（水生生物学专业论文）人工养殖菲牛蛭（poecilobdella+manillensis+lesson1842）菌性疾病的研究.pdf

人工养殖菲牛蛭( p o e c i l o b d e l l am a n i l l e n s i sl e s s o n ，1 8 4 2 ) 细 菌性疾病的研究 专业：水生生物学 硕士生：李浩华 指导教师：吕军仪 摘要 本文对菲牛蛭( p o e c i l o b d e l l am a n i l l e n s i s ) 在工厂化养殖条件下发生疾病的 病原菌的形态、生理生化特性、对多种药物的敏感性、防治方法以及病蛭组织 的显微病理变化进行了研究。 从患病的菲牛蛭腐烂处深层肌肉分离病原菌，得到6 株优势菌，编号为 0 6 0 1 、0 6 0 2 、0 6 0 3 、0 6 0 4 、0 6 0 5 、0 6 0 6 。通过对以上六株菌的菌落和菌体形态 观察、初步生理生化特征分析，菌株0 6 0 1 、0 6 0 3 、0 6 0 5 的形态特征一致，菌 株0 6 0 2 、0 6 0 4 、0 6 0 6 的形态特征一致，取菌株0 6 0 1 、0 6 0 2 作为实验用菌。经 人工感染试验，0 6 0 1 号菌液浓度为1 0 8 c f u m l 、1 0 7 c f u m l 、1 0 6 c f u m l 、 1 0 5 c n i m l 时的肌注感染死亡率分别为1 0 0 、1 0 0 、6 0 、3 0 * , 6 。0 6 0 2 号菌 液浓度为1 0 8 c f u m l 、1 0 7 c f u m l 、1 0 6 c f u m l 、1 0 5 c f u m l 时的肌注感染死亡 率分别为1 0 0 、8 0 、5 0 、3 0 。再次感染分离得到2 株菌，编号为0 6 0 7 和0 6 0 8 ，肌注感染感染发病率均为1 0 0 0 , 6 。且初次感染与再次感染菲牛蛭发病 症状与自然发病症状基本一致。这两株菌的理化特性指标与自然发病的水蛭中 分离到的菌株0 6 0 1 、0 6 0 2 一致。因此确定0 6 0 1 、0 6 0 2 号菌株为致病菌。通过 对菌株的菌落和菌体形态观察、生理生化特征以及1 6 s r r n a 基因序列分析，结 果表明0 6 0 1 号细菌为嗜水气单胞菌( a e r o m o n a sh y d r o p h i l a ) ，0 6 0 2 号细菌为 奇异变形杆菌( p r o t u e sm i r a b i l i s ) 。该病可由这两种菌单独或共同引发。 药物敏感和治疗试验表明，两株病原菌均对氨曲南、新霉素、环丙沙星等 药敏感。甩板蓝根和三黄药浴治疗效果较好，治愈率可达8 0 0 0 左右。 组织病理观察表明，患部皮肤表皮角质层溃烂、脱落；肌肉发生溃疡、腐 烂，肌纤维断裂、溶解、坏死；唾液腺排列混乱，部分出现断裂，表明这两种 病原菌均具有较强的毒力。 关键词：菲牛蛭，奇异变形杆菌，嗜水气单胞菌，1 6 s r r n a ，组织学 s t u d i e so nt h eb a c t e r i a ld i s e a s eo fl e e c h ( p o e c i l o b d e l l a m a n i l l e n s i sl e s s o n ，1 8 4 2 ) m a j o r ：h y d r o b i o l o g y n a l n e ：l ih a o h u a s u p e r v i s o r ：p r o l vj u n y i a b s t r a c t t i l i st h e s i sd e s c r i b e dt h em o r p h o l o g i c a l p h y s i o l o g i c a la n db i o c h e m i c a l c h a r a c t e r i s t i c sa n ds e n s i t i v i t yt od r u g so f p a t h o g e n i cb a c t e r i ao f t h ed i s e a s ei nl e e c k s i xs t r a i n sn a m e d0 6 0 1 ，0 6 0 2 ，0 6 0 3 ，0 6 0 4 ，0 6 0 5a n d0 6 0 6w e r ei s o l a t e df r o mt h e r o t t e nm u s c l eo f t h ei l ll e e e h s a c c o r d i n gt ot h ea n a l y z i n gr e s u l t st ot h e s es i xs t r a i n s i nm o r p h o l o g i c a l 仃a i t s ，p h y s l o l o g k a la n db i o c h e m i c a lr e a c t i o n s ，0 6 0 1 ，0 6 