（有机化学专业论文）香豆素吲哚喹啉染料的合成表征及光谱性能研究.pdf

s y n t h e s i sa n dc h a r a c t e r i z a t i o no fc o u m a r i n i n d o l e q u i n o l i n ed y e s a n dt h e i rs p e c t r a lp r o p e r t i e s b y s o n g j i z e n g b s ( l a n g f a n gt e a c h e r s c o l l e g e ) 2 0 0 8 at h e s i ss u b m i t t e di np a r t i a ls a t i s f a c t i o no ft h e r e q u i r e m e n t sf o rt h ed e g r e eo f m a s t e ro fs c i e n c e o r g a n i c c h e m i s t r y t h eg r a d u a t es c h o o l o f h u n a nu n i v e r s i t y s u p e r v i s o r p r o f e s s o rl i nw e i y i n g m a y , 2 0 1 1 册11m 6 7舢0川9 删1胂y 湖南大学 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所 取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任 何其他个人或集体已经发表或撰写的成果作品。对本文的研究做出重要贡 献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的 法律后果由本人承担。 作砉签名：束易丛髻 日期：劢71 年d 乃铂fe l 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意 学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文 被查阅和借阅。本人授权湖南大学可以将本学位论文的全部或部分内容编 入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇 编本学位论文。 本学位论文属于 l 、保密口，在年解密后适用本授权书。 2 、不保密团 ( 请在以上相应方框内打“”) 作者签名：桌名眯1 髫 刷磁轹嗽 日期：知“年口石月口fe 1 日期2 叫年白具 b 香豆素一吲哚，喹啉染料的合成及光谱性能研究 摘要 荧光比值探针在环境监测、生物化学等领域有着非常广泛的应用，这是因为 小分子的荧光探针具有诸多优点：非常高的灵敏性、操作简便、易于检测同时较 少的受生物样品的干扰。为了提高荧光比值检测的准确性和精密性，必须将背景 干扰降低到最小，所以一般要求荧光比值探针与目标分子结合前后吸收和发射波 长位移值大于8 0n m 。但是，大多数基于分子内电荷转移( i c t ) 机理的荧光比 值探针的发射波长移动较小，这种非常有限的波长移动出现光谱重叠现象，导致 光谱测定准确性和灵敏性大大降低。 在此，我们将染料转换策略应用到i c t 荧光染料探针设计中去。发现这种探 针具有非常大的发射波长移动，非常明显的波长移动值大大的提高了荧光检测的 准确性，同时也使荧光比值信号大为增强。基于以上的设计理念，我们首先合成 了一系列香豆素和香豆素菁杂化染料，并对其光谱性能进行了详细的研究。 1 羟基自由基探针8 ：一系列的光谱测定发现，染料8 是第一个具有优异光 谱性质的检测羟基自由基的荧光探针。同时染料8 在空气中表现出非常高的稳定 性，对羟基自由基的非常好的选择性。 2 p h 探针l hz 探针l h 具有非常好的光谱性质包括：具有大的发射波长值 的红移，荧光比值信号强。随着p h 值从7 5 l 降低到3 5 0 ，荧光比值增大了近 4 0 0 倍。由此可见，探针l h 是一个非常少见的测试p h 的荧光比值探针。 3 z n 2 + 探针l j ：探针l j 的优异的光谱性质、大的发射波长红移值以及对金 属锌离子的高选择性都表明：1 j 是一种新型的可以在近生物体的环境下检测金 属z n 2 + 的荧光比值探针。 