（微生物学专业论文）蛋白酶产生菌的筛选及其ap基因的克隆和表达.pdf

河南农业大学学位论文独创性声明、使用授权及知识产权归属承诺书 学位论学位 硕士 文题目 蛋白酶产生菌的筛选及其印基因的克隆 级别 和表达 学 学生李林珂科导师 姓名专 微生物学马向东 姓名 业 学位论文 否如需保密，解密时间 年月日 是否保密 独创性声明 本人呈交论文是在导师指导下进行的研究工作及取得研究成果，除了文中 特别加以标注和致谢的地方外，文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成 果，也不包括为获得河南农业大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材 料，指导教师对此进仃j 审定。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献 均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意。 特此声明。 研究生躲虏许百 导师躲嘭彳攻 日期：弘一占年占月，f 日 日期：掰多月y1 3 研究监钐舛珂翮鹕：翰破张册鹳：i 审习 致谢 本论文从选题、思路设计、实验方法到论文的撰写都是在导师马向东副教授的精 心指导下完成的，取得的每一点成果都倾注了导师的大量心血，在此对他们表示特别 的感谢! 马向东先生渊博的学识、严谨的治学态度、敏锐创新的科研思路和不断开拓 进取的科学精神使我受益匪浅，也将是我人生中永远的航标。三年来，恩师不仅在学 业上给予了始终如一的精心教诲和指引，在生活方面也对我关心备至，他们是我人生 旅途上最重要的启蒙者和领路人。从他们身上我不但学到了很多专业知识，更重要的 是为人处事的态度和方法。师恩似海，永生难忘。在此，对他们致以最崇高的敬意和 感谢! 在该论文的具体试验操作期间，在课题讨论、实验内容的安排、具体操作方面得 到了贾新成教授、梁振普老师、高玉千老师、陈红歌副教授及教研室的全体教师及实 验室的全体老师的重大帮助，有的还参与完成了本论文中的部分工作，在此对他们表 示衷心的感谢! 感谢他们在学习和生活中对我的关心和帮助。在本论文进行中还得到了 崔锦、刘寅、孙连海、刘琦等同学在诸多方面提供的重要帮助和支持。特此一并致谢! 三年中有欢乐也有泪水，是他们陪我度过了这人生中特别重要的阶段。 感谢父母多年来对我的抚养和教导，感谢我的朋友李超敏多年的理解与关心，是 他们无私的奉献和支持使我得以顺利完成学业! 最后谨将此文献给我的父母、姐弟和所有关心、支持我的亲朋好友。在我的漫漫求 学路上，他们不仅在生活上无微不至地关心我、爱护我，而且在精神上给予我强大的 支持和动力，正是他们一如既往的关爱使我有勇气和信心克服重重困难与挫折，在科 学研究的道路仁执着前进。 李林珂 河南农业大学生命科学学院 二零零六年六月 微生物学硕士论文 摘要 本研究利用传统微生物学方法，从郑州奶牛场土样中筛选到一株碱性蛋白酶产生菌菌株a - 1 0 9 ， 通过形态观察及生理生化反应，我们初步鉴定该菌株为枯草芽孢杆菌。以菌株a - 1 0 9 的总d n a 为模 板，用降落p c r ( t o u c h d o w n p c r ，t d - p c r ) 的方法对总d n a 样品进行了蛋白酶编码序列的扩增，获得 目的片段。对该扩增片段进行测序，测序结果及同源性分析显示：该片断含1 2 0 0 个碱基对，包含的 阅读框含1 0 9 6 碱基对。该片断为蛋白酶d n a 片段，能在数据库找到同源蛋白酶基因序列。克隆到 的蛋白酶d n a 片段与碱性蛋白酶e ( g e n b a n kn o ：a j 5 3 9 1 3 3 ) 的编码区同源性高达9 9 ，与中性蛋白酶 ( g e n b a n kn o ：n c 0 0 3 9 9 7 ) 的编码区序列最多有9 4 的相似性，至少有2 0 个氨基酸的差异。将它克 隆到大肠杆菌表达载体p e t 中，获得的重组质粒在大肠杆菌b l 2 1 中进行表达。结果表明：在3 0 培 养温度下，经诱导物i p t g ( 0 3 r e t o o l l ) 诱导4 h 后表达产生的蛋白酶量较大，表达的产物不能直接 分泌到培养基中，菌落经裂解液裂解后表达产物可以在牛奶平板上产生水解圈，但是表达产生的蛋 白酶活力远远小于野生菌产生的蛋白酶活力；根据成熟蛋白酶在牛奶平板上能形成水解圈，可以初 步判断该酶具有蛋白水解活性，进一步的酶学性质检测表明该蛋白酶的最适温度为5 0 ，最适p i i 为8 5 。 关键词：枯草芽孢杆菌蛋白酶基因克隆蛋白酶基因表达 微生物掌硕士论文 1 文献综述 1 1 蛋白酶概况 蛋白酶是催化肽键水解的一类酶，广泛存在于动物、植物和微生物中，执行许多不同的生理功 能“1 。用于“蛋白酶”的英文有p r o t e i n a s e ，p r o t e a s e ，p e p t i d a s e 和p r o t e o l y t i ce n z y m e ，这些 称呼原本的差异嘲现在已经逐渐模糊。因为好些水解肽键的酶并不直接作用于蛋白质，所以 p e p t i d a s e 被推荐使用”1 。 