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兰州大学硕上学位论文废水处理系统中降解基因的克隆新技术研究及多样性分析 中文摘要 杂环芳香族化合物是工业废水处理过程中的主要污染有机物。目前已有很多相 关的高效去除这些污染物的研究报道，但是人们对参与生物处理的主要功能菌以及 降解相关基因知之甚少。本研究主要采用微生物分子生态学技术及基因克隆技术， 对降解喹啉和焦化废水的生态系统中的主要功能菌进行研究，并进行克隆降解基因 的方法探索。 喹啉是含氮杂环化合物的典型代表，用途极其广泛，由于这类化合物水溶性较强， 已成为环境中普遍存在的污染物。我们建立了一个实验室规模反硝化喹啉降解生物 反应器，经过约1 2 个月的驯化后，喹啉去除率达到约8 0 以上。 研究显示在本实验室生物反应器1 9 0 6 0 0 天的运行过程，反应器中b c r a 和o x o o 两个功能基因的克隆文库基因序列的系统发育分析表明，b c r a 基因克隆文库中部分 序列与t h a u e r a 等菌株的b c r a 基因的相似性为9 7 以上，其余序列与己知b c r a 基因 序列的相似性为7 4 8 6 ；o x o o 基因克隆文库中部分序列与p s e u d o m o n a s p u t i d a 的 o x o o 基因相似性为9 9 ，而其余序列和已知的o x o o 基因的序列相似性较低。说明 喹啉驯化的反硝化反应器系统中，b c r a 和o x o o 基因的多样性较丰富，且具有一些新 的未知的类型。带有o x o o 基因的功能菌数量随反应器的运行逐渐减少，带有b c r a 基因功能菌数量逐渐增多。间接说明b c r a 基因可能参与了喹啉的厌氧降解。由于它 们数量变化与反应器的降解过程及运行状态密切关联，因此这两个基因可以作为一 种潜在的分子标记，用于监测含喹啉废水处理系统的状态。 本研究中构建了一套启动子捕获质粒系统。初步摸索了该系统的筛选方法，并 尝试利用该系统，以底物诱导的基因表达筛选方式，从焦化废水处理系统中克隆具 有不同启动子活性的基因片段。研究显示通过筛选系统的筛选，8 1 2 1 个克隆的文库 中筛选获得两种类型的克隆，其中一类克隆由于在载体的致死基因s a c b 中插入了i s 2 转座子导致基因的失活突变，从而被筛选系统筛选到。由于转座予i s 2 在e c o l ik - 1 2 菌系的菌株中普遍存在，本研究的发现为今后类似的以致死基因进行克隆的研究工 i i 兰州大学硕士学位论文废水处理系统中降解基因的克隆新技术研究及多样性分析 作中提供了借鉴，用于克隆的宿主e c o l i 菌株的选择将是一个重要的考虑因素。另外 一类克隆中具有启动子活性的基因片段，但克隆获得的启动子为未知序列，还需后 续的深入研究。 关键词：杂环芳香化合物，功能基因，降解，启动子捕获 i l i 兰州大学硕上学位论文废水处理系统中降解基因的克隆新技术研究及多样性分析 a b s t r a c t h e t e r o c y c l i ca r o m a t i ch y d r o c a r b o n sa r em a j o rp o l l u t a n t si ni n d u s t r i a lw a s t e r w a t e r t r e a t m e n t m a n ye f f i c i e n tp o l l u t a n tt r e a t i n gt e c h n i q u e sh a v eb e e nr e p o r t e d ，b u tw ek n o w l i t t l ea b o u tt h em i c r o b i a lm a j o rf u n c t i o n a ls p e c i e sa n dd e g r a d i n g r e l a t e dg e n e s i nt h i s s t u d y , m o l e c u l a rm i c r o b i a le c o l o g yt e c h n o l o g ya n dg e n o m i ct e c h n o l o g yw e r eu s e dt o a n a l y z et h em i c r o b i a lc o m m u n i t i e si nh e t e r o c y c l i ca r o m a t i ch y d r o c a r b o n s ( s u c ha s q u i n o l i n e ) c o n t a i n i n gi n d u s t r i a lw a s t e r w a t e rt r e a t m e n t f u n c t i o n a ls p e c i e sw e r es t u d i e d a n dap r o m o t e rt r a pp l a s m i ds y s t e mw a sc o n s t r u c t e df o rc l o n