d a n c ea n dd i v e r s i t yo fb a c t e r i o p l a n k t o nc o m m u n i t i e sa td i f f e r e n ts a m p l i n g p o s i t i o n ss h a r e dd i f f e r e n ts e a s o n a lp a t t e r n s ，n l eb c c si n2 0s a m p l e sv a r i e ds u b s t a n t i a l l y t l i nh o r i z o na n ds e a s o n , b u tt h ep a t t e r n so fc h a n g ei nb a c t e r i o p l a n k t o nc o m m u n i t i e ss h o w e d t h a tt h es e a s o n a ld i f f e r e n c em i g h th a v eas i g n i f i c a n ti m p a c to l ls t r u c t u 血gt h eb c c si nt h e l a k e c a n o n i c a lc o r r e s p o n d e n c ea n a l y s i s ( c c a ) c o m b i n i n gt h ed g g ep a r e r n sa n d p h y s i c o c h e m i c a lp a r a m e t e r si n d i c a t e dt h a tt h et e m p e r a t u r ea n dc o n c e n t r a t i o n so fb o d s ， n h 3 - n ，c o d m n ，t n ，t pa n dd os i g n i f i c a n t l yi n f l u e n c e dt h eb c c o u rr e s u l t si n d i c a t e t h a tt h ee u t r o p h i cs t a t u sa n ds e a s o nw e r et h em o s ti n f l u e n t i a lf a c t o r so nd e t e r m i n i n gb c c i nc h a o h ul a k e p h y l o g e n e t i ca n a l y s i s i n d i c a t e dt h a ts o m ec l u s t e 猖i n c y a n o b a c t e r i a a n d a c t i n o b a c t e r i ad i dn o ts h o w e dd i f f e r e n c e sh o r i z o n t a la n ds e a s o n a ls c a l e s ，b u tt h eo t h e r s d i d h o w e v e r b a c t e r o i d e t e sa n dc h i o r o f l e x iv a r i e di nh o r i z o na n ds e a s o n k e yw o r d s ： c h a o h ul a k e ，b a c t e r i o p l a n k t o nc o m m u n i t yc o m p o s i t i o n , d i v e r s i t y , h o r i z o n t a la n ds e a s o n a ld y n a m i c s ，d e n a t u r i n gg r a d i e n tg e le l e c t r o p h o r e s i s ( d o g e ) ， c a n o n i c a lc o r r e s p o n d e n c ea n a l y s i s ( c c a ) i i i 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得安徽农业大学或其它教育机构的学位或证书 而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示了谢意。 