0 3 ，0 6 0 5 s t r a i n sw e r ec o n f i r m e dt h es a m eb a c t e r i u ma n d0 6 0 2 ，0 6 0 4 ，0 6 0 6s t r a i n sw e r et h e o t h e rb a c t e r i u m e x p e r i m e n t so fa r t i f i c i a li n f e c t i o nt e s t sh a db e e nd o n ea n dt h e r e s u l t ss h o w e dt h a t0 6 0 1 0 6 0 2s t r a i n sc o u l dc a u s ed i s e a s ea n dd e a t hf o rl e e c h t h e r e f o r e , 0 6 0 1 ，0 6 0 2s t r a i n sw e r ep r o v e dt ob ep a t h o g e n i cb a c t e r i a b a s e do l lt h e m o r p h o l o g i c a lt r a i t s , p h y s i o l o g i c a la n db i o c h e m i c a l r e a c t i o n sa n dm o l e c u l a r i d e n t i f i c a t i o n ( 16 s r r n a ) ，0 6 0 1s t a i nw a si d e n t i f i e dt ob ea e r o m o n a sh y d r o p h i l a , a n d0 6 0 2s t r a i nw a sp r o t u e sm i r a b i l i s b o t ho f t h e0 6 0 1a n d0 6 0 2s t r a i n sh a db e e n d e m o n s t r a t e dt dh ea b l et oi n d u c et h ed i s e a s e so f l e e c hi nt i f f se x p e r i m e n t t h r o u g hs e n s i t i v i t yt e s t i n gt od r u g s , t h ep a t h o g e n sw e r es e n s i t i v et on e o m y c i n , c m o f l o x a c i na n da z t r e o n a r 也t h r o u g hs e n s i t i v i t yt r e a t i n ge x p e r i m e n t ，t h er a d i x i s a t i d i sa n dt h em i x t u r eo f r a d i xe tr h i z o m ar h e hr h i z o m ac o p t i d i sa n dp h e l l o d e n d r o n a n a r e n s ew e r et h em o s te f f e c t i v e l ya g e n c i e s i ng e n e r a l , t h es u r v i v a lr a t eo f t h e i l tl e e c hw 鹤a p p r o x i m a t e l y8 0 i nt h ee x p e r i m e n t h i s t o p a t h o l o g i c a ls t u d yw a sa l s or u ni nt h ee x p e r i m e n t ，t h er e s u l ts h o w e dt h a t i i l t h a tt h eh i s t o l o g i c a lc h a n g e so c c u r r e di m i l l l yi nt h et i s s u e so fs k i n , m u s c l ea n d s a l i v a r yg l a n d a tt h es a n l et i m e ，s o m et i s s u e sa n do r g a n sh a db e e nb r o k e no f fi nt h e d e a dl e e c h , w h i c hi n d i c a t e dt h a tt h i sk i n do f p a t h o g e n sh a dah i g hv i r u l e n c e k qw o r d s ：l e e c h , p r o t u e sm i r a b i i i s ，a e r o m o n a sh y d r o p h i l a ，1 6 s r r n a , h i s t o l o g i c a l 中山大学硕士学位论文 1 1 水蛭分类、分布 第l 章前言 水蛭，俗称蚂蟥，是具有多种医用功能的重要药源动物，是中国传统的名贵 中药材多数生长于沼泽、湖泊或水田等淡水环境中，陆地和海洋中也生活有少 数种类。