（有机化学专业论文）蛋白琥珀酸铁原料及制剂质量和稳定性研究.pdf

i 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 摘 要 蛋白琥珀酸铁(iron- protein succinylate，简称 isp)是一种多肽类蛋白补铁药物， 是意大利泛马克大药厂 80 年代研制的产品，1987 年在意大利上市并在全球20 多个 国家包括西班牙、葡萄牙、希腊、阿根廷、韩国等陆续上市发售。为弥补国内空白， 我们在成功研制了蛋白琥珀酸铁原料和制剂的基础上，对原料和制剂的质量和稳定 性进行了系统研究。 首先介绍了蛋白琥珀酸铁的应用和原料药的合成。蛋白琥珀酸铁以酪蛋白为原 料，在对酪蛋白上的氨基用丁二酸酐酰化改性后，使得蛋白上能与铁结合的位点增 加；酰化后的蛋白再与三价铁螯合，制得蛋白琥珀酸铁。 其次，对蛋白琥珀酸铁的相关质量指标进行了研究。使用高效液相色谱法对原 料中丁二酸残留量进行了检测，并对方法学进行了研究。使用分光光度法测量蛋白 琥珀酸铁中游离铁的含量。使用原子吸收光谱仪检测了原料药中重金属铅、砷、汞， 测定了载铁量，并对原子吸收分光光度法进行了方法学研究。在原料药的稳定性研 究中，考察了光、热、湿三个因素，并做了加速稳定性实验和长期稳定性实验，明 确了原料药除对高温敏感外，性质稳定。 在确定了处方后，对制剂进行了研究。在对小试蛋白琥珀酸铁口服溶液的质量 研究中，研究了口服溶液的一般理化性质；建立了液相色谱方法测定防腐剂的含量， 该法能同时测定制剂中的尼泊金甲酯钠和尼泊金丙酯钠。 通过制剂稳定性研究，验证了制剂处方和配制工艺的科学性，得出制剂在常温 下性质稳定，高温影响下性状等易发生变化的结论。这些结果为药品的有效期、包 装和贮存标准的制定提供了依据。 通过上述研究，明确了原料和制剂的质量检测项目和标准，原料和制剂质量可 以得到合理控制，保证药品安全有效。并为新药申报提供了必不可少的研究资料。 关键词：蛋白琥珀酸铁 蛋白琥珀酸铁口服溶液 质量研究 稳定性研究 质量标准 ii 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 abstract iron- protein succinylate is an iron supplement which was invented in 1980s by the italfarmaco in italy. it first appeared in italy in 1987, then spreaded to more than 20 countries, including spain, portugal, greece, argentina, south korea and so on. after the successful development of iron- protein succinylate and oral solution in our group, this article focused on the study on the quality and stability of iron- protein succinylate,. firstly, the synthesis of iron- protein succinylate was birdfly introduced. casein was chosen as the raw material and was succinylated to increase binding positon for iron ions,then iron- protein succinylate was prepared through complexing with iron ions. next, the quality of iron- protein succinylate was studied. using hplc and uv- vis, the content of succinic acid and free iron in our product was checked. both the trace metals and iron were determinated by aas. we also studied the stability of our product, and found that it is quite stable in normal condition. after screening the prescription of iron- protein succinylate oral solution, we studied the quality of the oral solution, such as the normal physical and chemical properties. hplc method was estabilished for the determination of methyl para- hydroxybenzoate and the propyl para- hydroxybenzoate. after testing the preparation