i n gd e g r a d i n g r e l a t e dg e n e s q u i n o l i n ei st h et y p i c a lp o l l u t a n t si ni n d u s t r i a lw a s t e t w a t e rt r e a t m e n t d u et oi t s s t r o n gw a t e rs o l u b i l i t y , i th a sb e c o m ew i d e s p r e a dp o l l u t a n t w eh a ds e tu pal a bs c a l e d e n i t r i f y i n gq u i n o l i n e - d e g r a d i n gb i o r e a c t o r a f t e r12m o n t h so fa c c l i m a t i o n ，i tr e a c h e d l l i g hq u i n o l i n er e m o v a le f f i c i e n c eo fa b o u t8 0 t h es t u d ys h o w e dt h a ti nt h ep r o c e s so f b i o r e a c t o r , t h e r ea r eh i g hd i v e r s eb c r aa n do x o og e n e sa tt h eb i o r e a c t o r t h en u m b e ro f b a c t e r i aw i t ho x o og e n ed e c r e a s e dw h i l et h eb a c t e r i aw i t hb c r ag e n ei n c r e a s eg r a d u a l l y d u r i n gt h em i m i n go ft h eb i o r e a c t o r i ti n d i r e c t l yp r o v e dt h a tb c r ag e n ep a r t i c i p a t e si nt h e a n a e r o b i cd e g r a d i o no fq u i n o l i n e b e c a u s et h eb u n d a n c e o ft h e s ef u n c t i o n a lg e n e s c l o s e l y r e l a t e dw i mt h ed e g r a d a t i o nr a t ei nt h ep r o c e s so fb i o r e a c t o r , w ec a l lu s et h e s et w og e n e s 勰ab i o m a r k e rt om o n i t o rt h eq u i n o l i n ed e g r a d a t i o ni nw a s t e w a t e rt r e a t m e n ts y s t e m i no r d e rt o i n t e n s i v e l y i n v e s t i g a t et h ef u n c t i o n a lg e n e sr e l a t e dt oh e t e r o c y c l i c a r o m a t i ch y d r o c a r b o n sd e g r a d i n g , ap r o m o t e rt r a pp l a s m i ds y s t e mw a sc o n s t r u c t e d t h e s c r e e n i n gm e t h o dw a si n i t i a l l ye x p l o r e df o rc l o n i n gg e n ef r a g m e n t sw i t hd i f f e r e n t p r o m o t e ra c t i v i t yf r o mt h ew a s t e r w a t e rt r e a t m e n ts y s t e mb a s e do nt h es u b s t r a t c - i n d u c e d g e n ee x p r e s s i o ns c r e e n i n g t w ot y p e so fc l o n e sw e r es c r e e n e do u tf r o mt h ec l o n el i b r a r y c o n t a i n i n g8 121c l o n e s o n et y p eo fd o n ew a ss c r e e n e dd u et ot h ei s 2i n s e r t i o nf r a g m e n t w h i c hh a sd e s t