（有机化学专业论文）水溶性黄酮化合物的生物合成、分离及应用基础研究.pdf

导师：王三永( 教授级高工) 李春荣( 教授级高工) 王辉( 副教授) 专业：有机化学 华南师范大学化学与环境学院 中国广州 2 0 1 0 5 水溶性黄酮化合物的生物合成、分离 及应用基础研究 专业名称：有机化学申请人姓名：臧国雄导师姓名：王三永( 教授级高工) 摘要： 天然黄酮类化合物大多具有显著的生理活性，在医药、食品以及化工等行业已有 广泛的应用。大多数黄酮化合物在水中的溶解度很小，这在一定程度上限制了它们的 应用范围。通过化学合成手段，使黄酮分子上增加脂肪胺基、磷酸酯等可增加其水溶 性，但可能同时会产生一些意外的副作用。采用生物合成或从天然产物中分离是开发 水溶性黄酮的最佳途径。 本文利用环糊精葡萄糖基转移酶( c g t a s e ) 、柚苷酶将葡萄糖糖基转移到黄酮分 子上，或将黄酮分子上的鼠李糖切除，合成了4 种水溶性黄酮化合物：a 葡萄糖基异 槲皮素、q 葡萄糖基槲皮素、a 一葡萄糖基新橙皮苷二氢查耳酮、橙皮素二氢查耳酮7 o 葡萄糖苷。本文研究了c g t a s e 的产酶工艺及条件优化，在最佳条件下，粗酶液的酶 活可以达到3 5 0 0 u m l 。在发酵培养得到c g t a s e 后，我们对生物合成上述4 种化合物 的工艺进行了研究，探讨了温度、p h 值、投料比等因素对生物合成的影响。对生物 合成得到的目标化合物进行了分离提纯，主要是采用大孔吸附树脂柱h p 2 0 和葡聚糖 凝胶柱l h 2 0 ，最终得到了产物。产物经谱图数据得以证实。 本文还研究了天然水溶性黄酮的代表槲皮素3 ，4 二葡萄糖苷的分离。我们 研究了不同品种洋葱中的黄酮类型，对提取、纯化工艺进行了研究。我们以黄皮洋葱 为原料，经过水提取、大孔吸附树脂分离、葡聚糖凝胶柱纯化最终得到了高纯度的槲 皮素3 ，4 二葡萄糖苷。 大多数黄酮类化合物都具有a - 淀粉酶抑制活性，因此本文首次研究了黄酮分子上 引入葡萄糖基对q 淀粉酶抑制活性及其他化学性质的影响。通过测定芦丁、槲皮素、 异槲皮素、a 葡萄糖基异槲皮素、舡葡萄糖基槲皮素、槲皮素3 ，4 二葡萄糖苷等六 个化合物的a 淀粉酶抑制率，初步发现：1 ) 黄酮分子上引入葡萄糖糖基，基本不影 响黄酮本身的q - 淀粉酶抑制活性；2 ) 水溶性增加，其洳淀粉酶抑制活性也不会有明 显提高。 我们还首次研究了新橙皮苷二氢查耳酮分子引入多个葡萄糖基或切除鼠李糖对 其甜味的影响。我们发现，这种方式的分子结构修饰不会提高或减少甜味，但是可改 善甜味质量，最重要的是其水溶性增加了几倍至几十倍，大大拓展了应用范围。 关键词：水溶性黄酮；环糊精葡萄糖基转移酶；生物合成；分离；活性研究 t h es t u d yo ns e p a r a tio na n dbio s y n t h siso fq u e r c e tin f l a v o nid s a n dt h eirb a sica p p lic a tio n m a j o r ：o r g a n i cc h e m i s t r yn a m e ：z a n gg u o x i o n gs u p e r v i s o r ：w a n gs a n y o n g a b s t r a c t m o s to fn a t u r a lf l a v o n o i d sh a v e s i g n i f i c a n tp h y s i o l o g i c a la c t i v i t i e s ，a n ds o m eo ft h e m h a v eb e e nu s e di nt h ep h a r m a c e u t i c a l , f o o da n dc h e m i c a li n d u s t r y b u tt h e i rt i t t l ew a t e r - s o l u b i l i t yl i m i t st h e i ra p p l i c a t i o nt oac e r t a i ne x t e n t t h ef a t t ya m i n em o l e c u l e s ，p h o s p h a t e c o u l db ea d d e dt of l a v o n o i d sb yc h e m i c a ls y n t h e s i sf o rt h e i ri n c r e a s e dw a t e r - s o l u b i l i t y , b u t t h em e t h o dm a y b ec a u s eu n d e s i r a b l ep h y s i o l o g i c a la c t i v i t yo rt o x i c i t