s stability, it was confirmed that the prescription and the preparing craft are good. as the oral solution is unstable under high temperature, it should be stored in a cool place. those results will be useful and essential for the application of new medicine. keywords: iron- protein succinylate oral solution quality stability quality criteria 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究 成果。尽我所知，除文中已经标明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体 已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集体，均已在文中以 明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名： 日期： 年 月 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权 保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。 本人授权华中科技大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检 索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 保密， 在 年解密后适用本授权书。 不保密。 （请在以上方框内打“” ） 学位论文作者签名： 指导教师签名： 日期： 年 月 日 日期： 年 月 日 本论文属于 1 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 1 绪 论 1.1 缺铁性贫血及危害 贫血（aniema）是指循环血液中的红细胞数或血红蛋白长期低于正常值的病理 现象。通常贫血分为三类：缺铁性贫血（iron deficiency aneima,ida） 、巨幼红细胞性 贫血和再生障碍性贫血。缺铁性贫血产生原因主要为血液损失或铁吸收不足所致， 如女性月经过多、消化系统溃疡、痔疮等慢性失血性贫血，营养不良、妊娠、儿童 生长期等缺铁性贫血1。 根据世界卫生组织（word health organization, who）疾病预防和控制中心 2004 年的报告预测2，全世界约 30 %的人口存在贫血，是全球最为普遍的营养性疾病， 不论发达国家还是在发展中国家，缺铁性贫血患者都有较高比例。在我国，缺铁性 贫血尤为严重，对于十几亿人口的中国来说，缺铁性贫血治疗对提高国民健康水平 有着重要意义。据国内相关报道，有些地区的婴幼儿和中小学生缺铁性贫血患者高 达 64.4 %，妇女达 47 %。who 报告同时指出，缺铁无论是否贫血，对人的健康危 害极大。孕妇如果缺铁，将给孕妇和胎儿生命安全带来很大隐患；而儿童缺铁对其 身体和智力发育有较大损害；缺铁还能降低体力劳动者的劳动能力和效率。 1.2 缺铁性贫血的药物治疗和发展 目前伴随着人民生活水平的提高，广大人民群众对身体健康日益重视。为了预防 和控制缺铁性贫血，采取了多种途径，如膳食途径、食物强化等，也取得了很好得效 果。然而对孕妇、儿童以及其它严重缺铁性贫血等病人，药物治疗就显得尤为必需。 缺铁性贫血的治疗药物很多。按给药途径可分为口服和静脉注射两种。口服剂 型很多，有片剂、胶囊、冲剂、糖浆、口服溶液等。静脉注射在查阅大量文献后仅 有右旋糖甘铁一种，注射剂由于风险大，毒性高，应用极少。 早期治疗方法多以口服无机铁盐为治疗手段，最常见的为硫酸亚铁。无机金属 铁盐被人体摄入后，在酸性胃液介质中易被电离成为金属阳离子，然后进入小肠被 2 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 人体吸收利用。而小肠壁对带有正电荷的金属离子有一定的排斥作用，导致部分金 属离子不仅不易被吸收，还会刺激胃肠，引起腹泻。不同金属元素之间的拮抗作用 也会使吸收进入体内的金属元素利用率和沉积效率受到限制，导致其生物有效性降 低。另有文献报道亚铁离子还能催化自由基，具有细胞毒性3- 5。 由于无机铁盐的种种弊端，人们开始寻找新的补铁药物。saltman 等研究人员通 过一系列研究，提出了铁的吸收转运机制。他们认为在动物的肠腔内，不论是三价还 是二价的铁，都必须与内源或外源配位体结合形成络合物，再以此形式吸收并进一步 转运。研究人员继而把目光投向了铁的螯合物。随后产生了大量的小分子有机铁配合 物。这类配合物按其载体可分为以下几类：有机酸类，如草酸亚铁，琥珀酸亚铁；氨 基酸类，如甘氨酸硫酸亚铁、天冬氨酸亚铁；糖类，如葡萄糖酸亚铁、果糖铁等。最 具有影响力的是有机铁配合物要数氯化血红素，1983 年美国 fda 正式批准雅培公司 的氯化血红素作为药品使用，国内外已广泛采用铁卟啉制剂作为缺铁性贫血的保健食 品和食品添加剂。