（有机化学专业论文）新型双核大环多胺金属配合物的合成与dna的性质研究.pdf

四j i l 大掌硕士学位论文 新型双核大环多胺金属配合物的合成和与d n a 的 性质研究 有机化学专业 研究生方玉果指导教师余孝其教授 化学核酸酶是当今化学生物学中发展迅猛、富有挑战性的新领域之一。近 2 0 年来，人工核酸切割试剂尤其是定点切割试剂的研究一直是生物化学和分子 生物学等学科中最为活跃的前沿领域之一。 大环多胺类金属配合物广泛应用于生物、化学和医学领域。本文致力于薪 型双核大环多胺金属配合物的设计合成与仿酶催化性能的研究。 本文以大环为原料，合成了以二肽桥联的双核大环多胺及其过渡金属配合 物，其结构通过了1 h n m r 、质谱、红外以及元素分析等方法的鉴定，研究了 目标化合物的合成方法，实现了简便高效的选择性合成。研究了此类配合物作 为化学核酸酶模型对质粒d n a ( p u c l 9 ) 的催化裂解性能，结果表明：配合物分 子在生理条件下，对质粒d n a ( p u c l 9 ) 有很好的切割活性，成功模拟了化学核 酸酶切割d n a 的高效性和专一性。 关键词：人工核酸酶大环多胺金属配合物合成d n a 切割仿酶催化 四川大学硕士学位论文 n o v e ld i n u c l e a rm a c r o c y c l i cp o l y a m i n em e t a l c o m p l e x e s l i n k e dw i t hd i p e p t i d e ：s y n t h e s i sa n dt h e i r i n t e r a c t i o nw i t hp l a s m i dd n a s t u d e n t ：y u g u of a n g s u p e r v i s o r x i a o o iy u a r t i f i c i a ln u c l e a s e sa r ean c wc h a l l e n g i n gf i l e dt h a ti sq u i c k l yd e v e l o p i n gi n c h e m i c a lb i o l o g y i nt h i s2 0y e a r s t h e s t u d yt h a tc h e m i c a ln u c l e a s e sr e a g e n t s e s p e c i a l l ys e l e c t i v i t y s i t ec l e a v a g er c a g e m si st h em o s ta c t i v ef i e l di nc h e m i c a l b i o l o g y m a c r o y c l i cp o l y a m i n e sm e t a lc o m p l e x e sa se n z y m em o d e l sa l ew i d e l yu s e di n c h e m i c a lb i o l o g y , m e d i c i n ea n dg e n et h e r a p y i nt h i st h e s i s ，n o v e lm a c r o y c l i c p o l y a m i n e sa n dt h e i rm e t a lc o m p l e x e sh a v eb e e nd e s i g n e da n dc a t a l y t i ce f f i c i e n c y i nd n a c l e a v a g e as e r i e so fm u l t i n u c l e a rm a c r o c y c l i cp o l y a m i n em e t a l ( z n 2 + c u 2 + c 0 2 + ) c o m p l e x e sc o n t a i n i n gc h i r a ld i p e p t i d el i n k a g ew e nd e s i g n e da n ds y n t h e s i z e d t h e s t r u c t u r e so ft h e s en o v e ld i n u c l e a rc o m p l e x e sw c r cc o n s i s t e n tw i t ht h ed a t e o b t a i n e df r o m1 h n m r ，m sa n di re ta 1 t h e s y n t h e t i cm e t h o d so ft h e t i t l e c o m p o u n d sh a v eb e e nd i s c u s s i o ni nd e t a i l ，as e r i e so fc o n v e n i e n ta n de f f i c i e n t r e a c t i o n sh a v eb e e nd e