（无机化学专业论文）基于纳米材料的高灵敏电化学生物传感器的研究.pdf

：- ： 基于纳米材料的高灵敏电化学生物传感器的研究 摘要 本论文制备了新型的纳米材料，并用于制作化学修饰r c l 极应用于生物传感 器。与传统的生物传感器相比，基于纳米材料的牛物传感器呈现出史高的灵敏度、 更长的寿命以及其它的优越性能。主要研究内容有如下两部分： 1 制备了一种基于c d sq d s c n t s g n p s c h i t 复合纳米材料的高灵敏电致 化学发光免疫传感器。由于在c d s 量子点膜中混合了聚二烯丙基二甲基氯化铵 ( p d d a ) 功能化的碳纳米管( c n t s ) 而使得c d s 量子点的咆致化学发光性能极人 提高。q d s c n t s 和g n p s c h i t 的结合不仅提高了复合物膜的生物相容性和稳 定性，也提供了一种有效固定生物分子的基质。当抗体被联到c d s q d s c n t s g n p s c h i t 复合物膜上后，就构建了e c l 免疫传感器。利用免疫反 应生成免疫复合物增大电极阻抗而使e c l 强度降低的原理检测抗原浓度，在优 化的实验条件下，e c l 的强度和抗原浓度的对数在o 0 0 6 1 5 0n gl 。呈直线关 系，检测限是o 0 0 1n gm l 。该研究是首次将c d sq d s c n t s g n p s c h i t 复合 物膜的e c l 、生物相容性和稳定性结合制备e c l 免疫传感器的报道。另外，q d s 在e c l 过程中可再生。q d s 依赖于粒子大小的性质也赋予它在e c l 应用中良好 的前景。本研究极大地促进e c l 和q d s 纳米复合材料在牛物分析上的应用。 2 成功制备了一种超强e c l 的纳米复合材料，并应用于制作超灵敏的电致 化学发光免疫传感器以检狈i j c e a 。这种方法有几点优势，第一，与纯的q d s 相比， 这种材料独特的结构不仅使e c l 强度放大了1 7 倍，也因为覆有一层a u n p s 而使毒 性降低，将成为制作e c l 免疫传感器的优良材料。第二，a p s 和a un p s 作为固定 a b 的交联剂，极大地放大了e c l 信号。第三，融合多重放大技术，该免疫传感 器显示出较高的灵敏性和较宽的线性范围，将成为蛋白质诊断的方法之一。第p q ， 据我们所知，这是首次报道这种新型复合材料用于e c l 免疫传感器。该传感器在 灵敏性和线性范围上都优于以前的传感器，e c l 信号的强度随着c e a 的浓度在 0 3 2p gm l 一到1 0 n gm l 一。之间变化时，呈线性降低，检测限为o 0 6 4p gm l 。本 研究为量子点纳米复合物的e c l 用于高灵敏度的分析丌辟了新的方法。 关键词：纳米术于料；量子点：尘物传感器；电敛化学发光 s t u d yo fh l g h s e n s l t l v i t y b i o s e n s o rb a s e do nn a n o m a t e r i a l s a b s t r a c t t h em a i ni d e ao ft h er e s e a r c hw a st oe x p l o r en o v e ln a n o m a t e r i a l sa n dp u tt h e m i n t ot h eu s eo f p r e p a r i n g s e n s i t i v eb i o s e n s o rf o rt h ed e t e r m i n a t i o no f b i o m a c r o m o l e c u l a r c o m p a r e dw i t h t r a d i t i o n a l b i o s e n s o r s ，t h en o v e lb i o s e n s o r s s h o w e dh i g hs e n s i t i v i t y , r a p i d i t ya n ds i m p l i c i t ys ot h a ti tc o u l db ew i d e l yu s e di nt h e f i e l do f b i o l o g i c a la n a l y s i s t h i sp a p e rc o n s i s t so ft w op a r t sb e s i d e st h ep r e f a c e ： 1 an o v e la n ds e n s i t i v ee l e c t r o c h e m i