在我国， 80 年代中期开始研究微量元素氨基酸螯合物，并在氨基酸 螯合铁方面已取得很大进展。 90 年代初报道了用酸解豆饼得到的复合氨基酸液与硫 酸亚铁螯合制备复合氨基酸螯合铁。但是时至今日，这类物质还是以保健食品或添加 剂在使用，国内仍然未见以上述物质为主药的真正意义上的药品。 70 年代后期，国外开始研究开发大分子的补铁药物。美国 albion 实验室率先 以动植物蛋白和铁元素为原料合成了蛋白铁的复合物。至今，大分子的补铁药物研 制成功并上市的并不多见，主要以多糖铁配合物6和蛋白铁配合物为主。 1987 年，意大利泛马克大药厂研制出一种名为蛋白琥珀酸铁(iron- protein succinylate，简称 isp)的纳米多肽类蛋白补铁药物，在意大利成功上市并在全球 20 多个国家包括西班牙、葡萄牙、希腊、阿根廷、韩国、中国等陆续上市发售，广受 各国医生欢迎。然而高昂的价格让国内病人难以承受。 1.3 蛋白琥珀酸铁的结构 理想的口服补铁药物，必须克服无机铁盐的胃肠道等副反应，使患者有好的顺 应性；还要能被患者较好的吸收，最好是在十二指肠内吸收。蛋白琥珀酸铁以蛋白 3 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 质为原料，在对蛋白上氨基进行丁二酸酐酰化后，使得蛋白质上能与铁结合的位点 增加。酰化后的蛋白不仅能使得铁与蛋白结合增加，而且化学性质，溶解性等都较 未经酰化的蛋白铁有大幅改善。蛋白琥珀酸铁中铁与蛋白质紧密螯合，服用后无铁 离子的刺激反应；还保持了酪蛋白对 ph 值的敏感特性，使其具有了肠靶向性。蛋白 琥珀酸铁化学结构如下图 1.1，1.27。 图 1.1 碱性条件下蛋白琥珀酸铁结构 图 1.2 酸性条件下蛋白琥珀酸铁结构 1.4 蛋白琥珀酸铁的药理学和药物代谢动力学 蛋白琥珀酸铁适应症为绝对和相对缺铁性贫血，由于铁摄入量不足或吸收障碍、 4 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 急性或慢性失血以及各种年龄患者的感染所引起的隐性或显性缺铁性贫血，妊娠与 哺乳期贫血。 蛋白琥珀酸铁作为一种大分子蛋白络合铁，它在 ph 值小于 4 时呈沉淀状态，而 在碱性条件下又重新变成可溶性物质。它在胃内不被胃蛋白酶消化，在中性 ph 值时 却能被胰蛋白酶水解。由于它具有这些独特的特性，蛋白琥珀酸铁受蛋白膜的保护 而不被胃酸破坏和胃蛋白酶酶解，对胃黏膜不造成损伤。在进入肠道后，它重新溶 解，并被胰蛋白酶所消化。蛋白保护膜被消化后，铁在十二指肠内开始释放。有研 究显示，蛋白琥珀酸铁非常有利于被机体吸收，却不形成高的吸收峰。药代学研究 显示它呈现的是一种恒定的吸收趋势，在机体的各个部位逐渐达到吸收和贮存的最 佳稳态。所以蛋白琥珀酸铁不会产生胃肠的耐受性问题8。 上海医科大学朱关珍、何晓明9对蛋白琥珀酸铁的疗效进行了临床研究，蛋白琥 珀酸铁治疗孕妇 ida30 例，有效率高达 97%，实验观察用药后血清铁有明晰的上升， 同时见 hb,rbc,hct均有明显的上升，说明该药对于中国人群疗效与国外人群一样 较好10- 11。 蛋白琥珀酸铁的安全性和耐受性都比较高。有报告指出 3354 个病例中有 93.7% 的病人没有出现任何副作用，而且出现的副作用都比较轻7。蛋白琥珀酸铁的耐受性 与硫酸亚铁和葡萄糖酸铁进行比较，很明显要优于后两者。三者在产生耐受性的百 分比如下图 1.3 所示12。 0 8 % 2 2 % 2 8 % 0 0 . 0 5 0 . 1 0 . 1 5 0 . 2 0 . 2 5 0 . 3 产生副作用病人百分比 图 1.3 蛋白琥珀酸铁与其它两种补铁剂耐受性比较 5 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 1.5 蛋白琥珀酸铁合成 铁离子存在形式受很多因素影响，在接触空气的水溶液中，fe3+和 fe2+的存在 状态由氧化还原电位和 ph 共同决定。在酸性很强的溶液中，fe2+不易氧化，而当 ph6 时，天然水中的 fe2+迅速氧化成 fe3+ 而沉淀，因此补铁制剂的氧化还原稳定性是一个非常重要的问题。尽管很多产品在 酸性或偏酸性条件下是稳定的，但不能保证在中性或碱性条件下的稳定。二价铁可 以和酪蛋白形成复合物，但溶解氧会将二价铁渐渐氧化，导致铁从二价氧化为三， 说明二价铁蛋白复合物很不稳定 。 三价铁与酪蛋白的结合取决于其本性(as1- 、as2- 、 - 、和?- 酪蛋白) 和铁的形式。 据估计,每1个 - 酪蛋白分子仅可以结合7个铁离子,其它几种结构的酪蛋白结合铁能力 也很有限13- 14 。通过对酪蛋白的化学改性，可大大提高蛋白与铁的络合位点。 以三价铁为补铁形式的蛋白琥珀酸铁由于在碱性条件下溶解性良好，铁存在形 式稳定，在十二指肠等主要吸收部位有很好的吸收效果，同时避免了以硫酸亚铁为 首的补铁剂引起的胃肠道不良反应。 国外对蛋白琥珀酸铁的合成申请了多个专利，对其合成过程工艺报道如下。 反应方程式7为： 制备工艺15- 16：称取一定量的酪蛋白，加入适量碱使其溶解。待蛋白完全溶解 后，加入一定量的丁二酸酐进行酰化即得琥珀酸蛋白。取一定量中间产品，溶解后， 向其中加入适量三价铁，反应完后，将溶液精制后干燥即得。 