共振结构使肽键的c - n 具有了部分双键性质，因此非常稳定，如果没有酶的催化作用，肽键水 解半衰期在中性p h 下会达到1 0 - i 0 0 年( 图1 ，2 ) 。 。知一。 + m t 岛叫“， 图1 共振结构使肤键具有部分双键性质图2 蛋白酶协助肽键的水解 生物体的许多生化反应要求肽键在毫秒内被水解，因而每个生物都备有具强亲核体的蛋白酶， 自然界大约有2 的基因是编码蛋白酶或其类似物的( 表1 ) 。1 。表i 各类生物基因组中蛋白酶基因的 比例 ，_ _ o q _ - l 柳l ， _ - _ _m n - - - - 。一 j _ 一j _ - - _ ； j ，_ _ - _ _ _ r - 孵 _ h h j - _ - _ _ - 耳目h ，d j _ - _ - _ _ j 一，- _ - - o ，j _ _ - u - t 日- 盎：= = ? 一，器嚣臻 翻哪蕾 r o f _ - h 】雌l ，啊加 蛋白酶种类的多样性和水解活性的专一性，使其在洗涤剂、食品、皮革等工业生产领域，成为 具有重要商业价值的工业用酶；此外，蛋白酶在基础研究中也有重要地位，如可在肽链合成、蛋 。白质测序中运用“。据估计当前世界工业生产酶市值1 0 亿美元，其中7 5 为水解酶类，蛋白酶为工 业生产酶三大类之一，其市值约占总市值6 0 ”1 。蛋白酶存在于所有生活有机体中，在生物进化历 史的早期即开始出现。根据其进化上及作用条件不同，可将其分为酸性、中性、碱性蛋白酶三类。 由于它是生活的有机体不可缺少的生理物质，因此蛋白酶的来源广泛，如动物、植物、微生物均可 产生蛋白酶。具有相同性质的蛋白酶即使来源于不同菌种，在基因结构上仍具有很高的同源性，而 性质不同的蛋白酶。即使来源于同一菌种，它们在氨基酸组成、基因结构上都存在着很大差异0 1 。 1 2 蛋白酶的来源 蛋白酶存在于所有生活有机休中，因此可从动物、植物，微生物中获得蛋白酶。但目前食品工 2 暑5裟銎要强嚣嚣 p m 曩_嚣*驾糟越甘卫 微生物学硕士论文 业用酶主要来源于微生物，蛋白酶是食品工业中应用最广泛的酶t 能够提高食品的品质、稳定性、 可溶性等。另外来自微生物中的蛋白酶还有以下优点：微生物生长快，适于大量快速培养。培 养基成本低。可选用作为工业生产蛋白酶的微生物种类很多，同时又可用遗传操作手段将其改良。 微生物生产的蛋白酶大多数是胞外酶，易于提取1 。 1 2 1 细菌蛋白酶 细菌中性蛋白酶只在p h 5 - 8 这样一个很窄的p h 范围内有活性，热稳定性较差，对疏水氨基酸 表现出高度的亲和性。它们反应速率适中，水解食物蛋白所产生的苦涩感比动物蛋白酶弱，因此在 食品工业中更具应用价值。n e u t r a s e 是一种中性蛋白酶，对植物中性蛋白酶抑制剂不敏感，这在发 酵工业中是有用的。在食物蛋白水解物的生产过程中，细菌中性蛋白酶较差的耐热性对于控制酶活 力，获得较低的水解度是有利的。一些中性蛋白酶属于金属蛋白酶，二价金属离子对它们的活性是 必须的；而另一些则属于丝氨酸蛋白酶，它们的活性不受鳌合剂的影响。细菌碱性蛋白酶的特点是 在碱性条件下( 如p l l1 0 ) 具有高活力和广泛的底物专一性：最适温度一般是6 0 c 左右。细菌碱性蛋 白酶的这些性质使之很适合用于洗涤剂。 1 2 2 真菌蛋白酶 真菌蛋白酶种类的多样性超过了细菌，例如a s p e r g i l l u so r y z a e 产酸性、中性和碱性蛋白酶。 真菌蛋白酶在p i l 4 - 1 1 都有活性，具有广泛的底物专一性，但是反应速度和耐热性不及细菌蛋白酶： 最适p h 4 q 5 ，在p b 2 5 - 6 0 范围内稳定：能够通过固体发酵工艺很方便地制备。真菌蛋白酶在干酪 制造业中特别有用。真菌中性蛋白酶属金属蛋白酶，在p h 7 0 活性最高，能被鳌合剂抑制：由于伴 随有肽酶活性和对疏水氨基酸肽键的专性水解作用，它弥补了植物、动物和微生物蛋白酶在减少 食物蛋白水解物苦味方面的不足。真菌碱性蛋白酶也被用于食品加工。 1 2 3 病毒蛋白酶 由于病毒蛋白酶在功能上参与病毒蛋白的加工处理，包括引起某些致命疾病( 如艾滋病和癌症) 的病毒，它们受得了广泛重视。至今在病毒中发现的蛋白酶都是肽链内切酶，分属于丝氨酸、天门 冬氨酸和半胱氨酸蛋白酶“”，还没有发现金属蛋白酶。逆转录病毒的天冬氨酞蛋白酶是该类病毒 装配复制所必须的，属同型二聚体：以聚蛋白前体一部分的形式被表达合成，再通过前体自我分解 释放出成熟肽。关于该类蛋白酶表达、纯化、酶学分析和突变体的文献很多，大量的研究都集中在 病毒蛋白酶的三维结构和它们与合成抑制剂的相互作用上，目的是设计有效的抑制剂，同无情传播 的病毒病( 如艾滋病) 搏斗。 虽然蛋白酶在自然界中广泛存在，但由于微生物生长迅速，对生长空间的要求少，遗传操作简 便，易改变其性质创造新酶以满足不同需要，因此成为蛋白酶首选来源。 1 3 微生物蛋白酶的分类 1 3 1 微生物来源的蛋白酶按作用p h 可分为三类，即碱性蛋白酶，中性蛋白酶及酸性蛋白酶，它们 作用最适p h 分别为碱性，中性及酸性 1 0 。