医学分子遗传学研究技术PPT课件.ppt

医学遗传学,医学分子遗传学研究技术TechniquesofMedicalMolecularGenetics,重组DNA技术分子杂交PCR技术及应用基因定位基因克隆,重组DNA技术过程包括构建，转化，扩增(克隆)，分离和检测等步骤。,第一节重组DNA,重组DNA技术(recombinationDNAtechnique)：将目的DNA片段或人工合成的基因，通过运载体在体外重组、转移并插入到另一种生物的基因组中，使其表达为新的性状或用于进一步的研究。也称基因工程(geneticengineering)，是基因操作的核心技术。包括DNA克隆(DNAcloning)和分子杂交(molecularhybridization)。,重组DNA技术流程简图,restrictionendonuclease,重组DNA技术流程简图,ligase,重组DNA技术流程简图,vector,restrictionendonuclease,ligase,重组DNA技术流程简图,vector,restrictionendonuclease,重组DNA,DNA克隆(DNAclone),重组DNA,基因组文库(genomiclibrary),染色体特异的基因文库(chromosomespecificlibrary),DNA克隆(DNAclone),cDNA文库(cDNAlibrary),重组DNA,基因组文库(genomiclibrary),染色体特异的基因文库(chromosomespecificlibrary),DNA克隆(DNAclone),cDNA文库(cDNAlibrary),基因转移(genetransfer),胚胎干细胞(embryonicstemcell，EScell),转基因动物(transgenicanimal),基因剔除小鼠(geneknockoutmouse),重组DNA,同源双链(homoduplex),异源双链(heteroduplex),第二节分子杂交,一、分子杂交的原理,核酸分子杂交(molecularhybridization)指不同来源的两条核酸单链，在一定条件下形成双链分子的过程。DNA杂交RNA/DNA杂交,（一）探针的制备和应用,探针(probe)：分子杂交检测其互补序列的标记DNA或RNA序列，能在许多DNA或RNA序列的复杂混合物中识别所需克隆的分子。,DNA探针(DNAprobe),二、分子杂交探针,RNA探针(RNAprobe)寡核苷酸探针(oligonucleotideprobe),简并探针(degenerateprobe),ATG,（一）探针的制备和应用,二、分子杂交探针,单一EST探针(uniqueEST-baseprobe),（一）探针的制备和应用,二、分子杂交探针,探针(probe)：分子杂交检测其互补序列的标记DNA或RNA序列，能在许多DNA或RNA序列的复杂混合物中识别所需克隆的分子。,DNA探针(DNAprobe),RNA探针(RNAprobe)寡核苷酸探针(oligonucleotideprobe),32P，35S，3H,地高辛生物素,同位素标记,(二)探针的标记及方法,非同位素标记,二、分子杂交探针,缺口平移法(nicktranslation),(二)探针的标记及方法,二、分子杂交探针,缺口平移法,胰DNA酶,DNA聚合酶,dATPdCTPdGTPdTTP,dATPdCTPdGTPdTTP,缺口平移法,dATPdCTPdGTPdTTP,缺口平移法,pApCpGpTpTpApGpGpApCpTpGpTpTpApCpCpGpApT,pTpGpCpApApTpGpCpCpTpGpApCpApApTpGpGpCpTpA,dCMP,dATPdCTPdGTPdTTP,缺口平移法,pApCpGpTpTpApGpGpApCpTpGpTpTpApCpCpGpApT,pTpGpCpApApTpGpCpCpTpGpApCpApApTpGpGpCpTpA,pC,dATPdCTPdGTPdTTP,缺口平移法,pApCpGpTpTpApCpGpGpApCpTpGpTpTpApCpCpGpApT,pTpGpCpApApTpGpCpCpTpGpApCpApApTpGpGpCpTpA,dATPdCTPdGTPdTTP,DNA聚合酶,缺口平移法,缺口平移法(nicktranslation),随机引物延伸法(random-primedlabeling),末端标记法PCR标记法,(二)探针的标记及方法,二、分子杂交探针,随机引物延伸法,dATPdCTPdGTPdTTP,Klenow,Klenow,Klenow,随机引物延伸法,（一）点印迹(dot-blot)法,1.dotandslothybridization,2.allele-specificoligonucleotide(ASO)hybridization,三、分子杂交的常用方法,（一）点印迹(dot-blot)法,1.dotandslothybridization,2.allele-specificoligonucleotide(ASO)hybridization,三、分子杂交的常用方法,（二）Southern印迹(Southernblot),（一）点印迹(dot-blot)法,三、分子杂交的常用方法,Southernblot,Southernblot,镰状细胞贫血(HbS)：第57位密码子,A：CCTGAGGAGS：CCTGTGGAG,Mst：CCTNAGG,Southernblot,A：CCTGAGGAGS：CCTGTGGAG,镰状细胞贫血(HbS)：第57位密码子,Southernblot,（三）Northern印迹(Northernblot),（四）Western印迹(Westernblot),免疫印迹(immunoblotting),（二）Southern印迹(Southernblot),（一）点印迹(dot-blot)法,三、分子杂交的常用方法,Westernblot,PAP复合物,ABC复合物,Westernblot,第三节聚合酶链反应PolymeraseChainReaction(PCR),KaryB.Mullis,KaryB.Mullis,TheNobelPrizeinChemistry1993,forhisinventionofthepolymerasechainreaction(PCR)method,第三节聚合酶链反应PolymeraseChainReaction(PCR),第三节聚合酶链反应PolymeraseChainReaction(PCR),1.templateDNA,2.primers,3.TaqDNApolymerase(Thermusaquaticus),4.Mg,5.dNTPs,第三节聚合酶链反应PolymeraseChainReaction(PCR),1.简单快速,2.灵敏,3.稳定可靠,1.需要靶序列的信息,2.产物较短,3.DNA复制的不精确性,4.假阳性,优点,缺点,第三节聚合酶链反应PolymeraseChainReaction(PCR),限制性内切核酸酶,限制酶：能够识别DNA链的特定部位并能进行切割。,发现于原核生物，几乎所有的原核生物都含有限制酶。现已分离出100多种。,重组DNA技术最常用的是型限制性内切核酸酶。它们能够识别并切割DNA链上小而特异的核苷酸序列，一般为4bp8bp。,型限制酶的识别序列一般都是回文序列，限制酶切割DNA可产生两种切割末端：平末端(bluntend)和粘性末端(stickyend)。,5CTGCAG33GACGTC5,5GGATCC33CCTAGG5,5GATC33CTAG5,5GGCC33CCGG5,Hae,Mbo,BamH,Pst,限制性内切核酸酶,Back,进行DNA重组，需要载体DNA和外源DNA具有相同序列的粘性末端。,1.使用相同的限制酶,2.使用识别相同靶序列的不同限制酶,3.使用识别不同序列，但能产生一致粘性末端的限制酶,限制性内切核酸酶,运载体,运载体(Vector)是能将外源目的DNA导入受体细胞，并可自我复制和增殖的工具。,1.分子量小，便于和较大的DNA片段结合，并能进入宿主细胞并在其中复制。,2.有多种限制酶切位点，各种限制酶只有单一切点。,3.载体DNA插入外源DNA片段，不影响其复制能力；有可供选择的标记基因(如抗药基因)或报道基因。,4.克隆载体上要有复制起点，表达载体上应有启动子。,运载体,1.插入型&置换型,2.克隆载体&表达载体,运载体(Vector)是能将外源目的DNA导入受体细胞，并可自我复制和增殖的工具。,运载体,一、质粒(plasmid),：是存在于许多细菌中，独立于染色体外的双链闭环DNA分子。,pUC192686bp,运载体,二、噬菌体(Lambdaphage)&粘粒(cosmid),是一种可在体外包装的细胞病毒，能高效感染细菌细胞并在其中克隆中等长度的DNA片段的载体。,噬菌体DNA长约50kb，为线性双链DNA分子，每条链各带有12bp长的单链互补末端，称为cos序列，进入宿主细胞后，通过粘性末端的配对而环化。,噬菌体有两种方式裂解(lytic)和溶源(lysogenic)进入细胞。,运载体,粘粒是将质粒和噬菌体改建的一种载体。,cosmid只含有噬菌体的复制起点，抗性标记(来自质粒)以及cos粘性末端，多用于构建高等生物的基因文库。,二、噬菌体(Lambdaphage)&粘粒(cosmid),运载体,三、大片段DNA克隆载体,1.P1噬菌体和PAC,2.细菌人工染色体(bacterialartificialchromosome，BAC),3.酵母人工染色体(yeastartificialchromosome，YAC),着丝粒有丝分裂的姊妹染色单体和减数分裂的同源染色体分离所必须；,端粒染色体完全复制和防护染色体末端不被核酸酶水解所必须,自主复制序列(ARS)元件染色体DNA自我复制所必须的复制起点,构建一个YAC需要4个短序列，即2个端粒、1个着丝粒和1个ARS元件，并将适当大小的外源DNA连接成一个线性分子。,运载体,各种克隆载体及其可插入DNA的大小,Back,基因定位(genemapping)：利用一定的方法将一个基因确定到染色体上的实际位置上。,1911年，Wilson将红绿色盲基因定位到X染色体,1968年，Duffy血型基因定位于1号染色体,第四节基因定位,基因定位(genemapping)：利用一定的方法将一个基因确定到染色体上的实际位置上。,基因克隆(genecloning)：用一定的方法把不同位点上的基因分离出来。,连锁分析(linkageanalysis)：利用被定位的基因与在同一染色体上另一遗传座位相连锁的特点，将该基因定位在某一染色体或染色体某一区带上。,一、连锁分析在基因定位中的作用,连锁分析(linkageanalysis)：利用被定位的基因与在同一染色体上另一遗传座位相连锁的特点，将该基因定位在某一染色体或染色体某一区带上。