yi nf i n a lp r o d u c t s s o b yb i o s y n t h e s i so ri s o l a t e df r o mn a t u r a lp r o d u c t sm a yb et h eb e t t e rm e t h o d s i no u rs t u d y , w es y n t h e s i z e df o u rk i n d so fw a t e r - s o l u b l ef l a v o n o i dc o m p o u n d s ， a - g l u c o s y lq u e r c e t i n , a - g l u c o s y li s o q u e r c e t i n , a - g l u c o s y ln e o h e s p e r i d i nd i h y d r o c h a l c o n e ， h e s p e r e t i n - 7 - o - g l u c o s i d e ，w i t ht h eh e l po fc y c l o d e x t r i ng l y c o s y l t r a n s f e r a s e ( c g t a s e ) a n d n a r i n g i n a s e w er e s e a r c h e dt h ep r o d u c t i o np r o c e s so ft h ec g t a s e ，a n di nt h e b e s t c o n d i t i o n s ，t h ee n z y m ea c t i v i t yi sa b o u t3 5 0 0 u m 1 f o l l o w i n g ，w es t u d i e dt h e i n f l u e n t i a l f a c t o r so nt h eb i o l o g i c a ls y n t h e s i s ，s u c ha st e m p e r a t u r e ，p h , f e e dr a t i oa n dt i m e w e p u r i f i e dt a r g e tc o m p o u n d sm a i n | yb yh i g h l yp o r o u ss y n t h e t i cr e s i nd i a i o n ( h p - 2 0 ) a n d s e p h a d e xl h 2 0 ，a n dt h es t r u c t u r e sw e r ei d e n t i f i e db y1 h n m r , ”c n m r , e s i m sa n d h p l c o u rp a p e ra l s os t u d i e dq u e r c e t i n3 , 4 d i g h c o s i d e ，w h i c hi st h er e p r e s e n t a t i v eo ft h e n a t u r a lw a t e r - s o l u b l ef l a v o n o i d s w ee x t r a c t e da n dp u r i f i e dd i f f e r e n tf l a v o n o i d sf r o m d i f f e r e n tv a r i e t i e so fo m o i l s of r o mw a t e re x t r a c t i o mh p - 2 0 ，s e p h a d e xl h 一2 0w ed i s c o v e r t h a tq u e r c e t i n - 3 ，4 - d i g l u c o s i d ei sm a i n l ye x i s t e n c ei ny e l l o wo i l i o l l w es t u d i e dt h e s ec o m p o u n d s q a m y l a s ei n h i b i t o r ya c t i v i t ya n do t h e rc h e m i c a l h i p r o p e r t i e sf o rt h ef i r s tt i m e w ed e t e r m i n e dt ：h ea a m y l a s ei n h i b i t o r ya c t i v i t ya b o u tr u t i n , q u e r c e t i n , i s o q u e r c e t i n , a - g l u c o s y li