v e l o p e d t h eh y d r o l y s i sc l e a v a g eo fp l a s m i dd n a ( p u c l 9 ) b ym a c r o c y c l i cp o l y a m i n em e t a lc o m p l e x e sh a sb e e ni n v e s t i g a t e d ，a n dt h er e s u l t s r e v e a l e dt h a tt h e s ec o m p l e x e sc o u l da c ta sp o w e r f u lc a t a l y s t sf o rt h ec l e a v a g eo f p l a s m i dd n au n d e rp h y s i o l o g i c a lc o n d i t i o n s k e y w o r d s ： a r t i f i c i a l n u c l e a s e s ；m a c r o c y c l i ep o l y a m i n e m e t a l c o m p l e x e s ；s y n t h e s i s ； m u l t i n u c l e a rc o m p l e x e s ；d n a c l e a v a g e ；m i m i ce n z y m ec a t a l y s i s 四j i i x ：学硕士学位论文 声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得 的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包 含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得四川大学或其他教育 机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何 贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 本学位论文成果是本人在四川大学读书期间在导师指导下取得的，论文成 果归四川1 大学所有，特此声明。 导师签名 学生签名 四川大学硕士学位论文 第一章大环多胺金属配合物作为人工核酸酶模型的研究进展 1 1 研究人工核酸酶的意义 人工核酸切割试剂是八十年代发展起来的生物无机化学的重要分支，近2 0 年来，人工核酸切割试剂的研究一直是生物化学中最为活跃的前沿领域之一 “。研究人工核酸切割试剂的主要目的是合成定点切割试剂，后者是一种重 要的分子生物学工具，在疾病的基因治疗、反义p c r 技术等领域中有着重要 的应用价值。此外，人工核酸切割试剂还可以在足迹技术和核酸高级结构的 研究中用作高分辨率的化学探针。研究人工核酸酶切割试剂具有很重要的理论 价值和应用价值：( 1 ) 人工核酸切割试剂可以作为许多天然核酸酶的模型， 有助于我们深入了解核酸酶的催化机理，对金属及配合物催化核酸水解机理的 研究可以帮助我们理解金属离子参与核酸酶催化水解时所起的作用；( 2 ) 人 工核酸切割试剂可以作为化疗药物用于治疗肿瘤以及遗传疾病，也可以作为 d n a 的结构探针用于研究d n a 的结构以及蛋白质与d n a 相互作用等； ( 3 ) 人工核酸切割试剂与d n a 结合的大分子偶联体具有定点切割的特点，可以作 为重要的分子生物工具，弥补天然核酸的缺陷，这也是研究人工核酸的终极目 的。此外，将定点切割试剂用于p c r 技术”，可以大大推进克隆技术的发展， 普通的核酸切割试剂在足迹技术中也得到广泛的应用。 f i g u r e l 1 2 大环多胺金属配合物的及它们仿酶催化作用研究进展 从上图可以看出，大环多胺有一个共同的特点，所有该类化合物都有一个 h己时n 拦 芒h 0 一 h厂_h 四川大学硕士学位论文 由多个原子组成的环，环上都有好几个可参与配位的n 原子，这一结构决定了 大环多胺的性质和用途。大环多胺是一类具有独特性质的配体，它既可以与金 属离子配合，也可与带正电荷的有机铵离子或带负电荷的有机阴离子发生配合 作用，以主一客体配合形式形成超分子，因此对大环多胺络合物的合成和配合 性质的研究是目前在生物有机化学、生物无机化学和配位化学等学科领域的重 要研究方向。大环多胺与阳离子配位主要是通过静电作用力，与胺离子配位是 通过氢键( 1 、卜- h o ) 作用力( 7 5 ) 和一部分静电作用力0 ) ( 2 5 ) 形成配 合物。而大环多胺与阴离子相配合则是因为其有较大的孔径和较强的静电荷， 孔径越大越容易同阴离子相配合。 由于其特殊的结构及其同过渡金属离子以及镧系金属离子等的络合作用， c y c l e n 能用于医药、酶模仿物”1 、分离和运载气体”。、金属阳离子提取“等 不同方面，如果对c y c l e n 加以适当修饰，其配位能力和所形成配合物的功能还 可大为拓展，如在生物医药中用作过渡金属，重金属，镧系和锕系金属的选择 性配位剂等。