,一、连锁分析在基因定位中的作用,连锁分析(linkageanalysis)：利用被定位的基因与在同一染色体上另一遗传座位相连锁的特点，将该基因定位在某一染色体或染色体某一区带上。,一、连锁分析在基因定位中的作用,连锁分析(linkageanalysis)：利用被定位的基因与在同一染色体上另一遗传座位相连锁的特点，将该基因定位在某一染色体或染色体某一区带上。,重组值(recombinationfraction)：是基因定位时两个基因间遗传图距的量度，即基因间的遗传距离。,如果两个基因之间有1的重组值，其遗传图的距离就是1厘摩(centimorgan，cM)。,一、连锁分析在基因定位中的作用,遗传标记(geneticmarker)：基因定位是确定某一基因在染色体上的未知位置，用连锁分析法进行基因定位需要一些遗传位点，这些位点应按孟德尔方式遗传，且具有多态性以显示其连锁关系，这些标记位点称为遗传标记。,连锁分析(linkageanalysis)：利用被定位的基因与在同一染色体上另一遗传座位相连锁的特点，将该基因定位在某一染色体或染色体某一区带上。,一、连锁分析在基因定位中的作用,一、连锁分析在基因定位中的作用,一、连锁分析在基因定位中的作用,一、连锁分析在基因定位中的作用,一、连锁分析在基因定位中的作用,Lod法,Lod(logarithmoftheodds)，是Morton在1955年提出的优势对数法。,Lod分值为3，连锁:不连锁1000:1，表示连锁存在,Lod分值为2，不连锁:连锁100:1，表示连锁不存在,一、连锁分析在基因定位中的作用,多点连锁定位(multipointlinkagemapping),利用三点交叉法(threepointcrosses)，可将某一致病基因定位于遗传标记的框架内，更精确的进行基因定位。,一、连锁分析在基因定位中的作用,多点连锁定位(multipointlinkagemapping),一、连锁分析在基因定位中的作用,二、体细胞杂交与基因定位,体细胞杂交(somaticcellhybridization)：又称细胞融合(cellfusion)，是将两个同种和/或不同种的细胞融合成一个新细胞，即杂种细胞(hybridcell)。,病毒诱导的细胞融合仙台病毒,化学融合技术聚乙二醇(PEG)电融合技术电穿孔法,细胞融合,二、体细胞杂交与基因定位,细胞融合,二、体细胞杂交与基因定位,细胞融合,二、体细胞杂交与基因定位,两个同种的动物细胞融合后形成的杂种细胞，细胞核一般保留双亲的染色体；不同种动物的细胞融合后，细胞核含有双亲的的染色体，但随着增殖传代的过程，会出现保留一方染色体，另一方染色体逐渐丢失的现象。,二、体细胞杂交与基因定位,二、体细胞杂交与基因定位,HAT选择系统1962年，利用缺乏HPRT酶为遗传标记的人突变细胞株发展起来的HPRT系统；1964年，加入缺乏TK(胸苷激酶)的小鼠细胞株TK系统，结合发展为HAT系统。,二、体细胞杂交与基因定位,HAT选择系统H：次黄嘌呤(Hypoxanthine)A：氨基喋呤(Aminopterin)T：胸腺嘧啶(Thymidine),氨基喋呤阻断DNA合成；融合细胞中含有TK和HPRT，可使次黄嘌呤转变为次黄核苷酸，鸟嘌呤转变为鸟苷酸。,二、体细胞杂交与基因定位,杂种细胞的选择和分离,二、体细胞杂交与基因定位,杂种细胞的选择和分离,二、体细胞杂交与基因定位,基因产物的检测与染色体定位,TK：17号染色体,二、体细胞杂交与基因定位,基因产物的检测与染色体定位,二、体细胞杂交与基因定位,微细胞融合(microcellfusion),染色体畸变和区域定位(regionalassignment),二、体细胞杂交与基因定位,三、原位杂交和荧光原位杂交,原位杂交(InSiteHybridization，ISH)：利用同位素标记的DNA探针，与玻片上的中期染色体进行杂交。是一种直接进行基因定位的方法。,荧光原位杂交(FISH)：用特殊的荧光素标记DNA探针，与玻片上的染色体或细胞组织标本进行杂交。,三、原位杂交和荧光原位杂交,三、原位杂交和荧光原位杂交,四、放射杂种,放射杂种(radiationhybrid)：用含有辐射切割的人类染色体片段的细胞与啮齿类细胞融合产生的杂种克隆细胞，是体细胞杂种的另一种类型。,1975年，Goss和Harris提出,1990年，Cox构建单染色体杂种细胞,1994年，Walter建立全基因组放射杂种,四、放射杂种,四、放射杂种,Genebridge4radiationdose:3,000Radsnumberofhybrids:93averagefragmentsize:10Mb,HumanWhole-GenomePanels,StanfordG3radiationdose:10,000Radsnumberofhybrids:83averagefragmentsize:4Mb,StanfordTNG4(TheNextGeneration)radiationdose:50,000Radsnumberofhybrids:90averagefragmentsize:800kb,四、放射杂种,/,10000100000000001000001000000000100000000000000001000000000000000000000010001000000,10000100000000001000001000000000100000000000000001000000000000000000000010001000000,四、放射杂种,第五节基因克隆