（植物学专业论文）栀子离体培养及愈伤组织成分提取.pdf

四川大学硕士学位论文 参考文献：6 2 声明6 7 致谢6 8 在读期间发表或已接收的论文6 9 图片目录 第一章 图1 1 腋芽丛生一9 图】2 苹尖丛生9 图1 3 花蕾的形成一11 图1 4 试管苗开花及果实的形成1 1 图1 5 试管苗生根且开花1 1 图1 6 移栽苗开花1 l 图1 7 生根愈伤严重1 3 图1 8 生根较好1 3 第二章 图2 1 疏松、浅黄色愈伤2 l 图2 2 白色透明愈伤2 1 图2 3 绿色愈伤疏松愈伤一2 l 图2 4 绿色致密愈伤2 l 第三章 图3 1 薄层层析显色3 2 图3 2 薄层层析显色3 2 图3 3 紫外扫描最大吸收值2 3 5 n m 3 2 图3 4 紫外扫描最大吸收值3 2 1 n m 3 3 图3 5 粗提物h p l c 谱图3 4 图3 64 。c 结晶针状晶体3 5 v 四川大学硕士学位论文 图3 - 7 常温结晶颗粒状和圆柑状晶体3 5 图3 8 品体紫外扫描3 6 表格目录 第一章 表1 一l 不同激素配比对腋芽丛生诱导的影响8 表1 2 不同激素配比对花蕾形成的影响一1 0 表1 - 3 几种生根培养基的诱导效果1 2 第二章 表2 1 不同培养基对愈伤组织诱导的影响2 0 表2 - 2 不同激素对愈伤组织诱导的影响2 0 表2 3 液体培养基对愈伤组织增殖的影响2 2 第二章 表3 1 正交试验设计，3 l 四川大学硕士学位论文 声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的 研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标 注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的 研究成果，也不包含为获得四川大学或其他教育机构的学位或 证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任 何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 本学位论文成果是本人在四川i 大学读书期间在导师指导 下取得的，论文成果归四川大学所有，特此声明。 、； ：铘 孙种 四川大学硕士学位论文 摘要 栀子离体培养及愈伤组织成分提取 植物学专业 研究生曾妮指导老师唐琳副教授 栀子( g a r d e n i a j a s m i n o i d e se l l i s ) 为茜草科桅子属植物，是一种使用较广泛 的园林观赏树种和药用树种。本文研究了栀子的腋芽丛生离体繁殖和丌花诱导， 以及栀子果皮，叶片，种子愈伤组织的诱导，并对果皮等愈伤组织所产生的次 生代谢物进行了初步提取和分离分析。 以栀子的茎尖和腋芽为材料进行丛生芽的诱导，培养基m s + 6 - b a1 0 m e e t , + i b a 0 2m e c l 的诱导效果明显，能在较短时间内获得大量的丛生芽，单 个外植体腋芽诱导数量最高可达5 0 个。 对丛生之后的腋芽进行开花诱导，在培养基m s + 6 一b a1 0m g c l + n a a 0 1 m 班+ g a 31 0 m g l 中，有花蕾的形成，用该培养基继代1 2 次后，移栽到1 2 m s + n a a0 5m g l 培养基中，植株生根，花蕾继续生长，最终开花，且有一 朵花形成果实并能成熟。 再生芽在1 2m s + i b a o 5m g l + g a 3 o 1 m e , l 培养基中进行生根培养，生 根率可达9 8 ，生根培养4 周后移栽到营养土中，移栽成活率达9 5 。 以栀子果皮、叶片、种子为材料进行愈伤组织诱导的研究。结果表明：b 5 培养基所得到的愈伤组织颜色为绿色质地致密，m s 培养基中愈伤组织浅黄疏 松。n a a 和k t 的激素组合对愈伤组织的诱导效果较好。m s + n a a1 0m g l + k t o 2 5m g l 培养基诱导出的愈伤组织颜色浅黄，质地疏松，增殖快速。用同样激 素组合的液体培养基对愈伤组织进行液体培养，可获得大量黄色的悬浮细胞。 1 四川大学硕士学位论文 对固体培养的愈伤组织以及液体培养获得的细胞进行提取、分离、纯化， 以分析其次生代谢物。较佳提取条件是：用4 倍于材料量的5 0 丙酮或者7 0 乙醇作为提取剂，超声波辅助提取1h ，提取液蒸馏浓缩成粉末，溶解后过大孔 树脂，分离得到部分物质，通过薄层层析、紫外可见光谱扫描以及h p l c 对粗 体物和分离得到的物质进行了检测，结合相关文献初步推测愈伤组织以此条件 得到的提取物主要为栀子苷和绿原酸等。 