研究生签名：壹色莲躯 时间：力膨y 年多月坼日 关于论文使用授权的说明 本人完全了解安徽农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留 送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复 制手段保存、汇编学位论文。同意安徽农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、 传播学位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名：红纛纽 时间；勿膨髟年石月j j 7 日 导师签名： 时间：乒卯参年6 月f r 7 目 1 文献综述 微生物作为生态系统的分解者和微食物环的重要组成部分，是有机质分解矿化， c 、n 、p 、s 等生源要素生物地球化学转化，生源温室气体( n 2 0 和c h 4 ) 排放以及 污染物降解等的主要参与者，其在物质循环和能量流动中起着必不可少的作用。同时 微生物又是生态系统中对环境胁迫最敏感、最脆弱的生物类群，环境因素的改变容易 导致整个微生物群落结构改变和功能退化。微生物多样性的丰度及其分布格局决定了 一个微生物生态系统的结构与功能【l 】。因此产生了微生物生态学，该学科就是研究和 揭示微生物系统与环境系统( 包括动植物) 间的相互作用及其功能表达规律，探索其 控制和应用途径的科学。 然而传统微生物生态学研究主要以微生物分离培养为前提，具有一定的局限性， 使其在全面揭示微生物生态系统的结构、功能及其相互关系等信息方面显得束手无策 冈。随着分子生物学的发展和成熟，分子技术也逐渐被应用到微生物生态研究中，即 产生了微生物分子生态学。顾名思义，微生物分子生态学就是在分子水平上探讨微生 物与其所处的环境，包括外界的自然环境和其他生物体内的内环境之间联系的一门科 学。核心问题是微生物生存的环境分子生态效应与遗传分子生态效应，探讨微生物与 环境因子相互影响的的分子机制和微生物对环境新奇信号的响应与遗传适应，从分子 水平揭示微生物进化的机$ 0 t 3 1 。 由于微生物分子生态学涉及面较广，包括人体肠道、极端环境、温泉、土壤、海 洋、湖泊等生态环境。本文主要针对微生物分子生态学的主要研究方法与在海洋、淡 水湖泊以及土壤领域的研究进展进行综述。 1 1 微生物分子生态学涉及的主要研究方法 a m a n n 等【2 】根据微生物原位的、不依赖于培养的微生物系统发育学研究结果认为： 在自然界中，通过实验室人工培养方法已经被分离和描述的微生物物种数量仅占估计 数量的1 5 ，而其余9 5 9 9 微生物种群还仍然未被分离和认识，因此单纯通过传 统的分离培养方法对于人们正确认识微生物资源，以及开发并利用这些资源造成了严 重的障碍。而大量的实验证明，借助于不需要培养的分子生物学方法对研究一定环境 中细菌群落结构与遗传多样性有着重要的作用。目前应用于微生物分子生态学研究的 主要方法包括核酸探针杂交检测法、荧光原位杂交法( f l u o r e s c e n t ns i t uh y b d d a z a t i o n , f i s h ) 、限制性片段长度多态性( r e s t r i c t i o n f r a g m e n t l e n g t h p o l y m o r p h i s m , r f l p ) 、 p c r 扩增与多态性分析及核酸序列分析、变性梯度凝胶电泳( d e n a t u r i n gg r a d i e n tg e l e l e c t r o p h o r e s i s ，d g g e ) 或温度梯度凝胶电泳( t e m p e r a t u r eg r a d i e n tg e le l e c t r o p h o r e s i s ， t g g e ) 等。本文主要介绍d g g e 、1 6 sr d n a 文库构建、r f l p 和f i s h 。 