我们以酪蛋白和无机铁盐为原料对蛋白琥珀酸铁的制备工艺进行了研究，使用 （casein- )nh2+o=c- ch2- ch2- c=o ph7.8 （casein- )nh- co- ch2- ch2- cooh fecl3 ph3.4 （casein- )nh- co- ch2- ch2- cooh(fexoyoh2) 6 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 了新的方法，得到了与国外一致的产品，并成功进行了小试和中试三批的研究。 1.6 立题意义 我国 80 年代中期开始研究了大量的铁有机螯合物，现今已取得很大进展。但 是，除少部分如葡萄糖酸铁开发成药物以外，大部分的铁有机螯合物都被作为饲料 添加剂。在食品添加剂中硫酸亚铁这中无机补铁剂仍然在大量使用。国内急需高品 质，高安全的补铁补血药物。本品治疗贫血的适应人群多为孕期妇女或儿童，较之 与其它同类药品相比，具备良好的安全耐受性特点，是一种具有较强市场针对性的 新型补血剂。国内仅独家销售国外进口品种，而且由于价格原因销量大受影响。 为了尽快追赶国际步伐，满足广大缺铁性贫血患者对于质量高，安全性好，不 良反应少，价格又适宜的补铁药物的需要，我们已经研究了蛋白琥珀酸铁的原料合 成工艺和制剂工艺。 然而，对于药品这样一种与人民群众身体健康，生命安全密切相关的商品，药 品质量控制显得格外重要。蛋白琥珀酸铁作为一种疗效好，不良反应少，几乎无耐 受性的补铁药，国内除对进口蛋白琥珀酸铁制剂临床应用有少数几篇文章报道外， 对原料和制剂的理化性质，各种杂质和含量等质量项目的检测方法和标准均未有报 道和研究。相关药学研究相当欠缺。 在成功进行了原料和制剂小试、中试的基础上，为了明确原料和制剂的理化性 质，制定出合理，简便，高效的质量控制方法，特立此题。 1.7 本论文研究内容 蛋白琥珀酸铁原料药按国家新的新药分类原则属于化学药品三类，而蛋白琥珀 酸铁口服溶液则属制剂六类。本课题目的是对蛋白琥珀酸铁原料和制剂的质量和稳 定性进行系统研究，明确它们的理化性质，为制定原料和制剂质量标准提供依据。 通过大量的分析研究工作，特别是原料药和制剂稳定性长期检测和观察，已基本明 确了原料和制剂的理化性质、质量控制方法和药物的稳定性。这些方法和结果，为 蛋白琥珀酸铁新药申报提供了重要资料，为该药上市奠定了良好基础。 7 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 本论文将介绍以下几个方面的研究： （1）原料药质量及标准研究 （2）原料药的稳定性研究 （3）制剂质量及标准研究 （4）制剂稳定性研究 8 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 2 蛋白琥珀酸铁的理化性质和主要指标的质量研究 保证药品安全、有效、质量可控是药品研发和评价的基本原则，其中，对药品 进行质量控制是保证药品安全有效的基础和前提。药物的质量研究与质量标准的制 订是药物研发的主要内容之一。药物的质量研究是质量标准制订的基础，质量研究 的内容应尽可能全面，既要考虑一般性要求，又要有针对性。确定质量研究的内容， 应根据所研制产品的特性，采用的制备工艺，并结合稳定性研究结果，以使质量研 究的内容能充分地反映产品的特性及质量变化的情况。 蛋白琥珀酸铁原料药的类别属于化学药品注册分类三类，根据药品注册管理 办法（试行） 的有关规定和技术要求，对本品理化性质和质量相关问题进行了研究。 现将蛋白琥珀酸铁原料的质量研究工作分述如下。 样品为小试原料三批 060101，060201，060301，对照品为从蛋白琥珀酸铁口服 溶液（意大泛马克大药厂 批号 001）中提取，经过精致干燥得到。 2.1 性状 2.1.1 外观 对原料进行外观观察，本品为红棕色粉末状固体，无特别气味。 2.1.2 熔点 取干燥蛋白琥珀酸铁供试品和对照品少量，置熔点测定仪上测定。结果三批小 试样品和对照品均无明显熔融现象，在 250至 300粉末变黑炭化。说明本品无明 显熔点。 2.1.3 溶解度 按中国药典 2005 版二部(凡例)有关溶解度规定对本品溶解度测定。称取研成细 粉的蛋白琥珀酸铁的供试品，置于 25士 2一定容量的溶剂中，每隔 5 分钟强力 振摇 30 秒钟，观察 30 分钟内的溶解情况，如看不见颗粒，即视为完全溶解。蛋白 9 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 琥珀酸铁溶解度的测定结果见表 2.1。 表 2.1 蛋白琥珀酸铁溶解度的测定结果 样品质量(g) 溶剂 溶剂体积(ml) 现象 结果 0.0112 0.0101 0.5030 0.0114 0.0115 0.0109 水 0.1mol/l hcl 0.1mol/lnaoh dmf 95%etoh 丙酮 10 100 10 100 10 15 10 50 10 50 10 50 大量不溶颗粒 大量不溶颗粒 大量不溶颗粒 大量不溶颗粒 少量不溶颗粒 全溶 大量不溶颗粒 大量不溶颗粒 大量不溶颗粒 大量不溶颗粒 大量不溶颗粒 大量不溶颗粒 不溶 不溶 溶解 不溶 不溶 不溶 因此本品溶解度定为：在 naoh 溶液中溶解，在水、hcl、dmf、etoh、丙酮 中不溶。 