三类酶的活性中心有着明显地不同：酸性蛋白酶含有二 个羧基，能为d a n ( 重氮乙酸正亮氨酸甲酯) 失活，不受鳌合剂，琉基试剂或丝氨酸蛋白酶抑制剂的 微生物学硕士论文 影响：中性蛋白酶的活性中心含金属离子，常常是z n 2 + ，可受到金属赘合剂e d t a 的可逆抑制：碱性 蛋白酶的活性中心为丝氨酸，能被二异丙基氟磷酸及苯甲基磺酸氯所抑制“2 1 1 3 ，2 微生物来源的蛋白酶按作用温度分为三类，即嗜冷蛋白酶、中温蛋白酶及嗜热蛋白酶。三类 酶作用的温度不同，嗜冷蛋白酶作用最适温度在5 - 1 0 1 2 温度达到3 0 1 2 酶极易失活：中温蛋白酶作 用的最适温度为3 0 - 4 0 1 2 ，温度达到5 0 时酶极易失活：嗜热蛋白酶作用的最适温度为6 0 8 0 。 1 3 3 根据蛋白酶作用位点在肽链中的位置，可将其初步划分为外肽酶和内肽酶两类，外肽酶又可 分为氨肽酶和羧肽酶。外肽酶水解最接近蛋白质底物n 一端或c 一端的肽键，：而内肽酶的作用位点 位于蛋白质内部，远离其n 一端和c 一端。 1 3 4 按照活性中心的功能基团，蛋白酶可进一步分成丝氨酸蛋白酶，天冬氨酸蛋白酶、半胱氨酸 蛋白酶和金属蛋白酶等4 类。丝氨酸蛋白酶的特点是活性中心存在一个丝氨酸基团；天冬氨酸蛋白 酶一般被称作酸性蛋白酶，都是肽链内切酶，其催化活性依赖于天冬氨酸残基，活性中心是由2 个 空间上相隔很近的天冬氨酸残基形成的二联结构；半胱氨酸巯基蛋白酶广泛存在于原核和真核生 物中，拥有2 0 个家族，木瓜蛋白酶是其代表；金属蛋白酶是催化类型最多的蛋白酶，来源广泛， 从高等生物的胶原酶，蛇毒液中的出血毒素到嗜热细菌的高温蛋白酶都属于金属蛋白酶。 1 4 碱性蛋白酶的一般性质 碱性蛋白酶是一类主要来源于嗜碱微生物的蛋白质水解酶类，属内肽酶中的丝氨酸蛋白水解酶 类。1 9 4 5 年瑞士d r j a a g “”等发现了微生物碱性蛋白酶，1 9 7 1 年h o r i k o s h i 首先报道了嗜碱性微 生物产碱性蛋白酶的研究1 ，此后碱性蛋白酶已成为国内外当前的研究热点“” 多数微生物碱性蛋白酶在p h 7 一l l 范围内有活性。在以酪蛋白为底物时最适p l i 以9 5 0 5 为 多，这种酶除水解肽键外，还具有水解酯键、酰胺键和转酯及转肽能力。多数微生物碱性蛋白酶不 耐热若在5 0 - 6 0 加热1 0 - 1 5 分钟，几乎其中一半酶的活性下降5 0 ，只有费氏链霉菌与立德链 霉菌等的碱性蛋白酶，经7 0 1 2 处理3 0 分钟，酶活性仅损失1 0 - 1 5 1 。我国生产的几种碱性蛋白酶 的耐热性亦在6 0 以下碱土金属，特别是钙对碱性蛋白酶有明显的热稳定作用。 碱性蛋白酶的分子量比中性蛋白酶小，而等电点高( p h 8 9 ) 许多碱性蛋白酶的氨基酸己经测定 “小圳“”。芽抱杆菌碱性蛋白酶中不舍半胱氨酸残基。两种枯草杆菌碱性蛋白酶( c a r s b e r g 枯草杆 菌碱性蛋白酶和n o v o 枯草杆菌碱性蛋白酶) 的高级结构也已阐明。这两种酶的化学性质几乎毫无区 别，它们的分子量和氨基酸个数几乎无差别，但它们的一级结构和酶的构象存在很大差异，在酶分 子中有8 3 个氨基酸不同，但是在活性部分的肽段氨基酸的顺序却完全相同。 丝氨酸碱性蛋白酶与胰蛋白酶都是丝氨酸酶。除d f p 外，苯甲磺酞氟( p i l s f ) 和其它磺酰卤化物 以及其它蛋白酶抑制物( 系一种蛋白质) 均可引起丝氨酸蛋白酶的失活。 活性中心的丝氨酸，可能是通过它的羟基同底物多肽的羧基结合而形成酶同底物之络合物，在 这里进行了酰化和去酰化反应而使底物水解。1 。如将枯草杆菌b p n 的碱性蛋白酶活性中心的丝氨酸 残基用- s h 基取代。变成疏基枯草杆菌碱性蛋白酶，其专一性发生了变化，酯酶活性只对硝基酚酯 起作用它的酰胺酶活性只有对咪哇酰胺有作用。 4 微生物学硕士论文 枯草杆菌碱性蛋白酶是由单条肽链所构成，它不需任何辅基，未发现需要激活因素，也末发现 曲霉碱性蛋白酶的激活剂1 1 5 碱性蛋白酶的作用机制 碱性蛋白酶属丝氨酸蛋白水解酶类，该类酶水解时通常分为两步反应，在反应中被切断的氨基 酸或肽链片段与酶之间会以共价相连，这一酰基化步骤之后跟随一个去酰基化过程，这一去酰基化 过程是一个水的亲核反应，结果是肽链的水解，丝氨酸内肽酶可分为三类：类胰蛋白酶、类胰凝乳 蛋白酶、类弹性蛋白酶，它们分别作用于带正电氮基酸残基、疏水残基、小疏水残基，多数丝氨酸 蛋白酶的催化基团是s e r - h i s - a s p 的三联体 1 6 碱性蛋白酶的用途 蛋白酶在各种形式的生物体中都广泛存在，执行多项复杂的生理功能，在引导基本代谢和调控 功能方面是至关重要的。蛋白酶在许多生理和病理过程中扮演关键角色，例如蛋白质代谢、血液凝 结、细胞生长和迁移、组织排列、发育中的形态建成、炎症反应、肿瘤生长和转移、酶原活化，蛋 白的跨膜转运、从前体蛋白释放激素和活性肽分泌等一般胞外蛋白酶催化大蛋白质水解成小分子 的反应，使其能被细胞吸收，而胞内蛋白酶在代谢调控中起关键作用。与我们对蛋白酶功能多样性 的预测相反，我们对蛋白酶执行这些功能的机制的了解非常有限。