s o q u e r c e t i n , a g h c o s y lq u e r c e t i na n dq u e r c e t i n3 , 4 - d i g h c o s i d e w cd i s c o v e r e dt h a tt h ea - a m y l a s ei n h i b i t o r ya c t i v i t yw i l ln o td e c r e a s ew h e n t h e g l u c o s e a r ea d d e dt of l a v o n o i d s ，a n dt h a ti nt h en a t u r e ，t h ew a t e r - s o h b i l i t ya n d w a t e r - i n s o l u b i l i t yf l a v o n o i d sh a v et h e5 f l l n e 伍- a m y l a s ei n h i b i t o r ya c t i v i t y w ea l s os t u d i e dt h ea w e e t n e s sa b o u ta - g l u c o s y ln e o h e s p e r i d i nd i h y d r o c h a l c o n ea n d h e s p e r e t i n - 7 - 0 一g h c o s i d e w ef o u n dt h a t ，t h et w om e t h o d s ，a d d e dg l u c o s et on e o h e s p e r i d i n d i h y d r o c h a l c o n ea n dc u tt h er h a r n n o s e ，w i l ln o ti n c r e a s eo rr e d u c et h es w e e tb u ti m p r o v e t h eq u a l i t y a n dt h em o s ti m p o r t a n ti st h ew a t e r - s o l u b i l i t yh a v eah i g hi n c r e a s i n g s ot h e y w i l lh a v ea w i d e l ya p p l i c a t i o n k e yw o r d s ：w a t e r - s o l u b i l i t yf l a v o n o i d ；c g t a s e ；b i o s y n t h e s i s ；i s o l a t i o n ；a c t i v i t ys t u d y i v 目录 摘要：i a b s t r a c t i i i 第一章绪论1 1 1 黄酮类化合物的研究进展1 1 1 1 结构与分类1 1 1 2 黄酮类化合物的提取与分离纯化3 1 1 3 黄酮类化合物的生物活性研究8 1 1 4 黄酮类甜昧剂的研究进展1 0 1 2 黄酮类化合物的水溶性衍生物的研究1 1 1 2 1 在酚羟基上引入亲水基团1 2 1 2 2 在其他位置引入亲水基团1 2 1 3 环糊精葡萄糖基转移酶的研究现状1 3 1 3 1 对嗜碱芽孢杆菌的研究1 4 1 3 2 发酵工艺条件的研究1 4 1 4 旷淀粉酶抑制活性的研究1 5 1 5 本研究的意义1 5 第二章实验部分17 2 1 实验仪器与材料1 7 2 2 环糊精葡萄糖基转移酶的发酵培养1 8 2 2 1 培养基配方18 v 2 2 2 菌种的培养1 8 2 2 3 菌种的生长曲线1 8 2 2 4 粗酶液的发酵制备。l8 2 2 5 酶活力的测定f 4 1 8 2 3 槲皮素的制备1 9 2 3 1 芦丁的提取与精制1 9 2 3 2 槲皮素的制备2 0 2 3 3 工艺流程。2 0 2 4 水溶性黄酮化合物的生物合成2 1 2 4 1 合成路线设计2 1 2 4 1 铲g iy c o s yi q u e r c e tin 的合成实验2 3 2 4 2 旷giy c o s yi is o q u e r c e tin 的合成。2 5 2 4 3h e s p er e tin - 7 - o - g lu c o sid e 的合成2 5 2 4 4 旷g ly c o s yi h e s p e r e tin 的合成2 6 2 5 水溶性黄酮化合物的分离纯化2 6 2 5 1 提取实验2 6 2 5 2 分离纯化实验2 7 2 6 猪胰液q 一淀粉酶( p p a ) 抑制活性测定方法【4 3 。