关键词：栀子；腋芽丛生：开花诱导；愈伤组织；液体培养；次生代谢 物；提取分离 四川大学硕士学位论文 s t u d i e so ni nv i t r oc u l t u r ea n dc a l l u se x t r a c t i o na n di s o l a t i o no f g a r d e n i a j a s m i n o i d e s e l l i s m a j o r b o t a n y m a s t e r ：z e n gn is u p e r v i s o r ：p r o f t a n gl i n g a r d e n i a j a s m i n o i d e se l l i s ，am e m b e ro ft h ef a m i l yr u b i a e e a e ，i t s 谢d e l y u s e df o rg a r d e n i n gp l a n tf o ri t sb e a u t i f u lf l o w e r sa n de v e r g r e e n ，i ti sa l s oac h i n e s e t r a d i t i o n a lm e d i c i n e a n dc a nb eu s e da sb o t hm e d i c i n ea n df o o dt h a th e a l t h y d e p a r t m e n th a sf i r s t l yp r o m u l g a t e d ，i tc o n t a i n sm a n yd i f f e r e n tc h e m i c a li n g r e d i e n t s ， g a r d e n i ay e l l o wi sr a r e l yn a t u r a lw a t e r - s o l u b l ec a r o t e n o i dp i g m e n tw i t ht h ef e a t u r e s o fn o n t o x i c ，s a f e ，s t r o n gp i g m e n t a t i o n ，a n dc a nb ew i d e l yu s e di nf o o dp i g m e n t a t i o n i nt h i s p a p e r , f l o w e r i n d u c t i o na n dt i s s u ec u l t u r e ，c a l l u si n d u c t i o na n d s e c o n d a r ym e t a b o l i t e se x t r a c t i o nw e r es t u d i e dt oe x p l o i tu t i l i z et h er e s o u r c eo ft h e g a r d e n i a j a s m i n o i d e se l l i s i nc h i n a e n h a n c e da x i l l a r yb r a n c h i n ga n df l o w e ri n d u c t i o no fg a r d e n i aj a s m i n o i d e s e l l i sw e r er e s e a r c b e df i r s t m u c hh o r m o n ew e r eu s e dt oc h o o s eb e t t e ri n d u c t i o n e f f e c t t h er e s u l t ss h o wt h a t ：m u l t i p l es h o o t si n d u c t i o ni so b t a i n e dt h r o u g h c u l t u r i n go nm s + 6 - b a1 0m g l + i b a0 2m g c l 。i nt h i sm e d i u mt h en u m b e ro fa e x p l a n tr e a c h e s8 - 1 0r e s p e c t i v e l y ，s t e ma p e xe v e nc a nr e a c ht o1 5 2 0r e s p e c t i v e l y t h eh i g h e s tq u a n t i t yo f i n d u c t i o ni sa p p r o v et o5 0p e re x p l a n t t e s t t u b ep l a n t l e te f f l o r e s c ei nv i t r oi ss t u d i e di nt h i sp a p e rt o o b r a n c h i n g a x i l l a r yb u d sw e r eu s