r o i e dt h es u i c i d eg e n ef u n c t i o no fp l a s m i d b e c a u s et h ei s 2f r o me c o l i k 1 2s t r a i n s ，t h er e s u l ti n d i c a t et h ec h o o s eo f 最c o l is t r a i nw i l lb eai m p o r t a n tf a c t o r i v 兰州大学硕士学位论文 废水处理系统中降解基因的克隆新技术研究及多样性分析 s h o u l db ec o n s i d e r e df o rt h es i m i l a rr e s e a r c hi nf u t u r e a n o t h e rt y p eo fc l o n eh a dt h e i n s e r t i o na n ds h o w e dp r o m o t e ra c t i v i t y b u tt h es t r u c t u r eo fp r o m o t e ri nt h i si n s e r t i o n f r a g m e n ts t i l lu n k n o w nd u e t ot h el i m i to fs o f t w a r ef o rp r o m o t e r ss e a r c h i n g k e yw o r d s ：h e t e r o c y c l i ca r o m a t i ch y d r o c a r b o n ，f u n c t i o ng e n e ，d e g r a d i n g ，p r o m o t e rt r a p v 兰州大学硕士学位论文废水处理系统中降解基因的克隆新技术研究及多样性分析 缩略词表 原创性声明 本人郑重声明：本人所呈交的学位论文，是在导师的指导下独立进行研究 所取得的成果。学位论文中凡引用他人已经发表或未发表的成果、数据、观点 等，均己明确注明出处。除文中已经注明引用的内容外，不包含任何其他个人 或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究成果做出重要贡献的个人 和集体，均已在文中以明确方式标明。 本声明的法律责任由本人承担。 论文作者签名：整! 灸日期： 銎垒：石二多 关于学位论文使用授权的声明 本人在导师指导下所完成的论文及相关的职务作品，知识产权归属兰州大 学。本人完全了解兰州大学有关保存、使用学位论文的规定，同意学校保存或 向国家有关部门或机构送交论文的纸质版和电子版，允许论文被查阅和借阅； 本人授权兰州大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检 索，可以采用任何复制手段保存和汇编本学位论文。本人离校后发表、使用学 位论文或与该论文直接相关的学术论文或成果时，第一署名单位仍然为兰州大 学。 保密论文在解密后应遵守此规定。， 论文作者签名：二垦盈导师签名：。幽期：2 1 1 垒：呈 论文作者签名： 鳖缝导师签名k 么望兰= 可期：2 1 丝：呈 兰州大学研究生学位论文电子版使用授权书 废水处理系统中降解基因的克隆新技术研究及多样性分析是本人在兰州大 学攻读博士口硕士幽学位的毕业论文，现已通过答辩。本人作为此论文的著作权人， 同意向兰州大学图书馆提交该论文的电子版和印刷本各一份。 根据中华人民共和国著作权法的规定，本人授权兰州大学图书馆对该论文 电子版享有以下权力：( 同意者画) 1 、同意提交全文。可以在提交 半年( 公开) 0一年( 秘密) n 二年( 机密) o三年( 绝密) 口 期限之后，由图书馆在校园网上提供全文浏览。 2 、本人论文解密之后，同意向“c a l i s 高校学位论文全文数据库”提交： 论文标题、提要和论文前1 6 页口论文全文口 3 、不同意提交电子版论文口。( 选此项者，须由作者本人出具不能公开证明， 导师签字，院系所加盖公章。) 图书馆承诺： l 、不对论文从收集、保存、发布意外的其他活动； 2 、未经著作权人同意，不得从事营利性活动。 院系：生命科学学院 作者( 授权人) 签名：夏溪 被授权人：兰州大学图书馆 学号：0 7 2 0 2 0 0 0 7 时间：2 0 1 0 年5 月2 0 日 关于学位论文向“c a l l s 高校学位论文全文数据库，授权的说明 随着网络和计算机技术的发展，近几年来在国际范围内进行着一种大学范围内 的学术资源共建、共享运动，目的是促进学术团体内学术资源的交流和使用。 c a l i s 高校学位论文全文数据库”是教育部支持的高等教育文献保障体系 ( c a l i s ) 的一个学位论文共建共享项目。目的是为中国高校范围内的读者通过网 络利用博硕士学位论文信息提供途径和保障。参加c a l i s 学位论文库建设的成员 单位( 约百所大学) 之间可免费检索浏览获得授权的论文全文。在获得作者授权方 面，“c a l i s 高校学位论文全文数据库”采用作者自愿的原则，作者是否授权完全 由自己决定。 