l u m i n e s c e n c e ( e c l ) i m m u n o s e n s o rb a s e d o nc d s q u a n t u m d o t s ( q d s ) 一c a r b o n n a n o t u b e s ( c n t s ) a n d g o l d n a n o p a r t i c l e s c h i t o s a n ( g n p s c h i t ) w a sp r e s e n t e d c d sq d se c lw a sm u c h e n h a n c e db yc o m b i n gp o l y d i a l l y l d i m e t h y l a m m o n i u mc h l o r i d ef u n c t i o n a l i z e dc n t s g n p s - c h i tn a n o h y b r i d sw a su s e dt oc o n s t r u c ta ne f f e c t i v ea n t i b o d yi m m o b i l i z a t i o n m a t r i xw i t he x c e l l e n ts t a b i l i t ya n db i o a c t i v i t y t h ep r i n c i p l eo fe c ld e t e c t i o nf o r t a r g e th u m a nl g gi sb a s e do nt h ei n c r e m e n to fs t e r i ch i n d r a n c ea f t e ri m m u n o r e a c t i o n ， w h i c hr e s u l t e di nt h ed e c r e a s ei ne c li n t e n s i t y t h el i n e a rr e s p o n s er a n g ew a s b e t w e e n0 0 0 6a n d15 0n gm l 一1 ，a n dt h ed e t e c t i o nl i m i tw a s0 0 0 1n gm l - 1 t h i s a p p r o a c ho f f e r so b v i o u sa d v a n t a g e so fb e i n gs i m p l e r , f a s t e ra n dm o r es t a b l ec o m p a r e d w i t ho t h e ri m m u n o s e n s o r s ，w h i c hp o s s e s s e sg r e a tp o t e n t i a lf o rp r o t e i nd e t e c t i o ni n c l i n i c a ll a b o r a t o r y 2 t h e h i g h l y i n t e n s ee c lf r o ma u n i q u e n a n o s t r u c t u r eo f a u s i l i c a c d s e - c d s q d sw a sd e v e l o p e d ，a n da nu l t r a s e n s i t i v ee c li m m u n o s e n s o r f o rc e ad e t e c t i o nw a sp r e p a r e d s e v e r a la d v a n t a g e so ft h ep r o p o s e dm e t h o ds h o u l d b eh i g h l i g h t e d f i r s t l y , t h i si st h ef i r s tr e p o r to fag r e a t l ye n h a n c e de c lf r o man e w c l a s so fq d s m e t a ls u p e rs t r u c t u r ew h i c hw a se x p l o r e da n da p p l i e dt ob i o s e n s i n g ， w h i c h o p e n e d an e wa v e n u et oe n h a n c e dq de c l s e c o n d l y , t h eu n i q u e