e dt of l o w e ri n d u c t i o n t h er e s u l t ss h o wt h a t ：f l o w e rb u d sc a r l f o r mo nm s + 6 - b a1 0m g h + n a a o 1m g l + g a 30 1m e r e a n di tc a nb l o o ma n d g r o w t ha tl a s tw h e ns u i t a b l em e d i u mw e r eu s e d t h ef l o w e ro ft e s t - t u b ep l a n t l e t h a v et h es a m ef r a g r a n c ea n da p p e a r a n c e t h eb e t t e rr o o tc u l t u r em e d i u mi s 1 2m s + i b a0 5m g l + g a 30 5m g l i n 四川大学硕士学位论文 t h i sm e d i u mt h er a t i oo f r h i z o g e n e s i si s9 8 t h es u r v i v a lr a t ec o u l da c h i e v e9 5 a f t e r4w e e k sr a d i c a t ei n d u c f i o n c a l l u si n d u c t i o no fg a r d e n i a j a s m i n o i d e se l l i s sp e r i c a r p i u m ，l e a f , s e e d s t h e r e s u l t ss h o wt h a t ：d i f f e r e n tb a s em e d i u mi n d u c t i o nd i v e r s i t yc a l l u s c a l l u si n d u c t i o n o fb 5i sg r e e nc o l o ra n dp y k n o - t e x t u r e ，b u tt i s s u el o o s e n e s sa n d l i g h ty e l l o wi nm s n a a + k tc o m b i n a t i o ni sg o o df o rc a l l u si n d u c t i o n t h eb e s tm e d i u mi sm s + n a a 1 0m g l + k t0 2 5m g l ，i nt h i sc o n d i t i o n ，t h el o o s e n e s sc a l l u sg r o w q u i c k l ya n d h a v el i g h ty e l l o w t h i sm e d i u mi su s e dt o l i q u i dc u l t u r et og e tag r e a tq u a n t i t yo f s u s p e n s i o n c e l l s c a l l u sa n ds u s p e n s i o nc e i l sw e r eu s e dt oe x t r a c t i o n ，a b s t r a c t i o n ，p u r i f i c a t i o n ， f o rt h ea n a l y s i so fi t ss e c o n d a r ym e t a b o l i t e f o u rf a c t o r si ne x t r a c t i o nw e r es t u d i e d ， i e e x t r a c t i n ga g e n t ( e t h a n o l ，a c e t o n e ，m e t h a n 0 1 ) ，s o l i d l i q u i dr a t i oo fe x t r a c t i n g s y s t e m ，r e f l u xt i m e ，c a l l u ss o u r c e t h es u p e r i o re x t r a c t i o nc o n d i t i o nw a st h a t ， c o n c e n t r a t i o no f a l c o h o l7 0 o r5 0 a c e t o n e ，s o l i d l i q u i dr a t i oo f1 ：6a n dr e f l u x3 r e p e t i t i o n s ，s u p e r s o n