若c y c l e nn 上带有酯，酰胺，毗啶等侧链基，则可作为碱金属 阳离子的配位剂，高选择性的提取n a + 。c y c l e n 还可以在生理条件下实现自组 装。特别是形成的络合物在生物酶模拟、d n a 切割等方面的应用，为研究生 命活动过程提供了一种良好的手段，引起了人们对其广泛的关注，并开发出各 种不同结构和作用的大环多胺及其衍生物“。 大环多胺的催化功效主要依靠于初始阶段对底物分子的选择性识别“。大 环多胺配合物的合成、稳定性及催化性能的研究，对于了解金属酶的结构、催 化作用机理以及设计合成人工酶有重要意义，成为生物化学领域研究的重要课 题。而如何合成具有特定结构的新型大环配体是需要解决的问题“。在过去 的二十年间，已经先后合成了含桥联羟基，咪唑基，叠氮基，硫腈基等多种基 团的大环配体，相关的酶模型配合物也有许多报道“。 由于大环多胺的金属配合物特异的催化活性1 ，因此对大环多胺及其金 属配合物开展研究，不仅对酶催化反应的识别、选择性及生物介质等有更好的 模拟，而且由于它与生物体系里的基本过程，如光合作用、氧化、磷酰化、水 解等相似，进而对深入阐明酶催化作用机制等具有重要意义。近几年来，对大 环多胺类配体及配合物的研究发展较快，尤其是在模拟水解金属酶方面引起了 2 四川大学硕士学位论文 科学家的浓厚兴趣2 ”2 “。本章我们将对大环多胺及其金属配合物对核酸的识别 和仿酶催化作用研搴进展进行概述和讨论。 1 2 1 对核酸化合物的识别 核酸是生命活动最主要的物质基础，d n a 和r n a 中的碱基是生命活动过 程中起至关重要的作用。研究人工核酸酶的主要目的是合成定点切割试剂，定 点切割试剂是由切割系统和识别系统构成。目前已经发展了多种核酸的识别体 系包括：寡聚核苷酸、多肽核酸( p n a ) 、d n a 结合蛋白和多肽、多聚酰胺等。 c y c l e n 的金属配合物广泛的用于d n a 的识别，能识别特殊d n a 系列的小 分子，由于可以用其作基因目标药物而受到了巨大关注。这些药物可能改变 d n a 的局部结构而阻止阻遏物或活性剂的进入，达到调整最终基因的表达程 序的目的。 e i i c h ik i m u r a 在这方面作了很多杰出的工作，尤其是c y c l e n z n ( i i ) 的配合 物与核酸的相互作用作了细致的研究“。他设计的配体分子的结构是模拟自 然界存在的非共价键，如氢键、疏水作用、静电作用等。c y c l e n 的z n ( i i ) 配合 物在中性介质中可以选择性地高效的识别t ，u 及含酰胺官能团的类似物。”。 识别是通过z n 离子和去质子的n 负离子和两个酰胺上的氧和c y c l e n 上的两个 n h 之间的氢键进行的。如图( f i g u r e 2 ) ：在2 5 。c ，= 0 1 0 ，用电势p h 滴定 l a ：x = h 2 0 b ：= 0 h z n 2 + - c y c l e n + 礅鲁 t t ( z n 2 + c y c l e n l f i g u r e 2 测得l o g 酸2 ) - - 4 2 ，其它碱基a ，g ，c 在相同的条件下都不和l 相互作用，所以， 化合物1 是一个能对t ，i j 进行识别的分子，但是其在生理条件下l o - 4 的离解常 数限制了其应用。为了发展能识别多个t ( u ) 的分子，k i m u r a 又继续研究了 3 x & h z 四川大学硕士学位论文 以对二甲苯基为桥连基团的双核和多核的大环多胺锌配合物“”( 如图f i g u r e 3 ，f i g u r e4 ) 。十分有意义的是配合物3 ，4 对t p t ( - - 聚胸腺嘧啶核苷) ，t r t p t ( 三聚胸腺嘧啶核苷) 的识别。每一个c v c l e n z n 2 + 配合物对应一个嘧啶环，在 p h = 7 4 的水溶液中，3 、4 的识别分别发生在i x r n 和n m 浓度。它们是有关多核金 属离子配合物和寡核苷酸可逆相互作用的第一例报道。其结果对于建立为控制 基因表达在d n a 或r n a 的特殊位置能联结连续的胸腺嘧啶和鸟嘧啶核苷酸的 小分子原型有重要的指导意义。 t p t b i s ( ( z n 2 - c y c l e n ) f i g u r e 3 带有一个或两个芳环基团的大环四胺化合物7 的z n ( i d 配合物可以选择性 与天然双螺旋d n a ( 含有1 5 0 个碱基对) 联接，结合发生在a t 富集区域。 这种选择性和结合能力依靠于芳环的兀冗s t a c k i n g 能力和芳环的数目。在 d n a 识别中，z n ( i i ) 是必需的金属离子，它不能被其他金属离子如c u 2 + 或n i 2 + 所取代“。k j i n u r a 等“的研究也证明：带侧臂芳环的z n ( 1 1 ) c y c l e n 配合物可 以通过z i l “亚胺基负离子的形成，有选择性地与单螺旋和双螺旋d n a 或r n a 中t 或u 结合，在断裂d n a 的a _ t 链中扮演分子拉链的功能。