s u p e r s t r u c t u r en o to n l ye n h a n c e dt h e e c li n t e n s i t yb y17o r d e r so fm a g n i t u d e ， c o m p a r e dw i t ht h ep u r eq d s ，b u ta l s og r e a t l yd e c r e a s e dt h et o x i c i t y , w h i c hp r o v i d e d a ni d e a la l t e r n a t i v ee c lr e a g e n ti nb i o a n a l y s i s t h i r d l y , b o t ha p sa n dg o l dn p sa s c r o s s 1 i n k e r sf o ra bi m m o b i l i z a t i o nc o u l ds i g n i f i c a n t l ya m p l i f yt h ee c ls i g n a l f o u r t h l y , i n t e g r a t i n gt h em u l t i p l e a m p l i f i c a t i o nt e c h n i q u e s ，i th a dah i g h l ys e n s i t i v e e c ld e t e c t i o nw i t hs p e c i f i ci m m u n o r e a c t i o n ，t h ei m m u n o s e n s o rs h o w e dr e m a r k a b l e e n h a n c e m e n ti nb o t hd e t e c t i o ns e n s i t i v i t ya n dl i n e a rr a n g e ，w h i c hm i g h tb e c o m ea n a t t r a c t i v ea p p r o a c hf o rc l i n i c a ld e t e c t i o no fp r o t e i n t h ee c li n t e n s i t yv a r i e dl i n e a r l y w i t ht h ec o n c e n t r a t i o no fc e ab e t w e e no 3 2p gm l 1a n d10n gm l ，a n dt h e d e t e c t i o nl i m i tw a s0 0 6 4p gm l k e yw o r d s ：n a n o m a t e r i a l ，q u a n t u md o t s ，b i o s e n s o r , e l e c t r o c h e m i l u m i n e s c e n c e n 目录 第一章绪言l l 生物传感器概述1 2 生物传感器分类l 2 1 根据生物传感器巾用作生物元件的材料分2 2 2 根掘生物传感器获取信号的物理元件分3 3d n a 生物传感器4 3 1d n a 生物传感器简介4 3 2d n a 的化学结构7 ：5 3 3d n a 生物传感器的设计5 3 4 d n a 传感器的展望7 4 免疫传感器7 4 1 免疫传感器的测定原理8 4 2 免疫传感器的分类8 4 3 电化学免疫传感器9 4 4 免疫传感器的固定化方法1 1 5 纳米材料在化学生物分析及传感中的应用1 4 5 1 纳米粒子标记d n a 探针的进展15 5 2 复合纳米材料构建的化学生物传感器16 5 3 量子点的特性和优点17 5 4 量子点的修饰及与生物大分子的偶联18 5 5 量子点在标记免疫分析中的应用18 6 化学发光技术简介19 6 1 化学发光的原理及特点一19 6 2 半导体纳米材料的电致化学发光：2 l 6 3 电致化学发光研究的发展趋势2 2 7 生物传感器的研究展望2 3 8 本课题的意义及研究内容2 4 第二章基于c d s 量子点一c n t s 金胶一壳聚糖复合物的高灵敏电致化 学发光免疫传感器2 5 1 引言2 5 2 实验部分2 6 2 1 药品2 6 2 2 实验装置2 7 2 3 水溶性c n t s p d d a ( p d c n t s ) 的制备2 7 2 4 纳米金壳聚糖( g n p s c h i t ) 复合物的制备2 7 2 5c d s 量子点的制备2 7 2 6e c l 免疫传感器的制备。