2.1.4 引湿性 照中国药典 2005 版二部附录 xix 项下规定，取干燥至恒重的试验样品约 1g， 精密称定，放入已恒重的称量瓶中，均匀铺平，厚度小于 5mm，随即放入 80%湿度 的干燥器中，置 25 培养箱中，于 0, 1, 2, 4, 8, 12, 24, 48, 72 小时分别取出称量，以 0 小时重量为对照，计算引湿增重。见表 2.2。 表 2.2 蛋白琥珀酸铁引湿性的测定结果 时间（h） 原重量（g） 引湿后重量（g） 增加（%） 0 1 2 4 8 12 24 48 72 1.0765 1.0005 1.0005 1.0005 1.0005 1.0005 1.0005 1.0005 1.0005 1.0765 1.0986 1.1218 1.1360 1.1486 1.1508 1.1529 1.1594 1.1669 0 2.1 4.2 5.6 6.7 6.9 7.1 7.7 8.5 10 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 结果表明，本品在 72 小时内，引湿增重为 8.5%，说明本品有引湿性，在包装和 贮存时应考虑该因素。 2.2 鉴别 根据中国药典 2005 版中相类似品种的鉴别方法对蛋白琥珀酸铁进行试验。 2.2.1 三价铁的鉴别 取本品 40mg，滴加 0.1mol/lnaoh 使溶解成 10ml，加硫酸 0.5ml，沸水浴至溶 液显淡黄色，滤过，滤液加亚铁氰化钾试液 10 滴，即生成深蓝色沉淀；离心，沉淀 加稀盐酸 2ml不溶，加氢氧化钠试液 5ml，即分解成棕色沉淀。 2.2.2 蛋白质的鉴别 取本品 2mg，滴加 0.1mol/lnaoh 使溶解成 20ml，取 2ml，置试管中，加考马 斯亮蓝试液 5 滴，摇匀，溶液由淡黄色变为蓝色。 2.2.3 紫外一可见吸收光谱(uv- vis)鉴别 仪器：uv- 2102 pc 型紫外可见分光光度计（尤尼柯（上海）仪器有限公司） 称取蛋白琥珀酸铁原料和对照品，滴加 0.1mol/lnaoh 使溶解成 1mg/ml，ph 值为 7.0.按中国药典 2005 年版二部附录 wa 分光光度法规定进行测定。测定范围为 200nm- 600nm，结果见图 2.1,2.2。 图 2.1 蛋白琥珀酸铁原料紫外光谱图 11 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 图 2.2 蛋白琥珀酸铁对照紫外光谱图 紫外图谱显示，蛋白琥珀酸铁在 200- 400nm 范围内无明显吸收峰，只在 250nm 附近有一条水平吸收线。 2.2.4 红外光谱鉴别 仪器：brmker 红外光谱仪 采用溴化钾压片法,照中国药典2005 版二部附录有关规定对蛋白琥珀酸铁原 料和对照进行测定。测定红外光谱图见图 2.3。 图 2.3 蛋白琥珀酸铁（上）及其对照（下）红外光谱图 12 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 结果分析：蛋白琥珀酸铁原料和对照图谱基本一致。 2.3 检查 2.3.1 酸度检查 蛋白琥珀酸铁原料同酪蛋白一样，在酸性条件下沉淀。由溶解度实验可知本品 不溶于水，但是原料制备过程中可能引入酸，故取水浸泡后滤液测定。取本品 1g， 加水 50ml 浸泡 1h后过滤，取滤液依法测定(中国药典 2005 年版二部附录 vih )。测 得小试三批样品的 ph 值均在 2.0- 3.0，结果见表 2.3。 表 2.3 蛋白琥珀酸铁酸度的测定结果 批号 060101 060201 060301 酸度 2.54 2.47 2.58 2.3.2 溶液颜色 取本品 2.5g，加适量 naoh 溶解配制成 100ml 的溶液，溶液颜色为红色。 2.3.3 溶液的澄清度 蛋白琥珀酸铁原料合成后可能含有一些不溶解物，如氢氧化铁等。这些不溶 物将严重影响原料药质量和安全，因为原料有不溶物，将直接导致口服溶液不澄 清。为保证原料含量和合成后精制效果，对三批小试原料的水溶液进行澄清度研 究。 方法和结果：取颜色项下溶液，与 0.5 号标准浊度液比较(中国药典 2005 年版二 部附录 ix a )。结果表明，溶液澄清。 2.3.4 干燥失重检查 参照中国药典 2005年版二部附录 viii l 规定，取本品 1g，置于与供试品在同样 条件下干燥至恒重的扁形称量瓶中，精密称定，于常温下减压干燥至恒重。以减少 的重量计算本品的干燥失重。检查小试三批原料，结果见表 2.4。 13 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 表 2.4 干燥失重检查结果 批号 干燥前重（g） 干燥后重（g） 干燥失重(%) 060101 060201 060301 1.0060 1.0010 1.0105 0.9798 0.9759 0.9872 2.6 2.5 2.3 检验结果显示：3 批样品与对照品干燥失重均未超过 5 2.3.5 重金属检查17- 19 在重金属的质量研究过程中，我们尝试了中国药典 2005 版附录中的几种方法。 由于存在蛋白质和铁对比色法的干扰，而且蛋白琥珀酸铁原料中重金属具体含量未 知，测定结果不可靠。 目前几乎所有工业产品出口， 尤其是食品， 化妆品等与人身体健康息息相关的产品， 对重金属的要求都远超出了一般药品的标准。