属环节动物门、蛭纲、真蛭亚纲，分为2 目( 吻蛭目、无吻蛭目) 1 0 科，约3 0 0 多个亚种( 杨童，1 9 9 6 ) ，我国分布有6 2 种( 宋大祥，1 9 7 8 ) 。最新 的分类系统将其与寡毛类( o l i g o e h a e t a ) 作为两个纲划归环节动物门( a n n e l i d a ) 的有环带亚门( c l i t e l l a t a ) 。它们都具有环带，又都是雌雄同体的动物，并通过 分泌容纳有受精卵的卵茧繁殖后代，胚胎发生也都相同，都缺少外骨骼和功能性 的叶足。 药用水蛭为医蛭形亚目医蛭科和黄蛭科动物，主要是欧洲医蛭( h i r u d o m e d i c i n a l i s ) ，宽体金线蛭( w h i t m a n i ap i g r a ) ，日本医蛭( h i r u d on i p p o n i a ) ，尖细 金线蛭( w h i t m a n i aa c r a n u l a t a ) 和菲牛蛭( p o e c i l o b d e l l am a n i l l e n s i s ) 等。中国 药典( 2 0 0 5 版) 收载的药用水蛭有宽体金线蛭、日本医蛭和尖细金线蛭。 宽体金线蛭在我国分布广泛，吉林、辽宁、河北、内蒙古、宁夏、甘肃、陕 西、山西、山东、江苏、安徽、浙江、江西、湖北、贵州均有发现；国外仅见于 日本。日本医蛭在我国分布很广，国外在日本、俄罗斯的远东地区及蒙古均有发 现。尖细金线蛭广泛分布于我国南方，国外仅见于日本。菲牛蛭主要分布于我国 华南地区，国外主要分布于菲律宾、印度尼西亚、印度、孟加拉国、斯里兰卡、 缅甸、泰国、越南等东南亚低于海拔5 0 0 米的广大地区。 1 2 水蛭的药用价值 水蛭是世界公认的一种名贵中药材，对治疗心血管、脑血栓、心绞痛等有较 好的疗效。目前，主要的入药方式有干燥全体，活体或其唾液腺提取物。水蛭属 较强的活血化瘀药物，始载于神农本草经，历代本草均有记述。据神农本 草经记载：“水蛭味咸平，主逐恶血，月闭，破血瘕集聚，无子，利水道。” 人工养殖菲牛蛭( p o e c i l o b d e l l am a n i l l e n s i sl e s s o n ，1 8 4 2 ) 细菌性疾病的研究 有些国家很早就利用水蛭的吸血习性对病人进行“放血治疗”，到1 8 世纪末， 该法极为风行，尤其在欧洲大陆达到顶点，今天这种疗法在整形外科，特别是断 肢再植的显微外科中仍在应用。 水蛭是活血化瘀中药，体内有水蛭素和蛋白质等活性成分。关于水蛭药用活 性物质研究由来已久，特别是随着现代生命科学技术的飞跃发展，水蛭的医用价 值不断被开发和拓展。不同种水蛭分离出的活性成分是不同的，大致可分为两大 类：一类是直接作用于凝血系统的成分，包括凝血酶抑制剂，以及其它抑制血液 凝固的物质，如水蛭素( h i d u d 啪、菲牛蛭素( b u f r u d i n ) 、森林山蛭素( h a e m a d i n ) 等；第二类是其它蛋白酶抑制剂及其它活性成分，如溶纤素( h e m e n t e r i n ) 、待 可森( d e c o r s i n ) 等( 李艳玲等，2 0 0 4 ) 。随着研究的不断深入，相继发现了在凝 血机制不同环节起抑制作用的多种物质，如：凝血酶抑制剂一水蛭素变异体家族： 凝血因子x a 抑制剂- - a n t i s t a s i n 、g h i l a n t e n ；凝血因子x i i i a 抑制剂- - t r i d i g e n ( s e a l ee ta 1 ，1 9 9 7 ；f i n n e ye ta 1 。1 9 9 7 ) ：血小板糖蛋白拮抗齐l j - - d e c o r s i n 、o r n a t i n ； 胶原诱导血小板聚集抑制剂一c a l m ( h a r s f a l v ie ta 1 ，1 9 9 5 ) 、l a p p ( l e e c h a n t i p l a t e l e tp r o t e i n ) ( c o n n l l ye ta l ，1 9 9 2 ) 以及能够降解血栓( 富含血小板) 的蛋 白- - h e m e n t i n 等。 水蛭发挥药效作用的成分不局限于抗凝血物质，微量元素及氨基酸也有协同 作用。对蚂蝗研究表明钙、镁两种人体必需的宏量元素含量均在1 0 0 0 p p m 以上， 痕量元素中铁、锌含量较丰富，c u 和m o 含量次之，而c o 、m n 、c r 未检出。 毒性痕量元素a s 和h g 含量很低，p b 含量略高。水解氨基酸分析：水蛭中含1 7 种氨基酸，其中有7 种人体必需的氨基酸。氨基酸总量约占水蛭的4 9 以上，而 人体必需氨基酸占氨基酸总量的3 9 0 , 5 以上。