（微生物学专业论文）壳聚糖接枝双醛淀粉固定化黑曲霉木聚糖酶的研究.pdf

河南农业大学学位论文独创性声明、使用授权及知识产权归属承诺书 学位论 壳聚糖接枝双醛淀粉固定化黑曲霉学位 文题目 木聚糖酶的研究级别 理学硕士 学生 吕帅 学科 导师 姓名专业 微生物学陈红歌 姓名 学位论文 如需保密，解密时间年月日 是否保密 独创性声明 本人呈交论文是在导师指导下进行的研究工作及取得研究成果，除了文中 特别加以标注和致谢的地方外，文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成 果，也不包括为获得河南农业大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材 料，指导教师对此进行了审定。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献 均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意。 特此声明。 研究生签名：吕帅导师签名：7 聋办承 日期：弘司年口e 月f 口日日期：阳存钼厂彦日 i 学位论文使用授权及知识产权归属承诺 本人完全了解河南农业大学关于保存、使用学位论文的规定，即学生必须 按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存提交论文的印 刷本和电子版本，并提供目录检索和阅览服务，可以采用影印、缩印或扫描等 复制手段保存、汇编学位论文。本人同意河南农业大学可以用不同方式在不同 媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。 本人完全了解河南农业大学知识产权保护办法的有关规定，在毕业离 开河南农业大学后，就在校期间从事的科研工作发表的所有论文，第一署名单 位为河南农业大学，试验材料、原始数据、申报的专利等知识产权均归河南农 业大学所有，否则，承担相应的法律责任。 注：保密学位论文在解密后适用于本授权书。 宇吴 研究生签名：昌，) 中 导师签名：7 蓐、彳2 秀发学院领导签名： 印建 日期7 年p 加f 。日日期：2 p 哆车彭角d 日日期五唧年月口日 致谢 本文是在导师陈红歌副教授的悉心指导下完成的，从论文的选题、试验设 计、论文的构思到语言的修善，都给予了精心的指导。导师宽于待人的高尚品 格，忘我的工作作风，严谨的治学态度，敏锐的思维，渊博的学识使我受益终 身，也是我永远学习的榜样。三年来，恩师对我的培养倾注了大量的心血，谨 此对恩师的教诲表示衷心的感谢并献上我诚挚的敬意。 在实验过程中，贾新成教授、吴坤教授、邱立友教授、宋安东副教授就实验 中出现的问题提出过不少建议，使得试验能顺利按时完成，同时，也得到了微生 物教研室的全体老师和实验室赵柏叶老师、胡瑜老师、赵玉萍老师的支持和帮助。 谨此表示衷心的感谢! 同学之间的相互合作和彼此的鼓励，使我克服了无数的困难与挫折，也使得 试验从开始到结束，能够顺利的进行，同时也和他们结下了深厚的友谊。0 3 级 研究生闰鑫、孙连海、刘亚峰、王少华、刘寅、崔锦等在实验初始阶段给予我很 大的帮助，0 4 级研究生孙富林、李彦鹏、王兰青、陈克、王会娟、张品品、冯 冲、李安华、董庸行、朱广军和食品学院的崔建涛、王育红以及0 5 级的黄慧敏、 李岳桦、张小强、阮森林、田建军、张东升和本科生李红亮、杨齐等在试验进行 过程中也帮了我不少的忙，在此向他们表示诚挚的谢意。难忘室友康静、高文静、 郑茜、鲁晓娟我们在一起度过的三年美好时光，我将永远珍视与她们的友谊。 感谢我的父母、亲人和朋友们三年来给予我的支持和鼓励，是他们的无私奉 献让我没有后顾之忧，全身心地投入到学习和工作中。 最后，再次向所有曾经关心我学习和成长的师长、同学和朋友们表示真挚的 谢意。 吕帅 2 0 0 7 年6 月于郑州 微生物硕士学位论文壳聚糖接枝双醛淀粉固定化黑曲霉木聚糖酶的研究 捅要 不同的酶由于其结构和特性都不相同，因此选择的载体和固定化方法也各有不同。为了 所研究的酶能够很好的适应所选的的固定化载体和采用的固定化方法，载体的选择仍然是固 定化酶首要解决的问题。对于木聚糖酶来说，由于底物的一些限制，固定化方法上多采用吸 附和载体结合法。本文在此基础上选取了两种无机插层材料水滑石和磷酸锆以及天然材料壳 聚糖通过接枝双醛淀粉这些载体，筛选出对黑曲霉a - 2 5 来源的木聚糖酶固定化效果较好的 载体，并对其固定化工艺进行了优化，进一步研究了固定化酶的酶学特性。研究结果如下： 1 寻找合适的载体是固定化研究的重要课题之一。通过对所选的几种载体的固定化试验， 筛选出了固定化木聚糖酶效果较好的壳聚糖接枝双醛淀粉。然后对壳聚糖接枝双醛淀粉材料 固定化木聚糖酶的条件进行了优化，结果表明：3 o g 壳聚糖球添加氧化度为9 5 的双醛淀 粉1 o g 在7 0 c 条件下处理1 6 h ，然后在此条件下，1 眶的载体在添加0 2 m o 1p h 5 6 醋酸缓 冲液、温度3 0 ，加酶量为4 m l 的条件下进行8 h 固定化处理效果好，获得的固定化酶回收 率可达6 3 。 2 与游离酶相比，壳聚糖固定化酶和壳聚糖接枝双醛淀粉固定化酶，其最适p h 没有变化， 均在4 6 ，p h 的稳定性交化不大，在p h 4 6 8 6 之间固定化酶稳定性很好，总体壳聚糖接枝 双醛淀粉固定化酶的p h 稳定性好于壳聚糖直接吸附固定化酶。