关键词：合成；香豆素一菁染料；分子内电荷转移机理；比值探针 f o r i m p l e m e n t a t i o n ，a n dm i n i m a ld i s t u r b a n c e t ob i o l o g i c a ls a m p l e s t om i n i m i z e c r o s s t a l ki ne m i s s i o nw i n d o w sf o rr a t i o m e t r i cm e a s u r e m e n tw i t hh i g ha c c u r a c y ，a r a t i o m e t r i cf l u o r e s c e n tp r o b es h o u l db ed i s p l a yal a r g ee m i s s i o nw a v e l e n g t hs h i f t ( 8 0n m ) a f t e ri ti n t e r a c t sw i t hat a r g e tm o l e c u l e h o w e v e r ，m o s to ft h ei c t b a s e d r a t i o m e t r i cp r o b e sh a v er a t h e rl i m i t e de m i s s i o ns p e c t r a ls h i f t ，w h i c hr e s u l t si np o o r r e s o l u t i o no ft h et w oe m i s s i o np e a k sa n dt h u se r r o r si nr a t i o m e t r i cf l u o r e s c e n c e m e a s u r e m e n t w eh a v ep r e s e n t e dag e n e r a ld y ec o n v e r s i o ns t r a t e g yt or a t i o n a ld e s i g n o fi c t - b a s e df l u o r e s c e n tr a t i o m e t r i c p r o b e sw i t hl a r g ea b s o r p t i o na n de m i s s i o n s p e c t r a ls h i f t s ，w h i c hi sh i g h l yf a v o r a b l ef o rd e t e r m i n i n gt h ef l u o r e s c e n c ei n t e n s i t i e s a n ds i g n a lr a t i o sw i t hh i g ha c c u r a c ya n df o re n h a n c e m e n to ft h ed y n a m i cr a n g eo f s i g n a lr a t i o s b a s e do nt h i ss t r a t e g y ，w ed e s i g na n ds y n t h e s i z ec o u m a r i na n dc y a n i n e d e r i v a t i v e s ，a n dp a r t i c u l a r l ys t u d i e dt h et a r g e tm o l e c u l e ss p e c t r a lp r o p e r t i e s 1 ar a t i o m e t r i cf l u o r e s c e n tp r o b e8f o rr e a c t i v eo x y g e ns p e c i e s w es t u d i e dt h e s p e c t r a lp r o p e r t i e so fp r o b e8 ，t r yo u rb e s tk n o w l e d g e ，w ef o u n dt h a tp r o b e8 r e p r e s e n t st h ef i r s ts m a l l m o l e c u l ef l u o r e s c e n tr a t i o m e t r i cp r o b ef o rh y d r o x y l r a d i c a lw i t ht h eo u t s t a n d i n gs p e c t r a lp r o p e r t i e s p r o b e8e x h i b i t sh i g hs t a b i l i t yi n t h ea i ra n dh i g hs e l e c t i v i t yf o rh y d r o x y lr a d i c a lo v e ro t h e rs p e c i e st e s t e d 2 r a t i o m e t r i cf l u o r e s c e n tp r o b e sl hf o rp h p r o b