作者授权给“c a l i s 学位论文全文数据库”后享有的权益有：1 ) 提高学位论文的 使用率，在更广的范围内被检索浏览，提高论文的影响力；2 ) 授权在“c a l i s 学位 论文全文数据库”发布论文全文的作者，可长期免费检索浏览该库收录的论文全文； 3 ) 对检索浏览率高的论文推荐出版社正式出版。 访问地址：h t t p ：c t d c a l i s c d u c 1 1 兰州大学硕上学位论文废水处理系统中降解基因的克隆新技术研究及多样性分析 第一章文献综述 1 1 芳烃化合物生物降解概述 芳香族化合物是一类具有苯环结构的化合物，广泛用于燃料和工业溶剂，目前 正以每年百万吨的数量被制造出来，其中单环芳香族化合物普遍用于工业溶剂等， 多环芳香化合物作为合成复杂化合物的中间体而被应用于染料、杀虫剂、冶金和制 药工业中( 张晶，2 0 0 4 ) 。由于他们结构稳定，不易分解，毒性很强，对生态环境和人 类健康造成严重的污染( 王菊思，1 9 9 5 ) 。 生物降解是指利用自然界中微生物( 如细菌、真菌、放线菌等) 的生物作用来分解 有机物，最终使其在含氧环境下分解为c 0 2 和h 2 0 ，在缺少氧环境下分解为c h 4 和 h 2 0 的过程( 董恒，1 9 9 7 ) 。由于安全有效、投资少、不需特殊设备等优点，用微生物 降解这些污染物的方法成为最有前途的治理环境污染的方法。 1 1 1 芳烃化合物的简介 环境中存在着多种多样的多环芳烃( p h a s ) ( f i g 1 ) 和单环芳烃，多环芳烃主要存 在于有机物的不完全燃烧产物，放射源，汽车尾气，固体燃料( 如煤炭，发电植物 燃料等) ，家庭生活排放物( 如吸烟和木材或煤炭的燃烧产物) ，地区性空气污染物 ( 如森林大火和农业燃烧产物) 中，甚至在食物中亦存在( f i n l a y s o n p i t t sb j ，1 9 9 7 ) 。 由于人类的活动，生态系统中的自然资源在过去的几十年中进行了大规模的迁移， 很多资源都被大规模地重新分配了，从而导致人类的生存环境暴露在这些各种各样 的多环芳烃中( f i a l az 1 9 9 9 ) 。其中有些多环芳烃( 如萘和菲) 也能够被利用起来，用 于合成杀虫剂，杀菌剂，洗涤剂，染料和卫生球等( s h e n n a nj l ，1 9 8 4 ) 。 兰州大学硕士学位论文废水处理系统中降解基因的克隆新技术研究及多样性分析 图1 1 环境中大量存在的多环芳烃化合物结构 f i g 1 1s 仇l c t u r eo fs o m ea b u n d a n tp o l y e y c l i ca r o m a t i ch y d r o c a r b o n s ( p a h s ) i nt h ee n v i r o n m e n t 由于石油、汽油、柴油或石油化工产物储藏罐的泄露或石油工业废物的排放， 地下水会被其中所含的单环芳烃所污染( a n d r e o n ia n dg i a n f r e d a , 2 0 0 7 ) 。这些单环芳 烃比汽油中的其它脂肪族烃类的水溶性高得多。苯、甲苯、乙苯和二甲苯同分异构 体( b t e x ) 是工业中的重要单环芳香烃污染物( k a o ，2 0 0 6 ) ，这些有机物有毒且会污 染地下水。 许多芳烃化合物都具有毒性、致突变性和致癌性( g o l d m a nr ，2 0 0 1 ；m a s t r a n g e l a g 1 9 9 7 ) 。芳烃化合物具有很高的脂溶性，因此很容易被哺乳动物的胃肠系统吸收 ( c e m i g l i ac e ，1 9 8 4 ) 。它们被人体吸收后能够很快地分布到多个组织中，趋向于富含 脂肪的组织。多环芳烃在人体内的代谢是通过细胞色素p 4 5 0 介导的混合功能氧化酶 系来完成的，第一步反应通常是氧化或羟基化( s t e g e m a nj j ，2 0 0 1 ) ，其降解产物环氧 衍生物或酚类物质可经过一系列反应生成葡萄糖苷、硫酸盐或谷胱甘肽配合物从而 达到脱毒的目的，一些环氧衍生物可能代谢生成二氢二醇，它能够经过配合形成可 溶性的脱毒产物或被氧化生成二醇环氧衍生物。许多多环芳烃都含有一个b a y 区和 一个k 区，这两个区能够代谢形成高度活化的b a y 区和k 区环氧衍生物，其中一些环 2 兰州大学硕士学位论文废水处理系统中降解基因的克隆新技术研究及多样性分析 氧衍生物具有致癌性( g o l d m a nr ，2 0 0 1 ) ( f i 9 1 2 ) 。多环芳烃在环境中很少单独存在，多 种多环芳烃混合物的相互作用能够加强其基因毒性和致癌性( k a i s e rj ，1 9 9 7 ) 。例如， 1 硝基芘就是由汽车尾气中的酮体及空气中存在的氮氧化物在柴油燃烧装置排放的 固体颗粒表面互相作用而产生的。在埃姆斯鼠伤寒沙门氏菌检测中，1 硝基芘被发现 是一种强致突变物和致癌物，而其母体物质芘却没有致癌性，只有很弱的致突变性 ( p o t h u l u r ij v ，19 9 4 ) 。 因此，许多芳烃化合物都被认为是环境污染物，会对植物和动物造成很大的影 响，经过食物链的富集，这些有毒化合物能够严重威胁人类的健康并且或造成基因 缺陷。