1 1 1 变性梯度凝胶电泳( d g g e ) d g g e 是由f i s c h e r 署1 l e r m a n 最先提出的用于检测基因点突变的一种电泳技术，它 的发明使传统的琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺电泳的分辨率精度提高到一个核苷酸 残基差异的水平。双链d n a 分子中八t 碱基之间有2 个氢键，而g ，c 碱基之间有3 个氢 键连接，因此at 碱基对对变性剂的耐受性要低于g ，c 碱基对。由于这四种碱基的组 成和排列差异，使不同序列的双链d n a 分子具有不同的解链温度。为了使目的序列 能够完全解链，在p c r 扩增目的片段时，在其中一个引物的5 端人为地添加一段约4 0 个碱基的g c 序列，称之为“g c 铗”，用以调节目的序列的解链行为。理论上认为，只 要选择的电泳条件如变性剂梯度、电泳时间、电压等足够精细，有一个碱基差异的 d n a 片段都可以在聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳分离开。染色后的凝胶用成像系统分 析可以在一定成都上反应样品的复杂性。条带的多少能反应样品中微生物组成的差 异，条带的亮度能反应样品中微生物的丰度。 1 9 9 3 年m y u z e r 等【4 j 首次将p c r d g g e 检测技术应用于微生物分子生态学研究领 域，分析菌藻席和细菌生物膜中微生物的遗传多样性，证明了该技术在揭示微生物遗 传多样性和微生物种群异化方面具有独特的优越性。g i l l a n 5 】采取三种不同的方法对 d g g e 法的可靠性进行了测试，结果证实d g g e 法是研究污染物质对微生物多样性影 响的一个很有价值的工具。d g g e 技术的一个显著特性就是可以同时对多份样品进行 分析，因此适合于监测环境中微生物在时间或空间上的动态变化。 在十多年的时间里已被广泛应用于各种环境微生物分子生态学的研究，如高温热 泉、湖泊、江河、海洋、根际、土壤等【6 7 ，8 】。目前p c r - d g g e 已经成为一项常规的分 子生物学研究方法，被广泛应用到微生物分子生态学研究领域中，尤其在微生物多样 性检测、微生物鉴定、微生物分子变异以及种群异化等方面的应用更加广泛。 1 1 21 6 sr d n a 文库的构建 评价环境样本中的微生物多样性最精确的方法就是获得其克隆的序列信息。环境 基因组总d n a 是环境中各种微生物基因组的混合物，虽然它包括了环境当中微生物 组成的信息，但是由于基因组d n a 过于复杂，不方便直接进行研究，因此实际上我 们通常通过研究基因组中的“分子尺”来研究环境中微生物的多样性和系统进化关系。 核糖体小亚基r n a 基因是最经常被选作克隆的基因，成为系统发生的准绳。核糖体小 亚基r n a 基因有3 种类型：2 3 s 、1 6 s 、5 sr d n a , 1 6 sr d n a 是目前微生物生态学研究中 广泛使用的“分子尺”，主要因为( 1 ) 核糖体r n a 是蛋白质合成必需的。所以它们广 泛存在于所有的原核生物中，并且结构和功能都是保守的； ( 2 ) 1 6 sr d n a 的序列中 包括可变区和高变区，因此既可以利用保守区域来设计引物，又可以利用高变区来进 行序列间的比对：( 3 ) 它们的序列变化比较缓慢而且在原核生物中不发生水平转移， 因此1 6 sr d n a 之间序列的差异可以反映不同生物之间的进化关系 9 1 ；( 4 ) 在g e n b a n k 2 ( h t t p ：w w w n c b i n l m n i h g o v ) 和r d pi i ( r i b o s o m a ld a t a b a s ep r o j e c ti i ，h t t p ： r d p c m e m s u e d u h u n l ) 数据库中已经登录了大量不同生物的1 6 sr d n a 序列，因此 知道了1 6 sr d n a 的序列信息以后，就可以在上述数据库中进行序列比对，找到这些 序列相应微生物的系统发育地位。 1 9 9 0 年，g i o v a n n o n i 等【l o 】首先用这一方法分析马尾藻海海面浮游微生物的多样 性，因为这一方法不需要得到环境中微生物的纯培养，突破了用传统的微生物分离纯 化的方法调查环境中微生物多样性时很多微生物无法得到纯培养的限制，因此这一方 法目前已经广泛运用于土壤、海洋、湖泊、肠道等多种生态系统中微生物多样性的调 查【1 1 】，并且揭示了环境中前所未知的微生物多样性 1 2 , 1 3 。