el hi sar a t i o m e t r i cf l u o r e s c e n t p r o b e w i t ht h e o u t s t a n d i n gs p e c t r a lf e a t u r e si n c l u d i n gl a r g ea b s o r p t i o na n d e m i s s i o ns h i f t sa sw e l la sal a r g er a t i os i g n a l w i t ht h ed e c r e a s i n go fp hv a l u e s f r o m7 51t o3 5 0 ，an e a r l y4 0 4 f o l dv a r i a t i o nb ef o u n di nt h ee m i s s i o nr a t i o s i ti s i m p o r t a n tt on o t et h a ts u c hal a r g ec h a n g eo fs i g n a lr a t i o sa tt w ow a v e l e n g t h si s h i g h l y d e s i r a b l ef o rr a t i o m e t r i cf l u o r e s c e n tp r o b e s ，a st h es e n s i t i v i t ya n dt h e d y n a m i cr a n g eo fr a t i o m e t r i cp r o b e sa r ec o n t r o l l e db yt h er a t i o s 3 r a t i o m e t r i cf l u o r e s c e n tp r o b e sl jf o rz n 什p r o b el ji sa ni n t e r e s t i n gc a n d i d a t eo f r a t i o m e t r i cf l u o r e s c e n tz n 计p r o b e sw i t he m i s s i o ni nt h en i rr e g i o n f u r t h e r m o r e ， r a t i o m e t r i cf l u o r e s c e n t p r o b el j e x h i b i t e dag o o ds e l e c t i v i t yt oz n 2 十t h e f a v o r a b l es p e c t r a lp r o p e r t i e so fc o m p o u n dl jr e n d e ri tp r o m i s i n ga sar a t i o m e t r i c f l u o r e s c e n tp r o b ef o ri n v e s t i g a t i n gz n 付a s s o c i a t e db i o l o g i c a lp r o c e s s e s k e yw o r d s ：s y n t h e s i z e ；c o u m a r i n - c y a n i n ed y e s ；i c t ；r a t i o m e t r i ep r o b e s i i i 香豆素一吲哚喹啉染料的合成及光谱性能研究 目、录 j 、 、 学位论文原创性声明：i 学位论文版权使用授权书i 摘 要j 一i i a b s t r a c t i i i i 第1 章绪论1 1 1 引言1 1 2 荧光1 1 2 1 荧光产生的机理1 1 2 2 分子结构对荧光的影响_ 2 1 2 3 荧光参数一 1 2 4 分子内电荷转移( i c t ) 机理 1 3 荧光染料简介 1 3 1 荧光检测对染料的基本要求一 1 3 2 荧光染料的分类 1 3 - 3 吲哚菁染料类荧光染料 3 4 5 5 6 8 1 4 本课题研究的目的、设计思路、及工作内容1 3 第2 章香豆素吲哚喹啉染料的合成研究1 4 2 1 染料分子的设计与合成路线图1 4 2 1 1 染料分子的设计1 4 2 1 2 合成路线图1 4 2 2 仪器与试剂1 5 2 2 1 仪器15 2 2 2 试剂16 2 3 实验部分1 7 2 3 1 取代香豆素的合成及结构表征1 7 2 3 2 一系列小分子原料的合成一1 9 2 3 3 一系列的香豆素一箐染料的合成2 2 2 3 4 香豆素箐染料的合成3 2 2 4 结果与讨论3 5 2 4 1 化合物l g 和1 h 以及l l 的比较3 5 2 4 2 化合物1 j 和l k 合成讨论3 6 2 4 3 化合物l o 