（植物学专业论文）水稻矮缩病毒编码的基因沉默抑制因子的筛选及验证.pdf

摘要 自1 9 9 8 年发现植物病毒编码的基因沉默抑制因子后，已在多种动植物病毒中发现该类 蛋白并研究了其中部分蛋白的作用方式，并发现有的基因组较大的病毒编码多个基因沉默 抑制因子，这对深入了解高等生物基因沉默的机制、植物抗病及植物与病毒的共进化关系、 功能基因组研究及其应用等都具有重要的意义。2 0 0 5 年，发现双链r n a 病毒水稻矮缩病毒 ( r i c ed w a r fv i f u s , l i d v ) s i o 编码的p n s l o 是一个基因沉默抑制因子。r d v 基因组较大， 由1 2 个片断组成。我们想知道该病毒基因组除了p n s l o 是否还编码其它的基因沉默抑制因 子，所以，我们利用渗透注射的方法在转绿色荧光蛋白( g r e e nf l u o r e s c e n tp r o t e i n ，g f p ) 的烟草中单独瞬时表达g f p 或将r d v 的7 个基因( s 2 、s 6 、s 7 、s 8 、s 9 、$ 1 1 、s 1 2 ) 分别与 g f p 共表达，结果显示g f p 单独注射和g f p 分别与r d vs 2 、s 6 、s 7 、s 8 、s 9 、s 1 2 混合注射叶 片在7 天以后观察不到g f p 的表达，即产生g f p 的基因沉默。而在r d vs l l 基因与g f p 共注射 的叶片中，7 天以后仍能观察到较强的g f p 表达。用g f p ! 异探针对上述叶片注射区进行 n o r t h e r n 杂交分析显示，g f p 的表达与荧光观察结果相一致。表明在r d vs l l 编码蛋白p n s l l 存在的情况下，g f p 的基因沉默过程受到了抑制，目p p n s l l 是r d v 除p n s l o 以外的又一个基因 沉默抑制因子。 关键词：转录后基因沉默，基因沉默抑制因子，瞬时表达，水稻矮缩病毒，渗透注射 a b s t r a c t t h ef i r s ts u p p r 鹤s o ro fg o n es i l e n c i n gw a sd i s c o v e r e di n1 9 9 8 s i n c et h e n , i n c r e a s i n g n u m b e ro fs u c hp r o t e i n sh a v eb e e ni d e n t i f i e da n dt h e i rr o l e si ni n t e r f e r i n gw i t hg e n es i l e n c i n g h a v eb e e nc h a r m e r i z e d , w h i c he x t e n d e do u ri n s i g h ti n t ot h em o c h a n i s m so fg o n es i l e n c i n gi n a l i 【 y o 慨p a t h o g e n - r e s i s t a n c e , c o - e v o l u t i o nb e t w e e n # a n t sa n dv i r u s 鹤，a n a l y s i s a n d a p p l i c a t i o no ff u n c t i o n a lg c n o m i c se t e r d vp i oi sar n as i l e n c i n gs u p p r e s s o ri nt h er d v g c n o m e , t h a tw a sf o u n di n2 0 0 5 w e w a n t e dt ok n o wt h a tw h e t h e rt h e r ea r ea n o t h e rs u p p r e s s o ri n r d v g e n o m c s e e d l i n g so ft r a n s g e n i cn i c o t i a n & b e n t h a m i a n al i n e1 6 cc a r r y i n gt h eg f pg e n e w e r ei n f i l t r a t e dw i t ha g r o b a e t e r i u mt u m e f a e i e n sh a r b o r i n gaf u n c t i o n a l3 5 s - g f pe x p r e s s i o n c a s s e t t e a l o n e , o r t o g e t h e r w i t h e a c hs e g m e n t ( s 2 、s 6 、s 7 、s 8 、s 9 、s l l 、s 1 2 ) i n r d v g e n o m e r e s p e c t i v e l y t h eg f pe x p r e s s i o nw a sn o tv i s i b l e , i