因此，美国环境保护协会将多种芳烃化合物列为重要的环境污染物( l i u k ，2 0 0 i ) 。 图1 2 环境中多环芳烃化合物的分布、毒性以及生物修复 f i g 1 2f a t e ，t o x i c i t ya n dr e m e d i a t i o no fp o l y c y c l i ca r o m a t i ch y d r o c a r b o n s ( p a h s ) f r o mt h ee n v i r o n m e n t 3 ! 州大学碰学位论立废水m 4 系统中降解摹斟的克隆新技术研究多样性* 析 1 _ 1 2 芳烃化合物的生物降解 1 12 l 多环芳烃的生物降解 多环芳烃微生物降解的第一步就是通过双加氧酶的催化将两个氧原子分别加入 多环芳烃苯环上的两个碳原子上生成顺= 氢二醇( k a n a l yra ，2 0 0 0 ) ，然后在脱氢酶 的作用下去芳香化生成双羟基化的中间体。然后双羟基化中间体开环生成三羧酸循 环中间物( s a b a t ej ，1 9 9 9 ) 。目前有很多相关的降解多环芳烃化合物的菌株的报道 ( h e d l u n db p ，2 0 0 1 ；s a m a n t as k ，2 0 0 1 ；k i y o h a r ah ，1 9 7 6 ；( s a m a m ask 1 9 9 9 ；j o h n a k l 9 9 9 ) 。在过去的十年里超过三个环的多环芳烃细菌降解研究取得了重大的进 展。四环芳烃如荧蒽，芘，苯并吖睫和苯并 a 蒽的微生物降解已经被不同程度地研 究过t ( k a n a l y r a ，2 0 0 0 ；j u h a s z a l ，2 0 0 0 ) 。许多非放线菌，如恶臭假单胞菌、绿脓 杆菌、荧光假单胞菌、洋葱伯克氏苗、黄杆菌等都已被作为研究对象，研究其是否 具有代谢苯并【a l 蒽、苯并吖啶、荧蒽以及芘的能力( k a n a l yr a ，2 0 0 0 ；w a t a n a b e k 2 0 0 1 ) 。 l 122 单环芳烃的生物降解 单环芳烃的生物处理过程中，细菌、真菌和微藻等微生物起了关键的作用 ( h o l l i g e re ta 1 1 9 9 7 ) 。已知的一些能够代谢单环芳香族化合物的生物体罗列在表i 3 中。 2 裟= ： ” 兰州大学硕士学位论文废水处理系统中降解基因的克隆新技术研究及多样性分析 表1 3 降解单环芳香族化合物的微生物 t a b l e 1 3 m i c r o o r g a n i s m si n v o l v e di nt h ed e g r a d a t i o no fm o n o a r o m a t i cp o l l u t a n t s 对单环芳烃的好氧降解代谢途径的研究发现其肯定有条至少一条代谢途径是 会生成取代邻苯二酚( a n d r e o n ia n dg i a n f r e d a ，2 0 0 7 ) 。如苯降解生成儿茶酚( t s a oe ta 1 ， 1 9 9 8 ；j o h n s o ne ta 1 ，2 0 0 3 ) ，而甲苯或乙苯通过不同的降解途径分别生成3 甲基儿茶酚 和3 乙基儿茶酚。二甲苯代谢生成单甲基邻苯二酚( j i n d r o v ae ta 1 ，2 0 0 2 ；s t e p h e n s ， 2 0 0 6 ) 。一个从石油污染水中获得的混合培养物能够将所有的b t e x 化合物降解为二 氧化碳( d e e ba n da l v a r e z c o h e n ，2 0 0 0 ) 。有些有氧代谢相关酶如儿茶酚2 ，3 双加氧酶被 用于检澳i j b t x 的生物降解( m e s a r e he ta 1 ，2 0 0 4 ) 。 苯的混合菌群厌氧降解已经被研究过- ( c o a t e se ta 1 ，2 0 0 2 ) 。甲苯和乙苯的厌氧 生物降解途径的细节也已知了( h c i d e re ta 1 ，1 9 9 9 ；h c i d c r , 2 0 0 7 ) 。c h a k r a b o r t y 和c o a t e s ( c h a k r a b o r t y , 2 0 0 4 ) 发现甲苯、乙苯和二甲苯异构体( 邻位和间位) 的代谢途径中存在 同样的一种代谢中间物苯甲酰辅酶a ，这一化合物是芳香族化合物厌氧代谢的最普 遍的主要中间物。苯酰基辅酶a 会进一步被降解为乙酰辅酶a ，最后生成二氧化碳。 b c r a ( 苯甲酰辅酶a 的还原酶) 基因是催化苯甲酰辅酶a 的脱环反应，这是多数芳 香族化合物在厌氧条件下被微生物降解的最关键步骤( h o s o d aa ，2 0 0 5 ) ，如图1 4 。据 推测喹啉的厌氧降解可能也经此步骤。需要强调的是，对二甲苯的厌氧代谢途径还 不是完全清楚( l i ne ta 1 ，2 0 0 2 ；c h a k r a b o r t ya n dc o a t e s ，2 0 0 4 ；s t e p h e n s ，2 0 0 6 ) 。