的合成讨论：3 8 i v 硕十学位论文 2 5 小结3 9 第3 章香豆素吲哚喹啉染料的光谱性能研究4 0 3 1 仪器与试剂4 0 3 2 实验部分一4 0 3 2 1p b s 缓冲溶液的配制4 0 3 2 2香豆素一吲哚喹啉染料母液的配制4 0 3 2 3 d ad y e 探针的分子结构：4 1 3 2 4香豆素染料和半箐染料的光谱性质研究4 1 3 2 5 羟基自由基、p h 、z n 2 + 探针设计4 4 3 2 6羟基自由基探针8 的光谱性质研究4 5 3 2 7 p h 探针1 h 光谱性质研究一4 9 3 2 8 z n 2 + 探针1 j 吸收和发射光谱研究5 1 3 3 小结5 2 结论5 3 参考文献5 4 附录a 攻读学位期间所发表的学术论文目录6 1 附录b 合成化合物一览图6 2 附录c 部分化合物的谱图6 3 j s 【谢6 7 v 荧光检测就是利用一定的化学作用将待测物和荧光染料探针结合在一起形成 配合物，而后通过对配合物进行一系列的光谱测定，研究待测物性质的一种方法 。以一定的光激发而发射荧光的染料，即为荧光染料，常见的荧光染料主要有 萘、葸、邻苯二甲酰亚胺、对甲基苯磺酰氯、香豆素、荧光素、吖啶、菲啶类染 料，荧光素类、罗丹明类、噻嗪类染料，氟化硼络合二吡咯甲川( b o d i p y ) 、二氟 烷硼类、二苯乙烯类、萘酰亚胺类、芴类荧光染料、罗丹明、对二氨基联苯、卟 啉类化合物和菁染料i z 巧j 。 荧光比率技术【6 】是荧光分析中的一项重要技术。在荧光光谱测定中，荧光探 针在与待测物结合后，会出现荧光发射光谱的红移或蓝移【7 墙j ，发射波长移动值越 大检测效果越好【9 - l o l 。以两个不同波长处的荧光强度比值变化来确定待测物的光 谱性能，称为比值测量。由于荧光比值探针在两个不同的波长处同时检测荧光强 度的变化。这样就可以大大减少甚至消除环境因素( 比如：探针浓度大小，探针 所处环境，激发光的光强度等因素) 的对检测结果的影响，使检测结果更为准确 和可靠，大大拓展了荧光检测的方法和范围【l 卜1 5 】。该方法具有检测速度快、重复 性好、用样量少、无辐射等优点【1 6 。17 1 。广泛的应用于离子检测、生物分析、环境 监测、生物化学、分析物的细胞比值成像分析【l 弘2 3 】等领域。 1 2 荧光 1 2 1 荧光产生的机理 荧光【2 4 2 5 1 是自然界中一种常见的发光现象，当荧光分子受到光、电和化学等 能量激发后，电子从基态跃迁到激发态，然后通过辐射衰变释放出光子又回复到 基态的过程中就会产生荧光2 6 1 。荧光产生的过程如图1 1 所示【27 1 。，s 表示单线 态，t 表示三线态，下标o 表示基态，下标1 ，2 表示第一，第二激发态。 大多数分子在室温时均处于基态的最低振动能级。但是在受到光、电和化学等能 量激发后，电子就会从基态跃迁到激发态。电子在激发态不稳定的，一般会通过 发光或者是非辐射跃迁等形式释放出能量后回到基态。电子由第一激发态的最低 振动能级回到基态时，会以发光的形式释放出能量，所发出的光即为荧光。由于 荧光的产生是从第一电子激发态的最低振动能级跃迁回到基态，与刚开始时，电 子被激发到哪一能级无关，因而荧光光谱的形状与激发光的波长无关，而只取决 于基态中能级分布的情况。 香豆素一吲哚喹啉染料的合成、表征及光谱性能研究 e 能量，f 荧光，p 磷光，i s c 体系间跨越，i c 内转换 图1 1 荧光产生的过程 因为在发射荧光以前有一部分能量通过振动弛豫、内转换等被消耗，发射光 的能量比吸收光的要小，因此荧光的特征波长比吸收光的特征波长要长。由于发 射荧光时仅由第一电子激发态的最低振动能级回到基态，所以荧光光谱通常只有 一个荧光带，不像吸收光谱有几个吸收带。 1 2 2 分子结构对荧光的影响 一般说来，具有强荧光的有机分子都具有大的、共轭刚性平面结构，取代基 团中多具有给电子取代基；最低单重激发态( s 1 ) 为兀，冗型等特性。因此能够 产生荧光的化合物大多数为有机芳香族化合物或它们与金属离子形成的配合物。 以下我们就具体阐述有机荧光分子结构对荧光的影响【2 引。 1 具有大的共轭的7 c 键结构的化合物容易产生荧光。能产生荧光的物质，其分 子都含有共轭双键( 兀键) 体系，共轭体系越大，离域兀电子越容易被激发，荧光越 容易产生。大部分有机荧光分子都具有芳环或芳杂环结构，并且芳香体系越大， 其荧光发射峰越往长波长方向移动，荧光强度也会变增。苯、萘仅在紫外区有荧 光，随着芳环的增加，它们的荧光光谱可以进入可见光区，如葸能发出蓝色荧光， 而并四苯则发出绿色荧光。 2 分子的刚性平面结构有利于荧光的产生。具有较为刚性结构特别是平面结 构的化合物有着较好的荧光性能，这主要是由于振动和转动耗散引起的内转换几 率减小的结果。闭环可以增加分子共平面性和刚性而使荧光增强，许多本身无荧 光或者荧光很弱的化合物与金属鳌合产生的具有环状结构的鳌合物时显示较强荧 光。