为确保重金属合格，最终选定原子吸 收和原子荧光光谱仪对重金属进行测定。 2.3.5.1 仪器与试剂 试剂：硫酸，硝酸，盐酸，抗坏血酸，硫脲（均为优级纯） 仪器：varian 原子吸收光谱仪，afs930 顺序进样原子荧光光谱仪 2.3.5.2 还原剂配制 称取抗坏血酸和硫脲各 5g，加水至 100ml 使溶解。 2.3.5.3 样品处理 干法：精密称取 0.5g, 置瓷钳锅中，小火炭化，后加浓硫酸 1 ml，小火灼干， 移入马佛炉中 500炽灼使完全灰化。冷却后加入 15ml硝酸和 5ml 盐酸小火加热溶 解，蒸至约 5ml，移入 50ml 容量瓶，加入 5ml还原剂，用 5%硝酸定容。 2.3.5.4 测定方法和结果 采用 varian 原子吸收光谱仪石墨炉法测定 pb，采用 afs930 顺序进样原子荧 光光谱仪测定三批原料 as、hg，结果见表 2.5。 14 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 表 2.5 重金属检查结果 批号 pb（ppm） as(ppm) hg(ppm) 060101 060201 060301 0.801 0.890 0.720 0.635 0.628 0.690 0.046 0.057 0.048 结果分析：三批样品中铅均小于10ppm，as，hg 的含量小于 1ppm，说明样品中的重金 属含量小于10ppm.。重金属限量可定为以铅计不得大于10ppm, as，hg可不作限定。 2.3.6 氯化物检查 本品原料在合成过程中由于使用了盐酸，最后不可避免引入氯化物。故应对其 在原料中含量进行控制。为检测出原料氯化物含量，采用中国药典 2005 年版二部附 录 a 比浊法进行测定。 方法： 取本品 0.25g， 加磷酸盐缓冲液 （ph7.6） 约30ml， 搅拌溶解， 然后加入 0.05mol/l 硫酸溶液调 ph 值至 2.53.0 使其完全沉淀，过滤，并用适量水洗沉淀，合并滤液，置 500ml 量瓶，加水稀释至刻度，摇匀，精密量取5ml，依法检查（中国药典 2005 年版二 部附录 a） ，分别与标准氯化钠溶液 1.0ml、2 .5ml、5.0ml 制成的对照液比较。 结果表明：三批样品溶液显色均浅于 5.0ml 标准氯化钠溶液制成的对照液的显 色，即样品中的氯化物均低于 2.0。 2.3.7 元素分析 仪器：el- 2 元素分析仪 德国 vario 公司 分别对酪蛋白、琥珀酸蛋白、蛋白琥珀酸铁和对照进行元素分析，分析测试结 果见表 2.6。 表 2.6 元素分析测试结果 元素 酪蛋白 琥珀酸蛋白 蛋白琥珀酸铁 对照 n c s h 12.68 44.20 0.897 4.316 11.08 41.09 0.685 3.642 9.709 39.54 0.584 3.409 10.24 37.87 0.618 3.401 15 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 实验结果分析：数据显示样品蛋白琥珀酸铁与对照中的 n、s、h 三元素相近， 而 c 元素样品略高。原因可能是蛋白原料 c 含量比对照原料高，元素分析仪结果波 动也可导致一定误差。 2.3.8 氨基酸分析 测定方法： 准确称取一定量的蛋白琥珀酸铁样品分别以 6 mol/l盐酸标准水解法 水解 24h，水解物用氨基酸分析仪进行分析。各氨基酸相对含量见表 2.7。 表 2.7 氨基酸分析的测定结果 氨基酸 酪蛋白 琥珀酸蛋白 蛋白琥珀酸铁 蛋白琥珀酸铁对照 asp thr ser glu gly als cys val met ile leu try phe lys nh3 his arg pro 6.72 3.76 4.79 21.37 1.84 2.95 0.66 5.75 2.81 4.54 9.16 5.36 4.75 7.77 1.96 2.41 3.48 9.91 6.75 3.77 4.75 21.38 1.80 3.12 0.91 5.72 2.84 4.53 9.13 5.39 4.68 7.24 2.53 2.34 3.36 9.74 6.38 3.79 4.62 21.64 1.68 2.98 1.12 5.59 2.92 4.59 8.74 5.21 4.58 6.94 2.48 2.19 3.36 10.92 6.91 3.85 4.76 21.76 1.85 3.55 0.82 5.91 3.01 4.59 9.19 5.39 4.61 6.91 2.31 2.28 3.38 8.91 实验结果分析：由氨基酸分析结果可以看出，从酪蛋白制备蛋白琥珀酸铁，整 个合成过程对蛋白的氨基酸组成没有改变，而且蛋白琥珀酸铁原料与对照的组成也 基本一致。 16 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 2.3.9 丁二酸检查 本品在合成过程中用到了丁二酸酐，在酰化反应完后多余的丁二酸酐都水解成 丁二酸。虽然在精制过程中可以除去大量残留的丁二酸，但可能仍有残留，为了保 证药品质量安全，对丁二酸残留进行检查。 采用高效液相色谱外标一点法检测原料中残留的丁二酸，具体方法如下20- 21。 