e g f pg e n es i l e n c i n g ，s t a r t i n gf r o m7d a y s p o s t - i n f i l t r a t i o n ( d # ) o i lt h el e a v e si n f i l t r a t e dw i t h3 5 s - g f pa l o n eo fc o - i n f i l t r a t e dw i t he a c h s e g m e n te x c e p tf o rs 1 1 ，n e v e r t h e l e s st h eg r e e nf l u o r e s c e n c ei nt h eto - i n f i l t r a t e dp a t c h e so f g f p + s 1 1w a ss t i l ls t r o n gv i s u a l i z e du n d e ru vl i g h ta tt h es a n l et i m e c o n s i s t e n tw i t ha b o v e f l u o r e s c e n to b s e r v a t i o n s ，n o r t h e r nb l o t t i n ga n a l y s i su s i n gp r o b es p e c i f i cf o rg f ps h o w e dg f p m r n aw a sa b u n d a n ti nt h et i s s u e sc o i n f i l t r a t e dw i t hs 1 1 + g f p , s 1 0 + g f po rt a v 2 b + g f p ， w h e r e a st h el e v e lo fg f pm r n ai nt h ec o n t r o l ( w t g f p , ) w a sn o td e t e c t a b l e t h e s er e s u l t s i n d i c a t et h a tr d vp n s l li sa n o t h e rs u p p r e * s o ro f g e n es i l e n c i n g k e y w o r d s ：p o s t - t r a n s c r i p t i o n a lg o n es i l e n c i n g , s u p p r e s s o r o fg e n es i l e n c i n g , l x a n s i e n t e x p r e s s i o n ，r i c ed w a r f v i r u s , i n f i l t r a t i o n 3 首都师范大学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取 得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不含任何其他个人或集体已经发表或撰 写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。 本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名：易参j 钕 7 日期：2 0 0 7 年5 月1 6 日 首都师范大学位论文授权使用声明 本人完全了解首都师范大学有关保留、使用学位论文的规定，学校有权保留学位论文 并向国家主管部门或其指定机构送交论文的电子版和纸质版。有权将学位论文用于非赢利 目的的少量复制弗允许论文进入学校图书馆被查阕。有权将学位论文的内容编入有关数据 库进行检索有权将学位论文的标题和摘要汇编出版。保密的学位论文在解密后适用本规 定。 第一章引言 r n a 沉默的研究历史及功能 1 1r n a 沉默的发现 r n a 沉默是一种普遍存在于线虫、真菌、动物和植物四界真核生物体内，在r n a 水 平调控基因表达的调控方式。该机制概念涵盖生物内的共抑制( c o - s u p p r e s s i o n ) ( n a p o f io t a 1 ，1 9 9 0 ) 、转录水平r n a 沉默( t r a n s c r i p t i o n a lg e n es i l e n c i n g , t g s ) 与转录后r n a 沉默 ( p o s t - t r a n s c r i p t i o n a lg e n es i l e n c i n g ，p t g s ) ( b a u l e n m b e , 1 9 9 9 ；d i n g , 2 0 0 0 ) 、r n a 介导的病毒 抗性( r n a - m e d i a t e d v i r u sr e s i s t a n c e , r m v r ) ( w a t e r h o u s e e l ：a 1 ，1 9 9 9 ) 、真菌内的基因“镇 压”( q u e l l i n g ) ( r o m a n oa n dm a c i n o , 1 9 9 2 ) 和动物中的r n a 干涉( r n a i n t e r f e r e n c e , r n a i ) ( f i r ee ta 1 ，1 9 9 1 ) 等各种概念。 