酶的最适温度提高了，壳聚 糖接枝双醛淀粉固定化酶和壳聚糖固定化酶的最适温度分别由游离酶的5 0 提高到5 5 和 6 0 ，温度稳定性都明显增加了，壳聚糖接枝双醛淀粉以及壳聚糖固定化酶在5 0 下半衰 期分别是游离酶的2 3 5 倍和1 5 1 倍。同时固定化酶在4 冰箱内的贮存稳定性比游离酶要 好，贮存7 6 天后固定化酶残余活力还保持在8 5 ，游离酶仅为6 0 。供试的所有离子对壳 聚糖固定化酶和壳聚糖接枝双醛淀粉固定化酶的影响有些区别，k + 、m 矿十和e d t a ，对壳 聚糖固定化酶的影响是部分失活的，但是对壳聚糖接枝双醛淀粉固定化酶是稍微激活的：除 a g + 以外，其它离子对固定化酶都没有激活作用。壳聚糖和壳聚糖接枝双醛淀粉固定化酶对 桦木木聚糖的k m 值分别由原酶的1 1 4 m g m l 稍微增加到l - 1 7 m g m l 和1 3 9 m g m l ，表明采 用壳聚糖或者是壳聚糖接枝双醛淀粉作为固定化材料基本保持了原有酶和底物的亲和性，但 是采用壳聚糖接枝双醛淀粉固定化后v 。稍有增大。 3 采用壳聚糖接枝双醛淀粉载体固定化木聚糖酶水解木聚糖得到的水解液成分通过高效液 相色谱分析发现，获得了以木二糖和木三糖为主的低聚木糖。 关键词：壳聚糖双醛淀粉木聚糖酶固定化特性 微生物硕士学位论文壳聚糖接枝双醛淀粉固定化黑曲霉木聚糖酶的研究 卜砖 k 。掣掣 南。笮y 蚓参厶x 3 ；| ，南赢，赢t 参：嘲罩一 m 毫赚 舢 矗龋 2 微生物硕士学位论文壳聚糖接枝双醛淀粉固定化黑曲霉木聚糖酶的研究 1 1 3 木聚糖酶的酶学特性 木聚糖酶在自然界分布很广，在海洋及陆地细菌、海洋藻类、真菌、酵母、瘤胃和反刍 动物细菌、蜗牛、甲壳动物、陆地植物组织和各种无脊椎动物中都存在木聚糖酶。但研究还 是以微生物产生的木聚糖酶为主，微生物产生的木聚糖酶具有多样性，即常常产生不止一种 类型的木聚糖酶，而且这些不同类型木聚糖酶的特性也存在差异1 。造成这种差异性的原因 有多种，可能是由于不同的基因产物或者是由于微生物分泌蛋白酶的水解作用，也许是不同 程度的糖基化和酰胺化引起。在许多真核微生物所产木聚糖酶中发现糖基化的现象是很普遍 的，如耐温真菌t a l a r o m y c e sb y s s o c h l a m y d o i d e sy h 5 0 的糖基组成为甘露糖、葡萄糖和岩藻 糖。另外一些来源于c l o s t r i d i u ms t e r c o r a r i u m , s t r e p t o m y c e ss p 和碱性耐温b a c i l l u ss p 等原核 微生物的木聚糖酶已被证实是糖蛋白西，10 1 1 1 。通常认为糖基化与酶抵御极端环境维持其稳定 性相关。不同的糖基化作用和蛋白酶解是木聚糖酶多样性的重要原因之一u 引。 大多数微生物来源的木聚糖酶具有以下性质：只含有一个亚基，对于不同生物来源的木 聚糖酶，分子量范围8 - - - 1 4 5 k d a ，等电点p i 为3 1 0 ：酶的最适作用p h 值为4 7 ，p h 稳 定范围3 1 0 ，真菌木聚糖酶的最适p h 值较细菌的偏酸性；酶的最适反应温度为4 0 7 5 ， 一般真菌木聚糖酶的热稳定性较细菌的差【1 3 1 。根据多种木聚糖酶的氨基酸组成及其三维结构 分析可以看出，谷氨酸、天门冬氨酸、酪氨酸、色氨酸、甘氨酸、丝氨酸对其催化特性及耐 碱、耐热性等是非常关键的。 1 1 4 木聚糖酶的研究概况 木聚糖酶有的只含有单一区域即催化区，也有的同时具备催化区和多种非催化区。多区 域木聚糖酶分子结构中含有催化区( c a t a l y t i cd o m a i n ，c d ) 、纤维素结合区( c e l l u l o s eb i n d i n g d o m a i n ，c b d ) 、木聚糖结合区( x y l a n - b i n d i n gd o m a i n ，x b d ) 、连接序列( l i n k e rs e q u e n c e ) 、 重复序y i j ( r e p e a t e ds e q u e n c e ) 、热稳定区( t h e r m u s t a b i l i s i n gd o m a i n ) 及其他未知功能的非催化 区等【1 4 l 。这些区域担负着不同的生理功能，不同微生物所包含的区域差别较大。有的仅具 有其中的一种或几种，有的则包含以上所有区域i l 习。 根据对木聚糖酶催化区域的氨基酸组成和疏水簇序列分析，可将其归为1 7 1 0 和( 3 11 两 大家族( f a m i l y ) 。不同木聚糖酶分子在其氨基酸组成数目和序列上相差很大，但它们的催化区 域在大小上比较一致，且同一家族中的木聚糖酶催化区域具有较高的同源性，根据已知酶可 以推测未知酶的催化特性。高分子量木聚糖酶( 分子量 3 0k d a ) 多数属于f i o 族，对木聚 糖的水解速度快，产物为聚合度卜5d p 左右的低分子量的寡糖，该族还包括对纤维素和木 聚糖都有水解作用的非特异性的葡聚糖酶；而低分子量木聚糖酶多数属于g 1l 族，对木聚 糖的水解速度慢，产物为聚合度5 - 1 0l o p 左右的木寡糖【1 6 , 1 7 。