化合物8 识别 4 四川大学硕士学位论文 d n a 时位点是连续的t 处，然而葸醌取代的c y c l e n - - z n 2 + 配合物9 识别的位点 是连续的碱基g 处矧，可能是葸醌的氧与鸟嘌呤的n 存在氢键作用。 4 x = y = z = h 2 0 t r i s ( z n 2 + - , c y c l e n ) h t p t p t t p t p t - t r i s ( z n 2 - c y c l e n ) r = hb r = r = 2 凹陆r r 2 凹 8 f i g u r e5 h 9 o = z n 2 + i | 眵 四川大学硕士学位论文 p n a - p a 能够形成管状凝胶体，它能够通过非供价键识别富含a 的寡聚核 苷酸例。 k kc g c a a a - 0 0 - p a l m i t o y l x o r t r r n t - - k 瑚群矿 f i g u r e 6 含有多个n 甲基吡咯( p y ) 、n 一甲基- 3 - 羟基吡咯( i p ) 和n - 甲基咪唑( i l l l ) 单元 以及一个y - 氨基丁酸的多聚酰胺( f i g u r e7 ) 是一类具有细胞穿透性的小分子， 能够识别特定的d n a 碱基序列和调控基因表达该结构通过与双链d n a 的小 沟结合而发挥识别作用。 f i g u r e7 发卡状的寡聚酰胺分子与d n a 的识别 6 四川大学硕士学位论文 s c h n e i d e r 等设计了一个基于三氨乙基胺的三核大环多胺铜配体1 0 洲，它 对核酸有很强的亲和力。研究表明这个配体在中性p h 下形成带电荷的多胺阳 离子，在三个大环单元上分布了6 个酸性的质子。可以和铜形成稳定的三核配 合物。配体和配合物均可以增加双连核酸的稳定性。 八 1 0 h p 弛8 1 2 2 对磷酸酯，磷酸根的识别 d n a 或r n a 核苷之间均由磷酸酯键键连。常把磷酸酯看成d n a 或r n a 的模型物来进行研究。k i m u r a 等”。发现双核配合物1 l 及多核配合物1 2 在 识别磷酸酯时表现出显著的特点。1 2 的t f i m e r i ce f f e c t 对n p p 。( 对硝基苯基磷 酸单酯) 影响比l l 大6 0 倍，1 2 与p p ( 基磷酸单酯) 的亲合常数比l l 大1 0 0 倍。 当然由于磷酸根离子与o h 负离子对z n ( i i ) 的竞争，因而在识别过程中，溶液 p h 值对z n ( i i ) 与磷酸根的亲核作用的影响也极为重要。同样侧链带胍基的化合 物1 3 对n p p 。具有很强的识别能力，p h = 5 5 时，结合常数l ( a = 1 1 0 4 。晶体 结构研究表明单磷酸酯与z n 2 + 结合时，带正电的胍基同时与磷酸根形成氢键或 离子键p “，从而获得额外的稳定。 7 四川大学硕士学位论文 h 1 3 1 2 o = 7 1 2 + 1 4o = z n “ f i g u r e 9 b c n n i s t o n 等人最近合成了带冠醚的化合物1 4 ，两环协同识别h 2 p 0 4 ，形 成夹芯配合物州。并且，k h 2 p 0 4 明显高于n a i l 2 p 0 4 ，其结合常数l ( a ：9 3 2 x 1 0 4 。可能是由于该冠醚对k + 半径的尺寸匹配，其结合力比n a + 强，络合在冠 醚中带正电的c 加强了对带负电的磷酸根的结合。 1 3 大环多胺类金属配合物的酶模拟研究 大环多胺既可以与正电荷的离子发生配合作用，又可以与带负电荷的有机 阴离子发生配合，以主客体配合物形式形成超分子。同时又具有能同客体分 子匹配的空腔。不同数目的连接段等，这样不仅有动力学特征，而且具有合适 的键合位置及功能基团： 一、可以形成配合物的形式与阳离子结合 四川大学硕士学位论文 二、借助氨基的质子化或季胺化状态通过氢键或静电作用识别阴离子。成环氮 原子具有强碱性，故能与h + 形成铵离子形式，较易导入羧基羟基，膦酸基 以及其它亲水基团或功能基团，则可得到一系列水溶性金属配合物配合物。其 中某些金属离子( 如铜、锌等) 的配合物在人体生理条件下表现出很好的稳定性， 因而在药物试剂如在核磁共振诊断( 人体显像) 、x 射线诊断、超声波诊断、放 射性诊断及放射性治疗等方面有潜在的应用前景”。同时在金属离子的分离 和回收方面也有广泛应用”3 。在酶模拟研究中，则主要是应用于羧酸酯、磷酸 酯及核酸的催化水解研究，进而较为深入地阐明酶的作用机制。 1 3 1 磷酸酯的催化水解 磷酸二酯存在核酸结构中，因此常以磷酸二酯键作为核酸模型，对其催化 水解的单核或者多核人工酶的研究大量见诸报道，是生物有机化学研究的主要 课题之一”“。在水解或酯基转移反应中，金属离子有两方面的作用：1 ) 同时 作为酸和碱催化帮，作为l e w i s 酸，金属离子与底物的p o 结合，降低其负电 荷而活化磷中心，同时它们提供一个金属键合的羟基，以利于发生亲核进攻， 因为m o h 2 的l e w i s 酸性随着金属离子的正电荷密度的增加而增加；可以 与离去基团结合而帮助离去基团离去。 