另外，e l k e 1 4 】等最近发现，1 6 s r r n a 基因序列分析对于海洋细菌多样性研究有重要意义，并通过实验证明，在某些情 况下，只需检测环境中是否存在某些细菌的1 6 sr r n a 基因，就可大致得出此环境中该 菌的生态分布状况。 对于基因文库的分析方法主要有以下几种：( 1 ) 菌落杂交法：利用具有类群特 异性的d n a 探针对文库进行快速扫描，通过观测每一种基因型的拷贝数，可以估计 各类微生物的丰度，应用此方法的前提是已知群落中各类群的特征基因序列，并针对 特征序列合成探针，实际上预测各类群的特征序列比较困难；( 2 ) r f l p 分析：对各 克隆进行r f l p 指纹图谱分析，此方法较d n a 测序法节省时间，但本身不能确定各菌 种的分类地位；( 3 ) d n a 测序：此法能够提供各个克隆分类地位的可靠信息，但需 要很长的试验周期、大量的试验材料，实际工作中对所有的克隆进行测序难以实现， 通常需要与r f l p 法或t r f l p 法结合，或者只随机挑选部分克隆进行测序，并根据克 隆的拷贝数估计种群丰度，但也导入了随机误差。 1 1 3 限制性片段长度多态性( 1 强l p ) d n a 的多态性分析可以通过r f l p 的方法来实现，利用能识别特定d n a 序列 ( 4 6b p ) 的限制性核酸内切酶消化d n a ，得到不同长度的d n a 片段。检测这种多态 性的经典方法是利用单拷贝基因作为探针，进行s o u t h e r n 点杂交试验。放射性标记的 探针与特定的d n a 片段相结合，酶切得到的不同长度的d n a 片段被分别标记，经 放射自显影技术检测放射性信号。另外一种方法是在对特定的基因序列( 通常为1 6 s r r n a 基因) 进行p c r 扩增后，用限制性内切酶处理扩增产物，基于不同种群1 6 s r r n a 基因序列的差异，将得到长度与数量不同的d n a 片段，通常用高分辨率的聚 丙烯酰胺凝胶电泳来分离，并利用荧光染料进行显色，得到特异性的电泳图谱。此法能 够反映多个酶切位点所包含的d n a 序列信息，这是因为单碱基对的置换、插入或缺 失以及染色体片段的倒置和易位等变异都会使序列出现变异，从而产生了多态性1 1 5 】。 因此在进行微生物群落物种多样性比较时能提供较丰富的信息，适合于较复杂的群落 之间的比较。但其缺点是：末端片段所提供的序列信息混杂在其它片段的信息中，无 3 法判断群落中有多少物种。 1 9 9 7 年l i uw t 等【1 6 】在r f l p 基础上建立了末端片段长度多态性( t e r m i n a l r e s t r i c t i o nf r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m ，t - r f lp ) 的方法，使用荧光或放射性标记引 物的一端或两端，这样酶切所得的末端片段被标记，电泳后只分析此末端片段的种类、 长度、数量即可。 1 1 4 荧光原位杂交( f i s h ) 荧光原位杂交技术是根据已知微生物不同分类级别上种群特异的d n a 序列，合 成荧光标记的特异寡聚核苷酸片段作为探针，用来与环境基因组中d n a 分子杂交， 检测该特异微生物种群的存在与丰度。该方法的特点是可以进行样品的原位杂交，应 用于环境中特定微生物种群鉴定、种群数量分析及其特异微生物跟踪检测，是目前在 微生物分子生态学领域应用比较广泛的方法之一。s e k a r 【1 7 】通过原位杂交和流式细胞 仪对北海的浮游细菌进行了分类研究，检测率达9 0 以上。 1 2 微生物分子生态学的主要研究领域及其进展 1 2 1 海洋微生物多样性研究 海洋微生物是海洋生态系统中的重要组成部分，海洋微生物的多样性研究，有助于 我们更为深入地掌握海洋微生物的分布特征及其在整个海洋生态系统中的功能与作 用，对深入开展海洋生态环境研究具有重要的意义。近年来，海洋微生物多样性研究及 其在海洋生态系统中的作用越来越受到海洋科学家的重视。