有些研 究者提出利用另一些中间物，如苄酸和甲苯甲基琥珀酸异构体作为特异的指示剂来 监测燃料污染物中的甲苯和二甲苯的厌氧降解情况( r e u s s e r e ta 1 ，2 0 0 2 ) 。 5 ! 州 学顺十学位论文腹m 处8 系统中降解幕目的克陲新技术研究多样性分析 。 c。 。：y j 、= 。= ：一 _ 1 。 ；。 ：- “。 辛 二一：。一 。 如 。 一一， “ 扣 = l 一“k 一 t 二一一l ， ”一， ：， 。：一一 图i4 部分芳香族化台物在厌氧条件下代谢至苯甲酰辅酶a 的还原酶 的代谢途径 f i g1 4p e r i p h e r a la n a e r o b i cp a t h w a y sf o rt h et r a n s f o r m a t i o no fs o m ea r o m a t i c g r o w t hs u b s t r a t e s t o t h ec e n t r a l i n t e r m e d i a t e b e n z o y l c o a 分子生物学手段的发展能够帮助我们从环境样本中更好地榆测到具有多环芳烃 降解能力的微生物( w a t a n a b e k ，2 0 0 1 ：w a t a n a b e k ，2 0 0 0 ) 。d n a d n a 杂交技术已经直 接应用于枪测环境中发现的重要组分( s a y l e rgs 。1 9 8 5 ；g u oc ，1 9 9 7 ) 。l a u r i e 和 j o n e s ( l a u f ead ，2 0 0 0 ) 利用q c p c r ( q u a n t i t a t i v ec o m p e t i t i v ep c r ) 的方法从芳香烃污 染的土壤中检测到了两种不同的多环芳烃降解基因型。 个能够快速矿化苯并【a 芘 的混合土壤菌群能够通过p c r 扩增1 6 sr d n a 片段然后进行变性梯度凝胶电泳 ( d g g e ) 的方法束进行分析( k a n a l yr a ，2 0 0 0 ) 。目前，利用1 6 sr d n a 序列分析技 术已经在不同的地理位置成功地分离了许多多环芳烃降解菌( w i l d a d aj , 2 0 0 2 ) 。 1 223 含氯杂环芳香族化台物的生物降解 杂环芳香族化合物由于污染面广、毒性较大，广泛存在于许多工业废水中( 如焦 化、石油化工、农药、染料等) ，一般难于被降解，常常导致常规的生物处理系统处 理效果不够理想( 何苗，1 9 9 7 ) 。 含氢杂环化合物主要产生自煤焦油，贝岩油中也骨有高浓度的氯化合物。它们 广泛存在于焦化废水、染料废水、制药废水、农药废水等工业废水及地下水中，废 兰州大学硕士学位论文废水处理系统中降解基因的克隆新技术研究及多样性分析 水处理中常见的含氮杂环化合物主要有吡咯、吲哚、吡啶、喹啉、异喹啉及其衍生 物等。与脂肪族或芳香族化合物相比，含氮杂环化合物不易受到代谢过程的破坏， 其生物降解性能也很差，并且此类物质中许多有致癌、致畸、致突变的性质，对环 境和人体健康会产生潜在的危害。 关于含氮杂环化合物的生物降解途径的研究目前还集中在好氧降解方面。含氮 杂环化合物的降解般起始于邻近氮原子的羟基化过程，其结合的氧来源于水。大 多数情况下，好氧降解包括几个羟基化步骤，然后是杂环或芳香环的双氧裂解。但 是有的降解途径中在环裂解前也包括还原反应。 近来的研究表明，厌氧微生物具有某些脱毒和利用难降解有机物的性能，而且 还具有某些在好氧条件下较难发生的生物化学反应，如多氯芳烃的还原脱氯、芳香 烃及杂环化合物的开环裂解等( 孙丽娟，2 0 0 5 ) 。d y r e b o r g 等人指出杂环化合物的厌氧 降解速率明显低于好氧降解速率，并且只有喹啉和吲哚可以在厌氧条件下降解 ( d y r e b o r g ，19 9 7 ) 。 1 2 2 3 1 喹啉的生物降解 喹啉是含氮杂环化合物的典型代表，用途极其广泛，是多种医药、农产品、染料等 生产中的重要原料和溶剂( j o h a n s o ns ，1 9 9 7 ) 。由于这类化合物水溶性较强，已成为环境 中普遍存在的污染物( w a r s h a w s k yd ，1 9 9 2 ；p e r e i r aw ，1 9 8 7 ；m u e l l e rj ，1 9 8 9 ；b a r r i e k r 1 9 8 4 ) ，喹啉及其衍生物还是焦化废水、石油废水、制药废水等多种工业废水中的 难降解有机污染物成分，它们对生物体具有致癌、致畸以及致突变性( h i r a o k 19 7 6 ；m i n a k on ，19 7 7 ；l a v o i ee ，19 8 4 ) 。 喹啉可以在好氧和厌氧条件下被微生物降解，国内外学者已经分离、驯化和筛选 出了一些可降解喹啉及其衍生物的微生物菌株，其中以假单胞菌属( p s e u d o m o n a ss p ) 最多( 崔明超，2 0 0 3 ) 。