m o r r o w 等”“研究了二价或三价金属离子对磷酸二酯化合物h p n p 的催化 酯基转移作用，结果发现金属离子对h p n p 的酯转移作用能力大小顺序为；t b 3 + o d 3 + y b 3 +e u 3 + n d 3 + p b 2 + l u 3 + l a 3 + c u 2 + z n 2 + c 0 2 + m n 2 + n i “ m 9 2 + c a 2 + 。最近m o s s 等研究发现四价金属离子对h p n p 催化水解比 二价或三价金属离子更好，其顺序大小为：c e “ 矿 n ， h f 4 + ”。金属离 子对h p n p 的催化是因为二齿鳌合中间体1 5 的形成。 大环化合物与镧系金属离子有较大的结合常数1 。化合物1 6 是一类侧链 带有亲核性羟基的大环四胺化合物，它们与镧系中l a j + 、e u “、l u “形成1 ：1 的配合物，对h p n p 的水解有较大催化作用”“。同其他e u “等大环配合物”“ 相比较，配合物e u “1 7 a ，t h “1 7 b ”“是属于比较强的l e w i s 酸，它们对h p n p 的催化水解结果表明，在相似条件下比其他镧系三价离子大环配合物更为有 效，水解速率有显著提高。 9 四川大学硕士学位论文 1 5 o ) m n + 1 6 ，撩蹦蒜掣2 n 哟 c 一洲善o n c t 寸慨 h p n p f i g u r e1 0 最近研究还表明磷酸二酯和金属配合物的反应活性不仅与离去基团的活 性有关，而且磷酸二酯不同其反应机制亦不同”。同时，还发现一些有荧光性 的镧系金属配合物对h p n p 的水解有催化作用”1 。 s c h n e i d e r 等”的研究表明，多羟基化合物的存在可使催化水解活性提高， 例如化合物1 8 的存在，可使b n p p 水解反应速率常数提高1 4 x1 0 6 倍。 对于配体及配体中羟基的作用，t o n e l l a t o 经过研究后确认，配体与金属离 子配位后，羟基变为氧负离子，氧负离子首先进攻活性中心而进行酰基转移反 应”“。c h i n 等”比较了化合物1 9 与c u ( i i ) 形成的配合物对b d n p p 的催化水 解活性，发现其催化活性大小顺序为：1 9 c 1 9 b 1 9 a ，这也证明配体中的侧 链o h 对催化水解起到重要作用。当o h 与n 原子相隔距离不同时，其催化活 性也有较大差异，催化机制也不尽相同。1 9 a 裂解磷酸二酯是通过直接水解， 1 9 b 主要通过水解，但也有部分酯基转移，1 9 c 主要通过酯基转移作用水解。 而五价磷的水解和酯基转移作用明显的不同在于后者为分子内亲核进攻”。一 个简单的侧链带有羟基的金属配合物通过酯基转移作用裂解磷酸二酯比碱性 磷脂酶有效。 四j 1 i 大学磺学位论文 1 8 ( 刚g 书一。 a ：r = h 1 9 b ：r = ( e l l 2 ) 2 0 h c ：r = ( c h 2 ) o h b d n p p k i m u r a 等“报道了一个z n ( i i ) 与侧链带有o h 的大环多胺配合物2 0 对 b n p p 的催化水解，发现比用2 l 。催化活性有显著提高。通过实验还发现磷酰 基转移在无水d m f 中比水中要快得多，并且证实2 2 对n e p 的分子内水解比 2 1 的7 3 ( 1 1 ) o h 对n e p 。分子内水解要快得多。这也说明了配体中侧链o h 存在 对水解反应的重要影响，这也可以作为在碱性磷脂酶( a _ p ) 之中s e r 1 0 2 和z n 2 + 离子共同作用的一个新的阐述。 h h n e p f i g u r e1 2 纠p 四川大学硕士学位论文 双核金属配合物催化水解磷酸酯的t u r n o v e r 数大多高于单核配合物，这是 因为：双金属离子中心可提供双倍的路易斯酸、碱作用，有效地降低底物中心 原子的电荷密度，使之更有利于亲和试剂的进攻，并可通过催化中心的协同作 用加速过渡态中间体的形成，同是促进离去基团的离去，配体的刚性、双核之 问的距离、金属离子与配体原子的结合方式及空间构型等几种因素相互制约， 共同决定了配合物对底物的选择性识别及结合。 b r e s l o w 小组合成了以不同间隔基桥联的配体2 3 ，发现桥臂较短的配合物 2 3 a - z n 2 和2 3 b z n 2 选择性水解单酯n p p ( 磷酸对硝基苯酯) ；而较长的联苯基 桥连的配合物2 3 c - z n 2 对二酯b n p p ( 磷酸双( 对硝基苯) 酯) ；h p n r r 磷酸( 1 3 一羟基- 丙基对硝基苯) 酯 ，u p u 尿( 嘧啶核) 苷3 ，5 - 尿苷】催化水解速度约 为相应的单核配合物的1 0 倍。含五个碳原子的柔性长链的配合物2 3 d z n 2 催 化效果极差，磷酸单酯和二酯的不同催化水解机理要求配体活性金属中心具有 适当的间距。水解n p p 时，双金属锌离子分别与底物的两个氧原子结合，并 促使桥连的羟基作为亲核试剂进攻中心p 原子( f i g u r e1 4 ) ，因此，金属金属 间距较短的配合物更适于与空间位阻较小但碱性更大的磷酸单酯配位；而 b n p p 只与配合物的一个金属离子配位， 同时受到键合在另一个z n ( i i ) 上的羟 基的亲核进攻而水解( f i g u r e1 4 ) ，故要求配体分子有一定的柔性和包容性畸“。 