4 5 1 2 8 2 6 1 溶液的配制：2 8 2 6 2 测定方法2 8 第三章结果与讨论2 9 3 1 黄酮化合物的生物合成部分2 9 附图4 9 v 酮( f l a v o n o n c ) 及z 氢黄酮醇( f l a v a n o n 0 1 ) 类，如陈皮苷；异黄酮( i s o f l a v o n e ) 及异黄酮醇 ( i s o f l a v o n 0 1 ) 类，如葛根素；黄 ) 完醇( f l a v a n 0 1 ) 类，如儿茶素；花色素( a n t h o c y a n i d i n s ) 类， 如飞燕草素；双黄酮( b i f l a v o n o i d s ) 类，如银杏素；查耳酮( c h a l c o n e s ) 类，如红花苷； 其他黄酮类，如异芒果素。黄酮类化合物具有多个苯环和酚羟基结构【1 】o 水溶性黄酮化合物的生物合成、分离及应用基础研究 7 6 7 6 图1 1 黄酮类的结构 4 表1 1 黄酮类化合物的分类及基本结构 4 5 类型基本结构类型基本结构 o e s - o o 2 山酮 呤洲o o o 水溶性黄酮化合物的生物合成、分离及应用基础研究 1 1 2 黄酮类化合物的提取与分离纯化 1 1 2 1 黄酮类化合物的提取 黄酮类化合物在花、叶、果等组织中，一般多以苷的形式存在，而在木部坚硬组 织中，则多以游离苷元形式存在。黄酮类化合物的提取的传统方法主要有：有机溶剂 法提取、热水提取、碱提取和超滤提取等，近年又陆续出现了超声技术提取、微波法 提取和超临界流体萃取法。 1 有机溶剂提取法： 利用黄酮类化合物与混入的杂质极性不同，选用不同溶剂萃取，可达到精制纯化 的目的。这是目前国内外使用最广泛的方法，很容易实现工业化生产。常用的有机溶 剂有甲醇、乙醇、丙酮等，但由于甲醇、丙酮等的毒性较大，因此一般采取乙醇为提 取溶剂。可用冷浸或加热抽提法提取，醇的浓度在6 0 - - - 9 5 之间，提取次数一般 为2 3 次【2 】。 2 热水提取法 由于有些黄酮苷类物质易溶于水，所以含这类黄酮苷类物质较高的原料，可以采 取热水提取法。浸提、煮提均可，提取次数一般为2 - 4 次，但由于水的极性大，易把 蛋白质、糖类等溶于水的成分浸提出来，从而使提取液存放时易腐败变质，为后续的 分离带来困难，但是因为消耗溶剂的成本比其他方法低，设备简单，仍为一种可取的 提取方法【3 】。 3 碱提酸沉法 黄酮类化合物分子中多有酚羟基，显酸性，故可用碱性水提取，再将碱水提取液 调成酸性，黄酮苷类即可沉淀析出。在用碱液提取时，所用碱的浓度不宜过高，以免 在强碱条件下加热破坏黄酮类化合物的母核。在加酸酸化时，酸性也不宜过强，以免 生成样盐，致使析出的黄酮类化合物又重新溶解，降低产品收率。当药材中含有大量 水溶性黄酮化合物的生物合成、分离及应用基础研究 果胶、粘液等水溶性杂质时，如花、果类药材，宜用石灰乳或石灰水代替其他碱性水 溶液进行提取，以使上述含羧基的杂质生成钙盐沉淀，不被溶出，这将有利于黄酮类 化合物的纯化处理【4 】。 4 超滤提取法 超滤是以多孔性半透膜超滤膜为分离介质，利用不对称微孔结构，常温下依靠 施压，使提取液流经膜面而使高分子杂质被截流的分离技术。超滤膜的孔径在几个纳 米至几百个纳米之间，能够在1 0 3 1 0 6 粒径范围内实现分子截留。由于大多数黄酮类 化合物的分子量在1 0 0 0 以下，而非有效成分如大多数的多糖、蛋白质、鞣质等其分 子量多在5 0 0 0 0 以上，因而使用超滤能够有效去除蛋白质、多肽、粘液质、鞣质、大 分子色素、淀粉、热原等，达到除菌、除热原、提高药液澄明度以及提高有效成分含 量等目的。选用超滤法可以提高提取物的纯度，并且在提取生产过程中，可以减少废 水排放，避免臭水、污水的产生，能降低生产成本【5 】。 5 超声波辅助提取 超声技术提取是目前比较新的提取方法，具有提取效率高、不破坏有效成分的特 点，目前已广泛用于提取生物碱、苷类等生物活性成分。对超声波辅助提取银杏叶中 黄酮苷的研究表明，超声波辅助提取可以强化提取效果，缩短提取时间，提高原料的 利用率。 6 微波辅助提取 近年来微波辅助提取技术，因其具有提取时间短、溶剂用量少及提取效率高等优 点，越来越受到重视。研究报道，利用微波辅助提取法提取刺五加中的黄酮类化合物， 结果表明，与索氏提取法相比，微波辅助提取法提取得率可提高4 0 。 7 超临界流体萃取 随着国际上超临界流体提取技术迅速发展，用该技术提取植物中的活性成分愈加 广泛。与有机溶剂法相比，超临界流体提取技术具有提取效率高、无溶剂残留、活性 成分不易被破坏等优点，还可以实现选择性萃取和分离纯化 6 1 。研究表明，以银杏叶 4 水溶性黄酮化合物的生物合成、分离及应用基础研究 黄酮为例，所得提取物中银杏黄酮含量为2 8 ，银杏内酯含量为7 2 ，均高于现行 的国际标准。 1 1 2 2 黄酮类化合物的分离纯化 用上述方法提取的黄酮类化合物仍然是一个混合物，不仅是含有其它杂质的粗 品，而且是几种黄酮类成分的混合物，需进一步分离纯化。常用的方法有柱层析法、 重结晶法、铅盐沉淀法和高效液相色谱法等。 ( 一) 柱层析法 1 硅胶柱色谱法 硅胶柱色谱法是实验室分离黄酮类化合物常用分离方法之一，主要适用于分离异 黄酮、二氢黄酮、二氢黄酮醇及高度甲基化( 或乙醚化) 的黄酮。少数情况下，在加 水活化后也可用于分离极性较大的化合物，如多羟基黄酮醇及其甙类等。由于黄酮类 化合物与硅胶有很强的吸附能力，难洗脱，而且与硅胶中很多金属离子络合而不能被 洗脱，所以应预先用浓盐酸处理硅胶除去金属离子，以免干扰分离效果。 2 大孔吸附树脂法 大孔吸附树脂法是2 0 世纪6 0 年代发展起来的，近年来逐渐被应用于植物化学成 分的提取分离，具有吸附快、吸附容量大、洗脱率高、树脂再生简单等优点川，适合 于工业化生产。 大孔吸附树脂是一类不含离子基团的网状结构高分子聚合物吸附剂，一般是以苯 乙烯和丙烯酸酯为单体，加入二乙烯苯为交联剂，甲苯、二甲苯为致孔剂，它们相互 交联聚合形成了多孔骨架结构。大孔树脂可分为非极性和极性两大类，根据极性的大 小还可以分为弱极性、中等极性和强极性等。大孔吸附树脂的理化性质稳定，不溶于 酸、碱及有机溶剂，不受无机盐及强离子低分子化合物的影响。 大孔吸附树脂吸附符合以下规律：非极性物质在极性介质( 水) 内被非极性吸附 剂吸附；极性物质在非极性介质中被极性吸附剂吸附；带强极性基团的吸附剂在非极 性溶剂里能很好的吸附极性化合物。 水溶性黄酮化合物的生物合成、分离及应用基础研究 目前，天然药物化学成份分离中最常用的树脂有d 1 0 1 、d a - 2 0 1 、a b 8 、h 1 0 3 、 l d 6 0 5 、c d a - 4 0 、d 1 3 0 0 型等，此外还有n k a 和s i p 系列嘲。 3 聚酰胺柱色谱 对分离黄酮类化合物来说，聚酰胺是较为理想的吸附剂。其吸附强度主要取决于 黄酮类化合物分子中羟基的数目与位置及溶剂与黄酮类化合物或与聚酰胺之间形成 氢键缔合能力的大小。聚酰胺柱色谱可用于分离各种类型的黄酮类化合物，包括苷及 苷元、查耳酮与二氢黄酮等【9 】。以b a p t i s i a l e c o n t c i 为例：黄酮类化合物从聚酰胺柱上 洗脱时大体有下述规律： ( 1 ) 苷元相同，洗脱先后顺序一般是：叁糖苷、双糖苷、单糖苷、苷元。 ( 2 ) 母核上增加羟基，洗脱速度即相应减慢。当分子中羟基数目相同时，羟基位置 对吸附也有影响，聚酰胺对处于羰基间位或对位的羟基吸附力大于邻位羟基，故洗脱 顺序为：具有邻位羟基黄酮，具有对位( 或间位) 羟基黄酮。 ( 3 ) 不同类型黄酮化合物，先后流出顺序一般是：异黄酮、二氢黄酮醇、黄酮、黄 酮醇。 ( 4 ) 分子中芳香核、共轭双键多者易被吸附，故查耳酮往往比相应的二氢黄酮难于 洗脱。上述规律也适用于黄酮类化合物在聚酰胺薄层色谱上的行为。 4 葡聚糖凝胶柱色谱法 葡聚糖凝胶分离黄酮类化合物的机理是：分离游离黄酮时，主要靠吸附，凝胶对 黄酮类化合物的吸附程度取决于游离酚羟基的数目。分离黄酮甙时，则分子筛的性质 起主导作用。 目前，常用的葡聚糖凝胶主要有s e p h a d e x - g 及s c p h a d e xl h 2 0 两种型号。 s e p h a d e xl h 2 0 是s c p h a d e x - g 经羟丙基化处理后得到的产物。与s c p h a d e x - g 比较， s e p h a d e xl h 2 0 分子中羟基总数虽无改变，但碳原子所占比例却相对增加。因此，与 s e p h a d e x - g 仅具有亲水性不同，它不仅可在水中应用，也可在极性有机溶剂或与水组 成的混合溶剂中使用。s e p h a d e xl h 2 0 除保留有s e p h 2 a d e x g 原有的分子筛特性 外，在由极性与非极性溶剂组成的混合溶剂中常常起到反相分配色谱的效果，适用性 6 水溶性黄酮化合物的生物合成、分离及应用基础研究 广，最适用从硅胶、大孔树脂和聚酰胺柱色谱中分离出来的黄酮类化合物糖甙配基及 糖甙的最终纯化【1 0 1 。 一般情况下，葡聚糖凝胶柱色谱中常用的洗脱剂有： ( 1 ) 碱性水溶液( 如0 1 m o l ln i - h o h ) ，含盐水溶液( o 5m o l ln a c i 等) 。 ( 2 ) 醇及含水醇，如甲醇，甲醇一水( 不同比例) ，叔丁醇一甲醇( 3 ：1 ) 、乙醇等。 ( 3 ) 其他溶剂，如含水丙酮、甲醇一氯仿等。 ( 二) 重结晶法 结晶法是选用合适的溶剂，将混合物加热溶解，形成有效成分的饱和溶液，趁热 过滤除去不溶的杂质，滤液低温放置或蒸去部分溶剂后再低温放置，使有效成分大部 分析出结晶。由于初析出的结晶总会带一些杂质，因此需要通过反复结晶，即所谓重 结晶的方法才能得到高纯度的晶体。结晶用溶剂的选择是最重要因素之一，一般要其 对被结晶成分热时溶解度大、冷时溶解度小；对杂质或冷热时都溶解，或冷热时都不； 溶解；与被结晶成分不发生化学反应；沸点不宜太高。