对比吸血类水蛭与非吸血类水蛭两类 在氨基酸的种类及含量上未见明显差别。微量元素的含量，尤其是活性较强的元 素s e 、n i 、c o 、c r 等，吸血的日本医蛭有明显的优势，这些优势同抗凝血作用 关系密切。 在国际医学领域，水蛭的医用价值引起了广泛重视，许多国家的药物学家纷 纷利用水蛭开发各种药物，取得了良好的效果。 2 中山大学硕士学位论文 1 2 1 抗凝、抗血栓作用 药理研究表明，水蛭素是目前提出世界公认的最强的凝血酶特效抑制剂，有 较强的抗凝血作用，它与凝血酶结合后形成一种非共价复合物。抑制凝血酶上凝 血因子i 的结合位点，使凝血因子i 不能和凝血酶结合。水蛭素与凝血酶的亲和 力极强，在很低的浓度下就能中和凝血酶。试验证明1 雌水蛭素可以中和5 9 9 凝 血酶，相当于摩尔数比为l ：1 ( 邵永强等，2 0 0 4 ) 。水蛭素不仅能阻止纤维蛋白原 凝固，也能阻止凝血酶催化的进一步的血瘀反应。如凝血因子v 、的活化 及凝血酶诱导的血小板反应等均能被水蛭素抑制，且随着水蛭素浓度的增加，血 凝过程会被推迟或完全阻止。水蛭素对由凝血酶诱导的其它细胞的非凝血现象也 有作用。近代研究表明，水蛭素可抑制凝血酶诱导的成纤维细胞的增殖和凝血酶 对内皮细胞的刺激，也可抑制凝血酶同血小板的结合及血小板受凝血酶刺激的释 放，并可使两者解离。 诱导血管内血栓形成虽有多种因素，但凝血酶诱发的血液凝固是血栓形成的 主要触发机理。由于水蛭素能有效地抑制游离的和凝血块上的凝酶，可防止各类 血栓的形成及延伸( 李天全，1 9 9 8 ) 。应用水蛭素治疗血栓有许多优点，第一、 水蛭素抑制专一性强，用量小，几乎没有毒副反应；第二、与肝素等抗凝剂不同， 水蛭素发挥作用不依赖于体内的抗凝血酶m ，这样，对因遗传或后天原因缺乏抗 凝血酶i 的病人同样有效；第三、水蛭素在体内半衰期短，有利于控制药物在血 浆中的浓度；第四、水蛭素分子量小，不会引起任何免疫学方面的效应。可以断 言，水蛭素在防治血栓和心脑血管疾病方面是一种更为特异更为有希望的药物。 1 2 2 降血脂作用 水蛭可抑制高胆固醇膳食家兔血脂的上升，延缓高血脂症与内皮损伤共同导 致的动脉粥样硬化斑块的形成减轻粥样斑块引起的动脉炎管腔狭窄( 王朋等， 1 9 9 6 ) 。水蛭也可降低实验性高脂血症小白鼠的血清胆固醇含量，且与安妥明作 用相近( 秦百宣等，1 9 9 4 ) 。水蛭水提液、醇提液、水煎醇沉液对正常大鼠的全 血粘度、i c 聚集指数、还原比粘度有明显降低作用。水煎醇沉液对血瘀模型 犬的r b c 压积、全血及血浆粘度有明显降低作用( 谢艳华，1 9 9 7 ) 。因此说明 3 人工养殖菲牛蛭( p o e c i l o b d e l l am a n i l l e m i sl e s s o n 1 8 4 2 ) 细菌性疚病的研究 水蛭具有良好的降血脂作用。 1 2 3 抗炎、抗肿瘤作用 大量研究表明，水蛭对急慢性炎症有一定的抗炎作用( 宋玉鹏，1 9 9 6 ) ，对 炎症的早期及后期病理改变均有抑制作用( 谢艳华，1 9 9 7 ) 。水蛭对慢性肾炎 c i c 有明显的清除作用( 王曙东等，1 9 9 3 ) 。 在肿瘤治疗中，水蛭可通过诱导肿瘤细胞凋亡，提高细胞免疫功能，抑制肿 瘤的生长( 刘京生等，2 0 0 1 ；任青华等，2 0 0 5 ) ，阳健认为其药理机制为水蛭 有抗高凝作用。有利于抗癌药理活性物质( 如锰、镁、锌等元素) 及免疫活性细 胞侵入癌组织而杀伤癌细胞。水蛭素还能能防止肿瘤细胞的转移，如纤维肉瘤、 骨肉瘤、血管肉瘤、黑素瘤、淋巴瘤和白血病细胞等，水蛭素配合化疗和放疗， 可促进肿瘤中的血流而增强抗肿瘤的疗效。 1 2 4 对心、脑血管系统的作用 水蛭可分泌一种组织胺样物质，使毛细血管扩张，缓解小动脉痉挛，减少血 液黏着力，水蛭素对心肌凝血又有抑制和治疗作用，以防止心脏病事件的发生( 刘 晓颖，1 9 9 8 ) 。 水蛭素可增加脑动脉血流量，促进血肿吸收，缓解颅内高压，改善局部血液 循环，保护脑组织免遭破坏，有利于神经功能恢复( 尹宝光，1 9 8 6 ) 。使用水蛭 素治疗脑出血，可明显降低脑水含量，提示凝血酶作为一种神经毒性介质，参与 了细胞毒性脑水肿的形成过程，水蛭素作为凝血酶的特异性抑制剂拮抗了其与毒 性受体的结合，避免了神经细胞进一步损伤，对减轻脑水肿，促进神经细胞功能 恢复起到非常重要的作用( 娄季宇等，2 0 0 4 ) 。 1 2 5 抗增殖、抗早孕作用 水蛭素对凝血酶诱导的其他细胞非凝血现象也有作用，能够抑制凝血酶诱导 的成纤维细胞的增殖和凝血酶对内皮细胞的刺激，抑制血小板的解离和释放等。 能明显抑制凝血酶诱导的血管平滑肌细胞( v s m c ) 增殖，而且较肝素作用强， 4 中山大学硕士学位论文 持续时间长( 王敏，2 0 0 3 ) 。对早期细胞外基质主要成分层粘连蛋白和型胶原 均有抑制作用( 郑燕林等，2 0 0 0 ) 。水蛭能拮抗主动脉内膜e t - m r n a 在皮细 胞( e c ) 、平滑肌细胞( s m c ) 的过表达作用，保护e c ，并抑制s m c 的增殖( 刘晓 颖，1 9 9 8 ) 。 