2.3.9.1 样品溶液的准备 取本品约 0.25g，精密称定，置一小烧杯，加 0.1mol/l加磷酸盐缓冲液（ph7.6） 约 30ml，搅拌溶解，然后加入 0.1mol/l盐酸溶液调 ph 值至 2.53.0 使其完全沉淀， 以 3000rpm离心 10 min，上清液置 50ml 量瓶中，定容即得。 2.3.9.2 仪器与试剂 色谱仪：agilent 1100 series hplc 仪， agilent 化学工作站 色谱柱：c18 250mm4.6mm，5um 试剂：水、磷酸二氢钾、磷酸 2.3.9.3 波长选择 将丁二酸用水溶解制成适宜浓度，经紫外分光光度法扫描，紫外吸收曲线见图 2.4。210nm 波长处有较大吸收，选择 210nm 作为检测波长。 图 2.4 丁二酸紫外光谱图 17 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 2.3.9.4 流动相选择 为使杂质成分与主成分的分离度满足含量测定的要求。根据色谱柱柱效情况，选择 合适的流动相组成十分必要。我们对流动相进行了筛选。流动相筛选试验结果见表2.8。 表 2.8 流动相筛选试验结果 流动相配比 结果 流动 相 1 0.025mol/l 的 kh2po4溶液，ph 值 3.0 主成分在 11 分钟后出峰，峰形较好，在样品 中与其它杂质分离良好 流动 相 2 0.025mol/l 的 kh2po4溶液，ph 值 3.5 主成分峰有点前拖，在样品中与其它杂质分 离不好 流动 相 3 0.025mol/l 的 kh2po4缓冲液（ph 值 3.0） ：甲醇95：5 在样品中与后面的杂质峰没分开 流动 相 4 0.025mol/l 的 kh2po4缓冲液（ph 值 3.0） ：甲醇98：2 主成分峰后有小肩峰，在样品中与后面的杂 质峰没分开 经过试验，其中 ph 值为 3.0 的 0.025mol/l kh2po4缓冲溶液为流动相时，供试 品溶液中主成分峰与各相关杂质的峰分离良好，主成分峰形好，未见明显拖尾。当 以此缓冲液为水相和甲醇配比作为流动相时，主峰的峰形不是很好，在供试品溶液 中主成分峰与周围杂质分离不好，鉴于这些，我们选用 ph 值为 3.0 的 0.025mol/l kh2po4缓冲溶液作为流动相。结果见图 2.5，2.6，2.7，2.8。 min2468101214 mau 0 0.25 0.5 0.75 1 1.25 1.5 1.75 2 vwd1 a, wavelength=210 nm (e:des0630d0630005.d) 3.066 图 2.5 流动相 1 18 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 min 24681012 mau 0 0.5 1 1.5 2 2.5 vwd1 a, wavelength=210 nm (e:des063006300001.d) 3.051 图 2.6 流动相 2 min 246810121416 mau 0 1 2 3 4 vwd1 a, wavelength=210 nm (e:des063006300004.d) 0.119 0.437 0.119 0.437 2.976 7.604 图 2.7 流动相 3 min246810 mau - 0.25 0 0.25 0.5 0.75 1 1.25 1.5 vwd1 a, wavelength=210 nm (e:des063006300006.d) 3.014 图 2.8 流动相 4 19 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 2.3.7.5 色谱条件和系统实用性实验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，0.025mol/l kh2po4溶液，磷酸调 ph 值至 3.0 的缓冲溶液为流动相；检测波长为 210nm，流速 1.0ml/min，柱温 30。理论板 数按丁二酸计算为 17284，结果见图 2.9。 min 0246810121416 mau 0 2 4 6 8 10 vwd1 a, wavelength=210 nm (e:des0630d0630009.d) 0.119 0.437 0.119 3） 。最低检测限为 20ng。 2.3.9.7 线性关系 取在 105干燥至恒重的丁二酸约 50mg，精密称定，置 100ml 量瓶中，加水适 量溶解并稀释至刻度，摇匀。精密稀释配成 5、10、25、50、75、100 g /ml 的溶液， 作为对照品溶液。在上述色谱条件下，进样 20 l，记录色谱图，结果见表 2.9。以丁 二酸的浓度为横坐标（c） ，以峰面积为纵坐标（s） ，求得回归方程为：s= 0.6947c- 0.7126，r =0.9993。结果表明，浓度在 5.056g /ml101.12 g /ml 之间范围 内，丁二酸的浓度与峰面积呈良好线性关系。结果见图 2.10。 