i cw a v et oa s s i s to n eo n eh o u r al o to fy e l l o wc o m p o n e n tw e r e e x t r a c t e d t h e nt h et o t a le x t r a c t i o nw e r ef u r t h e ri s o l a t e db ym a c r o p o r o u sr e s i n a n d t h ec h a r a c t e r i s t i c so fi s o l a t ew e r et e s t e db yt h i n l a y e rc h r o m a t o g r a p h y ( t l c ) ，u v s c a n ，a n dh i g hp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y ( h p l c ) t h er e s u l t ss h o wt h a t c a l l u se x t r a c t i o nm a yb ej a s m i n o i d i na n dc h l o r o g e n i ca c i d k e yw o r d s ：g a r d e n i a j a s m i n o i d e se l l i s ，a x i l l a r ys h o o tp r o l i f e r a t i o n ，f l o w e r i n d u c t i o n ，c a l l u s ，l i q u i dc u l t u r e ，s e c o n d a r ym e t a b o l i t e ，e x t r a c t i o na n di s o l a t i o n 4 四川大学硕士学位论文 摘要： 第一章栀子腋芽丛生离体繁殖及开花诱导 以栀子( g a r d e n i aj a s m i n o i d e se l l i s ) 茎尖和腋芽为外植体进行腋芽丛生离体 繁殖研究以及开花诱导的初步研究。 结果表明：在培养基m s + 6 - b a1 0m l + i b a 0 2m g l 中，腋芽丛生效 果最好，平均每个外植体可得到8 1 0 个丛生芽，每个茎尖可得到1 5 2 0 个丛生 芽：在培养基m s + 6 b a1 0m e c l + n a a o 1m l + g a 31 o m e d l 中，有花蕾的 形成，且最终能够开花并形成果实，花的香味外形以及果的外形均与自然生长 植株相似；较好的生根培养基为：1 2m s + i b a0 5m e c l + g a 30 5m e d l ，生根 率可达9 8 ，生根培养4 周后移栽，移栽成活率达9 5 。 关键词：栀子：腋芽丛生；开花诱导；离体繁殖 四川大学硕士学位论文 1引言 栀子( g a r d e n i a j a s m i n o i d e se l l i s ) ，常绿灌木，其花香形美，极富观赏价值， 是一种优质的瓮栽观赏花卉，其生活能力强，也可用于高速路沿道或园林绿化 树种。栀子果实中含烯醚萜类等成分，对消化系统、神经系统、心血管系统疾 病均有良好疗效，在临床中应用广泛“1 。 植物组织培养常用的方法有促腋芽分枝”1 、愈伤组织分化形成植株“3 ，细胞 悬浮培养5 1 获得植株等。其中促腋芽分枝其方法简便，繁殖速度快，可保持遗 传的稳定性。1 。促腋芽分枝”1 ( e n h a n c e da x i l l a r yb r a n c h i n g ) 又称腋芽法或腋芽丛生 法，通过茎节段或茎尖的腋芽进行增殖，在继代增殖的培养中，丛生芽被分割 成单个苗芽或小苗芽团，转接在新鲜培养基上继续增殖。因此本实验通过促腋 芽分枝以及生根诱导对栀子进行快速繁殖，可以在较短时问内获得大量再生苗， 对于资源的扩大有重要意义。 试管苗开花具有独特的观赏价值，但目前的研究并不完善，丌花技术还未 完全处于可控水平。植物丌花诱导与其生长习性、温度、光周期、碳氮营养的 水平以及内源和外源激素的水平有关，不同物种试管苗开花诱导的能力存在差 异，有诸多偶然因素的存在”3 。本实验在栀子试管苗开花技术方面开展了初步 研究，目前的结果只能推测其花蕾的形成与g a 3 的存在一定的联系。 2 材料与方法 2 1 实验材料 2 0 0 5 年8 月份采自华西药用植物园的栀子腋芽以及茎尖。实验采用的 6 - b a ( 6 一b e n z y l a m i n o p u r i n e ，6 - 苄基腺嘌呤) 、n a a ( n a p h t h y l a c e t i ca c i d ，奈乙酸) 、 i b a ( 1 n d o l eb u t y r i ca c i d ，吲哚丁酸) 、k t ( k i n e t i n ，激动素) 、2 , 4 - d ( d i c h l o r o p h e n o x y a c e t i ca c i d ，2 ，4 一二氯苯氧乙酸) 、g a 3 ( g i b b e r e l l i n 、赤霉素) 等均 为化学纯。 