r n a 沉默现象的发现最早可追溯到1 9 2 8 年，w m g a r d 等在研究烟草环斑病毒( t o b a c c o r i n g s p o tv i r u s ，t r s v ) 侵染烟草时发现，只有在起初感染的烟草叶片上可以观察到病毒感 染的坏死症状，上部的盱片不仅没有症状，而且还可以抵抗该病毒的再次侵染( h e l ra n d b a u l c o m b e , 2 0 0 4 ) 。当时人们无法解释这一现象，即使到了上世纪八十年代。虽然研究人员 已经开始利用转基因技术将病毒的一些基因转入植物体用以抵抗病毒侵染( b e v a ne ta 1 ， 1 9 8 5 ) ，人们依旧无法对这类现象的本质做出合理解释。1 9 9 0 年，n a p o l i 和v a nd e rk r o l 等 的研究工作对r n a 沉默发生机制的发现具有重大意义，他们试图将查而酮合酶基因转入 矮牵牛中，以期待过量表达该基因而加深花色。但与预期结果相反，花色非但没有加深反 而变浅了 a p o u e ta 1 ，1 9 9 0 ) n o r t h e r n 杂交分析表明外源转基因和内源同源基因的转录水 平均显著减少当时将这种外源和内源基因表达同时受到抑制的现象称为共抑制 ( c o - s u p p r e s s i o n ) s m i t h 等将多聚半乳糖醛酸酶( p o l y g a l a c t u r o n a s e ) 基因转入西红柿中， 同样也观察到共抑制现象( s m j me 8 1 ，1 9 9 0 ) 。 稍早的时候，m a t z k e 等还观察到转基因可 引起植物基因组中同源区序列产生甲基化，并导致相应基因的沉默( m a t 2 k ee ta 1 ，1 9 8 9 ) 。 1 9 9 5 年，g u o 和k e m p h u e s 在线虫中转化p a - i 基因时又发现了类似现象，并推测这可能 是由于正义或反义r n a 引起( 0 i 的a n dk e m p h u e s , 1 9 9 5 ) 1 9 9 8 年，r n a 沉默机制研究取得 了突破性进展，f i r e 和h e l l o 最终证明r n a 沉默是由d s r n a 引起的基因表达调控现象， l 为探明r n a 沉默机制奠定了基础( f i r ee ta i ，1 9 9 8 ) 。同年，植物病毒方面的研究也取得了 重要进展，人们发现了数种由植物病毒编码的r n a 沉默抑制因子( a n a n d a l a k s h m ie ta 1 ， 1 9 9 8 ；b r i g n e t ie ta 1 ，1 9 9 8 ；k a s s c l l a ua n dc a r r i n g t o n , 1 9 9 8 ) 。 随着研究工作的深入，目前已经在植物( h a m i l t o na n db a u l e o m b e , 1 9 9 9 ) 、线虫( f i r ee t a 1 ，1 9 9 8 ) 、昆虫( c a p l e ne ta 1 ，2 0 0 0 ) 、原生动物( n g oc ta 1 ，1 9 9 8 ) 、真菌( r o m a n oa n dm a c i n o ， 1 9 9 2 ) 、裂殖酵母( v o l p ee ta 1 ，2 0 0 2 ) 、小鼠( b e r n s t e i ne ta 1 ，2 0 0 3 ) 和人类细胞( p r o v o s tc ta 1 ， 2 0 0 2 ) 等几乎所有真核生物内发现有r n a 沉默机制，唯一例外的是芽殖酵母，到目前为止 还未发现任何r n a 抑制现象。r n a 沉默抑制因子的发现又使人们获得了一种很方便的研 究方法，结合分子生物学、生物化学、遗传学以及结构生物学各方面的研究，现在入们对 r n a 沉默所行使的功能已经有了比较清楚的了解，对其作用机制也有了一定程度的认识， 同时也开始广泛利用该机制在不同的机体内抑制目的摹因的表达。 图1 1 r n a 沉默现象的发现 1 9 2 8 年，w m g a r d 等在研究烟草环斑病毒侵染烟草时首先发下了发现r n a 沉默现象，引自饵e r ra n d b a u l c o m b e ，2 0 0 4 ) ；b ：1 9 9 0 年，n a p o l i 等在将查而酮合酶基因转入矮牵牛时发现了共抑制现象，引白 ( n a p o z ie ta 1 ，1 9 9 0 ) 。 1 2r n a 沉默的功能 r n a 沉默对对于机体生命活动具有重要意义。该机制参与线虫和植物中的异染色质 组装，并在转录水平和转录后水平控制动植物内转座子的运动。r n a 沉默还对动植物中一 些基因的m r n a 进行剪切或者翻译抑制，调控发育分化，同时在r n a 水平对抗外源遗传 2 物质的入侵。