《RTPCR技术顾杰》PPT课件.ppt

RT-PCR技术,陕西中医学院医学科研实验中心顾杰14187555402013.7.1,背景简介,绝大多数疾病都是由若干基因表达改变所引起的。基因的表达包括转录（DNARNA）和翻译（RNAprotein）两个阶段。中医药所发挥的治疗与预防作用是直接或间接调整了基因的转录而实现的。观察基因转录水平（mRNA）的变化，是中医药作用机制研究中的一个重要环节RT-PCR技术，是中医药对单基因转录（mRNA）作用研究的过程中，使用的一种常用方法。,陕西中医学院医学科研实验中心-顾杰,什么是RT-PCR?,对组织或细胞的总RNA进行抽提，把RNA反转录为cDNA，然后设计目的基因引物进行PCR，琼脂糖电泳并数码拍照，分析电泳条带灰度值，判断目的基因mRNA转录水平的相对量的变化。,如何做RT-PCR,1.抽提RNA,2.电泳或紫外分光光度计检测RNA的质量,3.RT反转录为cDNA（制备模板）,4.用引物进行PCR反应,5.电泳分析结果,保持实验室环境的干净和卫生！,一.抽提RNA（Trizol法）,从组织材料中抽提RNA.根本原则：防止RNA降解，确保无RNase!防止无处不在的RNase对样品产生降解作用,原理：异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法。方法采用强RNA酶抑制剂异硫氰酸胍，抑制RNA酶的活性，防止RNA的降解；酚/氯仿使蛋白质变性。离心后，RNA选择性地进入无DNA和蛋白质的水相。之后通过异丙醇沉淀，75%乙醇洗涤等，便可得到较为完整与纯洁的总RNA。理论上认为每克组织（或108个培养细胞）可提取5-10mgRNA。,步骤：1引颈处死小鼠，剖腹切取肝脏组织50mg（或106-107个细胞），加入1mlTrizol液，剪碎，快速充分匀浆。222，静置5min。3加入氯仿0.2ml，颠倒15s。422，静置3min。5离心：415000转/分15min。(低温高速离心)6取上清液0.5ml。7加入0.5ml异丙醇，混匀。822，静置10min。9离心：415000转/分10min。10弃上液。11加入1ml475%乙醇。12离心：410000转/分5min。13弃上液，真空干燥5min。14用高压消毒过的DEPC水25ul冰上溶解，-70保存。,仪器：RNasefree耗材、高温或DEPC处理器皿试剂：RNA实验专用、DEPC处理人员：戴口罩、手套环境：RNasefree工作区,操作快速！液氮研磨/液氮速冻RNA保存试剂,避免外源RNase污染（操作细节）,避免内源RNase污染（材料处理与保存）,提取好的RNA样品，分装后用-80度保存,二、检测RNA,方法：1.凝胶电泳检验法2.紫外分光光度计检验,1.凝胶电泳检验法,配RNA变性胶(1%):1:取一个150mL锥瓶,量30mL水,标线.2:称琼脂糖0.3g,加入约20mL水,加热溶胶.3:加入3mL10MOPS,加水至30mL4:加入0.54mL37%甲醛。配CoreMixA:如右表所示；变性处理RNA:1:向EP管中加入6.1uLCoreMixA,再加入1uL样品和4uL无菌水；2:将EP管放在PCR仪上68变性10min,立即放在冰上；3:每孔点样11.1uL,62V,电泳1.5h。,1.凝胶电泳检验法,LaneM：Trans8KDNAMarkerLane1、2：HumanTotalRNA,5.8sRNA,18sRNA,28sRNA,2.紫外分光光度计检验法（快速）,OD260/280“Pure”RNA：2.0(“Pure”DNA：1.8)蛋白质残留会显著降低该比值浓度计算公式：样本RNA含量（ug/ul）=OD260*160*40/1000,1.常规反转录体系,引物,dNTPs,酶,反应缓冲液(pH值，离子强度，Mg2+),模板(RNA),RI,三.RT反转录,2.几种反转录引物,3.常规反转录条件,1.5h,保持环境卫生，操作迅速防止污染干扰PCR结果,四.PCR,常规的PCR反应体系及条件,PCR反应体系为：dNTP（each0.5mM）2ul10buffer4ulMgCl2（25mM）4ul上游引物（4uM）1ul下游引物（4uM）1ul反转录产物4ulTaqDNA聚合酶（5U/ul）0.4ul加水至总体积为50ul,PCR反应条件为：943min；9440s，551min，722min，30个循环；725min4保存。,实验组：特异性引物对阳性对照组：actin或GAPDH等引物对,典型的引物18到24个核苷酸长，引物需要足够长，保证序列独特性，并降低序列存在于非目的序列位点的可能性,10*TBE电泳缓冲液：溶解108gTrisbase、55g硼酸于900ml去离子水中，加40ml0.5MEDTA,定容至1L，室温下保存。1.取PCR产物20ul与上样缓冲液4ul混匀后，上样于1.6%的琼脂糖凝胶中，其中一孔加DNAmarker，80V电压，电泳1小时。紫外透射仪下查看，并拍照。2.在紫外透射仪上，琼脂糖凝胶于DNAmarker相应分子量的位置，可见清晰的DNA条带。通过光密度值与对应内参基因条带的光密度值的比值，可作为该基因的相对转录量进行半定量分析。,五.电泳检测,电泳结果,从图中可看到目标条带，但是较弱；阳性对照，阴性对照均正常，表明PCR体系正常。,实验组阳性对照阴性对照,特异性引物对,-actin引物对,不加模板用水,RT-PCR实验设计实例：,1、实验材料：小鼠空白对照组及灌胃治疗组的肝脏2、实验目的：分析对照组及治疗组中小鼠A基因的表达的差异3、实验步骤：设计ACTIN及A基因的引物；分别抽取对照组及治疗组的小鼠肝脏的总RNA，DNaseI处理，以尽量去除基因组DNA；紫外分光光度计检测各样品的RNA总量；取1ug左右的RNA进行反转录；,取反转录好的cDNA总量的1/10（10ul反转录体积则取1ul），稀释10倍（稀释至10ul），取1/10（1ul）为模板，用ACTIN引物（阳性对照）、普通PCR体系、2025个循环做PCR；取等量产物电泳，根据电泳条带的亮度调整模板量（如1号的