四川大学硕士学位论文 2 2 实验方法 2 2 1 外植体的消毒及培养条件 将栀子茎尖和腋芽置饱和去污粉水溶液中浸泡1 0m i n ，之后用流动水冲洗 半个小时，接种前以7 0 酒精表面消毒3 0s ，弃去酒精，再用o 1 h g c l 2 溶 液消毒5 8m i n ，弃去h g c l 2 ，无菌水冲洗4 5 次，彻底洗去残余h g c h 。将外 植体接种在培养基中培养。 培养条件：培养基蔗糖浓度为3 ，琼脂浓度为0 8 ，p h 值为5 8 ，培养 温度为2 8 1 ，光照度2 0 0 0 l x ，光照时间1 2 h d 。 2 2 2 诱导腋芽丛生 取1c m 长的茎尖、带一个腋芽的茎段，分别接种入丛生诱导培养基n 1 1 - 9 号培养基) 中进行培养，培养方式与2 2 1 培养条件相同。培养一个月后，统 计腋芽丛生诱导情况。 2 2 3 诱导花营的形成 取丛生后得到的部分腋芽接种入开花诱导培养基( 1 一l o 1 1 7 号培养基) 中 进行培养，培养方式与2 2 1 相同，培养4 0 天后，统计花蕾的诱导情况。 2 2 4 诱导生根 待诱导产生的腋芽长到2 - 3e m 时，将丛生芽分离，接种入生根培养基( 1 1 8 - - 1 2 8 ) 中进行生根诱导，培养方式与2 2 1 相同。培养3 0d 后，统计生根情况。 2 2 5 培养苗的炼苗移栽和管理 待生根苗长势良好时，打开培养瓶瓶盖，对已生根的苗进行炼苗，炼苗5d 后从培养瓶中取出，在清水中浸泡2 0r a i n ，完全洗去根上附着的培养基，转入 7 四川大学硕士学位论文 盛有营养土的花衙中，温室培养，培养条件：培养温度为2 4 士1 ，光照度2 0 0 0 l x ，光照时间1 8b i d ，早晚浇水保持湿润。1 周后转移到自然条件下进行培养。 3 结果与分析 3 1 激素配比对腋芽诱导的影响 为了得到较好的腋芽诱导效果，选取了3 种不同激素( 6 一b a 、n a a 、i b a ) ， 2 个体系的激素配比方案，详细配比见表1 1 。 表1 1 不同激素配比对腋芽丛生诱导的影响。 旦! ! ! ! ：! 里壁垡! ! 坠婴! 些塑坠i ! ! ! 型! 皇! ! ! 翌! ! ! 塑型! 业i 堡垒坚盟! 望 培养基 激素浓度m g l l平均诱导腋芽数个 诱导效果堵乔基诱导效果 6 - b an a a腋芽茎尖 + 培养一个月后统计( 基本培养基为m s 培养基) + + + + 1 2 个以上丛生芽，基部无愈伤；抖8 1 2 个丛生芽；基部有愈伤，+ 3 - 5 个丛生芽 结果表明：生长素n a a 、i b a 与6 0 b a 搭配均能较好的诱导出丛生芽， 比较而言，6 - b a 和i b a 的搭配更适合于栀子的腋芽诱导。在培养基1 ，2 ，7 四川大学硕士学位论文 培养中，腋芽丛生的同时，外植体切口接触培养基处常形成一团绿色或白色的 愈伤组织；在培养基4 ，6 的培养过程中，外植体切口处几乎无愈伤组织的形成， 且丛生效果好。 本实验中，6 - b a1 0m e , l + i b a0 2m e d l 的激素搭配，栀子的腋芽诱导率 较高，且外植体在接触培养基的切口处，几乎没有愈伤组织的出现，单个带茎 段的腋芽诱导腋芽数平均可达到8 5 个，茎尖诱导腋芽数平均可达2 0 2 个，最高 可达到4 0 5 0 个。在此激素浓度配比的基础上将6 - b a i b a 的浓度增加( 至2 o ) 或降低( 至o 5 ) ，腋芽诱导效果均不太好。6 - b a1 0m e d l + n a a0 1m e l 激素 搭配对于腋芽诱导，也能得到较高的诱导率，如果n a a 的浓度过高，则容易 在基部出现较多的愈伤。( 图版1 - 1 1 2 ) 图1 1 腋芽丛生 f i g 1 1a l l i x e r yb u dp r o l i f e r a t i o n 3 2 激素配比对花蕾形成的影响 图1 2 茎尖丛生 唔1 2a l l i x e r 3b u dp r o l i l e t a _ 【i o o 在部分研究中，栀子腋芽丛生的增殖培养还添加了g a 3 ，增殖效果比较好， 但是没有进一步的机理研究驯。 本实验在上述已达到较好腋芽诱导效果培养基中添加不同浓度的g a 3 ， 见( 表1 2 1 ，以达到更好的诱导效果。培养过程中发现，在培养基m s + 6 一b a1 0 m e , l + n a a 0 1m e l + g a 31 0m e d l 中有花蕾形成，继代1 2 次之后，转入生根 培养基中，花蕾逐渐长大，最终丌花，花的花形花色与常规种植植株相同，且 味芳香，开花时间可持续2 周，其中一株培养苗在花凋谢之后结出果实，果实 9 四川大学硕士学位论文 形状、大小与常规种植相同，且在一个月后，果实成熟变黄。