最新的研究证明该机制还可以帮助机体对外界的非生物胁迫作出反应。 1 2 1 保护机体对抗外部遗传物质入侵 在利用病毒载体过量表达外源基因过程中，病毒学家发现了r n a 沉默的第一个生物学 作用。他们发现重组的病毒载体不但没有过量表达目的基因，反而降低了内源基因的表达， 这种现象被称为病毒诱导的r n a 沉默( v i r u s - i n d u c e dg e n es i l e n c i n g ，v i g s ) ( r u i ze ta 1 ， 1 9 9 8 ) 。后续的研究证明，v i g s 机制的本质就是宿主利用砌q a 沉默机制抵抗病毒入侵。 现在至少有三类证据直接证明r n a 沉默在抗病毒过程中起着重要的作用：首先在病毒 侵染植物时，会诱发r n a 沉默系统剪切病毒基因组生成s i r n a 。1 9 9 9 年，h a m i l t o n 等首先 在单链正义链病毒感染的植物内发现了病毒特异的正义和反义s i r n a ( h a m i l t o na n d b a u l c o m b e , 1 9 9 9 ) ，随后人们又在别的病毒感染植物和昆虫病毒感染细胞内发现了病毒特异 s i r n a 的存在( l ie ta 1 ，2 0 0 2 ；s i l h a v ye ta 1 ，2 0 0 2 ) ；另外一个非常有力的证据是许多植物病毒 和部分动物病毒都编码有r n a 沉默抑制因子来用以对抗宿主的r n a 沉默系统；第三方面的 证据来自于一些r n a 沉默相关基因突变体对病毒感染的敏感性。r d r 6 、s d e 3 、d c l 和 a g o i 都是r n a 沉默通路内的关键基因，研究表明r d r 6 、s d e 3 或者a g 0 1 突变的拟南芥都 对黄瓜花叶病毒( c u c u m b e rm o s a i ch n 嚣，c m v ) 非常敏感( b o u t e te ta 1 ，2 0 0 3 ；d a l m a ye ta 1 ， 2 0 0 0 ；d a l m a ye ta 1 ，2 0 0 1 ；m o u r r a i ne ta 1 ，2 0 0 0 ) ，而r d r 2 突变的拟南芥则对烟草花叶病毒 ( t o b a c c om o s a i cv i r u s ，t m v ) 和马铃薯x 病毒( p o t a t ov i r u s 丘p v x ) 都很敏感( y d ec ta 1 。 2 0 0 1 ；y ue ta 1 ，2 0 0 3 ) 。新的研究表明d c l 2 和d c l 4 突变的拟南芥对多种病毒都非常敏感， 而这两个基因则正是抗病毒过程中的关键基因( d e l e r i se ta 1 ，2 0 0 6 ) 这些研究说明了r n a 沉默系统直接参与了抗病毒作用 前面的介绍中我们已经知道d s r n a 是r n a 沉默的直接诱发因子，而d s r n a 则正是多种 病毒生活周期中的一种非常普遍的产物。单链正义链和单链反义链r n a 病毒在复制过程中 都会有一个包含正负链的双链结合期。一般认为这种双链会被宿主d c l 识别，直接诱发 l 斟a i 冗默，但是实际情况却非常复杂。以番茄从矮病毒为例，其病毒产生的s i r n a 分布并 不均匀，而是集中在一些特定区域，研究表明这些区域为正义链r n a 能形成发卡结构的区 域( s 五t t y ae ta 1 ，2 0 0 2 ) 。这说明在单链r n a 病毒侵染过程中，不但正负链基因组配对形成的 d s r n a 可以诱发r n a 沉默，单链r n a 的二级结构也会诱发r n a 沉默。虽然d n a 病毒在复 制过程中没有正负链配对的双链r n a 形式存在，但是却依旧会有d s r n a 的出现。以双生病 毒非洲术薯花叶病毒( a f r i c a nc a 础a v am o s a i cv i r u # ，a c m v ) 为例，该病毒以相反方向转 录的c 3 和外壳蛋白基因存在一段重叠区域，转录后互相配对就会形成d s r n a ( c h e l l a p p a n e t a 1 。2 0 0 4 ) 。而植物双链d n a 病毒p a r a e t r o v i r u s e s 转录生成的基因组r n a 末端存在反向重复 区域，因而可以直接形成双链r n a 。一个比较特殊的例子是动物双链r n a 病毒非洲淋巴细 胞瘤病毒( e p s t e i n - b a r rv i r u s ，e b v ) ，该病毒转录出的g n a t - - - - 级结构区形成发卡，剪 切后直接形成病毒编码的宿主m i r n a ，调控病毒和宿主的生命活动( n a i ra n dz a v o l a n , 2 0 0 6 ； p f e f f e re ta 1 ，2 0 0 4 ) 。 事实上，人们早已开始利用r n a 沉默的抗病毒功能在各种植物内进行抗病防治。这方 面应用的最成功、也是最广泛的例子是将病毒的外壳蛋白( c o a t p r o t i n ，c p ) 转入植物中， 引起所谓的c p 介导抗性。