水蛭具有一定的杀胚及刺激子宫收缩的作用，但不同给药途径对早期妊娠作 用不同。水蛭对蜕膜瘤亦有抑制作用，此作用又能被外源性孕酮所对抗，则可防 止早产( 杨仓良，1 9 9 5 ) 。杨健等对水蛭中抗早孕有效成分的研究，分离得到的 单体成分( 1 1 ) 具有较强的抗早孕作用，而且其安全范围较大、治疗指数较高，是 一种理想的抗早孕药物( 杨健等，2 0 0 2 ) 。 1 2 6 其他 水蛭为破血逐瘀药，中医临床广泛应用，在治疗多种因瘀血所致的疾病中疗 效确切，适应症涉及心脑血管、肝肾和血液病变、男科妇科疑难症、外伤疼痛及 呼吸、神经系统和癌症。水蛭除单味药治疗一些疾病外，常以群药出现在各种复 方制剂中，溶栓胶囊是治疗脑血栓的新药，具有较强的溶栓作用，也具有抑制血 小板聚集、抗凝血、改善脑血流量、改善缺氧状态等作用。另外，蛭芪口服液治 疗气虚血瘀型中风( 王曙东等，1 9 9 3 ) ，维脑康片治疗缺血性中风( 邵俭等，1 9 9 8 ) 都取得了良好的疗效，其中水蛭作为主药发挥了重要作用。近年来，水蛭制剂在 单纯西药难以控制或治愈的疾病中有了许多尝试。采用活血化瘀通下的水蛭大黄 合剂与小剂量抗精神病治疗精神分裂症，结果可减少西药用量及副作用，改善精 神分裂血瘀证之症状( 吕文海等，1 9 9 4 ) 。水蛭土元粉联用硝苯吡啶治疗高血压 并右室肥厚( 武继彪等，1 9 9 4 ) ，黄芪水蛭地龙配伍治疗慢性肾炎( 冯玲玲等， 1 9 9 7 ) 也都有新的突破。活血降粘片中由于加入水蛭提高了活血降粘的效果( 冯 玲玲等，1 9 9 6 ) ，消症复肝丸中如去水蛭则消退腹水之功近乎消失，肝脾的软化 回缩也受影响。水蛭在治疗瘀黄中亦为特效药物，其它虫类活血药似力薄而效逊 ( 周文献等，1 9 9 6 ) 。最近，有人发现水蛭具有活血通淋排石的作用，且疗效颇 佳，可用于泌尿系结石、前列腺增生伴炎症的淋症( 朱运斋，1 9 9 6 ) 。另外，水 蛭在五官科的应用也日趋广泛。水蛭药膜治疗复发性口疮可非常显著地缩短复发 性口疮的痊愈时阃。用活的水蛭浸泡于蜂蜜，用其液体滴鼻治疗痿缩性鼻炎、鼻 5 人工养殖菲牛蛭( p o e c i l o b d e l l am a n i l l e n m sl e s s o n ，1 8 4 2 ) 细菌性疾病的研究 咽癌疗效甚佳( 魏爱英，1 9 9 6 ) 。水蛭注射液对急性脑梗死有较好的治疗作用， 治疗前后与对照组比较，血液流变学、全血粘度高切值、全血粘度低切值、血清 超氧化物歧化酶( s o d ) 均有显著性差异( 王景恒等，1 9 9 6 ) 。水蛭在骨伤科中的 应用也日益广泛，如水蛭的复方用于疤痕挛缩、微血管术后危象、筋膜间区综合 症、陈旧性骨折、髌骨软骨炎等，疗效显著( 苏江等，1 9 9 5 ) 。水蛭应用纵有千 家百论，但终究以破血逐瘀通络为纲。对不同系统、病位瘀血症的异病同治形成 了水蛭广泛应用的基础。随着瘀症的进一步研究，水蛭的药用价值会不断提高。 1 3 国内外研究现状 目前，国内关于水蛭的研究，明显滞后其他国家。主要集中在系统分类，区 系分布调查和中药炮制制剂方面。国外对于水蛭的研究较多集中在水蛭的医用价 值、药用价值以及分子系统学研究等领域，而关于水蛭养殖生态学的报道都比较 零散。 k e e g a n ( 1 9 6 8 ) 对东南亚的菲牛蛭生活习惯进行观察。在毒理和药理生态作用 的研究表明水蛭受水体中化学药物等影响较大，另外该物种经常由于水体中的有 机化合物而引起病变( p e t r a u s k i e n e ，2 0 0 3 ) 。水蛭的应急反应( 又叫综合作用) 和免疫机理实验( e w a l d ，1 9 9 5 ) 表明在有强污染物和有机沉积物大量存在的养 殖条件下，水蛭都“逃逸性拮抗”现象，并且水蛭的体形由于刺激而发生变形( 主 要表现为肌肉的收缩和吸盘变异等) ，同时也会削弱水蛭的摄食量( l a p k i n a e ta 1 。 1 9 8 7 ；p e t r a u s k i e n e ，2 0 0 1 ) 。当然值得一提的是，所有的这些病变都是可以恢复 的。同时，还有实验表明在致死剂量的铜、汞、铝、苯酚、去垢剂以及聚乙烯等 一些常见的化学药物的作用下，水蛭会在1 5 分钟之内同样出现运动剧烈而逃离 的现象( l a p k i n a e ta 1 。1 9 8 7 ：f l e r o va n d l a p k i n a ，1 9 7 6 ) 。 有关蛭类生长发育生殖的研究，m a n n 对e r p o b d e l l ao c t o c u l a t a ( l ) ，e r p o b d e l l a r e s t a c e a ( s a v ) 的生活史进行研究；s a w y e r 等对h a e m e n t e r i ag h i l i a n i i 的生长、生 殖进行研究；k e e g a n 对东南亚的菲牛蛭一些生活习性进行研究。m o o r e 对印度 牛蛭分类、分布和习性进行研究。