2 8 2 7e c l 检测2 8 3 结果与讨论2 8 3 1c d sq d s 和g n p s 的表征2 8 3 2c d sq d s p d c n t s 复合物膜的电化学和e c l 性质2 9 3 3e c l 免疫传感器的制备与表征3 2 3 4 电致化学发光( e c l ) 二3 3 3 5 扫描电镜图( s e m ) 3 4 3 6 检测抗原( a g ) 3 5 3 7 免疫传感器的特异性、稳定性、重现性和再生性3 7 4 实验条件的优化3 8 4 i 免疫传感器制备条件的选择3 8 4 2e c l 检测条件的选择3 8 5 结论：4 0 第三章基于a u s i 0 2 c d s e c d s 复合材料的超灵敏电致化学发光传感 器检测癌胚抗原一4 l l 引言4 l 2 实验部分4 2 2 1 试剂一4 2 2 2 实验装置4 2 2 3 核壳结构c d s e c d s 纳米粒子的合成4 3 2 4 合成a u s i 0 2 c d s e c d s 纳米复合材料4 3 2 5e c l 免疫传感器的制备4 4 2 6e c l 检测。4 5 3 结果与讨论4 5 3 1 a u s i o j c d s e - c d s 纳米复合材料的表征4 5 3 2 a u s i 0 2 c d s e c d s 纳米复合材料的电化学和e c l 特性4 7 3 3e c l 免疫传感器的制作过程表征4 9 3 4 扫描电镜图片一5 0 3 5 电化学交流阻抗( e l s ) ：51 3 6 检测h i g g 抗原( a g ) 一5 2 3 7e c l 免疫传感器的特异性，稳定性，重现性和再生性5 3 4 小结5 4 参考文献5 5 结论6 6 致谢6 7 攻读学位期间发表的学术论文目录6 8 独创性声明：6 9 i v 青岛科技人学研究生学何论文 1 生物传感器概述 第一章绪言 生物传感器足将生物技术、材料技术、纳米技术、微电子技术等结合起来形成 的新兴高科技产品，它是住化学传感器基硼j 上发展起来的一类特殊的传感器，可在 医学及：一e 农业等其他领域广泛地应用于检测分析【1 3 】。国际纯粹与应用化学联合会 ( i u a p c ) 对化学传感器的定义为：一种小型化的、能专一和可逆地埘某种化合物或 某种离子其有应答反应，并能产生一个与此化合物或离子浓度成比例的分析信号的 传感 【4 1 。 生物传感器具有如卜优点：( 1 ) 生物传感器足由选择性好的生物材料构成的分 子识别元件，凶此一般不需要样品的预处理，样品中的被测组分的分离和检测同时 完成，且测定时一般不需加入其它试剂，凶此，具有良好的敏感性和特异性；( 2 ) 由 于它的体积小，可以实现连续在线监测；( 3 ) u l ：, j 应快，样品用量少，且由于敏感材料 是固定化的，可以反复多次使用；( 4 ) 传感器连同测定仪的成本远低于大型的分析仪 器，便于推广普及【4 1 。作为一种新的检测手段，生物传感器正迅猛发展，有的已在 生物功程、医学与临床、环境检测等领域展现出十分广阔的f ； 景【5 j ，2 1 世纪是生命 科学的时代，随着“人类基因组工作草图”的完成、纳米技术和纳米电子加工技术的 出现，无论在原理上还是加工加工技术上都将为生物传感器带来巨大变革。因此， 目前世界各国都投入巨资对生物传感器进行技术研究和产品= j 1 ：发。 2 生物传感器分类 生物传感器将牛物元件与物理元件构成相结合，形成对特定化学或生物组分具 有响应的检测装置。用作生物元件的材料有：酶、细胞及细胞器、抗原及抗体、核酸、 受体等，它们可以与被测物质起特异性反应，物理元件则包括：电化学的各种电极、 光导纤维、测声仪器、压电晶体等。根据不同的分类方法，常见的生物传感器可以 分类如下： 基丁纳米材料的高灵敏电化学生物传感器的研究 2 1 根据生物传感器中用作生物元件的材料分 2 1 1 酶传感器 这是一类研究最早的生物传感器，酶是一类生物催化剂，对相应底物具有催 化转化能力，可构建基于催化作用的生物酶传感器；同时，有些物质对酶活性有特 异性抑制作用，可制成酶抑制性生物传感器。 2 1 2 组织传感器 组织传感器实际上也是酶传感器，因为酶都是从动植物的器官，组织中提取出 了的，经过纯化成为单一的酶。组织传感器足利用天然组钐 中酶的催化作用，所以 也是一种酶传感器。由于这种酶存在于天然的动植物组织内，得到其它生物分子的 协同作用，因而十分稳定。 。 2 1 3 细胞传感器 细胞传感器足利用活细胞作为探测单元，可以测量被分析物的功能性信息，是 目前生物传感器研究中的一个热点。 2 1 4 微生物传感器 微生物传感器测定原理有两种类型一类是利用微生物在同化底物时消耗氧的 呼吸作用：另一类是利用不同的微生物含有不同的酶，这和动植物组织一样，把它 作为酶源。 