在蛋白酶参与的各种生理活动中， 目前研究得比较清楚的有：氨基酸的循环利用；生物的营养；细菌芽拖、酵母囊抱子，粘液菡果实 体、真菌分生抱子的形成和释放；休眠抱子的出芽；酶的修饰；基因表达的调控。 蛋白酶具有广泛的用途，主要应用在清洁剂和食品工业。近年来随着无公害工艺的发展，蛋白 酶在皮革处理和生物补救方面的应用越来越广泛，而且在制药工业中蛋白酶也是作为一种药物成 分。 1 5 1 清洁剂行业 杆菌属来源的碱性蛋白酶占据了洗涤剂添加剂市场的主导地位。它们加入洗涤剂后，使衣物上 蛋白质类物质产生的污点可以去除，并且由于它的清洁能力强，不含磷、无污染、洗涤效率高，无 需高水温及长时间搅动，只需浸泡一段时间，节约能源，因此，它的使用范围日益增加，市场潜力 巨大。在洗涤剂中添加的碱性蛋白酶有两个特性是人们所关心的：一是在p h 、温度较广的范围内能 否保持高活性及稳定性：二是在与氧化剂及去污剂共存时它的抗性如何。 1 6 2 食品工业 食品工业使用蛋白酶可以追溯到古代，那时在奶酪制作、面包制作、水解大豆和肉类的软化方 面已经常使用。 奶制品工业：奶制品工业中蛋白酶的主要应用是奶酪的制作。动物和微生物类属于酸性天门冬 氨酰苯丙氨酸甲醋类蛋白酶，分子量为3 0 0 0 - 4 0 0 0 d a 。在未断奶的小牛第四胃的粘膜粗提物中发现 有比胃蛋白酶活性高的多的凝乳酶c h y m o s i n 。由于奶酪制品的需求而导致的小牛胃粘膜的短缺，迫 使人们寻求一种微生物牛奶凝结酶作为替代品。微生物酶类也有两个缺点，即：( a ) 由于其非特异性 和热稳定性蛋白酶的含量较高，因此奶酪经过定时间的储存后就会有苦味；( b ) 产量低。对这一现 5 微生物学硕士论文 象的深入研究发现正常的巴氏消毒法温度对酶的产量并无影响，并且酶中含有少量非特异性的蛋白 酶。在奶酪制作中酶的主要功能是水解特殊的肽键( p h e l 0 5 - m e t l o f i ) 产生衍酪蛋白和大的肽段。凝 乳酶由于其对酪蛋白的高度特异性而在奶酪制作中可以发挥极好的效果。由毛霉菌m u c o rm i c h e l 、 枯草芽抱杆菌b a c i l l u ss u b t i l i s 和e n d o t h i ap a r a s i t i c a 等微生物产生的蛋白酶是遗传安全的 ( g e n e t i c a l l yr e g a r d e da ss a f e ) ，它可以代替了奶制品工业中使用的凝乳酶。1 9 8 8 年第一个重组 d n a 产生的凝乳酶引入到奶酪制作中。吉能科国际公司提高了a s p e r g i l l u sn i g e rv a t a w a m o r i 产生凝乳酶的产量而达到商业应用的水平。现在他们的重组凝乳酶产品已经证明是可行的，正等待 奶酪工业中使用的许可证一。 面包工业：面粉是面包制作过程的主要原料。它含有不溶解的谷蛋白，这决定了面包的质量。 由a s p e r g i l l u so r y z a e 产生的内切和外切蛋白酶可以通过限制性降解来修饰小麦谷蛋白酶处理 的面团可以增加其韧性和机械强度从而增加其应用范围。过量使用蛋白酶可以减少面团的混合时间 和增加面包的产量。使用细菌蛋白酶可以增加面团的筋度和延展性 豆制品工业：大豆由于其含有高质量的蛋白质而作为一种富营养性食物。很早以前蛋白酶就作 为大豆酱和其他豆制品的一种配料。真菌来源的碱性和中性蛋白酶在大豆酱制作中发挥重要的作用 经蛋白水解后的大豆蛋白可提高其功能在p a 8 条件下用a l c a l a s e 处理大豆蛋白，其水解产物具有 溶解度高、产量高、苦味低的特点。水解产物也应用于添加蛋白质的软饮料和食疗食物中。碱性蛋 白可水解植物，动物蛋白，a l c a l a s e 酶可作用于未端疏水氨基酸，使用这种酶可去除蛋白质水解时 产生的苦味”3 。来源于b a m y l o l i g u e f a c i e r s 的碱性蛋白酶可用于制备低变异源性的婴儿食品，还 可用于制备果汁、饮料及治疗用人工配制的高蛋白膳食9 1 例如江苏农学院郭敏亮等 2 6 和吉林省 生物研究所张德桐等分别用2 7 0 9 地衣芽抱杆菌( b l i c h e n i f o m i s 2 7 0 9 ) 碱性蛋白酶和胰蛋白酶， 以脱脂豆粕为原料，进行了制取大豆多肽及氨基酸饮料的研究。武汉食品工业学院的刘大川等。1 ， 采用酶水解法，由大豆分离蛋白制备大豆肽。对五种蛋白酶( 中性蛋白酶a s 3 9 8 ( 食用级) ，碱性蛋 白酶2 7 0 9 ，木瓜蛋白酶，胃蛋白酶，胰蛋白酶) 水解大豆分离蛋白的特性进行了比较，筛选出水解 能力最强的碱性蛋白酶2 7 0 9 ，确定了其最佳水解条件。东北农业大学食品科学系的于国平等“， 以分离大豆蛋白为初料，用碱性蛋白酶进行水解。水解后的蛋白分子肽链变短，其功能性发生了明 显改变，结果说明水解蛋白液中绝大多数是小分子肽，少量是没有水解或水解程度很低的蛋白质， 因此可使水解后的蛋白在食品中应用范围相应扩大，可用于天然蛋白质不能很好应用的食品，如饮 料、低酸食品等，也用来满足特殊人群对蛋白的营养需求。 蛋白水解产物的去苦味：蛋白水解产物在许多方面都有应用，例如食疗保健食品的配料，婴儿 奶粉、临床营养品和香味荆等。