k n i t t e l 1 8 】通过f i s h 方法对 h y d r a t er i d g e 和黑海的微生物多样性进行了定量分析比较，发现两个地区的优势群落 和所占比例各有不同，每个地区的微生物多样性随深度不同也不同。h i d e t o s h i 1 9 】等对 日本s a g a m i 海区和东京海区沉积物进行了细菌1 6 sr r n a 基因多样性分析，总共得到 1 9 7 种克隆，其中s a g a m i 海区占6 0 ，从中选出3 7 种克隆进行测序，发现所有的序列与数 据库中的d n a 序列同源性均高于8 4 8 。 我国对海洋微生物多样性的研究起步较晚，在分子生物学领域较少，主要集中在我 国厦门大学对海洋异样细菌的研究。陈喜涵首次对中国近岸、河口与近海海域以及亚 北极海区( 白令海) ，利用分子生物学方法研究了一类在海洋碳循环中有着重要地位的 严格化能异养细菌类群- - c y t o p h a g a - f l a v o b a c t e r i a ( 噬纤维菌黄杆菌类群，简称c f ) 的多 样性。填补了我国对异养细菌根据生理多样性进行分类的研究空l 刍 2 0 1 ，并对构建1 6 s r d n a 基因文库中引物的设计进行了完善。之后，曾永辉等人【2 l j 利用陈喜涵等人设计 的新引物构建基因文库对长江口和东海区的c f 类群多样性进行比较，提高了多样性 检出率，结合r f l p 方法进行测序后分析系统进化关系，发现两个区域的多样性具有 明显差异。此外，好氧不产氧光合异养细菌( a e r o b i ca n o x y g e n l cp h o t o t r o p h i cb a c t e r i a , m 心b ) 也是我国海洋生态学中功能细菌研究的一个热点。张瑶等人瞄】以基于时间序列 观察的蓝细菌校正的红外落式荧光显微镜技术( t i m e s e r i e so b s e r v a t i o nb a s e d 4 c y a n o b a c t e r i a - c a l i b r a t e di n f r a r e de p i f l u o r e s c e n c em i c r o s c o p y ，t m e m ) 调查了中国东海 和南海的河口、陆架海及外海的a a p b 空间分布、季节变化及与环境因子之间的关系， 并且在北太平洋海域更大范围的进行了a a p b 的生态分布研究，探讨了a a p b 在海洋生 态系统中的生态地位。另外，戴欣【2 3 】和徐美香凹也应用序列分析的方法分别对南沙 海区沉积物和深海沉积物中的微生物多样性进行了初步探索，为我国海洋微生物资源 的开发和保护做出了一定贡献。 海洋微生物群落的结构组成和特性在一定程度上反映了海洋生态系统的环境状 况，在海洋环境中，异养细菌丰度和多样性都很高，目前在全球海洋的尺度上，异养 细菌的丰度和多样性已经得到很好的认识，并且评估了其作为一个整体在海洋碳循环 中的贡献。但是目前仍然有相当数量的海洋微生物尚未被我们发现，对海洋微生物的 丰度、分布规律等也缺乏系统的了解。 1 2 2 淡水微生物多样性研究 湖泊是陆地表面具有一定规模的天然洼地的蓄水体系，是湖盆、湖水以及水中物 质组合而成的自然综合体。由于湖泊是地表的一种交替周期较长的、流动缓慢的滞流 水体，加之它深受其四周陆地生态环境和社会经济条件的制约，因而，与海洋和河流 相比，湖泊的动力过程、化学过程及生物过程均具有鲜明的个性和地区性的特点【2 5 2 6 l 。 对地区差异较大的三个淡水湖泊( 分别来自澳大利亚、德国和俄罗斯) 比较研究发现， 虽然这三个湖泊的主要浮游细菌类群属于a 、b 、丫变型菌亚纲、c f b 和放线菌纲，但 是不同潮泊之间存在着明显的差异1 2 7 ；对瑞典的5 个湖泊研究表明，湖泊所处的生态 区和营养状况对浮游细菌的多样性有着明显的影响【2 引。对同处于长江两岸的浅淡水湖 泊巢湖和龙感湖的底泥微生物比较研究表明【2 9 1 ，巢湖底泥所含放线菌 ( a c t i n o m y c e t e s ) 、解磷菌( p h o s p h a t e - s o l u b i l i z i n gb a c t e r i a ) 的量较高。