f i g u r e1 3 1 2 帅：u o ：舡 c o ( i i ) n i ( i i ) - - 一c u ( i i ) 。 2 8r = c h 2 c h 2 0 c h 2 c h 3 f i g u r e1 6 设计生理条件下有效的人工催化剂最重要的是提高金属中心的催化活性。 可以采用改变微环境的办法加强金属中心的内在活性。胶束能够提供一个类似 于酶的疏水性微环境m 1 。将金属酶的一个简单模型引入胶束体系中，利用金属 1 4 四川大学硬士学证论文 离子的特殊作用催化水解反应进行，而胶束体系所具有的疏水性微环境则对底 物有包络作用。将z n ( m 与非表面活性剂配体形成的配合物2 9 ，同 t r i t o n x 1 0 0 ( c a p s 中1 形成的混合胶束体系中的催化性能与3 0 相比较，发现催 化b n p p 时，前者快2 0 倍蚓。这是由于在胶束体系中，有利于超分子聚集的 缘故。 l 粥一 、 2 9 a r = h 2 0 b r = o h 3 0 ：京o h h 2 0 f i g e r = 1 7 在酶底物体系中，极化作用例如底物和酶之间的氢键，偶极作用，静电 作用，都非常有利于过渡态的稳定性。这些极化作用由于因为酶的疏水微环境 得到加强。假如催化中心的微环境得到改进，那么金属配合物的水解活性就会 增加。在水中得到疏水的微环境的最容易的方法是把催化中心连接到一个高分 子上。在此基础上，s u h 把c u c y c l e n 连接到p c d 树脂上，发现其水解活性显 著增加。”。他后来又设计合成了连在树脂上的含c u c y c l e n 的不同配合物 3 1 - 3 7 ，其水解活性都很高。 h厂-一、h x 妨o hr一h 寸 2鹱 h n 四川大学硕士学链论文 h h 1 6 o 八 四j h 大学硕士学位论文 l r i g u 聆1 8 1 3 2d n a 、r n a 的水解或裂解 j 核酸是生命活动最主要的物质基础。d n a 和r n a 在生命过程中起着极为 重要的作用。在自然界中有很多具有水解功能的金属酶，它们能水解蛋白质， 磷脂，d n a 、r n a 等重要的生命物质。由于此类酶的结构复杂，稳定性差， 因此仿酶研究为研究生命过程提供了广泛的可行性。对于d n a 、r n a 进行催 化水解或裂解已成为当前最为活跃的领域之1 。“，进入2 0 世纪9 0 年代以 来，有关d n a 、r n a 的水解或裂解研究取得较大成功。 d n a 的水解或裂解 d n a 有较高水解稳定性是由于在磷酸二酯骨架和潜在的亲核试剂之间的 排斥作用造成的，因此对于d n a 的水解或裂解的研究主要集中于对d n a 中 的磷酯键的水解。用金属离子如z n ( i i ) ，n i ( i i ) ，c d ( i i ) ，c a 0 d 等的配合物对 d n a 进行裂解早已被证实了“。”。核苷酸中的磷酸基团、糖部份、碱基残 基可以和金属离子结合，它们和金属离子的反应在很大程度上取决于形成的核 苷酸金属离子配合物的稳定性”。 含有更易被还原的基团或离子的配合物是d n a 等最有效的裂解试剂。将 葸环引入c o ( i i i ) 笼形配合物中，形成的亲水性配合物阳离子3 8 ，因为它能与 d n a 带负电荷的磷酸二酯骨架间发生静电相互作用，提高了与d n a 的结合能 力，从而更有利于d n a 水解或裂解”。 考了 hn。、制h够。 四川大学硕士学位论文 h 厂hl 。 邺一 h 1 冱i 】 h h 0 r = c 富n n c 3 oo。o ( c h 2 ) n n ( c h 3 ) 2 ( c h 2 ) n ( c h 九 册 3 9 啪1 9 在配合物中带正电荷的侧链能提高催化活性吲，如化合物3 9 对于d n a 的水解在很短时间内( 2 h ) “完成。季胺盐的静电作用加强了- q 带负电的磷酸根 结合，大大提高了b n p p n p p ，d n a 的催化水解能力。 高分子负载的大环多胺的c + 配合物与p u c1 8d n a 在3 t c 充分混和，3h 后7 0 的超螺旋结构变为开链环状结构，比没负载的快了2 0 0 倍。而且对于难 以水解的线性双螺旋也有很好的催化作用。这可能是由于高分子链上有多个活 性单元，与d n a ；卣更强的结合力。 n h 州人 = 一一 f i g u r e2 0 s c h n e i d e r 等l 6 8 3 研究了大环多胺4 1 、4 2 的c u ( i i ) l 鸵合物与质粒d n a 及 b n p p 水解情况，结果表明：c u ( 1 i ) - 4 1 在2 h 后，质粒d n a 的f o r ml 有5 2 被裂解，c o ( i i ) 一4 2 有5 6 f o r mi 被裂解。该裂解反应受到c u 2 + 与配体l 比例 的影响很大，当c u 2 + ：l = 2 ：1 时，4 2 在水解d n a 或b n p p 的活性提高达8 0 。 