蛋白水解产物的苦味对于在食物和保健产品方面的应用是一个主要 的问题。苦味的程度与水解产物中的疏水氨基酸的数目有关。肽段中心的p r o 残基也与苦味有关。 可以水解疏水性氮基酸和脯氨酸的肽酶在去除蛋白水解产物的苦味方面有重要的应用价值。从乳酸 菌分离的一种氨肽酶d e b i t r a s e 就是一个例子。梭肽酶a 因其具有很高的水解特异性而在脱苦味方 面具有很高的潜力。先用内肽酶进行初次水解，然后用氨肤酶进行二次水解相结合的方法可以增加 6 微生物学硕士论文 脱苦味所用水解产物的产量。 1 6 3 制药工业 蛋白酶的多样性和特异性使得它在寻找有效的治疗剂方面具有很大的优势。产生的蛋白酶已经 用作一种消化酸来治疗细胞溶菌酶缺乏综合症。梭菌胶原酶或枯草杆菌蛋白酶可以和广谱抗菌素复 合使用来处理烧伤和碰伤。从大肠杆菌分离的天( 门) 冬酰胺酶可用来除去各种淋巴细胞白血病血流 中的天冬酰胺酸。c o n i d i o b o l u sc o r o n a t u s 产生的碱性蛋白酶可以取代动物细胞培养中所使用的胰 岛素1 。 1 8 4 皮革工业 传统制革工艺在生产过程中使用诸如硫化物这样的危险化学品，带来了环境污染和污水处理的 问题。实践证明用酶制剂替代化学品是提高皮革质量、减少环境污染的有效途径。由于蛋白质是皮 革和毛发的主要成分，些特殊蛋白酶被用于选择性水解皮子的非胶原成份，去除非纤维蛋白如清 蛋白和球蛋白。 1 6 5 废物处理 碱性蛋白酶提供了有潜力的处理各种食品工业、家庭生活废弃物的方法，它可变废为宝，提供 大量的鱼或家畜的饲料，如d a l e w 。”报道了一种使用枯草杆菌碱性蛋白酶处理家禽屠宰场废弃羽 毛的方法，它可使羽毛变为高蛋白质的饲料添加剂。此外，很多有角蛋白水解活性的碱性蛋白酶 用于生产氨基酸及多肽。 1 6 6 化学工业 毫无疑问，化学合成中酶可在有机物中进行生物催化，然而，这一过程最主要的缺点是在有机 相中酶活大大降低在有机溶剂中保持或激活酶的活性有很重要的实际意义，一些研究己证实在有 机相中可使用碱性蛋白酶催化多肽合成。人们己致力于在不溶性载体上固定化碱性蛋白酶以合 成多肽。另外，人们发现在x 一射线胶片生物处理回收银中，碱性蛋白酶有应用的潜力，使用碱性蛋 白酶处理，不仅可使银得到回收，多元酯也可再循环，还减少了污染。 1 6 7 其他应用 蛋白酶除了工业和药物应用之外，它在基础研究中也有广泛应用。它对肽键断裂的选择性可以 解释结构与功能、肽链的合成以及蛋白质序列等方面的问题。 从本质上说，蛋白酶水解作用的广泛性和特异性可以应用在食物、清洁剂、皮革和制药等工业 中同时也应用于说明蛋白质的结构。 1 7 芽孢杆菌蛋白酶的研究现状 基因工程技术发展迅速，提供了一个极好的扩增和操纵基因的手段，已成为增进我们对遗传系 统结构一功能关系理解的重要工具现在，重要的工业产酶5 0 9 6 以上都是由基因工程微生物生产的 。细菌、真菌和病毒中都有蛋白酶基因被克隆和测序，不少关于微生物蛋白酶基因分离和表达的 文章被发表。 目前，蛋白酶基因工程研究的主要内容有：蛋白酶基因的表达：通过基因剂量效应( 增加基 7 徽生物学硕士论文 因拷贝数) 使蛋白酶基因过度表达，大幅度提高食品，洗涤荆和医药工业用酶的产量；蛋白酶在 微生物致病性中所起的作用：有些细菌的毒性与胞外蛋白酶的分泌有关，为了了解它们的致病机理 和研发治疗药物，需要克隆其蛋白酶基因；蛋白酶的调控：蛋白酶在细胞的生理活动中扮演重要 角色，为了研究其调控作用，已经克隆了大肠杆菌和枯草杆菌中的相关蛋白酶基因；蛋白质工程： 定位活性位点氨基酸残基；通过定点突变改变酶的性质，使之适应不同应用的需要。本文着重介绍 芽抱杆菌蛋白酶基因工程的研究进展。 从8 0 年末期开始，微生物蛋白酶的研究逐渐向基础理论和应用的纵深发展，主要表现在对蛋 白酶基因结构、蛋白质三维空间结构、结构与功能的关系以及蛋白质工程等方面的研究1 1 7 1 碱性蛋白酶基因的结构 碱性蛋白酶基因具有典型的“p r e 呻r o 一成熟酶前体”编码特征 7 ，其中，p r e 一序列编码信号 肽，p r o - 序列编码一段为蛋白酶形成具有生物活性的合适构象所需的肽链，如南极嗜冷芽抱杆菌， 分泌的碱性蛋白酶原由4 1 9 个氦基酸残基组成，成熟的酶蛋白由3 0 9 个氨基酸残基组成。 据m a l b r a o 2 9 等人比较，碱性蛋白酶活性中心及活性中心附近的残基相当保守，这提示着 碱性蛋白酶可能由一个共同祖先进化而来，枯草杆菌碱性蛋白酶的活性中心多由天冬氨酸、组氨酸 和丝氨酸组成，k n i d e e t a l 在比较了枯草杆菌胞内丝氨酸蛋白酶与枯草杆菌蛋白酶c a r l s b e r g 及b p n 之后发现，它们有4 5 的同源性1 。但活性中心附近保守性则相当高，这说明胞内酶及胞外蛋白酶 是共同祖先经不同途径进化而来。 在碱性蛋白酶中，枯草杆菌蛋白酶的研究历史较长，1 9 6 0 年，丹麦人首先利用地衣芽抱杆菌生 产枯草杆菌c a r l s b e r g 酶，随即被用于生产酶洗涤剂。