2 1 5d n a 传感器 d n a 传感器将特定序列的d n a 固定到换能器表面，通过与目标d n a 杂交， 形成双链d n a 后，检测由于杂交产生的响应信号，对目标d n a 进行高选择性、高 灵敏性的诊断。 2 1 6 免疫传感器 。 免疫传感器利用抗体与抗原之间的免疫应答机理，将其中之一修饰到换能器 内( 或表面) ，可以检测复杂体系中对应的免疫组分。 2 一一i j i 青岛科技人学研究乍学位论文 2 2 根据生物传感器获取信号的物理元件分 2 2 1 电化学生物传感器 按测量信号f 、= h ，电化学生物传感器又呵分为电流型、电位型、电容型和电 导，弘。电流型传感器利用固定在电极上的酶对酶底物的催化氧化或还原，产生可在 电极上还原或氧化的组分，获得电流信号：电位型传感器是基于离子选择性电极原 理而发展起来的，同定到电极表而的酶对底物催化，产生离子型物质，能引起指示 电极电f 移改变，电位变化关系遵循n e m s t 方程；电容型传感器则以通过免疫反应结 合到电极表面的免疫组分所引起的电容变化值为测定信号；电导型传感器利用酶催 化底物反应，导致反应体系中离子种类及浓度的变化，从而引起溶液导电性的改变， 以溶液电导率为响应信号。 电化学生物传感器的发展过程大概可分为三个阶段：1 9 6 2 年，c l a r k s l l 和l y n o s 首先提出使用含酶的膜将尿或葡萄糖转变为产物，使用p h 或氧电极来检测。后来 在1 9 6 7 年，u p d i k e 和h i k e s 把含有葡萄糖氧化酶的聚内烯酞胺凝胶膜固定到氧电 极上从而达到检测葡萄糖的目的i6 | 。这种利用酶的天然电子传递体氧来沟通与 电极之阳j 的电子通道，直接检测酶反应底物的减少或产物的生成的传感器，称为第 一代生物传感器。为克服第一代传感器受氧分压影响和h 2 0 2 过电位高、干扰多、 受氧溶解度限制等，自7 0 年代起人们丌始用小分子的电子传递媒介体来代替氧沟 通酶的活性中心与电极之间的电子通道，通过检测媒介体的电流变化来反映底物浓 度的变化，从而逐步发展出组织、微生物、免疫、酶免疫和细胞等第二代生物传感 器【7 2 1 。尽管媒介体型第二代生物传感器有许多优点，人们仍在追求酶与电极间的 直接电子转移，因为基于这种原理制备的传感器与氧或其他电子受体无关，无需引 入外j j u 媒介体，因此固定化相对简单，无# l - ) j t l 毒性物质，是最理想的生物传感器。 利用酶自身与电极i h j 的直接电子转移来完成信号的转换的生物传感器被称为第三 代生物传感器【1 3 2 5 1 。 2 2 2 光化学生物传感器 此类传感器以光学信号变化量为测定信息，由于可利用的光学信号很多，包 括光吸收、反射、散射、荧光、磷光、化学发光、表面等离子体共振等，故可大致 分为光化学酶传感器和光化学免疫传感器。前者利用在固定化酶作用下，当分析物 存在时，体系光学信号的变化；而后者是测量免疫反应发生后，引起的光学信号变 化。 基丁纳米材料的高灵敏电化学生物传感器的 刀：究 2 2 3 压电生物传感器 压电品体具有高灵敏性的质最响应特征，其频率变化与结合在其上的物质质 量相关。很显然，具有生物亲合性质的组分检测，可以构建压电免疫传感器。此外， 山压电传感与电化学方法结合发展起来的“电化学微天平技术”，尤其足将压电传感 与光谱电化学结合发展起来的压电光谱电化学方法，可同时提供电化学、质景、光 谱等多维信息，己成为日自订研究液固界面最有效的工具之一。 2 2 4 热传导生物传感器 通过特殊的量热设备来测量由于化学和生物反应导致反应体系的热量变化，此 变化值大小与分析物浓度相关。 3d n a 生物传感器 3 1d n a 生物传感器简介 自19 5 3 年w a t s o n 和c r i c k 创立生物遗传分子脱氧核糖核酸( d n a ) 的双螺旋 结构1 2 引，建立生物遗传基因的分子机理以来，有关d n a 分子的识别、测序一直为 人们所关注。1 9 9 0 年美国制定了世界最庞大的基因研究计划一人类基因组计划。随 着人类基因草图的公布，人们j 下在深入丌展后基因组计划研究，为此，国际上掀起 了有关生物芯片和生物传感器的研究热潮。近年来，分子生物学和生物技术迅速发 展，d n a 检测技术不断提高，同臻完善，为d n a 传感器的建立提供了可能。d n a 传感器不但在基因分析领域发挥了重要作用，还广泛应用到了环境监测、药物研究、 法医鉴定及食品分析等多个领域，具有广阔的发展前景。 