由于黄酮类化合物在冷或热甲 醇、乙醇、丙酮以及水中溶解度的差异，因此可以采用重结晶法进行分离。 ( 三) 铅盐沉淀法 此法过去曾用于研究，目前已很少采用。一般是在乙醇或甲醇溶液中依次加入适 量中性醋酸铅、碱式醋酸铅水液，分别使具有邻二酚羟基成分( 包括黄酮) 及含羟基 成分，具有一般酚羟基的成分分离，再分别将铅盐沉淀悬浮于醇中，脱铅后得到成分。 ( 四) 高效液相色谱法 高效液相色谱法具有分离效率高、分析速度快、检测灵敏度高等特点，且适应于 高沸点、大分子、强极性和热稳定性差的化合物的分离分析。近年来，高效液相色谱 法已经广泛用于黄酮类化合物的分离纯化以及定量和定性分析或少量样品的制备上。 7 水溶性黄酮化合物的生物合成、分离及应用基础研究 1 1 3 黄酮类化合物的生物活性研究 黄酮类化合物具有抗氧化、消炎、调节毛细血管的脆性与渗透性、保护心血管系 统、解痉、抑菌、抗肿瘤、抗肝炎病毒等具有重要生物活性，有很高的药用价值。很 多中草药都含黄酮类化合物，而且已经证明黄酮类化合物是其中的有效成份。 1 1 3 1 抗心血管疾病功能 黄酮类化合物具有抗心血管疾病的功斛1 1 d 3 1 。机体内的整个心血管系统( 即心、 动脉和静脉) 都依赖于毛细血管，这些微细的血管的平均直径约0 2 m m ，是微循环系 统的一个部分，为静脉和动脉的最小支脉的联系环节。已知毛细血管破损是维生素c 缺乏病坏血病的一个特征，维生素c 在维持毛细血管的健康方面十分重要。虽然 黄酮类化合物影响毛细血管脆性与渗透性的机制目前尚未弄清，但由于黄酮类化合物 与维生素c 在自然界总是同时存在，故可推测它们的功能是共同加强毛细血管和调节 其渗透性，防止毛细血管与结缔组织的内出血与破裂，共同建立起一个抗传染病的保 护屏障。 1 1 3 2 抗氧化功能 自由基性质活泼，有极强的氧化反应能力，对人体有很大的危害性。在体内自由 基和脂质过氧化作用使多种大分子成分，如核酸、蛋白质产生氧化变性，d n a 交联 和断裂，导致细胞结构改变和功能破坏，而引起癌症、衰老等退变性疾病【1 4 】。 黄酮化合物是优良的活性氧清除剂和脂质抗氧化剂，其清除自由基和抑制脂质过 氧化的机理是：与超氧阴离子反应阻止自由基反应的引发，与铁离子络合阻止羟基自 由基的生成，与脂质过氧化基反应阻止脂质过氧化过程。大量研究表明，b 环上的羟 基是黄酮类物质抗氧化、清除自由基的主要活性部位。但当b 环酚羟基数目增加到一 定量时，抗氧化活性不再随酚羟基数目的增加而增大【”】。当b 环酚羟基数目相同时， 含邻二酚羟基的黄酮的抗氧化活性明显优于b 环含间二酚羟基的黄酮，它的主要结构 差别仅在b 环上的酚羟基取代方式【l 引。 8 水溶性黄酮化合物的生物合成、分离及应用基础研究 1 1 3 3 抗肿瘤功能 抗肿瘤作用是黄酮类化合物的一个研究热点，目前已发现具有抗癌抗肿瘤作用的 黄酮类化合物主要有槲皮素、水飞蓟素、芦丁、柚皮苷、杨梅黄酮等，主要是通过3 个途径来实现的，即1 ) 对抗自由基作用；2 ) 直接抑制癌细胞生长；3 ) 对抗致癌、 促癌因子。黄酮类化合物抗癌抗肿瘤药理作用的构效关系研究表明：黄酮抗癌抗肿瘤 作用与其抗氧化抗自由基作用有很大的关系，而黄酮类化合物抗自由基作用强弱受其 结构影响，如c 2 ，c 3 位双键，酚羟基取代模式及数目和羟基甲氧基取代以及b 环 上存在邻二酚羟基，都影响其抗癌效果1 7 1 。朱振勤等【1 8 1 研究了1 2 种黄酮的构效关系 发现：羟基在b 环上时比羟基在a 环上具有更强的抗自由基能力；c 3 位的羟基或 配糖体也影响其清除自由基的活性。 1 1 3 4 抗肝脏病毒功能 研究表明，从水飞蓟( s i l y b u mm a r i a n u m ) 种子中得到的水飞蓟素( s i l y d i a n i n ) 、 异水飞蓟素( s i l y d i a n i n ) 及次飞蓟素( s i l y c h r i s t i n ) 等黄酮类物质经动物试验及临床 实践均证明有很强的保肝作用。临床上用以治疗急、慢性肝炎，肝硬化及多种中毒性 肝损伤等均取得了较好的效果。另外，王根生等【1 9 】报道甘草类黄酮( f l a v o n o i d so f g l y e y r r h i z a ，f g ) 给药可明显抑制小鼠肝脏m d a 增高和还原性谷胱甘肽的耗竭，其作 用呈一定的量效关系，电镜检查表明f g 可保护乙醇所致肝细胞超微结构的损伤；其 它一些黄酮化合物如淫羊藿黄酮、黄芪素、黄芪苷能抑制肝组织脂质过氧化、提高小 鼠肝脏s o d 活性，减少肝组织脂褐素形成，提示对肝脏有保护作用；田基黄总黄酮 也有降酶、改善肝功能的作用；黄芩苷对阿霉素引起的肝脂质过氧化有保护作用。 1 1 3 5 抗菌抗病毒功能 黄酮类化合物抗菌抗病毒作用已经得到医药界的肯定，这方面进行的研究较多， 如银杏黄酮、槲皮素、桑色素、山奈酚、木樨草素和杨梅黄酮等均有抗病原微生物和 抗病毒的作用。