对于许多r n a 病毒，例如t m v 、p v x 、苜蓿花叶病毒。扣晌 m o s a i ch r u s ，a l m v ) 、c m v 和烟草脆裂病毒( t o b a c c or a t t l ev i r u a ，a x v ) 等，在植物中表达 这些病毒的c p 蛋自已获得较高的抗病毒活性( b a u t e o m b ee ta 1 ，t 9 9 5 ；b u e h e re ta 1 ，2 0 0 3 ； w i l s o n , 1 9 9 3 ) 。这种抗性只有在用高浓度病毒或去外壳的病毒r n a 接种的条件下才能使之 感病。研究证明将卫星病毒的e d n a 、运动蛋白突变体以及复制酶亚基等转入植物( a n d e r s o n e ta 1 ，1 9 9 2 ；a u d yc ta 1 ，1 9 9 4 ；b a u l e o m b e , 1 9 9 4 ；p a l u k a i t i sa n dz a i t l i n , 1 9 9 7 ) ，同样可以介导对 病毒的抗性。 植物中的r n a 沉默在局部被诱导后，可以传播到整个植株( v o i n n e ta n db a u l e o m b e ， 1 9 9 7 ) ，这种特性也反映了其在抗病毒中的作用。在自然状态下，病毒通常通过伤口进入植 物的细胞，经复制后，在细胞间运动直至到达维管系统，然后系统侵染全植株。由v i g s 产生的系统r n a 沉默信号先于或至少同时与病毒传播，所以侵染的病毒与r n a 沉默信号之 闻实际上在进行一场赛跑。如果病毒运动得较快，它就能最终建立系统侵染。反之，如果 沉默信号“跑”得快，则病毒随后进入的系统组织中已经建立了耻n 沉默状态，导致侵染 的病毒因为不能复制而被破坏。后来的研究所揭示的一些病毒编码的r n a 沉默抑制因子具 有抑制r n a 沉默信号的产生或传播的功能即是对以上推论的另一种支持证据( 觅下文详 述) 。 转基因也是对机体的外源基因入侵，r n a 沉默对其也有抵抗作用。1 9 9 0 年，n a p o l i 等 首先在转基因矮牵牛中发现了这类现象，但到目前为止我们仍不清楚这种现象发生的机 制。一种可能是转入外源基因在插入基因组过程中会被机体某种机制标示，在基因转录过 程中被r d r p 识别，转录形成d s r n a ；另外植物体内某一个基因非正常过量转录时可能会 有一部分m r n a 出现非特异修饰( 例如没有迸行5 加帽、y p o l y a 加尾等) ，同样会被r d r p 识别生成d s r n a ；当然，如果转基因过程中插入的是多个拷贝且插入位点相近时，转基因 4 本身在转录过程中也可能形成反向重复，导致转录时形成d s g n a ( h e r ra n db a u l c o m b e , 2 0 0 4 ) 。 1 2 2 调控机体发育分化 随着研究的深入，人们发现r n a 沉默的首要机能是调节机体的发育分化以及细胞凋 亡。在这类调控过程中，机体会在特定时期特定位置改变内源d 、r n a ( m i c r o r n a ，m i r n a ) 、 反式激活小分子r n a ( t r a n s a c t i n gs i r n a ，m - 删a ) 以及其它小分子r n a 的量，从而降解 或者抑制宿主内某些基因的表达，对机体的重要生命活动进行调节。 m i r n a 是最先发现的一类内源小分子r n a 。1 9 9 3 年l e e 等通过遗传突变在线虫中发现 一个l i n - 4 基因与发育相关，与传统意义上的基因不同该基因不编码蛋白，而是形成一个2 2 n t 的非编码r n a ( l e ec ta 1 ，1 9 9 3 ) 。但遗憾的是这个发现的意义在一段时期内没有引起足够 的重视。直到2 0 0 0 年，r e i n h a r t 等通过相同的方法又在线虫中发现了一个与l i n 镁似的基 因l e t - 7 ，该基因也调控幼虫的发育( r d n h a r te ta 1 ，2 0 0 0 ) 。成熟的l i n - 4 和l e t - 7 的r n a 作用分子 是由其前体双链r n a 分子经d i c e r 识别并切割后产生的。目前将l i n - 4 和l e t - 7 类具有调控基 因表达作用的小r n a 称为微小r n a ( m i c r o r n a ，m i g n a ) 。 植物中的m i r n a 也参与发育调控，p a l a t n i k 等发现t c p 基因的表达受j a wm i r n a 的控 制( p a l a 舡i i l 【e ta ，2 0 0 3 ) 。丽h a v e 等的实验显示s c a r e c r o w 类的转录因子m r n a 可被 m i r n a l 7 1 介导的r n a 沉默机制切割( h a v ee ta 1 ，2 0 0 2 ) 。2 0 0 3 人们又在果蝇中发现了 m i r n a 基因b a n t a m ( b r e n n e e k ec ta 1 。