几种不同用途的商业木聚糖酶 如表l 所示【1 8 1 。因此，f 1 0 族的木聚糖酶比较适合工业应用。通常这两个家族的木聚糖酶 的催化区的氨基酸序列和催化基团的周围序列没有有意义的同源性，表明这两个家族在进化 上来源于不同的祖先基因，并且有不同的折叠方式【1 9 1 。 3 微生物硕士学位论文 壳聚糖接枝双醛淀粉固定化黑曲霉木聚糖酶的研究 表1 几种商业木聚糖酶及其供应商 t a b l e1af e wk i n d so fc o m m e r c i a ix y l a n a s ea n ds u p p i y e r 供应商 商业木聚糖酶名称 应用 舢k or a j a m a h ，f i n l a n d e c o p u l p s a n d o z , c h a r l o t t e ，n c a n dc a r t a z y m e b a s l e ，s w i t z e r l a n d 纸浆漂白 纸浆漂白 c l a d e n t , u kc a r t a z y m eh s1 0 ，c a r t a z y m eh t , c a r t a z y m es r1 0c a r t a z y m e 纸浆漂白 p s1 0 ，c a r t a z y m e9 4 0 7e ，c a r t a z y m en s1 0 ， c - e n e r c o r , f i n l a n d ；c i b ag i e g y , i r g a z y m e4 0 - 4 x a l b a z y m e4 0 _ 4 x i r g a z y m e - 1 0 a , 纸浆漂白 a l b a z y m e - 1 0 a m u l t i f e c tx y l a n a s e v o e s ta l p i n e ，a u s t r i a v a ix y l a n a s e b i c o n i n d i a , b a n g a l o r e p u l p z y m eh 八p u l p z y m ei - b ，p u l p z y m eh c b i o f e e db e t a , b i o f e e dp l u sf e e d c e r e m i x b l e a c h z y m ef 烘焙，食品 纸浆漂白 纸浆漂白 酿造 纸浆漂白 r o h ne n z y m e0 y ；p r i m a l c o 。e c o p u l px - 1 0 0 ，e c o p u l px 一2 0 0 ，e c o p u l px - 2 0 0 4 ，e c o p u l p 纸浆漂白 f i n l a n dt x - 1 0 0 ，e c o p u l pt x - 2 0 0 ，e c o p u l px m m e i t os a n k y o ，n o g a y aj a p a n x y l a n a s e s o l v a yi n t e r o x , u s a t h o m a ss w a n , u k i o g e n , c a n a d a s a n k y o ，j a p a n r h o l a s e7 1 1 8 o p t i p u l pl - 8 0 0 0 e c o z y m e g s - 3 5 ，h s 7 0 s a n z y m ea x , a l p e l a s ef e n z y m ed e v e l o p m e n t , u s a e n z e k ox y l a a a s e 研究 食品 纸浆漂白 纸浆漂白 纸浆漂白 饲料 食品 烘焙，食品， 饲料 随着化学修饰诱变和x r a y 等技术的广泛应用，阐明木聚糖酶的催化机制并鉴定出其 4 微生物硕士学位论文壳聚糖接枝双醛淀粉固定化黑曲霉木聚糖酶的研究 氨基酸组成中哪些氨基酸参与酶的催化作用的研究已取得了很大的进展。e l i z a b e t h 2 0 1 等人根 据木聚糖酶的作用机制可能与同样水解多糖的蛋清溶菌酶的酸碱催化机制相似，推测其催化 过程可能涉及酸性氨基酸残基。于是，他通过对来源于b a c i l l u sp u m i l u s 的木聚糖酶晶体的 三维结构进行分析并和其他酶进行同源比较后证实了推测的正确性。另外，m c c a r t h y 掣2 l 】 人对来自于d i c t y o g l o m u st h e r m o p h i l u mr t 4 6 b 1 的木聚糖酶x y n a 进行高分辨率( 1 8 n m ) x - r a y 同晶置换法衍射实验和m o r e a u l 2 2 1 以及l e e i 2 3 1 等人分别对来源于s t r e p t o m y c e sl i v i d a n s 的x y l a n a s ea 和来源于t h e r m o a n a e r o b a c t e r i u ms a c c h a r o l y t i c u mb 6 a - - r i 的木聚糖酶x y n a 进行了点突变。