国内谭恩光等研究吸血山蛭( h a e m a d i p s ah a i n a n ) 的生态分布、生长、摄食和生殖。曾报道在实验室条件下，广东菲牛蛭( h i r u d i n a r i a m a n i l l e n s i s ) 的生长和生殖，及广东菲牛蛭菲牛蛭生活水体的化学环境。一般来说， 6 中山大学硕士学位论文 在野生条件下从受精卵到“抱卵”阶段大约需要一局时圊；而幼虫孵化后，会仍 旧在亲本水蛭的呵护下持续长达三周( g o v e d i c ha n dd a v i e s 。1 9 9 8 ) ，在这段时 间里亲本水蛭会提供给幼体生存所必须的时候和保护( d - a v i se t8 1 。1 9 9 7 ；d e e g u i l e o re ta 1 ，1 9 9 4 ) 。但是关于受精卵排除体外但仍未孵化的这段时间里，水 蛭是怎样对受精卵进行营养补给，以及象这样的无脊椎动物到底产卵的速率如何 仍然需要进一步的研究( m o c ka n dp a r k e r , 1 9 9 7 ) 。 我国人工繁养殖的药源水蛭有四大品种：适于南方养殖的品种有宽体金线蛭 ( w h i t m a n i a p i g r aw h i t m a n ) 和亚洲水牛蛭( h i r u d i n a r i am a n i l l e n s i s ) 又称菲牛蛭；适 于北方养殖的品种有尖细金线蛭和日本医蛭。国外，吸血水蛭种类有：欧洲医用 水蛭( h i r u d om e d i c i n a l i s ) 、印度森林山蛭( h a e m a d i p s as y l v e s t r i s ) 、亚洲水牛蛭 ( h i r u d i n a r i am a n i l l e n s i s 、墨西哥水蛭( h a e m e n t e r i ao f f i c i n a l i s ) 、亚马孙巨型水蛭 ( h a e m e n t e r i a 劝i l i a n i 0 、北美水蛭( m a c r o b d e l l ad e c o r a ) 和乌龟水蛭( p l a c o b d e l l a o r n a t a ) 等。 有关蛭类田间饲养主要是非吸血的金线蛭，如宽体金线蛭。从1 9 9 5 年开始 进行人工饲养水蛭并获得成功，其中，江苏太湖水蛭养殖繁育场从1 9 9 5 年开始 对水蛭进行人工养殖，于1 9 9 8 年人工养殖成功。虽然目前发展规模还不大，但 效益十分可观，每亩纯利均在2 万元以上，是目前养鱼效益的7 1 0 倍。虽然水 蛭适应性强，耐饥能力强，有极强抗病能力，但对水质和环境有严格要求。在大 田养殖环境条件下，还存在着水蛭的孵化率及幼体成活率都不高的问题，因此难 于形成大批量的生产规模，远远不能满足市场需求。 非吸血蛭类不是像某些报道的那样吃细菌为主，它主要摄食一些无脊椎动 物，例如一些甲壳类、蜗牛以及一些环节动物等，因此在人工养殖水蛭的过程中， 除必须模仿自然条件下水体环境以外，还要重视其摄食习性和节律( p f e i e re ta t ， 2 0 0 4 ) ，甚至是投喂饵料的策略都要重视( k u t s e h e r a ，2 0 0 3 ) 。 随着研究的深入，人们把注意力转f 研究以哺乳动物为主要吸血对象的东南 亚的菲牛蛭，菲牛蛭是一种尚未被中国药典收载的医蛭科牛蛭属吸血类水蛭，广 泛分布于我国海南、广东、广西、福建及台湾等地。 国外k e e g a n ( 1 9 6 8 ) 对东南亚的菲牛蛭生活习惯进行观察，1 9 9 2 年s t e i n e r 首次从菲牛蛭( h i r u d i n a r i a m a n i l l e n s i s ) 提取2 种水蛭素，测定原始结构和功能， 7 人工养殖菲牛蛭( p o e c i l o b d e l l a m a n i l l e n m $ l e s s o n ，1 8 4 2 ) 细菌性疾病的研究 表明有抗凝活性。1 9 9 3 年s c a c h e r i 从菲牛蛭分离出2 种水蛭素变异体，测定其 氨基酸序列、c d n a 克隆和表达，表达产物有抗凝活性。国内谭恩光等( 2 0 0 2 ) 从广东产的菲牛蛭基因组中p c r 扩增出水蛭素基因，并克隆和测序，表明与马 尼拉的菲牛蛭水蛭素基因h m l 和h m 2 同源性分别为9 0 和8 8 6 ，说明国产菲 牛蛭有抗凝作用，并报道了广东菲牛蛭生活水体的化学环境及其生长和生殖习 性。吴志军等( 2 0 0 6 ) 进行了菲牛蛭成分与急性毒性试验研究，结果表明菲牛蛭 含有较高的氨基酸含量，而重金属和有机氯、有机磷农药残留量则较低，急性毒 性试验l d 5 0 1 0 9 k g ，可考虑作为一种新药用资源而加以研究。黄爱民等( 2 0 0 6 ) 从广西菲牛蛭中分离出两种特异凝血酶抑制剂一菲牛蛭素a ( b u f r u d i n a ，b d a ) 、 菲牛蛭素b ( b u f r u d i n b 。b d b ) ，在体内外均有较强的抗凝活性。