2 0 0 3 ) 。目前已在多种生物中鉴定了许多的 m i r n a ( n e l s o ne ta 1 ，2 0 0 3 ) ，其功能也是多方面的。例如在拟南芥中对开花时间和叶形态的 调控( k i d n e ra n dm a r t i e n s s e n , 2 0 0 4 ) ，在线虫中的对神经发育非对称性的调控( j o h n s t o na n d h o b c r t , 2 0 0 3 ) 和在果蝇中对发育过程中的细胞增殖和细胞凋亡基因的控制等( b r e n n e c k ee t a 1 ，2 0 0 3 ) 。由此推论m a i r n a 对生物体发育的调控是一种普遍而多方面的调控机制。 对植物内的小分子r n a 进行分析发现，占比例最大的是d c l 3 作用产生的2 4 - n t 的异染 色质、转座子和重复元件序列分子。第二类是经d c l l 剪切产生的m i r n a 分子。而第三类 则是由d c l 4 对t a s 基因剪切产生的一类2 1 - n t 反式作用分子( t a - s i r n a ) 。这第三类分子是 近来在研究植物形态发育过程中发现的( p e r a g i n ee ta 1 ，2 0 0 4 ) 它们由相应的m i r n a 指导 d i c e r 对t a - s i r n a 编码基因进行剪切，然后经过r d r 6 和s g s 3 等基因的作用形成成熟的 t a - s i r n a ( a d c n o te ta 1 ，2 0 0 6 ；y o s h i k a w ae ta 1 ，2 0 0 5 ) 。成熟的t a - s i r n a 与目的m r n a 配对后形 成双链r n a 对靶m 慰蛆进行剪切，从丽调节机体的形态建成和其它功能( a d c n o te ta 1 2 0 0 6 ； g a s c i o l l i 既a 1 ，2 0 0 5 ；p e r a g i n e 武a 1 ，2 0 0 4 ；v a z q u e z 吐a 1 ，2 0 0 4 ；y o s h i k a w ae ta 1 ，2 0 0 5 ) 。虽然 现在只有在拟南芥中发现了t a - s i r n a 的存在，但是很可能其它植物和线虫，链孢霉等编码 r d r p 的其它物种中都存有类似机制。 1 2 3 调控异染色质化 r n a 沉默的另一个重要作用与d n a 甲基化和调控异染色质化有关。人们首先发现在进 行植物转基因和病毒侵染植物时。伴随p t g s 的发生会产生相应基因d n a 编码区域豹甲基 化，最近人们又发现植物中d n a 的甲基化与组蛋白的修饰有关。酿酒酵母( s p o m b e ) 中 已鉴定出与r n a 沉默有关的基因有：一个属于a r g o n a u t e 家族的基因与d i c e r 同源的基因以 及一个具有r d r p 活性的基i 围f v o l p e e ta 1 ，2 0 0 2 ) 。这些基因中的任一个发生突变都将使异染 色质的形成和着丝粒的功能受到破坏，而后者对于有丝分裂中的染色体的精确分离是必需 的( b e r n a r da n d a l l s h i r e , 2 0 0 2 ；b e r n a r de ta 1 ，2 0 0 1 ) 。所以在粟酒酵母中r n a 沉默控制基因表 达是通过调节异染色质的形成而完成的，而后者又受组氨酸h 3 甲基化的调控。在裂殖酵母 中，与r n a 沉默相关的异染色质的形成也参与对一些减数分裂相关基因的调节。面这些基 因又受邻近位置上的可逆转座子的调控，同时转座子的转录诱导该位点的沉默。当r n a 沉 默相关基因发生突变或缺失转座子中长末端重复( 1 0 n gt e r m i n a lr e p e a t , l t r ) 时，减数分裂 相关基因的表达将不受控制( s c h r a r a k ea n da l l s h i r e , 2 0 0 3 ) 。这些一连串相关的事件说明 r a n a 沉默参与对酵母减数分裂的调控。真菌( n e u r o s p o r ac r a s s a ) 在减数分裂过程中染色体 的非配对区是一种较强的r n a 沉默信号( h y n e sa n dt o d d 2 0 0 3 ) 。而这个诱导沉默的过程又 依赖于推测的r d r p 、s a d 1 等r n a 沉默相关基因的功能( s h i ua n dm o t z e n b e r g , 2 0 0 2 ) 。有趣 的是线虫中与s a d - l 类似的基因e g o - 1 的突变体也导致减数分裂时染色体的不配对和生殖 细胞的变异( s m a r d o nc ta 1 ，2 0 0 0 ) 。这些结果都显示在有些物种中r n a 沉默可能是调控减数 分裂的一秘机制。 i 2 4 控制可移动遗传因子 可移动遗传因子( t r a n s p o s i b l ee l e m e n t s , t e s ) 是一类可在基因组中从一个位置移动到 另一位置的d n a 序列。