他们通过采用不同的方法对木聚糖酶性质的分析，都得出了木聚糖酶的作用 机制可能是广义上的酸碱催化机制，谷氨酸和天冬氨酸等酸性氨基酸残基起催化残基的作 用，它们与空间位置相近的其他极性氨基酸残基互作，维持两个催化残基的离子状态及产物 中间体的稳定性，保持酶的催化活性n 副。因此，在利用点突变或者其他手段改善酶学性质时， 要尽量避免涉及这些保守的氨基酸，以免影响酶的活性。 木聚糖酶的酶学性质决定了其在应用上的潜力及应用领域，目前国内的大部分研究主要 集中在从天然微生物中筛选性质更为优良的木聚糖酶；采用基因工程手段改良菌种以获得更 多的高产菌株或者极端耐性木聚糖酶的菌种筛选；优化发酵条件，进一步提高木聚糖酶的合 成水平：加深对木聚糖酶作用的分子机理的了解；通过基因克隆与表达和蛋白质工程改良木 聚糖酶的性质，研制出符合不同应用领域要求的木聚糖酶产品乜嘣，2 5 , 2 6 , 2 7 。 1 1 5 木聚糖酶的应用 近几十年来，随着木聚糖酶研究的不断深入，木聚糖酶在工业领域中的巨大价值引起 了人们很大的关注，特别是在纸浆造纸工业、食品与酿造工业、饲料、环保、能源、医药等 领域的开发、研究和应用。 1 1 5 1 在纸浆与造纸工业中的应用 木聚糖酶最重要的用途是在纸浆造纸工业中用于打浆处理、纸浆的漂白、二次纤维回收 等方面。制浆是造纸工业中的一道重要工艺，在硬木和软木纸浆中，沉淀的木聚糖是木质素 抽提的主要障碍，加入木聚糖酶水解木聚糖，从而提高木质素的抽提率。作为纸浆漂白助白 剂，木聚糖酶的前处理可以显著降低漂白用氯。若结合漂白工艺的改革，可进一步实现无氯 漂白，不仅可以改善漂白效果，还可以解决纸浆工业中的环境污染问题。因为研究发现，纸 浆漂白污水中含有有毒物质，这些物质能在生态系统的生物和非生物组成中积累，如氯苯、 氯二苯和其他氯化木质素次生物口8 捌。目前，欧洲和加拿大的一些大型造纸公司已将木聚糖 酶预漂白作为常规技术应用，不但提高了纸浆产量，同时也带动了木聚糖酶制剂市场的发展。 低氯和无氯漂白是未来的纸浆漂白技术的主流发展方向，而研究表明木聚糖酶能大大提高低 氯和无氯漂白纸浆的可漂性，同时，减轻环境污染问题。 1 1 5 2 在食品饮料工业中的应用 面包食品的诸多特性在很大程度上受谷物面粉中戊聚糖和淀粉含量的影响，木聚糖酶作 5 微生物硕士学位论文壳聚糖接枝双醛淀粉固定化黑曲霉木聚糖酶的研究 为一种面包的改良剂可以水解谷物面粉中的木聚糖产生木寡糖，从而改善面包的质地、结构、 松软度和保质期，而且在焙烤过程中有助于改善面包表面的色泽。另外，在制备饮料和酒类 过程中所用原料含有非淀粉多糖类物质，而这类物质水溶性较差，所以，会在饮料和酒类中 呈现不透明的混浊状态。木聚糖酶用来水解这类多糖物质，从而达到澄清饮料和酒类目的 3 0 1 。 1 1 5 3 木聚糖酶在饲料行业中的应用【3 1 l 植物细胞壁是由包括木聚糖和1 3 一葡聚糖的复杂多糖组成。非反刍动物由于缺少相应的 消化酶类，故半纤维素饲料对它们几乎没有营养，木聚糖酶可以破坏植物中的细胞壁结构， 改善农作物青贮饲料的营养成分，利于动物的消化吸收，显著提高各种饲料的利用率。同时 木聚糖酶还能降解可溶性多糖，降低其粘性，减少畜禽肠道疾病，增进畜禽健康，提高畜禽 成活率，减少粘粪，降低空气中氨气和硫化物浓度，减少粘粪排出和脏蛋，使畜禽体重均匀， 减少环境污染。 1 1 5 4 功能性低聚木糖的生产 功能性低聚木糖是指含有2 7 个木糖结构单位的低聚寡糖，具有增殖双歧杆菌、抗龋齿、 抗营养和促进钙吸收等功能。在食品、饲料、农业、药物等方面广泛应用，如低聚木糖可添 加到焙烤食品中，可保持食品水分，改变面团的流变特性。用低聚木糖作为营养物栽培的农 作物，具有抗病、生长迅速和果实产量大等优良性状。另外，由于低聚木糖具有表面活性部 位，可吸附肠道内有毒物质及病原菌，提高机体抗病力，激活免疫系统，因此可在医药中应 用【3 2 1 。由于低聚木糖具有潜在的应用价值，能够带来巨大的经济效益和社会效益，现如今， 低聚木糖在日本年产量已经超过1 5 0 0 t ，但是在我国目前还尚未实现工业化生产，只是近几 年在江南大学和中国农业大学等高校的一些学者的努力下，相关研究逐渐报道出来 3 3 , 3 4 , 3 5 1 。 目前，工业上多采用酶水解法来生产，即使用微生物产生的木聚糖酶分解木聚糖，然后经分 离提纯制得低聚木糖。用上述方法投入到工业生产低聚木糖，将需要大量的酶制剂，成本太 高，这也是国内低聚木糖产量低的一方面。因此，急需寻找有效的途径开发国内功能性低聚 木糖的生产市场。 1 2 固定化酶的研究进展 酶是一类具有生物催化功能的分子量适中的蛋白质，具有极高的催化效率、高度的特异 性及控制的灵敏性。大多数酶是水溶性的。由于酶催化反应具有底物专一性、催化高效性、 反应条件温和等优点1 3 6 1 ，已在许多领域得到广泛的应用。但是，酶在工业化应用中也有它 的不足之处：酶的稳定性差，容易失活；催化反应过后，与反应体系混在一起，难于回收， 不利于连续化生产；产物分离纯化困难，产品成本较高【3 7 】。因此，人们一直都在不断地研 究如何在克服传统酶技术的缺点的前提下高效利用酶的技术，固定化酶就是人们在寻求克服 这些不足的过程中不断改进发展起来的一项技术【3 剐。 