不同的微生物降解喹啉具有不同的代谢途径，目前已知的喹啉 的好氧降解代谢途径有四种，分别为5 , 6 二羟基2 ( 1 h ) 喹诺酮代谢途径、7 8 二羟基 2 ( 1 h ) 喹诺酮代谢途径、邻氨基苯甲酸代谢途径和8 羟基香豆素代谢途径。5 , 6 二羟 基2 ( 1 h ) 喹诺酮代谢途径和7 ，8 二羟基2 ( 1 h ) 喹诺酮代谢途径符合微生物降解时首先 形成羟基化中间产物的一般规律，苯环部分先形成二羟基衍生物，吡啶环保持完整， 7 ! 州太# 十学位论女墟水处目i 统中降斛摹坍豹克隆新技末研究多样性分析 再发生进一步环断裂降解，环的氧化与断裂个发生在c 一5 和c 6 之问，一个发牛 在c 7 和c 8 之i u 】，如图15 和l6 。 一啄一，“w 。i 鲰 t i 1 t 目 6k ej l h h * j 二m j 一一褥- = 娘一夺 莹鼍涟。 茹鑫穗。 * 啊* 。_ ￥矗t 滚m7 少悼“”岬瓣j 璃墒矿4 i _ 瓣7 图1 6 7 , 8 二羟基2 ( 1 h ) 喹诺酮代谢途径 f i g167 , 8 一d i h y d r o x y - 2 ( i h lq u i n o l i n o n em e t a b o l i cp a t h w a y 8 一羟基香豆素和邻氨基苯甲酸途径中，毗啶环优先被降解开环，最后得到无氮的 降解产物。s c h w a r z 等利用l q f l u o r e s c e n s3 ，产p u t i d a8 6 的研究发现，喹啉被氧化为2 ( i h ) 喹诺酮后继续被氧化为8 一羟基一2 ( i h ) 喹诺酮，随后转化为8 羟基香豆素， 然后水解并还原为2 , 3 - i 羟基苯丙酸，如图17 所示。 一。书一蹄，眵卜髀。n t i l “) t 髑 i _ e 一w ，* o 耕m # p * f q t 图178 箍基香豆素代谢途径 f i g178 - h y d r o x y c o u m a r i nm e t a b o l i cp a t h w a y 兰“ 学碰 学垃诖文废m 处理系统中降群基黼的克鞋技术研究盈多样怿升析 目前已有很多研究表明，喹啉及其衍生物在降解过程中取代首先发生在2 位 ( s c h a c hs ，1 9 9 3 ；s c h w a r z g , 1 9 8 9 ；r u g e r a ，1 9 9 3 ) 。而2 位已被取代的喹啉，则经历了不 同的代谢途径。尸p u t i d a3 3 1 ( b o t t g , 1 9 9 0 ) 降解4 ( 1 h ) 喹诺酮时，4 位首先被氧化， 所得2 一甲基- 4 ( 1 h ) 喹诺酮又继续在3 位氧化随后经历了吡啶环断开的降解途径， 见图i8 。厌氧条件下喹啉的降解途径还未见报道。 瓣_ 味一啦一噪。一 f $ o 蝴 2 - # 一l h q 日澜 。= = ：“一o g 图i8 邻氨基苯甲酸代谢途径 f i g1 8a n t h r a n i l a t e m e t a b o l i c p a t h w a y 1 2 微生物群落结构的分子生态学技术 微生物分子生态学随着现代分子生物学技术在生态学研究中的应用而产生，通 过对微生物的核酸序列进行分析，从基因水平反殃微生物群落结构、遗传多样性及 其与环境闻的相互关系r 李武2 0 0 6 ) ，微生物的多样性、群落结构和系统发育地位成 为该领域的研究热点。 它避开了传统微生物生态学方法中分离培养的限制，直接的探讨自然界中微生 物的群落结构及其与环境的关系。微生物分予生态学研究中常用的技术主要有变性 温度梯度凝胶电泳指纹图谱技术、e r i c p c r 指纹图谱技术、末端限制性片段长度多 态性技术、克隆文库分析技术、分子杂交技术等。这些技术方法的采用使得微生物 分子生态学研究获得了很多突破和重要研究成果( a m a n nr l ，1 9 9 2 ；) ，以下着重就本研 究中应用的儿个技术做详细介绍。 兰州大学硕士学位论文废水处理系统中降解基因的克隆新技术研究及多样性分析 1 2 1 变性腽度梯度凝胶电泳( d g g e t g g e ) 指纹图谱 变性梯度凝胶电泳( d e n a t u r e dg r a d i e n tg e le l e c t r o p h o r e s i s ，d g g e ) 技术是19 7 9 年 由f i s c h e r 和l e r m a n 等( f i s c h e rs 。g ，19 8 3 ) 最先提出的用于检测d n a 突变的一种电 泳技术( f i s c h e rs g ，1 9 8 3 ；l e r m a nl s ，1 9 8 4 ；m y e r sr ，1 9 8 5 a ；m y e r sr ，1 9 8 5 b ) 。m u y z e r 等 在1 9 9 3 年首次将其应用于微生物群落结构研究，后又发展出其衍生技术，温度梯度凝 胶电泳( t g g e ) ( 项丽，2 0 0 7 ) 。此后十几年间，该技术被广泛用于土壤、活性污泥、生 物膜、人体、动物肠道、湖泊等各个领域，目前，它与单链构象多态性( s s c p ) 和末端 限制性片段长度多态性( t r f l p ) 等方法一起，已经发展成为研究微生物群落结构 的主要分子生物学方法( 徐玲玲，2 0 0 7 ) 。