而反硝化细菌 ( d e n i t r i f y i n gb a c t e r i a ) 和纤维素分解菌( c d l u l o l y t i cm i c r o b e s ) 则含量相对较低，通 过分析与t p 、t n 和叶绿素a 等相应环境指标的关系，推测巢湖底泥微生物可能在一定 程度上加速了富营养化进程。 湖泊浮游细菌类群结构的变化受富营养化程度调控1 3 0 1 。在富营养化程度高的湖泊 中主要受营养物质的调控 3 1 1 ，如瑞典的湖泊在发生蓝藻水华时，其浮游细菌类群以变 形杆菌( p r o t e o b a c t e r i a ) 、拟杆菌( b a c t e r i o d e t e s ) 、放线菌( a c t i n o b a e t e r i a ) 、疣微 菌( v e r r u c o r n i c r o b i a ) 和浮霉菌( p l a n c t o m y c e t e s ) 为主【3 2 】。而在芬兰，腐殖质含量 不同的湖泊，其浮游细菌的功能类群也不相同【3 3 1 。对淡水湖泊中的丝状细菌研究发现， 它的分布受到水体酸碱度、营养状态调控【3 4 】。而在没有富营养化的湖泊中，原生动物 等捕食者调控着浮游细菌的多样性【3 0 】。 对于同一湖泊来说，其生物群落和营养物质受季节的调控，从而对其浮游细菌群 落结构也有影响【3 5 3 6 1 ，x i nw u 等人p t 于2 0 0 4 年3 月、5 月、7 月和9 , 9 连续四次在同一 5 地点采集太湖水样，分别构建1 6 sr d n a 克隆文库，从四个文库中得到的3 3 6 个克隆分 成了1 4 2 个o t u ( o p e r a t i o n a lt a x o n o m i cu n i t s ) ，绝大部分属于a 、1 3 、y 、6 变型菌亚纲、 拟杆菌门和放线菌门，并且发现7 月份水样明显不同于其他三个水样，另外系统进化 分析表明其中5 3 个序列被划分到6 个新类别，推测可能与其特定的环境有关。 同时在水体的不同层次( 表水层、变温层和均温层) ，由于物理和化学因素的 不同，其浮游细菌多样性也各不相同。w a l t e r z 等郾】将d g g e 与f i s h 以及序列分析三 种方法结合，对康士坦茨湖的浮游细菌进行了不同季节和不同层次的比较，结果发现 尽管有一些条带在所有样品中均出现，但季节变化和层次变化规律依然很明显。 在湖泊生态系统中，水体营养物质的数量或种类的改变，皆能导致浮游细菌多样 性的改变【3 9 4 0 】。因此微生物多样性常被用作监测和预测一个水生生态系统健康与否的 标准。了解浮游细菌类群的多样性、时空分布和及其与环境因子的对应关系是湖泊生 态系统保护、水环境检测和污染治理的重点内容和国际前沿。目前我国淡水湖泊微生 物分子生态的研究还处于起步阶段，虽然近两年对太湖的研究开始成为热点【4 l j ，但近 几年日益频繁的“水华 出现，迫使我国科研工作者须在以后不仅要加强这方面的理 论研究，还要为水体富营养化治理以及污水生物治理提出切实可行的方案。 1 2 3 土壤微生物多样性研究 从微生物群落多样性的全球格局来看，植物群落类型初步决定了微生物群落的组 成，植被通过影响土壤环境，进而影响土壤微生物群落结构和多样性。研究发现，土 壤微生物多样性与覆盖子土壤上的植物群落多样性呈正相关【4 2 】。不同的原始环境必然 有不同的特定微生物群落，热带原始森林和寒带原始森林的微生物群落明显不同【4 3 j 。 土壤微生物物种的多样性是多样性研究中最基本的内容。d u i n e v e l d l “ 应用 p c r - d g g e 研究了菊花生长过程中其根际细菌类群多样性的动态变化，对生长过程 中根际细菌类群的d g g e 带谱通过u p g m a 算法聚类分析，发现带谱之间的相似性 为8 2 ，没有发生显著变化，与同时通过纯培养方法进行研究的结果一致，因此认为 根的生长过程对根际优势细菌类群的影响不大。s m i t 4 5 等也应用d g g e 对一麦田中 优势细菌的多样性随季节的变化做了研究，结果显示不同季节样品的d g g e 带谱有 差异，但差异仅出现在较弱的条带上，表明麦田中的优势细菌相对稳定，但在较弱条 带所代表的细菌类群上存在着较大差异。通过对带谱进行聚类分析，发现虽然其中的 优势细菌类群相对稳定，但七月份的带谱与其它月份的明显不同，表明七月份麦田中 的细菌多样性发生了某些变化。 