4 青岛科技人学研究生学f 节论文 3 2d n a 的化学结构 p 图l 一1d n a 双螺旋结构示意图图1 2d n a 生物传感器原理图 f i g 1 1s c h e m a t i cd i a g r a mo fd u p l e x f i g 1 - 2s c h e m a t i cd i a g r a mo fd n a b i o s e n s o rd n ah e l i x ss t r u c t u r e 构成d n a 的基本单元是脱氧核糖、核苷酸和磷酸。核苷酸碱基主要有四种： 腺嘌呤( a d e n i n ea ) 、胸腺嘧啶( t h y m i n et ) 、鸟嘌呤( g u a n i n eg ) 、胞嘧啶( c y t o s i n e c ) 。d n a 分子的一级结构足核苷酸通过3 t ，5 磷酸二酯键连接而成没有支链的直线 形或环状结构。1 9 5 3 年3 月，w a t s o n 和c r i c k 提出了d n a 双螺旋模型的二级结构，即 d n a 分子是由两条多聚脱氧核糖核苷酸链组成，链的内侧是碱基，两条链以平行方 向盘绕同一条轴形成右旋的双螺旋结构，两条链上的碱基是匹配的，称为碱基互补， 腙嘌呤和胸腺嘧啶以两个氢键连结，鸟嘌呤和胞嘧啶以三个氢键连结，在d n a 分子 中互补碱基的含量相等。d n a 双螺旋结构如图1 1 所示。 3 3d n a 生物传感器的设计 利用d n a 传感器测定目标d n a 的整个过程通常包括以下四个步骤：( 1 ) 单 链d n a 的阎定，即将s s d n a 连接或者同定到一个稳定的表面，通常使用固体电极厂 形成d n a 修饰电极；( 2 ) 杂交过程，d n a 修饰电极放入被测溶液，当互补d n a 链与之相遇时，它们将在电极表面杂交形成d s d n a ，杂交条件须严格控制；( 3 ) 杂 交信号的转换，即如何将杂交信息转化为可测定的信息，如电信号、化学发光信号 等；( 4 ) 信号的检测。化学发光d n a 传感器通常是基于对固定在d n a 探针上的 标记物的化学发光性质的检测来达到对目标d n a 进行检测的目的【2 7 之9 】。其中 基丁纳米材料的高灵敏电化学生物传感器的研究 s s d n a 在电极表面的固定和d n a 探针标汜物的选择是此类传感器的关键i u j 题，制 约d n a 传感器发展的瓶颈。 3 3 1 单链d n a 在电极表面的固定化 d n a 的固定化【27 】是d n a 电化学传感器制作中的首要问题，固定化量和活性直接 影响传感器的灵敏度，为了把d n a 牢固连接在电极表面，往往需要借助有效的物理 或化学方法。目前d n a 的固定方法大致有- 卜面四大类： ( 1 ) 吸附法这种方法是将d n a 直接吸附到电极表面。即在一定实验的电位 范围、p h 值、温度下将预处理好的电极直接放入含有探d n a 的溶液中，反应一段时 问后，用水冲洗掉多余的d n a 即可。这是一种最简单的d n a 匿l 定方法，固定化速度 快，不需要什么特殊的试剂，也不需要对核苷酸进行修饰衍生化。但是吸附固定的 d n a 在高盐浓度的环境中容易从电极表面脱落，所以不适宜在高盐浓度条件下使 用。而且它是多点位的吸附甚至d n a 可能平躺在电极表面，因而d n a 的固定化密度 较小，并且多个作用点固定d n a 使d n a 片段运动自由度减小，在杂交反应中影响其 与互补d n a 的杂交效率。 ( 2 ) 共价键合法共价键合法是通过形成共价键，如酰胺键、酯键、醚键等 使d n a 固定到电极表面。首先是将传感器表面进行活化预处理，引入各种所需的活 性基团，如羧基、羟基、氨基等，或对核苷酸进行衍生，使其带上合适的功能性基 团，随后用双官能团试剂或偶联活化剂联结电极与衍生后的d n a 分子。共价键合法 可以提高探针的牢固度及耐用性。因为d n a 分子以一端固定，结构灵活，有利于杂 交反应的进行。 ( 3 )自组装法一般以金电极作为基体电极，并在d n a 探针分子上接上毓醇 基团，利用s h 基团可自组装至电极表面。即在一定p h 值、温度下将预处理好的电 极直接放入含有5 h s s s d n a 的溶液中，探针d n a 可以特异性的吸附到电极表面， 反应一段时问后，用水洗去多余的d n a 即可。以自组装膜法得到的s s d n a 修饰电极 表面高度有序，稳定性好，在适当的固定密度下，对互补d n a 有很高的杂交效率； 但它对毓基修饰的d n a 化合物纯度要求较高，分离提纯操作繁琐，由于有大的亲水 性核酸基团存在，也较难产生一个紧密的堆积表面，并且有一定的非特异性吸附结 合。 。 ( 4 ) 亲和素( a v i d i n ) 一生物素( b i o t i n ) 反应系统固定方法 这种方法一般 是将亲和素共价偶联【2 8 】或通过静电作用吸附到支持物上。