一般具有刚性结构的化合物常常具有较高的发光能力。例如8 羟基喹啉是一 个在分析化学中常用的配位试剂，荧光量子效率极低，几乎可以认为不发荧光。 2 硕上学位论文 然而，当其与铝离子配位之后，形成的8 羟基喹啉铝后就具有很好的荧光性能， 目前已经在有机电致发光材料中广泛的应用。 3 增加助色基团有助子荧光的产生。一般来说，化合物的共轭体系上如果具 有强的供电子基团，如一n r 2 ，o h ，o r 等，可以使化合物的荧光增强，因为含 这类基团的荧光体，其激发态常由环外的羟基或氨基上的电子激发转移到环上而 产生的。由于它们的电子云几乎与芳环上的轨道平行，共享了共轭电子结构，同 时扩大了其共轭双键体系。所以这类化合物的吸收光与发射光的波长都比未被取 代的芳香族化合物的波长要长，且荧光效率增加。与供电子取代基相反，吸电子 取代基如碳基、硝基、重氮基团等会减弱化合物的荧光发射。这是由于这些基团 所引起的兀一兀型跃迁是禁阻跃迁，结果是s l t l 系间窜越过程被加强，在实验中可 以观察到荧光减弱和磷光增强的现象。另外，分子两端分别有供电子和吸电子基 团时，可使荧光分子发射的荧光波长发生红移并伴随强度的增强。具有共轭结构 的分子内电荷转移( i c t ) 荧光化合物是目前研究得比较热的一类化合物之一， 由于这类化合物7 【电子具有较好的离域性，在光照时容易发生整体的激发，从而 引起分子的电子转移，电子密度重新分布，因而具有很好的光电性能。 除了取代基的给受电子效应外，其取代位置的不同也会在一定程度上影响化 合物的荧光性能。一般邻位和对位取代( c n 除外) 化合物的荧光会增强，不过随着 共轭体系增大，取代基位置的影响就不再显得重要了。如果在荧光发色团上取代 上重原子如c l ，b r ，i 等，则往往会导致荧光的减弱和磷光的增强。这个现象称为“重 原子效应”，原因是由于重原子的存在使得荧光发色团中的电子自旋轨道耦合作用 加强，从而显著增加了s 1 t l 系间窜越的几率。 1 2 3 荧光参数 如前所述的荧光产生过程，我们可以知道荧光具有如下特征： 1 特征波长比吸收光的特征波长要长； 2 荧光光谱通常只有一个荧光带； 3 荧光光谱与吸收光谱极为相似，成镜像对称关系。 下面介绍的荧光参数值，他们都是基于荧光的这些特性测定的。 1 2 3 1 荧光量子产率 荧光量子产率( f l u o r e s c e n tq u a n t u my i e l d ) 又称荧光量子效率，符号可表示 为西f 。荧光量子产率即荧光物质吸光后所发射的荧光的光子数与所吸收的激发光 的光子数之比值【2 9 1 。它的数值在通常情况下总是小于l 。西f 的数值越大表明该化 合物的荧光越强，荧光量子产率的测定通常通过参比法进行测定。 1 2 3 2 斯托克斯位移 荧光光谱较相应的吸收光谱红移，荧光与激发光之间存在能量差别，物体吸 收光子( 吸收) 的能量大于辐射光子的( 发光) ，因此发光光谱同吸收光谱相比， 3 香豆素一吲哚喹啉染料的合成、表征及光谱性能研究 发生红移现象。斯托克位移是用来衡量发射光与激发光能量差值大小的物理量。 称为斯托克位移( s t o k e ss h i f t ) 。这种现象是斯托克斯在1 8 5 2 年首次观察到的， 因此被称为斯托克斯位移。 1 2 3 3 荧光发射光谱 荧光发射光谱是由于分子吸收辐射后再发射的结果。使激发光的波长和强度 保持不变，而让荧光物质所发出的荧光通过发射单色器照射于检测器上，进行扫 描，以荧光波长为横坐标，以荧光强度为纵坐标作图，即为荧光光谱，又称荧光 发射光谱。 1 2 3 4 荧光激发光谱 激发光谱是引起荧光的激发辐射在不同波长的相对效率。让不同波长的激发 光激发荧光物质使之发生荧光，而让荧光以固定的发射波长照射到检测器上，然 后以激发光波长为横坐标，以荧光强度为纵坐标所绘制的图，即为荧光激发光谱。 1 2 3 5总荧光量 用不同波长的荧光强度来表示物质发射的荧光的强弱，而用该物质的发射光 谱的面积来表示荧光的量，称为总荧光量。 1 2 3 6 荧光寿命 当去掉外界激发光后，分子的荧光强度降到激发时最大荧光强度的e ，所需 要的时间，称为荧光寿命，用t 表示。荧光物质的分子受外界光激发后振动能级的 电子跃迁到高能态，当处于第一单线态电子激发态落至基态并发射出荧光，平均 寿命为1 0 咱秒。 1 2 4 分子内电荷转移( i c t ) 机理 所谓的分子内电荷转移f 3 0 引1 ，是指分子在激发态时发生分子内电子转移 ( e t ) ，造成正负电荷的分离，形成分子内电荷转移态( 即i c t 态) 。一般来说， 发生电荷转移的分子应包含电子给体( d o n o r ) 和电子受体( a c c e p t o r ) ，而且两者通 过共轭7 c 键连接，7 c 键提供电子转移的通道( 如图1 2 ) 。通过分子内电子转移，给 体提供电子，受体接受电子，形成一种电荷分离态，d + a 。