6 微生物硕士学位论文壳聚糖接枝双醛淀粉固定化黑曲霉木聚糖酶的研究 1 2 1 固定化酶的概念 固定化酶的研究始于1 9 1 0 年，正式研究于2 0 世纪6 0 年代，7 0 年代已在全世界普遍展 开。1 9 7 1 年的第一届国际酶工程( e n z y m ee n g i n e e r i n g ) 会议首先提出“固定化酶”这一 名称并被采用。酶的固定化( i m m o b i l i z a t i o no f e n z y m e s 、i m m o b i l i z a t i o ne n z y m e s ) 是指通过 某些方式将酶和载体相结合，酶被载体材料束缚或限制于一定区域内进行特有的催化反应， 并可回收及重复利用的一类技术1 3 9 柚】。与游离酶相比固定化酶在保持其高效专一及温和的酶 催化反应特性的同时，又克服了游离酶的不足之处，呈现贮存稳定性高、分离回收容易、可 多次重复使用、操作连续可控、工艺简便等一系列优点【4 l 】 1 2 2 固定化酶的发展史【4 2 4 3 州 固定化酶的研究最早可以追溯到1 9 1 6 年n e l s o n 和g d t i i n 首先发现酶不溶于水而具有 酶活性这一现象。1 9 4 8 年s u m m e r 把刀豆脲酶制成非水溶性酶，也同样具有酶活力。接着 在1 9 5 3 年g r u b h o f e r 和s c h l e i t h 首先将羧肽酶、淀粉糖化酶、胃蛋白酶、核糖核酸酶等结合 在修饰过的聚苯乙烯树脂上，实现了酶的固定化【4 2 】。进入六十年代后，固定化酶的研究得 到了迅速发展，科研工作者们开发出了许多新的酶固定化方法，并对固定化酶的理化性质进 行了大量的研究，综述和专著大量涌现【4 3 1 。六十年代后半期，欧美各国及亚洲的日本在固 定化酶方面的研究工作展开，瑞典u p s a l a 大学的p o r a t h 教授对固定化酶进行了卓有成效的 研究，最初主要将水不溶性酶与不溶性载体结合起来，成为不溶于水的酶衍生物，所以又称 为水不溶酶( w a t e ri n s o l u b l ee n z y m e ) 和固相酶( s o l i dp h a s ee n z y m e ) ，但是后来发现，也可 以把酶包埋在凝胶内，酶本身是不溶的，不过被固定在一个有限空间内，因此，水不溶性酶 和固相酶的名称不恰当了。于是在1 9 7 1 年，第一届酶工程会议正式建议采用固定化酶的名 称【4 2 i 。1 9 6 9 年日本的千烟一郎博士首先将固定化酶应用于工业生产，开创了固定化酶应用 的新纪元。 我国的固定化酶研究开始于1 9 7 0 年，首先是微生物所和上海生化所的酶学工作者同时 开始了固定化酶的研究工作【4 5 】。此后，许多单位相继进行了固定化酶的应用研究。其中，将 在染料工业中使用的双功能试剂对1 3 硫酸酯乙砜基苯胺引入固定化领域，用于多糖载体与 多种酶共价结合，后来还研制成功固定化57 一磷酸二酯酶生产单核苷酸，固定化青霉素酰 化酶生产6 一氨基青霉烷酸( 6 - a p a ) 和固定化葡萄糖异构酶生产果葡糖浆等，这些都已成 为颇具我国特色的固定化方法，成功应用于工业化生产。 现在，酶的固定化已拥有一套成熟的技术，而且在此基础上，已发展了细胞固定化技术。 细胞器固定化技术、固定化多酶反应器、固定化微生物多酶反应系统、固定化酶一微生物复 合物等技术相继发展起来，因而使用生物工程更趋向于相互联系，综合发展。酶的固定化技 术一直是这一发展的基础阳】。 近年来，各国已从早期集中于各种固定化酶制备方法的研究转向酶在固定化后作用机制 以及在工业、医学、化学分析、亲和层析、环境保护、能源开发等方面的应用研究，已取得 7 微生物硕士学位论文壳聚糖接枝双醛淀粉固定化黑曲霉木聚糖酶的研究 许多重要成果，产生了巨大作用，但仍有很大的发展潜力。采用固定化酶技术大规模生产的 企业尚属少数，仍需大力研究开发【4 2 1 。 1 2 3 酶的固定化方法 传统的酶固定化方法大致可分为4 类：吸附法m 】、交联法【4 7 1 、包埋法【4 引、共价结合法 【4 9 】。 1 2 3 1吸附法( 物理吸附法和离子交换吸附法) 1 ) 物理吸附法是利用各种固体吸附剂将酶或含酶菌体吸附在其表面而使酶固定化的方 法，简称吸附法。物理吸附法常用的固定化酶的载体有：活性炭、活性氧化铝、皂土、硅藻 土、高岭土、多孔玻璃、多孔陶瓷、硅胶、羟基磷灰石、二氧化钛等无机载体；有机载体有 面筋、淀粉、纤维素、胶原、赛璐珞和火棉胶等。 2 ) 离子交换吸附法，是一种电性吸附，它利用酶蛋白在解离状态下可用电荷引力和固 定到与酶蛋白电荷相异的离子交换剂上的一种固定化方法。常用的载体有阴离子交换树脂： d e a e ( - - 乙氨基乙基) 一纤维素、t e a e ( 四乙氨基乙基) 一纤维素、d e a e 一葡聚糖凝胶： 阳离子交换树脂有：c m c ( 羧甲基纤维素) 。 吸附法具有工艺简便、反应条件温和、不会引起酶的变性失活、载体价格便宜、可反复 使用等优点，缺点就是吸附作用选择性不强，酶和载体结合不牢固，酶易于从载体上泄漏出 来污染催化反应产物等。 1 2 3 。2 交联法 利用双功能或多功能试剂，使酶分子之间或者酶蛋白与其它惰性蛋白之间发生交联作 用，凝集成网状结构，称为交联法。