本实验室已将该技术广泛应用于人体( z h a n g m ，2 0 0 7 ；s h e nj , 2 0 0 6 ；p a n gx ，2 0 0 5 ) 和动物肠道( w e ig ，2 0 0 7 ) 以及废水处理系统( 1 i u b ，2 0 0 6 ；m a oy ，2 0 0 8 ) 等各种复杂微生物生态环境中。 双链d n a 分子在聚丙烯酰胺凝胶电泳时，迁移行为决定于分子大小和电荷。但 同样长度的d n a 片段在胶中的迁移行为一样，不能被区分。一个特定的d n a 片段有 其特有的序列组成，其序列组成决定了其解链区域( m d t m gd o m a i n , m d ) 和解链行为 ( m e l t i n gb e h a v i o o ( f i s c h e rs g ，1 9 8 3 ；l e r m a nl s ，1 9 8 4 ) 。一个几百个碱基对的d n a 片 段一般有几个解链区域。d g g e t g g e 技术是在聚丙烯酰胺凝胶基础上，加入了变性 剂梯度或是温度梯度，当温度逐渐升高( 或变性剂浓度逐渐增加) 达到其最低的解 链区域温度时，该区域内的碱基对发生解链。当温度再升高依次达到各其它解链区 域温度时，它们也依次发生解链。直到双链d n a 完全解链，从而能够把同样长度但 序列不同的d n a 片段区分开来。 d g g e t g g e 的一个很大的优点是可以对胶中所感兴趣的条带进行研究，得到 它们的序列，从而可以直接获得和系统生态功能相关的微生物种群的系统进化信息。 但是已有研究表明，不同的d n a 条带在d g g e t g g e 胶中可以迁移到相同的位置 ( s e k i g u c h ih ，2 0 0 1 ) ，目前一般常用的方法是直接从胶中回收d n a ，然后构建其克隆 文库，再对其中的克隆进行测序( s e k i g u c h ih ，2 0 0 1 ) 。然而，p c r 过程中产生的异源 l o 兰州大学硕士学位论文废水处理系统中降解基因的克隆新技术研究及多样性分析 双链( h e t e r o d u p l e x ) 和单链d n a ( s i n g l e - s t r a n d e dd n a ) 也会对分析单条带序列 造成偏差。本实验张学礼博士提出在进行d g g e f f g g e 电泳之前，尤其是要分析单 一条带序列时，先用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳对p c r 产物进行纯化，去除单链的效 果最好( z h a n gx ，2 0 0 4 ) 。 由于d g g e t g g e 图谱中一般只有一二十个条带，在研究复杂环境生态系统( 如 土壤，人体肠道) 时，其中微生物种类很多，这些条带反映的就只能是群落中的优 势菌群，一般只有在总的微生物群落中占1 以上的种群才能被检测出来( m u y z e r g ，1 9 9 9 ) 。一个有效的方法是使用类群特异性p c r d g g e t g g e 的方法。首先用类 群特异性( g r o u p s p e c i f i c ) 引物对基因组总d n a 进行p c r 扩增，再用于d g g e f f g g e 分析( k o w a l c h u kg ，1 9 9 7 ；n u b e lu ，1 9 9 7 ) 。本实验室张美玲等人利用柔嫩梭菌亚群和 乳杆菌类群特异性p c r d g g e 技术比较溃疡性结肠炎患者溃疡粘膜与非溃疡粘膜 菌群组成的差异，发现不同的粘膜位置这两个类群的结构发生了改变( z h a n gm ，2 0 0 7 ) ， 庞小燕等人通过对健康人肠道中的拟杆菌组成的比较，发现不同人个体肠道中的拟 杆菌具有宿主特异性( p a n gx ，2 0 0 5 ) ，李曼等人用拟杆菌与柔嫩梭菌的类群特异性p c r - - d g g e 方法分别分析了一个中国家庭中的7 位不同性别的成员肠道内拟杆菌与柔嫩 梭菌的菌群组成，发现匠t h e t a i o t a o m i c r o n 与rb r o m i i t e 男性中的比例要高于女性，提 示肠道菌群与性别有一定的相关性( “m ，2 0 0 8 ) 。 1 2 2 克隆文库分析技术 目前分析细菌多样性研究方法主要分为两种，其一为传统的纯分离培养方法，其 二为不依赖分离培养的分子生物学方法。前者只能对环境样品中“可计数的、可培养” 的细菌提供信息；其二为不依赖分离培养的分子生物学方法，后者可以通过分析环境 样品的1 6 sr d n a 克隆文库的序列实现( d a r b ye ta 1 ，2 0 0 1 ) ，从而达到研究和监测环 境样品中细菌多样性、种群结构和区系变化的目的( b r a m b i u a e ，2 0 0 1 ；b a k e r ( 3 , 2 0 0 1 ；林 山杉，2 0 0 7 ；r i j 振静，2 0 0 8 ) 。 1 6 sr d n a 序列包括了保守区和可变区，是目前微生