例如：x uhx 验证了7 种结构类型的3 8 种黄酮对具有抵制抗生素作 9 水溶性黄酮化合物的生物合成、分离及应用基础研究 用细菌的抑制活性，试验发现杨梅酮和毛地黄黄酮抑菌作用明显，杨梅酮可以显著地 抑制b u r k h o l d e r i a c e p a c i a 生长繁殖【2 0 1 ；石钺、石任兵等在对银翘散抗流感病毒作用的 物质基础进行研究时，从银翘散抗流感病毒有效部位群中分离得到6 种黄酮类成分， 分别是醉鱼草苷、金合欢素、橙皮苷、异甘草素、异甘草苷和金丝桃苷，证明了黄酮 类化合物是银翘散抗流感病毒的主要物质基础1 2 1 1 。 1 1 3 6 抗炎功能 目前已发现多种黄酮类化合物具有抗炎作用。杨东梅、许实波等【2 2 1 从穿心草中分 离得到的l ，6 二羟基3 ，5 二甲氧基酮( c x ) 具有直接的抗炎作用，研究表明，c x 对二甲苯所致的小鼠耳肿胀、醋酸所致的小鼠腹腔毛细血管通透性增加及鸡蛋清致大 鼠足肿胀这三种急性炎症都有明显的抑制作用。姜科植物b o e s e n b e r g i a p a n d u r a t a 中 1 4 个黄酮化合物以及银杏双黄酮如阿曼托黄素、银杏黄素、紫杉双黄酮也有不同程度 的抗炎活性【2 3 1 。 1 1 4 黄酮类甜味剂的研究进展 食品高倍甜味剂是指甜度为蔗糖几十倍以上的甜味剂，分天然和化学合成两大 类。天然高倍甜味剂由于其安全性好，消费者易接受，备受市场的欢迎。目前天然高 倍甜味剂主要有甜菊糖、甘草甜素、罗汉果苷、二氢查耳酮和索马甜等。 二氢查耳酮是黄酮化合物的一类，最初是从柑橘、柚苷中分离得到的具有甜味的 化合物。人们合成了大量该类甜味剂的衍生物，其中有些只是在结构上作了些微小的 改变，有些则作了较大的改变。所有这些，都是为了进一步了解其结构与风味的关系， 或是为了提高质量和溶解度及降低毒性等。 新橙皮苷二氢查耳酮( n h d c ) 是黄酮类化合物的一种，其基本骨架结构是l ，3 二苯基丙酮。它的甜度为蔗糖的1 8 0 0 倍，但在水中的溶解度仅仅为o 5g l 。目前， 新橙皮苷二氢查耳酮已经被多个国家批准作为香料或甜味剂使用。但由于该甜味剂有 类似甘草的不良后苦味、在水中的溶解度小等缺点，一定程度上限制了它的广泛应用。 1 0 水溶性黄酮化合物的生物合成、分离及应用基础研究 图1 3 新橙皮苷二氢查耳酮 欲改善新橙皮苷二氢查耳酮的甜味特性，目前方法有两种：一种是与其他甜味剂 复配使用，降低新橙皮苷二氢查耳酮的使用量。这是目前新橙皮苷二氢查耳酮在食品、 医药日化、饲料等行业的主要使用方法，这就导致新橙皮苷二氢查耳酮使用量在全球 年消费量只有几十至几百吨。另一种方法是添加其他口味矫正剂，如葡萄糖酸钠、葡 萄糖酸内酯、硫酸镁等。这种口味矫正方法，由于其效果有限，实际在工业上采用并 不多。 1 2 黄酮类化合物的水溶性衍生物的研究 黄酮类化合物种类多，结构和存在状态不同，溶解度有很大的差异。槲皮素类黄 酮类化合物分子中存在着交叉共扼体系，所以是平面型分子，分子堆砌较紧，分子间 引力较大，不易被溶剂或溶质分散，水溶性差，极大地限制了其生物利用度和体内给 药途径。为了增加槲皮素类黄酮类化合物的水溶性，同时又不改变其药效基团，目前 大致有两种方法：1 在其母核的酚羟基上引入亲水基团；2 在空位上引入亲水基团。 第1 种方法又可以分成：羟基糖甙化，7 位或3 位的葡萄糖、鼠李糖等；黄酮甙 元的无机酸酯化，硫酸酯、磷酸酯等，制备成钠、钾盐，增加其水溶性；引入其他 的亲水基团，如脂肪胺基等。 水溶性黄酮化合物的生物合成、分离及应用基础研究 1 2 1 在酚羟基上引入亲水基团 p e r i c l e sc a l i a s 【2 4 】将黄酮类化合物( 如栋精) 3 位或5 位羟基进行糖基化分子修饰。 结果表明，黄酮类化合物经过糖基化分子修饰后，其在水中的溶解性由低于l o g g m l ( 2 0 c ) 提高到3 0 0 m g m l ( 2 0 c ) ，其抗肿瘤活性比没有进行糖基化的要高出许多，而 对细胞的毒副作用却明显降低。 余戟瞄】等由槲皮素合成了槲皮素7 硫酸酯钠和槲皮素7 ，4 ，- 二硫酸酯二钠两种化 合物，结果表明：这两种化合物解决了槲皮素水溶性的问题，虽然在一定程度上降低 了槲皮素抑制细胞生长的活性，但抗血小板作用却有所增强。另有吴毓秀【2 6 1 报道槲皮 素制成的水溶性槲皮素磷酸酯钾，能有效降低血液粘度，抑制血小板的聚集及微循环 系统血栓的形成。这对研究提高槲皮素的生物利用度和改变槲皮素体内给药途径都具 有指导意义。 孙铁民【2 刀等研究制备了8 个槲皮素4 脂肪胺基烷取代衍生物，未见其生物活性 报道。一方面4 脂肪胺基烷取代衍生物增加了槲皮素的水溶性，此外胺基烷氧基在 许多药物中都是药效基团，增进了它的药效，另一方面4 羟基取代，改变了其酚羟 基的结构，尤其是邻苯二酚的结构受到破坏，可能对其生物活性有所降低。 