，它的电子结构会发 生较大变化，与带有自由基d + 、a 的基态分子电子结构相似。例如胺上的n 原子 为s p 3 杂化，为金字塔构型，当其一个电子被激发并失去时，n 变为为s p 2 杂化为平 面三角形构型。处于激发态上的分子内电荷转移态分子是不稳定的，具有正负电 荷复合趋向而回到基态，要是这个过程为辐射跃迁，就会伴随i c t 荧光发射。分 子电荷转移态的稳定性受外界环境的影响较大，凡是能稳定正负电荷分离的因素 将会降低电荷转移态的能量，导致i c t 荧光光谱红移( 例如溶剂效应) ，反之则 会导致i c t 光谱蓝移。因此，当电子给体的给电子能力或电子受体的接受电子能 力增强时，i c t 荧光染料的荧光发射波长将发生红移。反之，其荧光发射波长将 发生蓝移。 4 典型的i c t 荧光探针分子是由荧光团与识别基团直接相连构成的，这类探针 的荧光团上分别连有推电子基( 电子给体) 和吸电子基( 电子受体) ，构成一个强的推 拉电子体系，并且推电子基或吸电子基团本身又充当识别基团或识别基团的一部 分。当识别基团与被分析物作用时，会对荧光团的电子给体的给电子能力或电子 受体的接受电子能力产生影响，减弱或增强电荷转移能力，从而导致荧光光谱的 变化，主要是使荧光光谱蓝移或红移。 1 3 荧光染料简介 1 3 1 荧光检测对染料的基本要求 一般认为适宜生物应用的荧光染料应该具有以下特征【35 】： 一、荧光量子产率( f l u o r e s c e n tq u a n t u my i e l d ) 西f o 5 ，研的数值越大表明 该化合物的荧光越强，检测下限越低，提高检测的灵敏度和准确性。 二、染料的最大发射波长最好接近于近红外区域，波长一般大于5 0 0 n m 。因 为生物体内存在很多的有机共轭小分子，例如嘌呤、嘧啶、各种氨基酸，蛋白质 分子等，他们在紫外区域都有吸收和发射光谱，如果荧光染料的吸收波长在紫外 或者较短波长区域，将会降低荧光探针的灵敏度，并且某些干扰分子的自发荧光 也会掩盖探针的发射光谱，从而使检测的结果出现偏差。 三、荧光染料应该具有较高的稳定性。在光照下、酸碱、较高温度等的条件 下，荧光染料都能够稳定存在，进而保持其化学、光谱性质的稳定性。 四、染料分子应该具有较好的细胞穿透能力和细胞内的溶解能力。染料分子 既要有一定的油溶性又要有一定的水溶性，油溶性是为了便于穿透细胞膜( 细胞 膜主要有磷脂分子组成) ，水溶性是为了有助于在细胞内很好的分散，进而发挥效 能。 五、染料基团对生物体不会造成伤害。依据设计荧光探针只对特定的靶标发 生作用，而不会对细胞内其它活性组织产生破坏作用，否则，荧光探针就会失去 5 香豆素一吲哚喹啉染料的合成、表征及光谱性能研究 生物应用价值。 1 3 2 荧光染料的分类 从1 6 世纪荧光现象被发现到现在，人们已先后设计合成出了很多荧光染料， 下面分别进行简单的介绍。 1 3 2 1 香豆素类荧光染料 香豆素【2 6 1 ( 见图1 3 ) 又名氧杂萘邻酮或邻羟基肉桂酸内酯，是香豆素类荧光 增白剂的基本结构。它最早是在18 2 0 年用酒精从黑香豆中提取得到的【3 引。 18 6 8 年，p e r k i n 用水杨醛与醋酐在无水醋酸钠存在下缩合，首次人工合成了香豆素。 香豆素以葡萄糖苷的形式广泛存在于自然界中，这种糖苷化合物能在酸性、酶或 紫外光照射下分解，产生新鲜甘草气味。因此，香豆素在烟草香精和日化香精中 占有很重要的地位，可与香兰素一起作为食品香料调味剂。除此之外，香豆素还 可在工业上用作橡胶塑料制品的除臭剂和电镀工业的光亮剂，香豆素化合物还是 重要的光敏剂和液晶用材料。通过掺杂到空穴传输材料聚乙烯咔唑( p v k ) 中，荧 光量子效率高、成膜性能优良的香豆素类荧光化合物还可用于有机电致发光材料。 香豆素有许多天然衍生物，还有许多合成衍生物，它们的用途相当广泛。 香豆素环各位置上取代基的性质对香豆素类化合物的功能影响很大，尤其是 3 位和7 位上取代基的作用更为明显。对香豆素化合物结构与荧光性能关系的研 究表明，香豆素类化合物所具有的荧光与7 位供电子基团向香豆素环内的内酯键 中的羰基发生分子内电荷转移有关，各种荧光性能可通过香豆素母体上吸供电子 基团的修饰来实现。7 位供电基和3 及4 一位吸电子基团性质的变化，可造成香豆 素化合物产生从红色到蓝绿色的蓝移 3 7 - 3 9 j 。 香豆素类化合物也是常用的农药，如非内吸性杀虫剂蝇毒磷c o u m a p h o r s ，抗 凝血性杀鼠剂杀鼠迷c o u m a t e t r a l y l 和间接抗凝血性杀鼠剂溴鼠隆b r o d i f a c o u m 等。香豆素类化合物又是一类天然药物，其呋喃香豆素类和呋喃并苯并香豆素类 化合物则是可广泛应用于光敏医药、光敏农药和分子生物学等领域。 1 3 2 2 罗丹明、荧光素类荧光染料 罗丹明、荧光素类荧光染料，具有大的摩尔吸光系数，较高的荧光量子收率， 和较长的激发波长，能满足使用绿激光器的激光诱导荧光( l i f ) 系统发展需要，在 液相色谱( l c ) 和毛细管电泳( c e ) 的分离及荧光检测时背景信号干扰较小。 6 簿品 硕r 上学位论文 r 2 r 1 i n r l r 2 0 h i i 图1 4 罗丹明( i ) 和荧光素( i i ) 的母体结构 罗丹i j y j ( r h o d a m i n e ) 是一种氧杂蒽类荧光染料，具有两种互变的分子结构( 图 1 5 ) ，一种被认为是醌式( 1 ) ，另一种是内酯式( 2 ) 。罗丹明荧光染料在中性和酸 性条件下是以醌式存在的，此结构的罗丹明在可见光区有很强的吸收和荧光：在 碱性条件下以内酯式存在，内酯式的罗丹明在可见光区无荧光【4 0 4 2 1 。这一点与另 一类重要的氧杂葸类荧光染料荧光素正好相反。 r 2 1 r 2r 2 r 1 n o h 一 r 。一 _ _ _ _ _ _ _ _ _ - _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ - _ _ _ _ _ - _ _ _ _ _ _ _ _ - _ _ _ _ l _ 一 h + 图1 5 罗丹明的两种形态 1 醌式，共轭有荧光；2 内醌式，不共轭无荧光； 2 n r i r 2 另外罗丹明类荧光染料适用的p h 值范围较宽( 可低于生物体的p h 值) ，还可 以通过对母体的修饰满足不同使用条件( 例如：最大吸收波长，亲水性能，最大发 射波长，量子收率等) 的需要。所以该类荧光探针已广泛的应用于p h 检测、小分 子检测和复杂生物体系的研究等领域 4 3 , 4 4 j 。 1 3 2 3 氟化硼络合二吡咯甲川类荧光染料的基本结构和性能简介 氟化硼络合二吡咯甲川( 简称b o d i p y ) 类荧光染料是近二十几年才发展起来， 并受到广泛重视的一种较新的荧光化合物。染料的母体结构如图1 6 所示，其核 心是左右两个吡咯环、中间一个硼氮六元杂环，三个环呈非常好的共轭的平面结 构，与硼原子相连的两个氟原子位于b o d i p y 核心平面的两侧。 b o d i p y 类荧光染料【2 7 , 3 5 , 4 5 具有非常优异的光物理性质。诸如：摩尔消光系 数较大，具有很高的荧光量子产率，光谱性质稳定，不易受到溶剂极性和p h 值 7 香豆索一吲哚喹啉染料的合成、表征及光谱性能研究 的影响。荧光光谱峰宽较窄。b o d i p y 类荧光染料在生物分析领域、d n a 测序和 d n a 标记领域等领域有着非常广泛的应用。 图1 6b o d i p y 化合物的母体结构 尽管氟硼荧染料有诸多的优点，但还是有一些不尽如人意的地方。比如氟硼 荧染料难于引入活性基团，使应用方面收到了很大限制。氟硼荧染料的合成路线 较长，对操作者要求较高，合成周期较长，收率一般很低，纯化表征较困难。另 外氟硼荧染料的量子产率相对较低等缺点。 总结以上所描述的几类荧光染料，我们可以发现，这些染料都存在着各种缺 陷，在应用上存在很大的局限性。因此，设计新型的性能优异的荧光染料就成为 目前荧光染料发展和应用的迫切需要，菁类荧光染料是一类非常优秀的荧光染料， 具有其他染料无法比拟的优越性，例如与其他染料相比，吲哚类菁染料具有：摩 尔消光系数大、荧光性质好、最大吸收波长可调谐范围大、易于合成并且有相对 较高的稳定性，具有较好的细胞穿透能力和细胞内的溶解能力，对生物体应该没 有或者仅有极小的毒害等优点。下面我们将详细的介绍该类荧光染料的特点及最 新研究动向。 1 3 3 吲哚菁染料类荧光染料 1 3 3 1 菁染料结构 r 3 i r 1 y i z r l ，r 2 2a l k y l ，a r y l ，e t c x = c i ，b r ，i ，c 1 0 4 ，e t e r 3 ，r 4 ，r 5 ，p - 6 = h ，c h 3 ，s 0 3 h ，o c h 3 ，e t c y = o ，s ，n ，c h ( c h 3 ) 2 ，e t c n ；0 ，1 2 z 。- c _ ，一c 2 c 。 图1 7 菁类染料的基本结构 8 硕十学位论文 根据甲j i i 链两端母核是否相同，可以将其分为对称型和不对称型吲哚菁染料， 根据共轭甲川链上的碳原子数n 可以将染料分为一甲川菁染料( 单菁染料) ，三甲 川菁染料( c y 3 或一碳菁染料) ，五甲川菁染料( c y 5 或二碳菁染料) 和七甲川菁 染料( c y 7 或三碳菁染料) 等1 4 引。 由于苯环上、n 上或吲哚环3 位碳上可以引入不同的取代基团，而不同的取 代基团具有不同的亲水性，从而导致不同的吲哚菁染料存在水溶性差异。根据染 料的溶解性能，又可将吲哚菁染料分为水溶性和非水溶性两大类，水溶性的吲哚 菁染料大都被当作荧光标记试剂应用于生物荧光分析方面【4 。 