研究表明【4 6 】，l g q - 壤中原核生物的数量最多，约为2 6 x 1 0 2 6 个细胞，所含有的n 、 p 与陆生植物相当。真菌、藻类和原生动物的数量较原核生物要少得多。对甘肃环县 草地可培养细菌分离后发现，平均每l g 土壤有6 5 个不同的细菌种群，细菌总量为 4 5 1 x 1 0 9 1 7 4 x 1 0 1 0c f ug - 1 土壤【4 7 1 。对美国威斯康星农田土壤的微生物多样性分析表 6 明，约9 8 的物种属于细菌，其中1 6 1 属于变形杆菌，2 1 8 属于纤维分解菌，另 有2 1 8 属于低g 屺含量的革兰氏阳性菌【4 3 】。目前，英国成立了土壤生物多样性研究 小组( s b p ) 专门对苏格兰地区的土壤进行研究，已经取得了许多宝贵数据【4 9 】。 1 3 微生物分子生态学的研究展望 h a n d e l s m a n 等 5 0 1 1 9 9 8 年提出宏基因组学( 环境基因组，m e t a g e n o m i c s ) 后，利用 现代基因组技术进行自然或人工环境的微生物群落的研究成为热门方向。目前，宏基 因组学手段已经被应用于海洋和土壤微生物群落的研究。来源于环境中未培养微生物 的功能基因为基因组学研究拓宽了微生物群落的研究领域。尽管分子生物学研究工具 免不了存在这样或那样的缺欠，但是在被选择用来破译微生物系统的真实信息方面， 微生物分子生态学具有传统方法所无法比拟的优势和特点。随着分子生物学研究手段 在微生物生态学领域应用的不断深入和扩展，发掘了大量未培养微生物新物种的重要 信息，丰富和提高了人们对自然界中微生物多样性和生态学功能的重新认识【5 1 1 ，此外， 在微生物区系分子组成及变化规律以及微生物系统进化研究方面也取得了重大突破， 这些都充分说明开展微生物分子生态学研究的必要性及其重大意义。 工业化的进程加快了社会的发展，但也造成了环境的严重污染。随着各国对生态 环境的重视和人们环保意识的增强，对于环境微生物也不再局限于纯理论研究，而把 焦点放在了生物多样性与环境因素的关系上，目的是为环境污染的治理提供理论依据 和基础支持。可喜的是，通过微生物对污染环境的修复作用，使人们展现了净化环境。 的光明前景。同时，在这个领域内，微生物分子生态学基础逐步受到重视。比如：微 生物种群结构对于环境变化，尤其是污染环境的反应动力学的研究，是建立在环境污 染物产生的环境分子生态效应的基础上；污染物的微生物降解的生化机制与微生物修 复多态性分子生态学的研究，是建立在微生物对污染环境适应的遗传分子生态效应的 基础上。由此可见，微生物分子生态学的研究对环境污染的生态修复提供重要理论依 据。 总之，微生物分子生态学是在分子水平上探索微生物与环境之间相互作用的科 学。理论基础是微生物存在的环境分子生态效应和遗传分子生态效应。它的发展将是 生命科学其它学科发展的基础，因为微生物分子生态学积聚了生态生物化学、化学生 态学、微生物生理学、生物物理学等生命科学各个学科的精华。反之，它的发展同样 也促进了这些学科的发展，尤其是相关微生物领域各学科的发展。另一方面，把微生 物与环境之间相互作用的规律从分子水平得以阐明，为微生物工程、发酵工程、环境 修复工程等高新技术提供了更为科学的理论基础，加快了技术革命的步伐，更为引人 注目的是使微生态制剂、分子生态制剂、基因治疗能够更适合于人类健康事业发展的 需要。所以，微生物分子生态学的发展前景将更加光明。 7 2引言 巢湖位于长江中下游的安徽省中部( 3 0 0 2 5 ，- 3 1 0 4 3 q q 和1 1 7 0 1 6 - 1 1 7 0 5 1 e ) ，是我 国著名的五大淡水湖泊之一，也是安徽省的第一大湖泊。历史上巢湖曾是景色秀美、 物产丰富的鱼米之乡。然而，随着周边城市和农村经济的迅速发展和人口的快速增长， 给这一地区的生态环境带来了巨大的压力，尤其令人堪忧的是，由于污水排放、化肥、 农药的大量使用、周围湿地面积减少、水土流失和湖盆的淤积速度加快，巢湖也因此 变成了我国目前污染最严重的三大淡水湖之一【5 2 1 。巢湖水体的严重富营养化和由此引 发的生态破坏已经引起了国家和地方政府的极大关注。 微生物是生态系统中对环境胁迫最敏感、最脆弱的生物类群，环境因素的改变容 易导致整个微生物群落结构改变和功能退化 8 , 5 3