交联法亦称架桥法，游离酶的氨基酸残基与双官能团或 者多功能团交联剂反应而被固定化可得酶蛋白单位浓度较高的固定化酶。常用交联试剂有戊 二醛、双重氮联苯胺一2 ，2 一二磺酸、1 ，5 一二氟一2 ，4 - - - 硝基苯、己二酰亚胺酸二甲酯等。交 联法单独使用时，由于反应条件剧烈，酶活力损失都很大并且得到的固定化酶颗粒小，实际 使用时，往往同其他固定化方法联合使用或者作为其他固定化方法的辅助手段唧1 。由于交联 条件的不同和在交联体系中添加不同的材料，可以产生物理性质各异的固定化酶。如将酶酰 经凝胶包埋后，再经交联等。 1 2 3 3 包埋法 包埋法就是将酶或者酶菌体等包埋在多孔载体中使酶固定化的方法。这种方法可以防止 酶蛋白的流失，对于底物来说，仍能渗入其中和酶接触。包埋法分为凝胶包埋法( 网格型) 和微囊化法( 微囊型) 。 1 ) 凝胶包埋法就是先把单体、交联剂和悬浮在缓冲溶液中的酶混合，然后加入催化剂 使单体、交联剂聚合，随后在酶分子周围形成不溶性的交联高聚物网格。常用的凝胶有聚丙 烯酰胺凝胶、硅橡胶、卡拉胶、大豆蛋白质、合成纤维等。其中，交联聚丙烯酰胺凝胶包埋 法是较早使用，也是常用的包埋技术【5 l 】。 8 微生物硕士学位论文 壳聚糖接枝双醛淀粉固定化黑曲霉木聚糖酶的研究 2 ) 微囊包埋是以超滤用的高分子半透膜包裹含酶的液滴而成。它大多用于医学领域。 包埋法固定化酶在工艺制备上简便，反应比较温和，因为酶包埋在载体中，所以反应时 仍可以保持酶的自然性质，因此可获得较高的酶活力回收。目前，普遍应用于各种酶的固定 化如胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、1 3 一葡萄糖苷酶、1 3 一淀粉酶、过氧化氢酶、胰凝乳蛋白酶等 【5 2 j 3 , 5 4 , 5 5 1 。但是包埋法固定化酶也存在易泄漏、扩散限制和在催化反应中受到传质阻力的影 响等问题，因此，酶、底物和产物的分子大小以及溶解性能要求严格，对大分子和不溶性底 物的酶来说就不很适宜。 1 2 3 4 共价结合法 共价结合法是指酶分子的非必须基团和载体表面的活性功能基团通过形成化学共价键 实现不可逆结合的酶固定化方法，又称载体偶联法。载体偶联法所得的固定化酶与载体连接 牢固，有良好的稳定性及重复使用性，成为目前研究最为活跃的一类酶固定化方法。与载体 以共价键结合的酶的功能团包括：氨基：赖氨酸的e 一氨基和多肽键的n 末端的q 一氨基： 羧基：天门冬氨酸的1 3 一羧基、谷氨酸的q 一羧基和末端a 一羧基：酚基：酪氨酸的酚环： 巯基：半胧氨酸的巯基：羟基：丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸的羟基：咪唑基：组氨酸的咪唑基： 吲哚基：色氨酸的吲哚基。最为常见的有氨基、羧基、酪氨酸和组氨酸的芳环。共价结合 法常用的载体有：纤维素、琼脂糖凝胶、葡聚糖凝胶、甲壳素、壳聚糖、氨基酸共聚物、甲 基丙烯酸共聚物等。 酶分子侧链与载体功能基团之间，往往不能直接反应，因而反应前必须将载体功能基团 加以活化，然后与酶分子反应而固定化。根据所选择载体和酶蛋白分子上官能基团的不同， 将常用的共价结合法可分为以下几类：( 1 ) 重氮法h 1 1 。这是一类应用广泛的方法，适用于多 糖类的芳香族氨基衍生物、氨基酸共聚物、聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、乙烯二马来酸共聚物和 多孔玻璃等载体。将具有氨基的不溶性载体，以稀盐酸和亚硝酸钠处理，成为重氮化物，然 后在温和的条件下再与酶分子的氨基酸残基( 如游离氨基，组氨酸的咪唑基，酪氨酸中的酚 基) 结合。( 2 ) 肽键法哺1 。这种方法是在酶分子与载体间形成肽键。将含羧基的不溶性载 体转变为酰基叠氮衍生物、异氰酸盐、异硫氰酸盐衍生物或酰氯衍生物等，再把这些活化的 衍生物与酶的游离氨基反应而形成酰胺键。( 3 ) 烷基化法和芳基化法啼7 1 。主要是以卤素为功 能团的载体与酶蛋白的氨基及巯基发生烷基化或芳基化反应而形成固定化酶的一种方法。 1 2 3 5 一些新型的固定化技术 除了以上几种固定化方法外，人们在此基础上不断的研制了新的方法提高固定化酶效 率，为工业化应用提供依据。通过辐射、光、等离子体、电子等新方法均可制备高活性固定 化酶。以”7c s 为辐射源，通过y 一射线引发将甲基丙烯酸甲酯接枝共聚于尼龙膜表面，载体 经进一步活化，已经用于青霉素酰化酶的固定化【鲳1 。光偶联法是以光敏性单体聚合物包埋固 定化酶或带光敏性基团的载体共价固定化酶，反应条件温和，可获得酶活力较高的固定化酶。 l i 等利用含芳香叠氮基的光活性酯，在远紫外光辐照下，叠氮基光解生成氮烯与p e s 膜表 9 微生物硕士学位论文壳聚糖接枝双醛淀粉固定化黑曲霉木聚糖酶的研究 面的c h 键间发生插入反应形成仲胺，将脲酶共价键合到p e s 膜的表耐卵】。高度激发的原 子、分子、离子以及自由基的聚集体就是等离子体，大量的等离子体常在室温下存在。载体 材料表面通过等离子体进行特定修饰 6 0 , 6 1 ，引入活性基团。