( 图版l 一3 ，l 一4 ， 1 - 5 ，1 - 6 ) 在m s + 6 - b a1 0m g i n a a0 1m g l 中添加0 2 - 0 5 浓度的g a 3 没能诱导 出形成花蕾，在培养基m s + 6 一b a1 0m g l + i b a0 1m g l 的基础上添加不同浓 度的g a 3 ( 0 1 1 0 ) 也未见花蕾的形成。 表1 2 不同激素配比对花蕾形成的影响。 t a b l e l 2 e f i e c to f h o r m o n eo r lf l o w e ri n d u c t i o n + 培养4 0d 后统计( 基本培养基为m s 培养基) 花蕾诱导效果：+ 有花蕾出现；一无花蕾出现； 丛生效果：卅腋芽1 2 个以上；+ + 腋芽8 - 1 2 ：+ 3 - 5 腋芽 1 0 四川大学硕士学位论文 图1 3 花蕾的形成 f i g 1 3f o r m a t i o no f f l o w e r b u d 图1 5 试管苗生根且开花 f i g 1 - 5 r a d i c a t ea n db l o o m i n g 3 3 低温处理对花蕾形成的影响 图1 4 试管苗开花及果实的形成 f i g 1 4b l o o m i n ga n d f r u c t i f i c a t i o n 图1 6 移栽卣开花 f i g 1 - 6r o o t e dp l a n t sm o v e d t o f l o w e r p o tb l o o m i n g 选择生长旺盛的丛生芽，连同培养基一起置于4 c 冰箱，冷处理2d 之后 取出，继代培养，培养基与表1 2 相同，4 0d 后观察，未见花蕾的形成。此结 果表明短暂的低温处理对栀子花蕾的形成无明显的影响。 3 4 激素对生根诱导的影响 以m s ，1 2 m s 培养基为基础培养基，添加不同浓度的不同生长素，如 1 1 四川大学硕士学位论文 n a a i b a ，以及赤霉素等，进行生根诱导。培养基以及诱导效果见表1 - 3 。 表1 3 儿种生根培养基的诱导效果 t a b l e1 - 3e f f e c to f d i 侬r e n tc u l t u r em e d i u mt or o o tf o r m a t i o n 培养2 5d 后统计 + ，+ + ，+ + + ，生根效果依次递增：一根上形成愈伤组织 实验结果表明：栀子的生根诱导相对比较容易，在未添加激素的m s ，1 2 m s 培养基中就能生根，在添加适当激素的培养基中，生根效果要较未添加激素的 效果好，且生根的数目更多，根毛丰富。生长素浓度加大的时候，根生长迅速， 但是与此同时根上会形成大量的愈伤组织，不利于植株的移栽。 同时发现，在生根培养基m s + n a a l 0 m g l + g a l 0 m g l 中，诱导根生长的 同时，花蕾生长速度也加快，且最终能够开花。因此这个培养基比较适合用于 形成了的花蕾外植体的生根诱导。( 图版l - 7 ，1 8 ) 四川大学硬士学位论文 图i - 7 生根愈伤严重 f i g i 7c a l l u si nr o o t s 图1 8 生根较好 f i g 1 - 8 t h eb e t l t e rr o o t s 3 4 。l 培养苗的炼苗和移栽管理 在生根培养基中培养3 周之后，栀子的根系发育较好，根的长度2 3c m 。 此时打丌培养瓶瓶盖进行炼苗，炼苗5d 后将生根苗取出，用清水浸泡2 0m i n ， 并彻底洗去根上附着的培养基，将苗移栽到盛有营养土的花瓮中，每天早晚喷 洒清水，保持湿润和足够光照，3 周后观察，栀子长势良好。茎尖抽出新叶， 生长状态良好。移栽成活率可达9 5 。( 图1 6 ) 4 讨论 近年来，国内外研究人员对栀子组织培养中腋芽丛生的诱导以及植株再生 进行了比较广泛的研究，也取得了较好的成效，筛选出比较合适的基础培养基， m s 培养基，适合与腋芽丛生的激素为6 - b a ，n a a ，i b a “等，一个腋芽能 诱导大约1 0 一2 0 个丛生芽“1 。本实验在前人研究基础上进行激素筛选，得出 一组诱导率较高的激素组合：m s + 6 - b a1 01 3 ) g l + t b a 0 。1m g l ，该培养基中 接种的外植体，单个茎尖诱导平均可达到2 0 个丛生芽，最高可得到5 0 个以上 的丛生芽，且没有畸形苗的出现。 栀子试管苗开花技术目前未见报道。前人在腋芽诱导增殖过程中添加了 g a 3 以促进增殖“。