j ps a n t o s 2 8 1 将铝盐与黄酮类化合物进行络合，形成黄酮类化合物的铝盐络合物 使黄酮类化合物在水空气界面具有较好的分散性。该铝盐络合物可用于理论研究， 如研究黄酮类化合物的界面反应活性，以及黄酮类化合物在水空气界面上液体单分 子层的形成。 1 2 2 在其他位置引入亲水基团 这种方法目前报道还比较少，以槲皮素为例，尽管其b 环上有2 ，5 ，6 三个空 位，但是由于其平面结构，和临苯二酚的结构，较a 环6 ，8 位空间位阻较大，不易 其他基团的进攻，8 位空间位阻小，为酚羟基a 位，易于连接，如图所示。 1 2 水溶性黄酮化合物的生物合成、分离及应用基础研究 o ho 图1 2 曼尼希碱酸碱连接位置示意图 由此，代永盛【2 9 】等利用曼尼希碱，将其引入到槲皮素的8 位上，进而制备得到它 们的盐酸盐，最终得到的3 种曼尼希衍生物，分别是8 吗琳环甲基槲皮素、8 甲基哌 嗪环甲基槲皮素、8 乙基哌嗪环甲基槲皮素，实验结果表明，这几种化合物的水溶 性较槲皮素有了显著的提高，但其活性测试还未见报道。 簪 虽然通过化学合成的方法可以得到很多槲皮素类黄酮化合物的水溶性衍生物，而 且具有一定的活性。但通过化学合成的方法增加一些基团( 例如脂肪胺基、磷酸酯、 硫酸酯) 得到的最终化合物，可能会有产生一些意外的毒副作用。因此，本研究采取 生物合成技术，利用环糊精葡萄糖基转移酶的作用，在水溶性较差的黄酮化合物分子 上引入水溶性的葡萄糖基，从而增强其水溶解性，使之在应用范围上得到较大的拓展。 1 3 环糊精葡萄糖基转移酶的研究现状 环状糊精葡萄糖基转移酶( c y c l o d e x t r i ng l y e o s y l t r a n s f e r a s e ，c g t a s e ) 是催化淀粉等 合成环状糊精的酶，研究表明，芽孢杆菌属的多种细菌都能产生c g t a s e 3 0 1 ，如软化 芽孢杆菌( b m a c e r a n s ) 、巨大芽孢杆菌( b n t g a t e r i u m ) 、环状芽孢杆菌( b c i r c u l a n s ) 、 嗜热脂肪芽孢杆菌( b s t e a r o t h e r m o p h i l u s ) 、嗜碱性芽孢杆菌( a l k a l o p h i l i cb a c i l l u s ) 和肺炎克氏杆菌( k l e b s i e l l ap u e u m o n i a e ) 等。应用环糊精葡萄糖基转移酶可进行p 环糊精( p c y c l o d e x t r i n ，p c d ) 的生产【3 1 1 和对一些糖类和配糖物进行化学改性3 2 。3 1 。目 前，国内外对c g t a s e 的需求量逐年增加，多用于c d 的生产，而将其用于黄酮类化 合物的生物合成改性的报道还比较少。 1 3 水溶性黄酮化合物的生物合成、分离及应用基础研究 1 3 1 对嗜碱芽孢杆菌的研究 早前的研究工作中，多集中采用软化芽抱杆菌产生c g t a s e ，但由于其菌种酶系 不纯，培养时易受杂菌污染；且需有机溶剂作为助剂，以促进反应，增加产率，而这 些有机溶剂都有一定的毒性，故给工业化生产带来一系列问题。嗜碱芽孢杆菌则不存 在使用有机溶剂的问题。 日本掘越弘毅脚 3 4 1 致力于嗜碱芽孢杆菌的研究，在分离培养基中加入 i n a 2 c 0 3 ，使培养基呈碱性，从6 0 0 株茵中分离出的b a c i l l u sn o 3 8 2 菌种所产酶的 活力最高，它具有酶活性高、不易污染、在制备c d 时不需要有机溶剂、得率较高等 优点，所以利用此菌进行c g t a s e 的生产，使成本大幅度降低，从而为c d 的工业化 生产奠定了基础。 国内江苏省食品发酵研究所也从碱性土壤中成功地分离出嗜碱芽孢杆菌n 2 2 7 菌株，采用摇瓶发酵后酶活最高可达到2 5 0 0 u m l t 3 5 1 ；曹新志【3 6 1 等对一株嗜碱芽抱杆菌 117 7 菌株经紫外线和y 射线诱变处理后，筛选得到突变株7 1 2 ；王雁萍【3 7 】等应用氮 离子注入对嗜碱芽孢杆菌进行诱变育种，获得了产生c g t a s e 的0 2 2 5 2 7 1 菌株。 1 3 2 发酵工艺条件的研究 为确定嗜碱芽孢杆菌的发酵条件，n a k a m u r a 3 8 】等对n o 3 8 2 菌株的基本培养条 件进行了探讨。首先，对碳源和氮源进行了试验。该菌株虽能利用葡萄糖、果糖、麦 芽糖、蔗糖、乳糖等，但以糊精和可溶性淀粉作为碳源效果最好；采用酪蛋白氨基酸、 牛肉膏、玉米浆、脱脂大豆等作为有机氮源时，以5 t 米浆( 可溶性淀粉1 ) 效果最 佳。其次，研究了加入各种碳酸盐对产酶的影响，以加入1 0 n a 2 c 0 3 或n a h c 0 3 效 果最理想。采用上述培养基于3 7 通气培养4 8 h ，酶活力达最高峰。 江苏省食品发酵研究所【3 5 】在