大部分枯草杆菌蛋白酶由2 7 0 多个氨基酸残 基组成，由于枯草杆菌蛋白酶的高分辩率结构己经清楚，而且有合适的克隆、表达系统以及准确定 量的分析催化活性的方法，因此它是进行蛋白质工程研究的合适的对象，迄今为止对枯草杆菌蛋白 酶所做的定位诱变( s d 岫己有4 0 0 多个，在理论及应用上都取得了相当的进展及成功，人们对微生 物进行基因工程改造，其目的就是为了使产物高效表达或者获得性能改进的产物。 1 7 2 碱性蛋白酶基因的筛选和表达 对碱性蛋白酶基因的筛选可采用多种方法，如免疫法、d n a 杂交法，遗传互补法等。用免疫法 筛选时，须以高纯度的蛋白酶作抗原，制备特异性强的抗体，用d n a 杂交法筛选时，则需要与所分 离的基因具有高度同源性的蛋白酶基因片段，遗传互补法则简捷，直观，可一次筛选出具有生物活 性的基因，常用宿主为大肠杆菌( e s c h e r i c h i a c o l i ) 和枯草杆菌( b a c i l t u ss u b t i l i s ) 。e c o l i 遗传背景清楚。可用于分离各种基因的载体种类繁多，e c o l i 筛选是否成功，与碱性蛋白酶基因的 种类，来源、检测方法有关。k n i d e 等人、y a m a d a 等。1 的研究证明，e c o l i 可作为宿主菌筛选蛋 白酶基因，但用来筛选b s u b t i l i s 的基因，直接筛选成功的例子很少，对此，一般认为枯草杆菌 中某些蛋白基因，在表达水平较高时，过多酶积累会妨碍e c o h 的生长，甚至使细胞死亡，从而使 筛选失败。 目前以枯草杆菌、碱性蛋白酶基因缺陷型菌株筛选蛋白酶基因，是最常用的筛选方法，因为它 8 微生物学硕士论文 可将产物分泌到胞外，因而可在含蛋白酶底物的检测平板上直接进行筛选，例如s l o m a 。对枯草杆 菌m i n o r 胞外蛋白酶基因的筛选。 蛋白酶基因的表达受到多种因素的制约，其中包括基因自身结构的特点，使用的克隆系统及外 部培养条件等。基因本身的启动子顺序，m r n a 与核糖体的识别及结合位点( s d 序列) 、s d 序列与翻 译起始密码子之间的d n a 顺序与距离影响了基因转录与翻译过程中基因与r n a 聚合酶、核糖体的相 互识剐与结合能力。如b a n d 1 等的研究表明。不同宿主菌对基因的s d 序列的识别与结合能力是不 同的，s d 序列对基因的能否表达及表达水平有显著影响。 在碱性蛋白酶基因的克隆及表达研究中，在宿主菌e c o l i 中的表达效率远低于b s u b t i l i s 导入酶基因后的克隆菌的酶活性高于宿主菌自身，但不一定高于该基因的供体菌。如来自地衣芽抱 杆菌c 1 2 1 3 、2 7 0 9 的碱性蛋白酶基因“”，在b s u b t i l i sd b l 0 4 和b g z 0 3 6 中表达水平均为供体菌表 达水平的2 0 。 为提高表达水平，常采用高拷贝表达型载体，带有强启动子或插入易被宿主菌识别的s d 序列， 但克隆系统是一个复杂精巧的平衡体系，高拷贝往往会导致组质粒自身的不稳定或使克隆菌不稳 定，l e o n h a r d t 1 研究表明，要提高重组质粒的稳定性，可争取减小质粒的分子量，降低质粒拷贝 数，延缓宿主菌生长速度等方式。 培养条件影响蛋白酶基因表达的外部条件，培养基组成，培养温度，菌体生和速度对表达影响 很大，研究表明，丰富培养基会增加质粒的不稳定性。 1 7 3 碱性蛋白酶的基因工程改性 改变起始密码子或者改变原肽链中某个氨基酸1 均可提高酶产量。枯草杆菌蛋白酶有广的底物 特异性，通过它的两个特异性口袋s 1 和s 4 ，与底物的侧链氨基酸p l 和p 4 反应。通过改变两个特 异性口袋s l 、s 4 可改变s 1 、s 4 对p l ，p 4 的特异性，同时可以改变酶的活性。如将枯草杆菌蛋白 酶的p r 0 2 2 5 用a l a 、l e u ，m e t 、g l n 、v a l 或s e r 替换，突变酶对酯的活性提高1 5 倍，但对肽键 的活性降低，将枯草杆菌蛋白酶e 的g l u l 5 6 - g l u1 5 7 一s e r l 5 8 一s e r l 5 9 ( e g s s ) 、 g l y l 6 0 一s e t - 1 6 1 m r l 6 2 - s e r l 6 3 ( g s t s ) 和s e r - 1 6 1 - t y r l 6 2 - s e r l 6 3 - t h r l 6 4 ( s t s t ) 缺失，发现s t s t 缺失对酶活性无影响，另两种缺失的突变酶活性大大降低，而且s t s t 缺失突变酶底物特异性趋近 于类似于弹性蛋白酶的底物特异性”。 传统的化学固定法常常导致酶分子随机定向于固相表面，因此大大降低酶活性，人们可以在远 离活性位点处引入c y s ，这一遗传修饰的枯草杆菌蛋白酶通过c y s 的一s h 固定于固相表面，保证了 酶充分发挥催化能力 洗涤剂、制革工业要求酶在高温条件下有稳定的酶活，因此，酶的稳定性是商品化成功与否的 关键因素，通过定位诱变引入盐桥、二硫键，芳香硫相互作用和提高酶对钙离子的亲和度是提高酶 的稳定性的一种方法，如t a k a g i 1 l 利用s d m 技术，在枯草杆菌蛋白酶e 中引处一个二硫键，结 果该突变酶的t a m 值比野生酶高了4 5 ，而且催化能力并末发生变化。