1 3 3 2菁染料合成 一般菁染料的合成包括三个步骤： 1 带有活性甲基的吲哚及其衍生物( 碱性杂环中间体) 的合成； 2 碱性杂环中间体与成盐剂( 也称烷基化试剂) 反应得到杂环季铵盐； 3 杂环季铵盐与缩合剂进行缩合反应得到目标染料。 常见的缩合剂有2 一氯- 1 - 甲酰基一3 一羟甲基环己烯等【4 引。早期w i l l i a m s 制取 “豆粉蓝菁染料，是由喹啉( 后发现含有4 甲基喹啉杂质) 和碘戊烷反应，再用 氨处理，得到。之后，大量结构各异的菁染料相继合成出来。其中常见的合成半 菁染料的方法是：在合适的碱催化下，季铵盐与取代的苯甲醛发生缩合反应， k o r a i n e m 等合成了系列二甲川i 菁染料，图1 8 示。 叩却r + r b a s e e t o h r r = a l k y lg r o u p ； x = n m e 2 o m e ，o h ，h ： a = b r i 图1 8 菁染料合成路线 + p h 、卤肖朋詈 r = c 4 h 8 s o f 图1 9 吲哚三碳菁染料合成路线图 1 9 9 2 年，l i p o w s km 等4 9 】利用乙醇作溶剂，醋酸钠作催化剂合成了一种吲哚 三碳菁染料( 如1 9 所示) 。七甲川链结构中的不饱和六元桥环上的氯原子可以与 胺、酚和硫醇等发生亲核取代反应，生成一系列通过氨键、醚键和硫醚键等相连的 9 香豆素一吲哚喹啉染料的合成、表征及光谱性能研究 取代衍生物。 1 9 9 5 年，p a t o n a yg 等1 5 0 】报道了合成吲哚三碳菁染料( 如1 1 0 所示) 反应条件 较为简便的方法，该法用正丁醇和苯( v ：v = 7 ：3 ) 的混合物作为反应溶剂，向其中加 入含有活性甲基的四氮杂环基盐( 2 e q ) 和2 一氯一卜甲酰基一3 一( 羟亚甲基) 环己烯 ( 1 e q ) ，加热回流反应。该种方法的突出优点就是不使用任何催化剂，反应过程中 产物水与苯能形成共沸物，利用油水分离器除去水，能够使反应进行的更为彻底。 r u 卜 + o h b u t a n o l b e n z e n e yr x ah ( c h 2 ) 4 s 0 3 bh c 2 h 5 ( i ) eh ( c h 2 ) 3 n h 2 h b r ( b r ) 图1 1 0 菁染料的合成路线 y 慵z - i rx yr x do c h 3 eo c h 3 h o h c ( c h 2 ) 4 s 0 3 c 2 h 5 ( i ) c l b u t a n o lb e n z e n e y圣丛 a h c m e 2 ( c h 2 ) 4 s 0 3 bh c m e 2 c 2 h 5 ( i ) c h c m e 2( c h 2 ) 3 n h 2 h b r ( b r ) d h c m e 2 c m e 2 ( c h 2 ) 4 s 0 3 c h o y圣隧 e o c h 3c m e 2 c 2 h 5 ( i ) f h o c 2 h 5 ( i ) g h s c 2 h 5 ( i ) 图1 1 1 七甲川菁染料的合成路线 2 0 0 1 年p o t o n a yg t 5 1 。5 3 1 报道了合成七甲川菁染料新的更为简便的方法，图1 1 1 示。该方法首先用2 ，3 ，3 三甲基吲哚和相应的卤代烃合成季胺盐，而后使用正 丁醇和苯( v ：v = 7 ：3 ) 的混合物作为反应溶剂，加热回流n 烷基取代的季胺盐和2 1 0 硕士学位论文 氯一1 甲醛一3 ( 羟亚甲基) 环己烯，不采用催化剂，产率大大提高。合成的这些染料 可用于做生物分子荧光标记试剂。 s t e p h e n j 等5 4 1 采用固相合成方法，通过半菁染料中间体在磺酰氯树脂上的捕 获、活化，再利用杂环碳亲核试剂切断合成了不对称菁染料，从而大大缩减了纯 化步骤，提高了合成效率。 y ，z 2 c r 2 , n h 2 ，o ，s ( c h h ； r = a l k y l ； n - - 3 图1 1 2菁染料的结构式 1 3 3 3菁染料在离子检测和生物分析方面的应用 吲哚菁染料具有摩尔消光系数大，荧光量子产率高，最大吸收波长可调谐范围 大，荧光发射波长范围宽( 一般在6 0 0 - 1 0 0 0 n m 的近红外区) 等特点，因此可大大避 免生物自身的荧光背景干扰【5 5 1 ；该类染料与生物基质结合后具有强烈的荧光增强 作用、相对较好的稳定性等优点，作为一种新型荧光探针已在生物分析、生物芯 片、d n a 测序、荧光免疫分析、流式细胞测量、临床诊断分析与治疗等生命科学 前沿领域有了重要应用p 6 。 以下我们将着重介绍菁染料在探针和生物分析方面的应用 李瑶等【5 7 】利用吲哚菁染料c y 3 ，c y 5 分别标记到两种组织的c d n a ，制备成c d