这类因子分为二类，类型i 是一类可逆因子( 又称为逆转座子) ，即 它们的复制是通过以其r n a 中间体为模板，经逆转录而完成的。这类因子在真核生物中含 量丰富，它们组成植物中大部分的t e s ( 例如在玉米中，其组成占核i 勾d n a 的7 0 以上) 。 6 植物中有4 类这类1 e ，其中主要的一种在其序列末端含有长末端重复序列( 1 0 n gt e r r n i r 目i r e p e 瞳。l t r ) 。i i 类t e 在所有生物中均存在，特别多见于原核生物。该类t e 中含有末端反向 重复序列( t e r m i n a li n v e r t e dr e p e 峨t i r ) ，t i r 的大小从1 1 到几百个b p 不等。这类t e 可编码 转座酶( t r a n s p o s 醐a ) 。该酶与t i 皈应并将整个t e 序列切割下来，然后再插入到基因组的 其他位置( 以上参考文献见综述( b 刚n 由叽2 0 0 0 = , k u n 髓ra l db e n n e l z 矾1 9 9 9 ) ) 。以上二类 t 哟能在植物的整个基因组中移动，通过插入基因组中而引起突变，从而为进化提供突变 材料。但过多的由t e 造成的突变对植物功能的稳定将是有害的，甚至有可能将基因组切断。 为了在基因组的突变和稳定之间维持相对的平衡，高等生物在长期的进化过程中获得了一 种抑制t e 过分活动的机制，印利用r n a 沉默机制控制由于转座子的频繁移动和插入基因组 而造成的有害突变，从而维持基因组的相对稳定性。在线虫生殖细胞中对参与r n a 沉默机 制的突变基因的筛选中发现，许多与r n a 沉默有关的基因也具有控制可移动遗传因子的功 能( c 拥a h o kda 1 ，2 0 0 0 ) 。这些结果暗示r n a 沉默可能具有控制可移动遗传因子( 如转座予) 的作用。在果蝇中也发现有类似的现象，r n a 解旋酶基因( r n ah d i c m e s p i n d l e - e h o m e l e s s ) 的突变使果蝇失去r n a 沉默的功能，并且其逆转座子的活性增强 ( a r a v i n & a 1 ，2 0 0 1 ) 。 1 2 5 协助机体应对外部非生物胁迫 在研究抗逆反应过程中，研究人员又发现了一类非常特殊的2 4 n 1s i r n a 先天负链 转录西冈忧( 憎t l r d 酬f 9 甘虮，苜州p cd r n a ，n 玉r n a ) ( b o 慨“e ta 1 ，2 0 0 5 ) n a t - d r n a 是由两个相邻基因转录配对形成d s r n a 产生的一个2 4 n ts i r n a 。成熟的n 蕾- s i r n a 与一个或 者两个母本m r n a 结合，诱发正常m r n a 的剪切，调控基因的表达，对机体外的逆性环境 作出反应。由于在植物和其它物种中大量存在这种正反向配对的m r n a ，因而我们有理由 相信这可能是一类非常普遍的r n a 沉默调控机制( c h e n e t d ，2 0 0 5 ；y a l l 酣a d a l ，2 0 0 g ) 。 2 r n a 沉默作用机制 r n a 沉默泛指各种在r n a 水平发生的序列特异抑制基因表达现象，这包括转录调控、 r n r n a 稳定性调控和翻译效率调控等。如图示，这些过程在生化机制上都具有三个共同特 点：1 ) d s 刚a 的生成；2 ) c l s r n a 的剪切和2 1 2 4 卟- n t 了突出叠刚a 的生成；3 ) s i r n a 指导 功能复合体对部分或完全互补的r n a 或d n a 进行作用，调控基因表达 7 尽管不同种类的r n a 沉默发生机制有一定的差异，但其生化机制上都具有三个共同特 图1 - - 2 r n a 沉默的基本作用方式 点：1 ) d s r n a 的生成；2 ) d s r n a 的剪切和2 1 2 4 ) 、 n ts i r n a 的生成：3 ) s i r n a 指导功能 复合体发生作用。 根据作用位置的不同，r n a 沉默可以分为转录水平的r n a 沉默和转录后水平的r n a 沉 默。而转录后水平的r n a 沉默又可以细分为外源诱发的r n a 剪切和内源诱发的转录后调控 两种不同通路。由于转录水平r n a 沉默的研究较少，这里我们将着重对转录后水平的r n a 沉默的不同机制分类进行介绍。另外，动物和植物的内源和外源r n a 沉默都有一定的差别， 我们会附带介绍。 2 1 转录水平r n a 沉默 转录水平的r n a 沉默( t r a n s c r i p t i o r dg e n e s i l e n c i n g t g s ) 是指由于d n a 结构的改变而 导致基因不能够转录成m r n a 。从而导致r n a 沉默的现象。t g s 的产生主要与基因组中相应 基因的启动子或其基因的读码框区域由于同源r n a 或d n a 的相互作用而产生甲基化有关。 其中由r n a 引发的甲基化而导致的r n a 沉默称为r n ai 导的d n a 甲基化( r n a d i r e c t e d d n am d h y l a t i o n ，r d d m ) 。