枯草杆菌蛋白酶b p n 、 c a r l s b e r g 、d y 等通过定位诱变缺失7 5 - 8 3 位氨基酸残基，这一缺失阻止了c a 与酶的亲和位点，但 9 微生物学硕士论文 依然保持酶的活性，这一突变使酶适用于含有鳌合剂的系统如洗涤剂中1 。 此外，从理论上说，假如人们在与枯草杆菌蛋白酶自身降解有关的位点定点诱变，应可防止由 于自身降解而导致的酶失活问题。 由于亚洲地区习惯于低温洗涤，因此，适应于低温的酶也有广阔的应用前景，t a g u c h is 等人 将枯草杆菌蛋白酶的v a l 7 2 替换成l i e ，a l a 9 2 替换成t h r ，g l y 3 1 替换成a s p ，获得的突变酶在 1 0 度时催化一合成底物的活性比野生酶提高2 倍，在6 0 度时热稳定性接近于野性酶。 枯草杆菌抗氧化能力较差，受到氧化荆( 增白剂、消毒剂) 作用时，会立即失去9 0 9 6 的酶活力， 通过改造，可提高其抗氧化性，朱榴琴等1 得到的枯草杆菌蛋白酶e 的突变酶m 2 2 2 a ，i t 2 2 2 a n i l 8 s 具抗氧化能力，3 7 与1 姗如一起保温1 h ，活性仍保留9 0 。m 2 2 2 a n 1 1 8 s 还具有热稳定性。 1 0 微生物学硕士论文 引言 很多微生物都可以产生具有工业价值的胞外碱性蛋白酶，但到目前为止，用于碱性蛋白酶工业 生产的主要菌株及最重要的研究、开发对象都是芽孢杆菌，包括地衣芽抱杆菌、桔革芽抱杆菌、短 小芽饱杆菌等。国际上最重要的碱性蛋白酶商品几乎都是用芽孢杆菌生产的。我国碱性蛋白酶的工 业生产菌株则有地衣芽抱杆菌2 7 0 9 、c i2 1 3 ，嗜碱性短小芽饱杆菌b 4 5 等。另一方面，虽然人们对 蛋白酶的研究和利用已有多年的历史，但仍存在蛋白酶制剂品种单一、价格昂贵等问题，加上各国 都十分注重对已有的重要微生物资源的保护，使得产酶优质菌株的筛选和选育仍是重要的课题，特 别是对于发展中国家更是如此。 本工作拟利用传统微生物学方法，从我国丰富的微生物资料宝库中筛选耐高温的碱性蛋白酶产 生菌株，通过形态观察进行初步鉴定，并利用基因工程技术克隆并表达碱性蛋白酶基因，为下步构 建其高效表达菌株进行基因工程改性及工业化生产打下基础。 微生物学硕士论文 2 实验材料与方法 2 1 试验材料 枯草芽孢杆菌1 2 0 ( 河南农业大学微生物实验室保存提供) ；芽孢杆菌a - 1 0 9 自行筛选。 菌种和质粒：ec o l id h 5o 菌株( s u p c 4 4h s d r l 7r k - m k + r e c me n d a lg y h 9 6t h i r e l ) ，b l 2 1 菌 株( d e 3 ) p l y s s ( h s d s g a lc s m + c l t s 8 5 7i n d ls a e 7 n i n 51 a c u v 5 t 7 基因1 ) ( 以下简称b l 2 1 ) ； b l u e s c r i p ts km 1 3 质粒( 2 9 6 k b ) ，p e t - 3 0 a ( + ) ( 5 4 k b ) 均由本实验室保存。 2 2 培养基 所有培养基用去离子水配制后，于1 5 m p a 压力下湿热灭菌2 0 分钟，如需要液体培养基在接种 前加入适量的抗菌素或其它溶液，固体培养基用微波炉溶化后冷却至5 5 ( 2 后倒平板，如需要在倒平 板前加入适量的合适抗菌素或其它溶液。本试验所用l b 培养基、s o b 培养基、s o c 培养基等按参考 文献吲配制。 一 豆粕培养基：豆粕粉3 ，琼脂粉1 5 。 筛选培养基：胰蛋白胨1 ，酵母浸出粉0 5 ，氯化钠0 5 ，脱脂牛奶0 8 _ 1 0 ，琼脂粉1 5 - 1 7 ， 自然p h 值。 细菌鉴定培养基：参照严杰主编的现代微生物学试验技术及其应用 2 3 生化试剂与分子生物学试剂 四种脱氧核普酸( 4 x d n t p ) ，d n a 限制性内切酶( b a h a i 、k p n i 等) ，t 4 d n a 连接酶，d n a m a r k e r s ( xd n a e c o r t l 4 、 d n a h i n d m a r k e r s 、d e l 2 0 0 0 ) 。普通t a qd n a 聚合酶、标准蛋白质分子 量，i p t g ( 异丙基硫代一b d - 半乳糖普) 等购自大连宝生物工程公司；t r i s 、e d t a 、琼脂粉、十二烷 基硫酸钠( s d s ) ，溴化乙锭( e b ) 、溴酚蓝、甘油、r n a 酶蛋白酶k 、5 - 溴- 4 一氯一3 一吲哚一b d - 半乳 糖苷( x - g a l ) 、n a c i 、k c i 、o h 、酚：氯仿：异戊醇( 2 5 ：2 4 ：1 ) 等均为上海生物工程技术服务 有限公司进口分装产品。胰蛋白胨、酵母提取物购自o x o i d 公司；琼脂糖购自s p a n i s h ；c a c h 、p i p e s 、 d m s o 、卡那霉素、氯霉素、氨苄青霉素购自s i g m a 公司。