p u l e o 等将钛合t i 一6 a i - 4 v 表面 用丙烯酸胺等离子体处理引入氨基，然后将含碳硝化甘油接枝于钛合金表面，另外又采用另 一种处理方法，用等离子体处理的钛合金先由琥珀酸酐处理，再用含碳硝化甘油接枝，进而 将溶菌酶和骨形态蛋白进行固定，实现了生物分子在生物惰性金属上的固定化1 6 2 1 。 可逆溶解性固定化技术是指将酶固定化在可逆溶解的载体材料上，酶催化反应在均相条 件下进行，通过控制其环境条件使载体和酶形成不溶性复合物从反应液分离出来，从而实现 酶的回收与重复利用的一种固定化技术【6 3 1 。其中，甲基纤维素一醋酸一琥珀酰羟丙酯聚合物 是一种p h 依赖型载体，在p h4 5 以下不溶，而在p h 5 5 以上呈可溶状态。c h e n 等就根据载体 的这一特性，将溶菌酶共价固定于该聚合载体上，研究发现固定化酶稳定性比游离酶好，同 时固定后的激活能量低于游离酶畔】。另外对p h 敏感的e u d r a g i tl - 1 0 0 和e u d r a g i ts 一1 0 0 共聚物 作为固定化载体在多个酶的固定化过程中都取得了很好的固定化效果。可逆溶解性聚合物根 据其形成沉淀的条件可分为p h 敏感型、温敏型和光敏型等可逆溶解性固定化技术1 6 5 1 。 传统的酶固定化方法的缺点是酶在任意位点与载体进行连接，使酶活性位点不能充分暴 露，而且酶的固定化量降低惭】。酶的定向固定化技术是指通过不同的方法，把酶和载体在 酶的特定位点上连接起来，酶在载体表面按一定的方向排列，使它的活性位点暴露于载体表 面的外侧，有利于底物与酶的活性位点的结合，从而能够显著提高固定化酶活性的一类方法。 酶的定向固定化方法有：利用酶和它的抗体的亲和连接，利用酶通过糖基部分固定化，利用 酶和金属离子连接的方法，利用分子生物学的方法等【6 7 】。 为了充分发挥不同酶的各自优势把不同来源的酶与整个细胞的生物催化性能相结合，实 现多酶共固或整个细胞的固定化，也日益受到研究者的重视。或者利用性能优良的天然载体， 借助现代技术对传统载体进行改性及合成新型载体材料等也可以改进酶的固定化技术。 d s o u z a 等将稻壳用聚乙烯涂层，然后将转化酶吸附于载体并用2 戊二醛进行交联，固定化 酶被重新用蔗糖水解，未见活性损失 6 s 】。 另外，无载体固定化酶的研究也成为人们研究的热点，它是利用交联溶解酶、晶体酶、 物理聚集酶和喷雾干燥酶而形成c l e s 6 们、c l e c s t 7 们、交联酶聚集体c l e a s ( c r o s s l i n k e d e n z y m ea g g r e g a t e ，c l e a s ) 1 7 1 1 和交联喷雾干燥c l s d s ( c r o s s l i n k e ds p r a g - d r i e de n z y m e ， c l s d s ) t 7 2 l 等4 种无载体酶系统。同传统的酶固定到载体上相比，具有以下一些优点：1 ) 可 得到较高的催化剂比表面；2 ) 有较高的酶催化活性，成本低；3 ) 可实现多种催化剂的注入； 4 ) 受底物扩散限制的影响较小；5 ) 提高了酶在极端条件下及有机溶剂中和蛋白酶中的操作 稳定性。尽管如此，不同的无载体酶也有各自的不足之处。如交联溶解酶( c l e s ) 是人们研究 最早的、操作最为简单的一种无载体酶，但是该方法的缺点就是机械稳定性较差，虽然可以 通过一些方法加以改进，但明显降低酶活性水平，因此在工业应用中受到限制。其它几种无 1 0 微生物硕士学位论文壳聚糖接枝双醛淀粉固定化黑曲霉木聚糖酶的研究 载体酶均是在此基础上加以改进的固定化方法。原理上，很多酶包括天然酶都适于制备 c l e c s 或c l e a s 无载体酶。它是一个比较实用的技术，并且在很多领域如有机合成、手性 分子的拆分和生物催化剂、多孔料应用于印刷套色版、缓解蛋白质毒性等，尤其是在生物传 感器方面具有很大的应用前景。i v a n u d ol u i z 7 3 】利用c l e c s 技术将葡萄糖氧化酶制成葡萄糖 生物传感器。目前，无载体固定化酶在很多应用中都取得了成功，但是仍有许多的不足，如 如何在不引起扩散限制的情况下，来控制酶聚集体的微粒尺寸、改变酶的结构等等一些问题。 对于无载体固定化酶的研究国外开展的比较早，我国还处于刚起步的阶段，随着固定化酶在 世界范围内的广泛发展，那么无载体固定化酶也将是人们开发的重点。 无论采用上面那种方法进行酶的固定化，其最重要的原则还是参与固定化反应的酶的残 基基团不能是催化酶活性中心的氨基酸残基，否则导致酶活力下降，严重的将使酶完全失活。 因此，在固定化之前，尽可能的了解该固定化酶的氨基酸组成，位于酶活性中心的氨基酸、 酶的立体结构，化学修饰对活性的影响以及活性中心的保护剂等。 目前，固定化酶技术是酶工程研究的重点和热点之一。研究探索新的酶固定化技术、提 高固定化酶活性收率、延长半衰期、降低成本将成为固定化酶研究领域的主要内犁7 4 j 。 随着固定化的不断发展，人们的研究热点已经逐渐从酶的固定方法转向酶载体研究，载 体材料的研究也在向功能化和精细化方向发展。根据现今的固定化酶载体多样化可以将固定 化载体逐渐划分成有机高分子载体、无机载体和复合载体三大类。 在有机高分子载体中，合成高分子凝胶载体一般强度较大，但传质性能较差，会对酶的 活性产生影响。常见的载体有聚丙烯酰胺和聚乙烯醇等。经过人们多年的研究，在固定化载 体中合成的有机材料作为载体，层出不穷。