方富永等( 2 0 0 7 ) 研究表明菲牛蛭中含有丰富的微量元素和脂肪酸，可作为药品、营养型和保健型 食品开发。另外，菲牛蛭提取物有较强的抗动物血栓形成作用( 黎渊弘，2 0 0 6 ) 。 水蛭养殖是近年来刚刚兴起的特种养殖业，随着养殖规模的不断扩大，水蛭 的疾病也随之增加，而国内对其研究较少，目前l i 螽床上所见到的水蛭疾病均没有 一个准确的命名。国内，磨美兰等( 2 0 0 3 ) 报道从患病的宽体金线蛭体内分离到 大肠杆菌( 占4 6 1 5 ) ，变形杆菌( 占3 0 7 7 ) ，沙门氏菌( 占2 3 0 8 ) ，认为疾病是 由多个病因导致的一种临床综合症。张晓君等( 2 0 0 6 ) 报道了嗜水气单胞菌引起 的宽体金线蛭的疾病。目前关于菲牛蛭养殖病害方面的研究尚未见报道。 1 4 本研究的目的和意义 蚂蟥是一味传统中药。本草纲目对水蛭的药理疗效、使用方法做了较全 面记载。现代药理实验表明水蛭注射液能使肿瘤细胞坏死、消失，对网状内皮细 胞有增强作用。目前，药材市场水蛭货源紧缺，市场价格从1 9 9 0 年1 8 元公斤 左右，到2 0 0 4 年达2 8 0 元，公斤，短短1 4 年它的价格上升了1 5 倍，近年来水蛭 的市场价维持在3 0 0 元公斤左右。水蛭的供求矛盾尖锐，过度的扑捉野生水蛭， 导致水蛭老产区不断消亡，新产区无法形成，预计不远的未来，水蛭的资源将可 能遭受灭顶之灾。因此，进行药用水蛭资源的保护和增殖工作迫在眉睫。 进行药用水蛭人工养殖是解决上述状况的一条有效、快速的途径。药用水蛭 在我国除了捕获野生者外，现已在广东、广西、江苏、山东等省区进行人工养殖 8 中山大学硕士学位论文 并获得了成功。 我国适合养殖的品种有宽体金线蛭、菲牛蛭、尖细金线蛭和日本医蛭。随着 研究的深入，人们把注意力转向研究以哺乳动物为主要吸血对象的菲牛蛭。1 9 9 2 年s t e i n e r 首次从菲牛蛭提取2 种水蛭素，测定原始结构和功能，表明有抗凝活 性。1 9 9 3 年s c a c h c r i 从菲牛蛭分离出2 种水蛭素变异体，测定其氨基酸序列、 c d n a 克隆和表达，表达产物有抗凝活性。国内谭恩光等( 2 0 0 2 ) 从广东产的菲 牛蛭基因组中p c r 扩增出水蛭素基因，并克隆和测序，表明与马尼拉的菲牛蛭 水蛭素基因h m l 和h m 2 同源性分别为9 0 和8 8 6 ，说明国产菲牛蛭有抗凝作 用，并报道了广东菲牛蛭( h i r u d i n a r i am a n i l l e n s i sl e s s o n ) 生活水体的化学环境 及其生长和生殖习性。吴志军等( 2 0 0 6 ) 进行了菲牛蛭成分与急性毒性试验研究， 结果表明菲牛蛭含有较高的氨基酸含量，而重金属和有机氯、有机磷农药残留量 则较低，急性毒性试验l d s o 1 0 9 k g ，可考虑作为一种新药用资源而加以研究。黄 爱民等( 2 0 0 6 ) 从广西菲牛蛭中分离出两种特异凝血酶抑制剂一菲牛蛭素a ( b u f r u d i n 八b d a ) 、菲牛蛭素b ( b u f i u d i nb ，b d b ) ，在体内外均有较强的 抗凝活性。方富永等( 2 0 0 7 ) 研究表明菲牛蛭中含有丰富的微量元素和脂肪酸， 可作为药品、营养型和保健型食品开发。另外，菲牛蛭提取物有较强的抗动物血 栓形成作用( 黎渊弘，2 0 0 6 ) 。 随着菲牛蛭药用价值的开发，人们开始大量养殖菲牛蛭。随着养殖规模、养 殖密度的不断加大，以及缺乏规范的引种检疫及在养殖过程中对传染病的有效控 制，加之水蛭所处的特定水生境更易于病源的播散等，使得某些病原菌广为扩散， 相应感染症时有发生；对水蛭的养殖构成了严重的威胁，给相应养殖带来了较大 的经济损失。显然研究揭示弓 起此类疾病的主要病原菌，建立相应的检验技术， 明确对相应细菌感染的高效防治方法，无疑对提高人工养殖水蛭的经济效益和社 会效益都是至关重要的。目前对我国产的菲牛蛭养殖病害尚未见研究报道。本研 究为规范化人工养殖菲蛭提供基础资料。 9 中山大学硕士学位论文 2 1 材料来源 第2 章材料与方法 病蛭来自广州安圣药源生物开发有限公司，病蛭体重1 5 9 1 8 9 ，人工感染 实验所用的健康菲牛蛭由广州安圣药源生物开发有限公司提供，体重1 5 9 2 0 9 。 2 2 病症的观察 观察病蛭的外观症状，取病灶部位水浸片观察，排除霉菌与寄生虫感染后进 行细菌的分离与培养。 2 3 培养基的制备 分离细菌用淡水营养琼脂培养基( 陈绍铭等，1 9 8 5 ) ，其配方为：蛋白胨 1 0 9 、牛肉膏3 9 、酵母膏2 9 、氯化钠5 9 、琼脂1 8 9 ，水1 0 0 0 m l 。将上述成分溶 于水中，加热，不断搅拌，至溶解完全后用1 0 的h c i 或n a o h 调p h 值至7 o 7 2 。1 2 1 灭菌2 0 分钟，倒成平板或斜面备用。 菌落形态观察用e m b 培养基、血平皿，由广州环凯微生物科技有限公司生 产。 