其它均为国产分析纯试剂。 2 4 主要试剂盒 t r a n s f o r m a t i o n & s t o r a g es o l u t i o n ( 2 x t s s ) 购自美国e p i c e n t r et e c h n o l o g i e s 公司；d n a 胶 纯化回收试剂盒及d n ap c r 纯化回收试剂盒购自c l o n t e e h 公司：质粒小量提取试剂盒购自o m e g a 公 司。 2 5 试验仪器 显微镜o l m p u s b x 6 0 ， z i e g r ae i s 型制冰机，d 1 1 f 一一5 型稳压稳流定时电泳仪，s c s 一2 4 型和 t h z - 8 2 型恒温振荡器，s 卜c j i c 型超净工作台，t g l - 1 6 g 高速离心机，w d - - 9 4 0 3 c 型紫外分光仪， p t c - - 2 0 0p c r 仪，s i g m as k l 8 型冷冻离心机，j y 9 6 - 超声波细胞破碎机，u n i c o - 7 2 0 0 型分光光度 计，l 硎一2 5 0 s 微电脑控制恒温恒湿培养箱，v i l b e rl o u r m a t 凝胶成像系统。 2 6 实验方法 2 6 1 培养条件 微生物学硕士论文 所有平板均在3 7 恒温静止培养2 4 h 左右：所有液体菌株均在3 7 恒温摇床培养过夜。 2 6 2 菌体保存 短期保存：划线培养于含适当抗生素的l a 平板，4 存放约四周。 长期保存：将0 5m l 过夜培养液与0 5m l 4 0 ( v v ) 灭菌甘油充分混合后，一2 0 或一7 0 存放。 2 6 3 土壤样品采集 从郑州地区的4 个不同地点分别采集的4 个土壤样品，选择无人为干扰、有机质含量丰富、水 分适宜的土壤。选取采集地点地表植被根系周围的土壤，铲去表土，向下挖松2 - 5 c m 深土层，并将 上下土壤充分混匀，每个样品约取5 0 0 9 土壤，装入无菌纸袋，并在袋上注明采集地点、植被，日 期和土样号。 2 6 4 菌悬液的制备 称取土样l o g ，加无菌水l o o m l 制成1 1 0 的土壤稀释液。摇床2 2 0 r p m 振荡3 0 b i n 。静置5 m i n 吸取上清液l m l ，依次稀释1 0 2 ，1 0 3 、1 0 、1 0 5 倍。 2 6 5 平板接种 涂抹法：用移液枪吸取5 m l 的土壤稀释液于平板中央，随即用三角形玻璃棒涂匀。 混菌法：吸取稀释液l m l ，加入无菌的培养皿中，分别注入预先溶化并冷却到4 5 5 0 的培养基 约1 8 - 2 0 m l 。轻轻摇转培养皿，使样品和培养基充分混匀。 2 6 6 分离培养 接种好的培养皿，倒置放入培养箱中培养，3 7 ，1 6 1 8 h 便可以见到明显的菌落。根据微生 物菌落的形状、大小、表面结构、边缘结构、质地、光泽，透明度、颜色和产生的可溶色素等方面 的特征，用接种环将孤立的单个菌落一一挑出，移到相应培养基的试管或平板上，并编号。 之6 7 继代培养 连续继代培养1 0 代，重新运用平板法测定筛选出的菌株，保留活性无明显变化的菌株。 2 6 8 菌株保存 筛选出的菌株，分别采用牛肉膏斜面临时保存，和甘油管长期保存。斜面置于4 冰箱中，甘 油管置于冰箱中- 2 0 保存。 2 6 9 菌株鉴定”“” 鉴定菌株：分离自郑州地区土壤中菌株 对照菌株：枯草芽抱杆菌1 2 0 菌株，河南农业大学微生物试验室提供。 细菌的分类鉴定是细菌一项及其重要的基础性研究工作。常规的细菌鉴定方法主要是通过对细 菌菌落形态特征、细胞形态、特殊的细胞结构( 如鞭毛、芽孢等) 观察、革兰氏染色，细菌的生理生 化特征( 如营养类型、碳源，氮源的利用能力、培养温度、p h 的耐受性等) ，血清型等，将细菌进行 分类、鉴定。 2 6 9 1 茵体形态观察 将待鉴定菌在牛肉膏平板上培养2 4 h r 后染色并镜检。 1 3 微生物学硕士论文 染色方法包括：革兰氏染色、荚膜染色、细胞壁染色、抗酸染色“ 2 6 9 2 培养特征观察 取菌龄为2 4 - 4 8 h 的a 菌株集中在牛肉膏平板、牛肉膏斜面3 7 c ，培养2 4 h 。同时进行琼脂柱、 明胶穿刺培养，温度3 7 c ，2 4 h 培养。 2 6 9 3 需氧性测定和运动性测定 将斜面培养2 4 小时a 3 - 2 菌株用外径1 5 m 的接种环穿刺接种到培养基管底，3 天后观察结 果。如果菌落沿培养基表面生长，表明为好氧菌。反应为阳性。如菌落沿穿刺线生长反应为阴性。 2 6 9 4 生长温度测定 在牛肉膏培养基( 外加1 葡萄糖) 中用直针接种，在恒温水浴中不同的温度下( 4 、1 0 、1 5 、4 0 、 4 5 ，5 0 、5 3 c ) 培养2 - 5 天。观察菌株的生长状况，采用比浊法测定菌体生长量。 2 6 9 5p h 5 7 培养基中生长状况观察 取营养肉汤中培养的菌株接种在基础培养基液体试管中，3 0 c 培养1 - 7 天。观察菌株生长状况。 2 6 9 6 耐盐性试验