20 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 表 2.9 线性关系试验结果 浓度（g /ml） 5.056 10.112 25.28 50.56 75.84 101.12 峰面积 3.16 6.51 17.11 32.46 53.00 69.63 0 1 0 2 0 3 0 4 0 5 0 6 0 7 0 8 0 02 04 06 08 01 0 01 2 0 浓度c （u g / m l ) 峰面积s 图 2.10 浓度峰面积关系曲线 2.3.9.8 精密度实验 将线性关系项下浓度为 50.56g /ml的溶液，依法操作，连续进样 5 次，记录峰 面积。结果见表 2.10。 表 2.10 精密度试验结果 序号 1 2 3 4 5 峰面积 32.46 32.51 32.53 32.64 32.64 平均峰面积= 32.54 rsd = 0.21%（n=5） 结果表明，rsd = 0.21%，本法精密度良好。 2.3.9.9 回收率实验 取 060101 批蛋白琥珀酸铁原料，配制成浓度约 25mg/ml 的溶液，分别精密移取 10ml 于 10 个离心管， 编号为 110， 其中 13 管中加 0.5mg/ml 丁二酸溶液 4ml、 4 21 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 6 管中加 0.5mg /ml 丁二酸溶液 5ml、79 管中加 0.5mg /ml 丁二酸溶液 6ml，110 管分别加入 0.1mol/l 盐酸溶液调 ph 值至 2.53.0 使其完全沉淀，以 3000rpm 离心 10 min，上清液置 50ml 量瓶中，定容即得。测定结果见表 2.11。 表 2.11 回收率实验结果 序 号 加入量 (mg) 峰面积 原样品溶液 平均峰面积 测得量(mg) 回收率 （） 平均回收率 （） 1 2.0100 26.150 1.9204 95.54 2 2.0100 26.130 1.9189 95.47 3 2.0100 26.250 1.9282 95.93 4 2.5125 33.205 2.4686 98.25 5 2.5125 33.035 2.4554 97.73 6 2.5125 33.165 2.4655 98.13 7 3.0150 39.760 2.9779 98.77 8 3.0150 40.035 2.9993 99.48 9 3.0150 40.040 1.435 2.9997 99.49 97.64 rsd =1.65% (n9) 结果表明：样品处理方法回收率较好，能够准确测定样品中的丁二酸残留。 2.3.10.10 丁二酸含量限度 取本品及对照品约 0.25g，照 3.3.9.1 项下方法操作制备供试品溶液；另取 105 干燥至恒重的丁二酸约 2.5mg，精密称定，置 100ml 量瓶，加适量水溶解并稀释至刻 度，摇匀，作为对照溶液（50ug/ml） 。将供试品溶液和对照溶液 0.45 m 微孔滤膜过 滤，分别进样 20ul，记录色谱图，供试品溶液的色谱图中，丁二酸的峰面积不得大 于对照溶液色谱图中丁二酸的峰面积（0.5） 。结果见表 2.12。 22 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 表 2.12 3 批样品及对照品游离丁二酸含量限度测定数据 批号 060101 060201 060301 对照品 限度（） 0.043 0.042 0.045 0.050 结论：通过丁二酸残留测定方法学研究的系列实验证明，用高效液相色谱法作 为丁二酸残留限度测定方法，精密度高、线性关系良好，样品测定处理方法回收率 也符合要求，能够科学、合理、有效的控制本产品的质量。 2.4 游离铁 蛋白琥珀酸铁应是一种无离子状态的三价铁的络合物，产品可能存在内在的降 解和本身的不纯，都会导致游离铁的存在，它的存在会影响铁含量测定的准确性和 产品质量，所以游离铁的测定和限值很重要。在参考有关文献的基础上，采用可见 分光光度法测定22- 23。 方法原理：三价铁离子与巯基乙酸在碱性条件下形成紫红色的复合物，535nm有 吸收，通过测定吸收值来得到其中的含量。 2.4.1 试剂与仪器 试剂：柠檬酸, 氨水，铁标准溶液 100ug/ml 仪器：unico 7200 可见分光光度计 尤尼柯（上海）仪器有限公司 2.4.2 试液的配制 柠檬酸溶液：取无水柠檬酸 20g，加水 100ml，摇匀，即得 200g/l 的溶液 氨水溶液：取 64ml 2528的氨水，加水至 100ml，摇匀。即得 1718氨水 溶液 2.4.3 样品制备 同 2.3.9.1 项下，最后溶液如仍有沉淀，需过滤。 23 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 2.4.4 波长选择 取铁标液10ml置25ml量瓶， 加柠檬酸2ml和巯基乙酸0.1ml， 摇匀后加氨水4ml， 加水稀释至刻度，摇匀，放置 20min，经紫外分光光度法扫描，吸收曲线见图 2.11， 在 535nm波长处有最大吸收。 图 2.11 游离铁复合物紫外光谱图 2.4.5 测定方法 精密移取供试品溶液 10ml置 25ml 量瓶，加柠檬酸 2ml 和巯基乙酸 0.1ml，摇匀 后分别加氨水 4ml，加水稀释至刻度，摇匀，放置 20min，在 535nm 测定吸收度， 与标准铁溶液 5ml 用同一方法制成的对照液比较，供试品溶液的吸收度不得大于对 照液的吸收度（0.1） 。 2.4.6 线性关系 取标准铁溶液，配成浓度分别为