r d d m 首先是在由类病毒侵染植物的研究中被发现的 m 触阻e 9 9 冒e ta l 。，1 9 9 4 ) 。类病毒的核酸是由一类非编码的、几百个核苷酸组成的、高度 配对的r n a 组成，其复制是在核中通过宿主r n a 聚合酶i i 的作用而产生。在侵染植物的过 程中，其c d n a 拷贝整合到植物的基因组中并产生甲基化，这种甲基化作用只有当类病毒 复制时才产生。这说明类病毒或其复制中间体具有诱导其c d n a 拷贝产生甲基化的作用。 r d d m 现象后又在细胞质中复制的病毒、但带有外源基因以及由非病毒引起的转基因系统 8 中相继被发现( m a b 水e e t a l 。2 0 0 1 ) 。现已知r d d m 导致与r n a 同源的d n a 区域中的大部分胞 嘧啶产生甲基化。另一类t g s 是由含可形成双链r n a 启动子的转基因引起的。双链r n a = j f 起同源的启动子区域产生甲基化，从而导致相应基因的转录不能进行。t g s 模式图见图1 - - 3 。 图1 3 转录水平r n a 沉默模式图 ( b f l , b u m aa fc e l l ，2 0 0 b ，1 6 ：4 6 8 9 4 6 9 3 ) 2 2 转录后水平r n a 沉默 根据诱发因子和作用意义的不同，我们将转录后水平r n a 沉默分为外源因子诱发的 转录后r n a 沉默和内源因子诱发的转录后r n a 沉默两个类型。 2 2 1 外源因子诱发的转录后r n a 沉驮 动物内的外源因子诱发p t g s 机制较为简单。在果蝇体内，诱发因子d s r n a 会被r n a b e l i i 类似物d c r 2 剪切生成双链西r n a 。然后这些d r n a 的不稳定端和d c 融2 结合，另一 端和r 2 d 2 的r n a 结合区域结合。通过d i c e r 和a g 0 2 的相互作用，双链s i r n a 被引导 并与a g 0 2 形成复合体，在这里与沉默无关的一条链会被a g 0 2 降解，而另外一条链将会 指导a g 0 2 复合体与同源m r n a 结合。然后由a g 0 2 完成对目的基因的剪切( d ua n d z a n o r e ；2 0 0 5 ；t ( x n a ia n d z a n o r e , 2 0 0 5 ) 综述。在p t g s 信号通路中，除了d i c e 和a r g o n a j c e ， 真菌、线虫和植物还需要r d r p 的作用对沉默信号进行扩增。 在植物系统内，转基因外源遗传物质的插入和病毒的入侵都会诱发转录后r n a 沉默。 不同的是一些外源因子直接以d s r n a 的的形式存在，而另外一些遗传物质和病毒会以单 链r n a 的形式存在，被宿主特定机制识别后才会生成d s r n a ，诱发r n a 沉默。 拿 植物系统内d s r n a 直接诱发的转录后r n a 沉默在实际研究中应用最为广泛，但我们 图1 4 r 夕 源因子诱发的转录后r n a 沉默发生机制 a ，动物内外源因子诱发的转录后r n a 沉默发生机制。引( v a u c h e c e t , 2 0 0 6 ) ；b ，植物体内直接由双 链r n a 诱发的转录后r n a 沉默发生机制。引自( b r o d e r s a n d v o i r m c t , 2 0 0 6 ) ；c ，植物体内由单链r n a 诱发的转录后r n a 沉默发生枫制f s r o d e r s e na n dv o i r m e t , 2 0 0 6 ) 。 对其作用机制仍知之甚少。如图l - - 4 b 所示，该通路的d s r n a 直接由特定基因转录后配 对形成，然后进入d i c e r 和r i s c 复合体剪切。外源d s r n a 剪切后至少生成两种s i r n a ， 其中2 1 n ts i r n a 被认为介导m r n a 的剪切，而2 4 n ts i r n a 则可能与染色体的修饰直接 相关( h a m i l t o ne t a l ，2 0 0 2 ) 。但遗憾的是到目前为止，人们还没有发现任何与该机制直接相 关的突变体。这可能是因为d s r n a 的过量积累诱发了多种d i c e r s 和r i s c 共同作用，而这 些内源因子原本作用于不同的r n a 沉默机制。 植物中单链r n a 的积累可以诱发r n a 沉默。如图1 - - 4 c 示，双链r n a 的合成依赖 于宿主编码的一个r n a 依赖的r n a 聚合酶r d r 6 的作用( d a l m a ye ta 1 ，2 0 0 0 ；m o u r r a i ne t a 1 ，2 0 0 0 ) 。而r d r 6 作用过程中的模板可能是丢失5 帽子或者3 尾巴的结构异常 r n a ( g a z z a n ie ta 1 ，2 0 0 4 ) 。目前还不清楚拟南芥中的哪个d i c e r 剪切该通路中的d s r n a ， 但突变体研究证明一些基因参与了单链到双链和双链的剪切过程。这些基因有：功能未知 的c o i