这说明双核配合物中，两个金属离子中心的协同作用对d n a 裂解也是十分重 要的。 二氯1 ，4 ，7 一三氮杂环壬烷的c u ( i i ) 配合物【c u ( i i ) 【9 】柚e n 3 a 2 】能有效的裂解 单螺旋( m 1 3 d n a ) 和双螺旋d n a ( 质粒d n a ) 。s e r g e s o n 等证明了用c o ( i i i ) 1 8 p h n n i h 如a ? 四j l l 大学硬士学位论文 的配合物的确能导致d n a 的有效水解或裂解，如c o ( n 1 ) 的c y c l e n 配合物水解 d n a 比e u ( i 田配合物有效7 。 f i g u r e2 1 将大环多胺与肽连接形成的4 3 ，其双核z i i ( i i ) 配合物不仅能有效的水解 d n a 的模型物h n p p 7 1 ，而且由于两个金属中心与d n a 中相邻的磷酸酯基 团之间的匹配，其水解d n a 的活性比单核配合物4 4 z n ( i i ) 高2 0 7 1 “。并且 多肤的胺基保护基具有芳环结构时比游离的胺基或者乙酰基都要好，这说明结 合能力越强，水解速度越快。 4 3 4 4 f i g u r e2 2 1 9 四川大学硕士学位论文 如何使d n a 在温和情况下，用低浓度的人工合成配合物对其进行水解是 一个十分重要的研究方向。b a n o n 掣7 2 1 在这方面的研究取得了一定成效，他们 用异双核配合物4 4 【r h ( p h i ) ：z b p y - 肽( r h p ) 】催化水解d n a ，表明铑插入剂将反 应活性的锌肽传送到d n a 螺旋上的作用，使用低分子浓度( 如5 吣i ) 的配合物 就可以有效的水解d n a 。 f i g u r e2 3 赵玉芬的研究小组发现，丝组二肽( s e r - h i s ) 可在中性条件下通过水解方 式切割线型和超螺旋型的d n a “，切割产生的d n a 碎片可以经t 4 连接酶连 成较大的片段。这是迄今为止第一例不含金属离子的d n a 水解型人工切割试 剂。研究证实，丝组二肽所含的n - 端胺基、羟基是具有切割活性的必需基团， 而羧基则不是，咪唑基的存在虽非必需，但却可以提高其切割活性。有趣的是， 与丝组二肽十分相似的组丝二肽对d n a 没有切割活性，可见丝组二肽中各基 团的相互位置对是否具有切割活性有重要影响。 r n a 的水解或裂解 酯基转移反应中，对r n a 的选择性高于d n a “”，对通过酯基转移裂解 r n a 的研究集中于多齿配体金属配合物的使用上“。多齿配体的功能为：既 可以调节催化裂解的金属离子效率和在溶液中保持金属离子以防止金属离子 氢氧化物沉淀或金属核苷酸化合物的形成，也可以使金属离子催化剂更好的与 核酸结合。大环多胺就属于这类多齿配体，选用它们的金属配合物来水解r n a 是十分合适的。 四川大学硕士学位论文 4 5 4 6 毒目掰描孙 州眦) 4 7 f i g u r e2 4 钙的镧系离子对r n a 水解，其活性大小顺序为：n ( i v ) l a ( i i d “”。化 合物嘶及4 7 的e u ( h i ) 配合物，可以在生理条件下，有效裂解r n a 。外加金 属离子对大环多胺配合物的催化活性有较大影响，如在z n ( y 0 3 ) 存在下， e u ( i i i ) 4 5 的催化活性提高1 5 倍。四羟基c y c l e n - - e u 化合物4 8 在3 7 ， 4 h 内使m e s s a g er n a 完全断裂”。 九肽链接的大环多胺4 9 在室温，p h 中性条件下选择性切割h i v 的转移 r n a “，发现有e u o n ) 参加反而不如没e u ( u i ) 的效果好。九肽简化为酪氨酸的 衍生物5 0 选择性地切割r n a 的非配对尿苷。与寡聚核苷酸链接的化合物5 l 对r n a 切割具有选择性，且速度比纯粹的1 ，5 ，9 一三氮杂十二烷z n “配合物 快1 0 0 倍”“。这是一种将识别体系与催化体系组合提高选择性和催化活性的有 效方法。 蒋紫h 以鬈k h 、 ：h n h r k k r r q r 舳 4 0 秘 四川大学硕士学位论文 h 5 0 f i g u r e2 5 0 h hh c c g g a c a m o 一 一厂v n 、川 o0 5 1 f i g u r e 2 6 。 综上所述，通过对模型物的巧妙设计，某些配体及金属配合物对磷酸酯、 d n a 、r n a 的催化水解加速能力己接近酶分子，可以实现通常化学方法难以 完成的反应。开展对磷酸酯、d n a 等水解酶的研究，不仅对于阐明酶催化作 用机制，揭示生命活动过程中的基本规律具有重要意义，而且也是开发新的催 化剂的有效途径之一。 单核或多核大环多胺金属配合物对于天然水解酶活性金属中心机制的研究 有着重要的理论意义，并在d n a 、r n a 定点断裂、核酸结构功能探针、作用 于基因表达水平的高效新型药物的设计合成、有毒磷酸酯裂解功能材料的开发 等方面有广阔的应用前景。进一步研究将集中于新型配体的开发、多金属离子 活性中心的作用等方面。 