随后将生物素连接的d n a 通过生物素和亲和素之间的专一性亲和作用反应而固定。这种固定生物分子的方法 6 青岛科技人学研究生学位论文 在生物传感器领域逐渐受到人们的重视。d n a 生物素化是在碱性条件一f 5 一氨基衍生 的d n a 和n 羟基丁二亚胺长链生物素反应生成。一般情况下，这些方法简便温和， 且高效，凶此应用越来越广泛。 3 3 2d n a 杂交的信号转换 在合适的条件下，d n a 探针电极浸入含有目标d n a 链的溶液后，d n a i j 与电极 表面的d n a 探针杂交形成d s d n a 。在电化学d n a 传感器的设计中，必须采用一种电 活性分子一杂交指示剂，来检测所发生的杂交信息，它能选择性地与d s d n a 结合， 并能在电极上产生某种呵测定的电信号从而反映d n a 的杂交信息。用于杂交信号转 换的杂交指示剂主要有：嵌入剂、d n a 分子小沟结合剂、电活性标记物及具有化学 放大功能的酶作为标记物。在化学发光d n a 生物传感器的设计中，一般是通过检测 某种具有特殊化学发光性质的标记物束实现的，如酶标记物、纳米粒子标记物等， 与相应的底物发生反应即产生可检测的化学发光信号。 一 3 4d n a 传感器的展望 d n a 生物传感器作为一类新的传感器证在快速的发展，由于它在医学、临床诊 断、环境监测等领域中有着广泛的应用前景，倍受研究者的关注。电化学d n a 传感 器具- 自重要的理论意义和应用价值，它开辟了电化学与分子生物学交叉学科的新领 域。为生命科学的研究提供了一种新技术、新方法。在临床医学和遗传工程等领域 的研究具有深远的意义和应用价值。但是，这种传感器尚存在易受干扰、重现性差 等问题，仍限于实验室阶段。今后电化学d n a 传感器的研究工作将会集中在：( 1 ) 适于高灵敏度检测的杂交指示剂的筛选研究；( 2 ) 电极结构的优化，稳定的自组装单 分子层修饰电极在电化学d n a 传感器的研究；( 3 ) 电化学d n a 传感器在疾病基因诊断 上的应用；( 4 ) 将一些药物作为杂交指示剂，研究其与d n a 的相互作用。研究目标主 要是向实用化、小型化发展，并且在d n a 固定化、信号转换等方面不断应用新技术， 对传感器的性能进行改善和补充，使之更加适应实际应用的需要。 4 免疫传感器 免疫传感器足将免疫测定法与高灵敏的传感技术相结合而构建的一类新型生物 传感器，应用于痕量免疫原性物质的分析研究。免疫传感器能识别较大分子之间的 微小差异，具有很强的专一性。免疫传感器的工作原理和传统的免疫测试法相似， 7 基丁纳米材料的高灵敏i u 化学生物传感器的研究 都属于固柏免疫测试法，即把抗原或抗体固定在同相支持物表面，来检测样品中的 抗原或抗体。不同的是，传统免疫测试法的输出结果只能定性或半定母地判断，且 一般不能对整个免疫反应过程的动态变化进行实时监测。n l i 免疫传感器将抗原( 或抗 体) 吲定在传感器基体上，通过传感技术使i 吸附发生时产生物理、化学、i 乜学或光学 上的变化，转变成可检测的信号来测定环境中待测分子的浓度【2 引。它具有能将输出 结果数字化的精密换能器，不但能达到定量检测的效果，而目山予传感o j 换能同步 进行，能实时豁测到传感器表面的抗原抗体反应。 4 1 免疫传感器的测定原理 免疫传感器具有三元复合物的结构，即感受器、转换器和电予放大器。在感受 器单元中与抗体和抗原选择性结合产生的信号敏感地传送给感受器，抗体! j 抗原的 亲和性结合具有高度的特异性。检测抗体的结合反应有两种摹本方法【3 l 】：( 1 ) 标记法 标记法采用酶、荧光物质、电活性化合物等进行标记，抗体抗原反应过程通过电化 学、光学等手段进行检测，同时对浓度信息加以化学放( 酶标记) ，从而实现高灵敏 检测目标物该类传感器的原理主要有夹心法和竞争法，前者足在样品中的抗原与传 感界面上的抗体结合后，再标记的抗体与样品中的抗原结合，形成央心结构，后者 则是用标记的原与样品中的抗原竞争结合传感界面的抗体标记的抗体。( 2 ) 非标记法 在抗体预期相应的抗原识别结合时直接转变成可测信号。这类传感器在结构一卜可进 一步分为结合型和分离型两种。前者足将抗体或抗原直接匿i 定在传感器表面上，传 感器与相应的抗原发生结合的同时产生可测信号；后者是用抗体或抗原制作抗体或 抗原膜，当其与相应的配基反应时，膜电位( 或其他物理参数) 发生变化，测定膜电 位的电极与膜是分丌的。一般来说，非标记免疫传感器的灵敏度比标记免疫传感器 低【3 2 1 。 4 2 免疫传感器的分类 抗原抗体结合前后可导致多种信号的变化，如在重量、光学、热学、声学、电 化学等方面。由于免疫传感器的检测结果最终还需换能器转换成输出信号，其检测 效果因此也往往取决于所用换能器的精确度与稳定性，故换能器的种类对传感系统 来说显得尤为重要。