本实验在诱导腋芽产生丛生芽的过程中，发现在添加了一 1 3 四川大学硕士学位论文 定浓度g a 3 的培养基中部分外植体有花蕾形成，初步推测其花蕾的形成与g a ； 的存在有关，g a 3 能促迸部分植物开花并促进雌花的形成“。花蕾形成之后， 在同种培养基继代培养的过程中，花蕾长势比较缓慢，而将之转入生根培养基 之后，根生长的同时花蕾生长速度也加快，认为是乍根划激内游乍k 系的 收， 从而促进了花蕾的生长，生根培养4 0d 之后开花，其花形花色花香均与原材料 来源植株相似，培养瓶里的白色花朵能够持续丌放2 周而不凋谢。实验中有一 朵花凋谢之后形成果实，且最终成熟，其形状颜色与材料来源植株相似。将有 花蕾的生根苗移栽之后一个月左右，也能开花。 试管苗由于生长空间的狭小以及培养条件的限制，一般很难发育到开花阶 段，但有少数的品种的试管苗在适当的培养基和培养条件下可以生长发育到开 花阶段“。如王熊( 1 9 8 4 年，1 9 8 8 年) 报道的素心兰试管苗开花。t a n g ( 2 0 0 0 年) 报道了人参试管茁开花现象。试管苗丌花的诱导与植物的生长习性、温度、光 周期、碳氮营养的水平以及内源和外源激素的水平有关，目前尚缺乏系统的研 究。试管花具有独特的观赏价值，如果能够在可控条件下保证试管植物百分之 百的丌花，就可以作为商品直接在市场上出售，具有一定的市场前景“”。此外， 这种技术在观赏植物的杂交育种上也有一定的应用前景“。 栀子作为一种集观赏和药用为一体的植物，其试管苗开花并结果具有一定 的市场价值，本实验在诱导开花过程中发现其重现性并不太好，所以还需要进 一步的相关研究，以期在可控条件下，使栀子试管苗能够百分之百的开花和形 成果实。 实验中发现栀子诱导生根比较容易，考虑到在添加了生长素和g a 3 的培养 基中，生根效果良好且能促进花蕾的生长，故选用此激素配比的培养基。而仅 仅是常规的生根诱导，不添加激素的1 2m s 培养基就能满足生根的要求。 1 4 四川大学硕士学位论文 参考文献 1 赵长新，廉美兰，等栀子组织培养与快速繁殖 j 3 延边大学农学学 报，2 0 0 5 ( 3 ) ：1 5 9 1 6 3 2 陆斐，刘宝光，等栀子的组织培养快速繁殖技术 j 北华大学学 报，2 0 0 0 ( 6 ) ：5 3 3 5 3 5 3 a b d u l l a h g r a 1 2k h a t e e b 从，s e r a g em e f f e c to fd i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o n so f g r o w t hr e g u l a t o r s o n g a r d e n i aj a s m i n e o i d e sc v v e i t c h i im i c r o p r o p a g a t i o nb y t i s s u ec u l t u r et e c h n i q u e j a g r i m a r i s c i 2 0 0 3 ( 8 ) ：3 5 4 0 4 任治军，张立明，等栀子主要成分的提取工艺及药理研究进展 j 天然产物研究与开 发，2 0 0 5 ，1 1 ( 6 ) ：8 3 1 8 3 7 5 g e o r g eps r a v i s h a n k a t ga i n d u c i n go fc r o c i na n dc r o c e t i ni nc a l l u sc u l t u r e o fg a r d e n i aj a s m i n o i d e se l l i s j f o o db i o t e c h n 0 1 0 9 y ，1 9 9 5 ，9 ( 1 ) ：2 9 3 8 6 陈_ s 安，于晓尔，芎产藏红花素栀子愈伤组织的诱导和筛选 j 中国生物上程杂志， 2 0 0 6 ，2 6 ( 6 ) ：5 0 5 4 7 税不先，熊英栀子的规范化栽培技术 j 时珍国医国约，2 0 0 5 ，1 6 ( 1 2 ) ：1 3 2 6 1 3 2 7 8 李铁军，李晓华，等栀子花乐条育苗与栽培管理技术 j 中国林副特 产2 0 0 6 ( 6 ) ：3 8 3 9 9 邓先珍，雷永松，等栀子丰产高效栽培技术 j 湖北林业科技，2 0 0 6 ( 3 ) ：6 5 6 6 1 0 肖潇，唐琳，等悬浮培养促进栀子再生的研究 j 四川人学学报( 自然科学版) ，2 0 0 5 ( 6 ) ：1 2 4 l 一1 2 4 5 1 1 l a ic h i n g l o n gp r o d u c t i o no fc r o c i nb yf r u i tc a l l u sc u l t u r eo fg a r d e n i a j a s m i n o i d e se l l i s j f o o db i o t e c h n o l o g y 似y o r k ) ，1 9 9 9 ，1 3 ( 3 ) ：2 0 9 2 1 6 1 2 雷颖水栀子组织培养和快速繁殖，科研与技术 j 2 0 0 6 ( 6 ) ：1 0 1 1 0 3 1 3 g e o r g e ，p s ，r a v i s h a n k a r ，g a i n d u c t i o no fc r o c i na n dc r o c e t i n si nc a l l u s c u l t u r e so fg a r d e n i aj a s m i n o i d e se l l i s j f o o db i o t e c h n o l o g y 似 y o r k ) ，1 9 9 5 。9 ( 1 2 ) ：2 9 1 4 胡彩英，刘庆，等栀子花的组织培养与快速繁殖 j 温州农业科技，2 0 0 6 ( 2 ) ：2 2 2 3 1 5 i c h i ，t ，h i g a s h i m u r a ，y ，e ta 1 a n a l y s i so fc r o c e t i nd e r i v a t i v e sf r o mg a r d e n i a ( g a r d e n i aj a s m i n o i d e se l l i s ) f r u i t s j n i p p o n 肋o k u h a nk o g y o6 a k k a i s h i j o u r n a lo fj a p a n e s es o c i e t yo ff o o ds c i e n c ea n dt e c h n o l o g y , 1 9 9 5 。( 4 2 ) 1 0 ：7 7 6 1 6 朱至清，植物细胞j ：程 m 北京：化学工业出版社，2 0 0 3 ：2 8 四川大学硕士学位论文 第二章栀子愈伤组织的诱导 捅要： 以栀子果皮、叶片、种子为材料，进行愈伤组织的诱导。基础培养基为 m s ，b 5 培养基，激素选择6 - b a 、k t ，i b a 、n a a 、2 , 4 d 等。 不同的基础培养基相同激素配比，诱导产生愈伤组织外观不同。以b 5 为 基础培养基，诱导产生愈伤组织颜色为绿色或浅绿透明，质地比较致密，愈伤 增殖较慢。m s 培养基中，产生的愈伤组织颜色为乳白或者浅黄色，质地疏松， 湿润，增殖较快，比较适合用于愈伤组织的继代增殖培养，且利于色素的积累。 较适合的愈伤诱导培养基为：m s + n a a1 0m g l + k t 0 2 5n q i g l 。 将部分浅黄色愈伤组织继代入液体培养基中，在摇床上以1 2 0 转分钟的转 速暗培养，3 0 d 内可产生大量的悬浮细胞，且细胞团颜色为黄色或黄棕色，较 适合的液体培养基为：m s + n a a 0 5 m g l + k t 0 2 m g l 。 关键词：栀子果皮，种子，叶片，愈伤诱导，液体培养 四川大学硕士学位论文 1 引言 迄今为止，国内外对栀子愈伤组织培养的研究报道比较少，肖萧等对栀子 不同外植体进行了愈伤组织的诱导以及分化再生植株的研究。陈书安等利用栀 子愈伤组织产生悬浮细胞筛选藏红花素高产细胞株，可以在一定程度上解决藏 红花短缺的问题，具有很高的经济价值。 用于愈伤组织诱导的外植体有种子“1 ，叶片“”，果皮等，肖萧等的研 究表明，栀子叶片在适宜的培养基上很容易诱导得到愈伤，陈书安等研究表明， 同等条件下栀子叶片诱导愈伤能力高于栀子种子。 本实验以果皮，种子，叶片为材料进行了愈伤组织的诱导，发现栀子果皮 愈伤诱导的能力也很强，可以达到与叶片诱导相当的水平。诱导产生的大量细 胞可用于进一步的研究，如栀子有效成分栀子苷等的的提取和分离纯化。 2 材料与方法 2 1 实验材料 实验材料为2 0 0 5 年8 月采自华西药用植物园的栀子果实以及叶片。实验中 使用的6 - b a ( 6 一b e n z y l a m i n o p u r i n e ，6 - 苄基腺嘌呤) 、n a a ( n a p h t h y l a c e t i ca c i d ， 奈乙酸) 、i b a ( i n d o l eb u t y r i ca c i d ，吲哚丁酸) 、k t ( k i n e t i n ，激动素) 、2 ，4 d ( d i c h l o r o p h e n o x y a c e t i ca c i d ，2 ，4 二氯苯氧乙酸) 等都为化学纯。 2 2 实验方法 2 2 1 外植体的消毒 a 1 栀子果实的消毒：将果实置饱和去污粉水溶液中浸泡10m i n ，用试管刷 刷洗果皮，之后用流动水冲洗2 0m i n ，滤纸吸干果实表面水分，7 0 酒精表面 消毒1m i n ，弃去酒精，再用0 1 h g c l 2 溶液消毒8 1 0 m i n ，弃去h g c l 2 ，灭菌 蒸馏水冲洗4 次，彻底洗