1 4 核酸的水解机理 目前的切割系统按照切割机理主要分为自由基型、磷酸酯水解型和消除型 三大类( 8 引。按自由基机理切割核酸的试剂都能产生某种自由基进攻核酸的糖 环或是碱基，夺取氢原子而导致其氧化破坏，进而使核酸链发生断裂 8 3 。由 四川大学硕士学位论文 于产生的自由基的体积往往很小且易于扩散，故这类切割试剂常常可以用作性 能良好的足迹试剂。不过这类试剂也存在着较多的缺点：a 切割产生的碎片的 末端结构不同于酶解产生的末端结构，因此它们不能再利用连接酶连接而很难 被进一步利用；b 由于这类试剂产生的自由基很容易扩散，会在多个位点造成 切割，因此用这类试剂作切割系统的定点切割试剂的序列专一性会受到影响； e 自由基对生物活性有毒副作用，因而无论是用于活体细胞内的研究还是作为 药用都是不利的；d 往往需要具有氧化还原活性的辅助因子，增加了体系的复 杂性。 1 4 1 以水解机理切割核酸的试剂 水解机理是切割试剂提供某种亲核试剂进攻磷原子，发生亲核取代反应使 核酸水解。由于水解机理是通过磷酸二酯键的断裂而实现对核酸的切割，与天 然的核酸酶相似，不会导致碱基和糖环的破坏，没有自由基机理的种种缺陷。 水解型的切割系统一般都可以提供某种亲核基团( 如羟基) 。对r n a 而 言，往往是切割试剂促使2 - o h 脱质子化形成2 0 + ，然后它进攻连在3 - 位上 的磷原子，从而发生分子内酯基转移反应形成2 ，3 环磷酸酯，同时使得r n a 断裂；而对d n a 而言，则往往是切割试剂直接提供某种亲核基团进攻磷原子， 从而发生亲核取代反应而使d n a 水解。 水解型切割试剂相比于自由基型切割试剂而言有许多优点：a 其对核酸 的切割与天然的核酸酶相似，生成的碎片具有3 或5 磷酸末端，且碱基和戊 糖环不会被破坏，可以用连接酶连接起来而进一步加以利用：b 这类试剂不产 生易扩散的自由基，因此有利于合成具有高度序列专一性的定点切割试剂；c 不需要具有氧化还原活性的辅助因子，对生物体毒害较小。鉴于水解型切割试 剂的上述优点，它可以作为定点切割试剂最佳的切割系统。 1 4 2 以消除机理切割核酸的试剂 消除型的切割系统目前只发现了两例，分别为赖色赖三肽和赖酪赖三肽。 它们可以识别d n a 中的脱碱基部位，并在该部位产生切口，其机理为反式消 除。这类试剂相当少，不具有普遍性。 四川大学硕士学位论文 1 4 3 以氧化机理切割核酸的试剂 这类切割方式，顾名思义，就是通过氧化还原的方式使d n a 发生断裂，形 成小的碎片。通常需要对体系中加入氧化还原性辅助物质，从而造成d n a 发生 断裂。比如，加入h 2 0 z 等。这类切割方式，通常会对d n a 的糖环或者磷酸末端 发生破坏，使得所得的碎片不能够得到再利用。 j ac o w a n 。等研究了两个c u 肽结合的化合物【g g h c u 】 k g h k - c u + 与双螺旋d n a 的相互作用，发现其切割机理属氧化切割，其动力学属二级动力 学。 g g h c u k g h k 。c u f c h 2 h n h 3 + n 驴抛2 7 高志建8 5 3 等研究了如下( f i g i l r e2 8 ) 三铜配合物能在h 2 0 2 - 抗坏血酸的存在 下有效切割d n a , 切割活性依次增加。 f i g u r e2 8 根据所需要断裂的核酸底物适当选择识别系统和切割系统，并将它们进行 组装可获得具有预设计性能的核酸定点断裂工具。目前在三大类人工核酸切割 试剂中，自由基型的最多，水解型的相对较少，尤其是d n a 才( 解型切割试剂。 研究并发展以水解方式断裂核酸的人工核酸切割试剂是今后研究的一个重要 方向。水解型切割试剂虽然较自由基型的人工核酸切割试剂有诸多优点，是合 成定点切割试剂的最佳切割系统，但其活性普遍不高，与天然的核酸酶相去甚 2 4 四川大学硕士学位论文 远，进一步提高定点切割试剂的活性和专一性是今后研究的方向之一。 1 5 本论文的设计思想 近2 0 年来，人工核酸切割试剂的研究一直是生物化学和分子生物学等学 科中最为活跃的前沿领域之一。所谓核酸切割，就是通过化学反应将长链的核 酸分子( 包括核糖核酸和脱氧核糖核酸) 断裂成较短的碎片。d n a 上的磷酯 健是相当稳定的，在p h = 7 0 ，3 06 c 的条件下其寿命为2 千万年，它的寿命是相 当长的。因此寻找有效的化学核酸酶成为研究的热点，而化学核酸酶可以模拟 天然酶催化d n a 的水解裂解。 近年来有关双核金属配合物切割d n a 的报道越来越多。实际上，许多天 然的磷酸酶就需要两个甚至多个金属离子活化才能发挥催化效果”。研究表 明，双核金属离子配合物的催化活性比相应的单核配合物要高，这是因为双核 配合物中两个金属离子可以产生协同效应，共同催化核酸底物的水解。非天然 氨基酸、多肽的合成已成为人们关注的热点，它们在金属肽”“、金属蛋白设计 s s l 和研究多肽的电子转移1 方面起着重要的作用。c y c l e n 能结合许多金属离 子，并且具有结合力强和热力学稳定等优点。多肽结构丰富，且小分子肽价廉 易得，因此通过多肽与c y c l e n 连接，构建特异催化活性的功能分子将会具有 很大潜力。s u h 等已报c y c l c