正是基于换能器在传感器中的特殊地位，免疫传感器的种类一 般可根据换能器的的不同来划分。到目前为止，可将其分为以下几种：电化学免疫传 感器、光学免疫传感器、质量检测免疫传感器、热量检测免疫传感器。目前，光学 传感器的发展较快，但由于电化学分析有光化学分析无法比拟的优势，如可实现在 8 青岛科技人学研究生学位论文 体检测，不受样品颜色、浊度的影响( 即样品可以不处理，不需分离) 并且需要的仪 器相对简单，凶此，电化学免疫传感器的前景较好。 4 3 电化学免疫传感器 4 3 1 电位型免疫传感器 1 9 7 5 年j a n a t a 首次描述了用电位测量来监测免疫化学反应，这种免疫测量原理是 先通过聚氯乙烯膜把抗体固定在金属电极上，然后用相应的抗原与之特异性结合， 抗体膜中的离子迁移率随之发生变化，从而使电极上的膜电位也相应发生改变。膜 电位的变化值与待测物浓度之问存在对数关系，因此根据电位变化值即可求出待测 物浓度。但灵敏度较低，故未得到实际应用。 2 0 世纪8 0 年 f 七r e c h n i t z 等人将在商业上取得成功的离子选择性电极、p h 巾l 或气 敏电极引入到电位测量式免疫传感器中，使灵敏度得以改进。如将c 0 2 气敏电极用 于抗生素、人i g g 和地高辛的免疫化学测定，离子选择性电极的免疫传器也被用来检 测前列腺素、皮质醇抗体和地高辛抗体等。r u o y u a n d 、, 组报道了纳米会修饰玻碳电极 i 直i 载抗体的电位型白喉类毒素免疫传感器的研究。该传感器利用纳米材料大的比表 面积及良好的生物兼容性，增大了固定在电极上的抗体量，并使抗体保持良好的生 物活性，从而提高了传感器的灵敏度。传感器对白类毒素检测的线性范围是 2 4 1 2 8 0 n g m l ，线性相关系数为0 9 9 7 8 ，检出限为7 8 n g m l 。 4 3 2 电流型免疫传感器 该类传感器的原理主要有竞争法和夹心法两种。前者是用酶标抗原与样品中抗 原竞争结合电极上的抗体，催化氧化还原反应，产生电活性物质而引起电流化，从 而可测得样品中抗原浓度。后者则是在样品中的抗原与氧电极上的抗体合后，再加 酶标抗体与样品中的抗原结合，形成夹心结构，从而催化氧化还原应产生电流值变 化。a f p 是珍断肝癌的重要蛋白质。利用酶的放大作用，可获得极高的灵敏。a f p 传感器在l o 一1 0 2 9 m l 范n 内有定量关系。方法是将抗原固定于氧电极的表面，测 定时在待测a f p 的溶液中加入己知浓度经标记过氧化氢酶的a f p 溶，一旦遇到a f p 的抗体时，待测的a f p 抗原与标记的抗原就在电极上产生与抗体结合的竞争反应， 最后达到一定的比例，然后将电极取出用水沈净，再放入含氧化氢的酶活性物质的 溶液中，由于标记的酶能催化过氧化氢分解而产生氧。氧的增加使传感器电流值增 大，从电流的增加速度或最大变化量可求出标记酶的量，即结合于膜的标记a f p 的 9 基丁纳米材料的高灵敏电化学生物传感器的彬f 究 量另外再求得a f p 抗体膜的最大抗原结合量，便町算出被测非标记a f p 抗原的量【3 3 1 。 r u q i ny u 实验小组制作了c 3 电流型免疫传器该免疫传感器把c 3 抗体固定在溶胶凝 胶修饰的电极上，并与待测溶液中的c 3 h r p 芹i j c 3 竞争反应，从而达剑检测补体c a 的 目的，其浓度范围可达0 0 8 5 6 1 a g m 1 此外，用酶联免疫吸附试验及多功能电流免疫 传感器还先后检测了茶碱、载脂蛋向e 、促卵泡激素与黄体f 卜成激素等人体血清中的 生物活性物质，该类传感器在医学领域罩的应用进_ 步拓宽了道路。 4 3 3 光学免疫传感器 在光学免疫传感器中，光学信号的获得既叮用标记法也可以不用。不需要标记 的光学传感器( 直接光学传感器) 占日日订使用的光学免疫传感器牛相当大一部分，包 括衰减式反射、椭圆率测量法、表面等离了体共振( s p r ) 、光纤波导、干涉仪和光 栅祸合器等。 4 3 4 压电晶体免疫传感器 压电晶体免疫传感器是最常见的一种质量测量式免疫传感器，它的原理是石英 晶片在振荡时有个基础频率，当样品巾的抗原或抗体与包被在晶片一卜的抗体或原结 合时，由于负载的增加，晶片的振荡频率会相应减少，其减少值与吸附上的质量有 相关性。1 9 7 2 年s h o n s 等人首先在石英晶体表面涂覆一层塑料薄膜吸附蚩自质，成功 制备了用于测定牛血清白蛋白抗体的压电晶体免疫传感器，而使压电现象用于免疫 测试的想法成为现实。n g e h n g w a i n b i 等曾将对硫磷( p a r a t h i o n ) 的抗体固定在压电晶 体的两侧用以直接测定气相中的对硫磷，压电晶体的振荡频率变化值f 与对硫磷