如：聚乙烯醇冷冻胶，聚乙烯醇氧化物，无孔聚 苯乙烯，聚苯乙烯磺酸钠p s p n a s s 微球载体，p f 凝胶载体( 对苯二酚和甲醛聚合物) ，球状 纤维素单宁树脂，多孔醋酸纤维素球形载体等。而天然高分子凝胶载体一般无毒性，传质性 能好，但存在强度较低、厌氧条件下容易被细菌分解和寿命短等问题。常见的有琼脂、海藻 酸钠、明胶等。近来人们对甲壳素和壳聚糖这些天然多糖类材料很感兴趣，越来越多的研究 人员采用壳聚糖或者壳聚糖复合物作为固定化酶载体。壳聚糖是甲壳素的n 一脱乙酰基的产 物，天然的碱性氨基多聚糖，由2 氨基一2 一脱氧一b - d 一葡萄糖以1 3 ( 1 4 ) 糖苷键连接而成。 壳聚糖分子本身带有大量的羟基和氨基以及部分的n 一乙酰基，因此，它的性质比较稳定， 不溶于大部分的有机溶剂，只溶于一些低浓度的有机酸和无机酸。正由于壳聚糖的这些性质， 使得它易于进行酰化、酯化、醚化、烷基化、氧化、螯合等化学修饰和接枝改性r 7 5 】。 本文就是采用天然高分子材料壳聚糖，通过加工接枝上无毒的经过处理获得的一种变性 淀粉双醛淀粉。将经过修饰的壳聚糖载体用于固定化木聚糖酶，进行了酶的固定化研究 和探索。 无机材料作为固定化酶载体具有稳定性好、机械强度高、对微生物无毒性、不易被微生 物分解等特性。在这方面，美国的u o p 公司以氧化铝为载体，德国的m i l s s 公司以二氧化 微生物硕士学位论文壳聚糖接枝双醛淀粉固定化黑曲霉木聚糖酶的研究 硅为载体制备固定化酶取得了显著的成效。复合载体材料是将有机材料和无机材料复合组成， 以改进材料的性能。磁性高分子微球是近年来研究的较多的一类复合载体材料。 1 2 4 固定化酶的应用 随着酶固定化技术的发展，固定化酶的应用范围不断扩大。目前，在化学及化工领域、 食品、临床医药、生物传感器及环境一废水处理等方面显示了巨大的应用前景。 1 2 4 1 在食品行业的应用 固定化酶技术在食品行业中得到了成功运用。首先，固定化氨基酰化酶是世界上第一种 用于工业化生产的固定化酶。1 9 6 9 年，日本就将它用于拆分d l 一氨基酸，连续生产l 一氨基 酸，其生产成本仅为流离酶生产成本的6 0 7 6 。目前，固定化葡萄糖异构酶是世界上生产 规模最大的一种固定化酶，1 9 7 3 年就已用于果葡萄糖浆的连续工业化生产，其固定化方法普 遍采用热处理固定化法。它可以用来催化玉米糖浆和淀粉生产高甜度的高果糖糖浆，得到含 果糖5 5 的高果糖浆，在价格方面，要比同等甜度的蔗糖低1 0 一2 0 。现今，高果糖浆在 世界上的产量约9 0 0 0 k t ，它是固定化酶应用的最成功的工业实例。淀粉酶及糖化酶能催化淀 粉转化为葡萄糖，是较早研究并仍在研究的固定化生物催化剂，旷淀粉酶与糖化酶的共固定 化实现了淀粉的液化与糖化两步反应的合二为一、淀粉一步水解为葡萄糖且操作半衰期可达 9 2 0h ，而当旷淀粉酶、糖化酶及葡萄糖异构酶共固定化时又可使淀粉转化果糖。不仅如此， 酶尚可与细胞等其它生物分子构成共固定系统【_ 7 。n 。两种或多种有联系的酶共固定化构成更 为复杂的生物转化系统、却又能将复杂的生物反应过程简单化，这是一种颇具新意的研究思 路。其次，淀粉及纤维素是地球上贮量丰富的可再生资源，通过固定化酶催化水解实现其高 附加值转化，符合社会经济可持续发展的时代要求，如固定化蜗牛酶就对纤维素的降解具有 良好的酶催化活性【7 翻。 1 2 。4 2 固定化酶在化学及化工领域中的应用 固定化酶在化学及化工领域中的应用研究也是人们感兴趣的课题，通过反相悬浮聚合制 备的聚丙烯酰胺原位固定化碱性蛋白酶水凝胶球体可直接用于洗涤剂制备，且具有潜在的应 用前景。脂肪酶既能催化天然油脂及酯类的水解，也能在有机介质中催化酯的合成、交换、 氨解及肽合成而具有重要工业价值，故固定化脂肪酶的研究颇受重视订母他刚，有关的国内外 对于脂肪酶的固定化研究日益增多。 1 2 4 3 在临床医药及生物传感器方面的应用 近年来，酶在医药中的使用越来越受到大家的重视，固相酶在医药中的应用也逐渐的展 开，不断的受到大家的青睐。琼脂糖固定化牛胰核糖核酸酶能很好地催化合成重要的寡核苷 酸哺。前列腺素衍生物是2 0 世纪重要的医药发现之一，用大孔聚n 一氨乙基丙烯酰胺固定化 前列腺素合成酶用于酶促催化合成前列腺素衍生物e 1 时，固定化酶显示出良好的储存稳定 性及活性嘲。目前固定化酶在治疗酶缺乏症、癌症、代谢异常症以及制造人工脏器方面，也 已取得了引人注目的成就。壳聚糖固定化胰蛋白酶制备具有多种药用价值的高比活抑肽酶已 微生物硕士学位论文壳聚糖接枝双醛淀粉固定化黑曲霉木聚糖酶的研究 显示出工业化应用前景，微囊固定化过氧化氢酶具有良好的酶活性及稳定性，将在临床检测 及卫生防疫方面具有广泛用途1 。药用酶可通过固定化提高稳定性及缓释性，并可除去免疫 原性，甚至葡聚糖磁性毫微粒固定化l 一天冬酰胺酶具有通过血液注射治疗急性淋巴白血病 的医用前景h 。 酶固定化技术的发展使生物传感器应运而生。生物传感器是由生物活性物质与探针电极 组成的分析系统，可以简便、快速地测定各种特异性很强的物质，其最主要的元件都是固定 化生物敏感膜( 多数情况下为酶膜) 。葡萄糖氧化酶被固定化在纳米微带金电极上可得到能 用于活体检测的微型生物传感器擒钔；聚吡咯固定化脲酶传感器在脲浓度为( 5 1 0