2 4 细菌分离 取症状典型濒死的菲牛蛭3 尾，无菌操作，取病灶处肌肉( 无菌操作甜去表 层后暴露深层肌肉) 剪烂，接种环接种于普通营养琼脂平板上，2 8 恒温培养 2 4 2 8 1 a ，做细菌分离；待分离细菌后，分别挑取形态、色泽一致的优势菌落，在 平板上划线纯化3 次，获得纯培养后，甩1 5 2 0 的甘油保存于8 0 冰箱备甩。 人工养殖菲牛蛭( p o e c i l o b d e l l ar n a n i l l e n s i sl e s s o n ，1 8 4 2 ) 细菌性疾病的研究 2 5 病原菌的鉴定 2 5 1 病原菌的形态观察 分别将病原菌接种于普通营养琼脂平板、e m b 琼脂平板，2 8 。c 恒温培养2 4 2 8 h 后，观察菌落及其形态。 对培养1 4 1 8 h 的幼龄菌进行革兰氏染色。并以大肠杆菌( ) 和枯草杆菌 ( + ) 对照观察其形态特征。 将培养1 8 2 4 h 的菌经2 5 的戊二醛洗脱、固定后，用1 的磷钨酸染色， 在j e m - 1 2 0 0 e x 透射电子显微镜观察菌体形态。 2 5 2 生理生化特性测定 用广州环凯微生物科技有限公司的菌种鉴定管测定主要生理生化特征，严格 按照实验说明及要求进行，并人工补充其他的生理生化实验。 2 5 3 病原菌的分子鉴定 细菌分类是细菌学研究中的一个重要的内容，在细菌被发现以来，微生物学 家就一直试图对这些微小的生物作一个准确的界定，并由此发展出一系列的分类 方法。目前，这些方法主要可分为两类，一为基因型法，另一为表型法。前者包 括d n ag + c 含量的测定、d n a d n a 杂交、r r n a 同源性比较和基于d n a 的 分型技术。后者包括传统的形态和生理生化法、数值分类法、自动鉴定系统、细 胞壁组分分析、细胞脂肪酸分析、全细胞蛋白质分析、多胺的测定等。这些方法 在细菌鉴定中都得到了广泛的应用，但要对多样性如此复杂、数量巨大的细菌作 出准确的鉴定，仅使用其中一种方法而得出的鉴定结果很显然不具说服力。在实 际的细菌鉴定过程中可发现使用不向的鉴定方法得出的结果并不完全一样。 k a t s u y a 报道过一株菌的形态和生理生化特征与肠弧菌非常相似，但与肠弧菌标 准菌株的d n a - d n a 杂交结果显示两者的同源性不超过4 2 ，显然不属于同一 种。因此，有学者认为在对细菌进行分类鉴定时应考虑使用多种方法，并综合考 虑这些方法的出的结果再下结论基于此，为了提高鉴定的可靠性，在疑似病原菌 中山大学硕士学位论文 的鉴定中除使用传统的形态及生理生化鉴定外，还采用了1 6 sr d n a 序劭分析法。 1 6 sr d n a 是信息大分子，被认为是最有用的分子记时计，被广泛地运用于细菌 分类中，主要是因为：一、分布广泛，因此能够包含所有的细菌分类单位；二， 它们源于同一个祖先，具有同源性。 2 5 3 1 细菌d n a 的制各 将细菌接种于普通培养基上，2 8 0 培养过夜。取单一菌落溶于5 0 1 a l 的无菌 去离子水中，于1 0 0 c 下水浴7 1 0 m i n ，1 2 0 0 0 r p m 离心5 m i n ，取上清作为p c r 反应的模板。 2 5 3 21 6 s r r n a 基因的p c r 扩增 1 6 s r r n a 基因的p c r 扩增的两个通用引物分别为2 7 f ( 正向引物) ：5 - a g a g t tt g at c ( c a ) t g gc t ca g - 3 ( 对应于e c o l i l 6 s r r n a 基因的第8 2 7 个碱基位置) 、1 4 9 2 r ( 反向引物) ：5 一g g tt a cc t t g t ta c g a c t t 一3 ( 对应于e c o l i l 6 s r r n a 基因的第1 4 9 2 1 5 1 0 个碱基位置) ( m a r t i n e l a l ， 1 9 9 8 ) 设置5 0 “l 的反应体系，按表2 - 1 顺序加入各成分。p c r 反应条件为9 6 预变性6 m i n ，9 4 变性l m i n ，5 0 。c 复性l m i n ，7 2 c 延伸2 m i n ，3 0 个循环，最 后7 2 c 温育6 m i n 。取5 m 扩增产物于1 的琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果。 表2 - 1p c r 反应体系成分及浓度 t a b 2 1t h ec o m p o n e n t sa n dt h e i rc o n c e n t r a t i o no ft h ep c rs y s t e r m 2 & 3 3p c r 产物的分子克隆 我们对p c r 产物进行分子克隆以得至4 高质量的d n a 序列结果，主要步骤包 人工养殖菲牛蛭( p o e c i l o b d e l l a m a n i l l e n s i sl e s s o n ，1 9 4 2 ) 细菌性疾病的研究 括：p c r 产物纯化一目的d n a 片断的体外连接一转化大肠杆菌一蓝白斑筛选阳 性克隆一菌落p c r 检测阳性克隆。 2 5 3 3 1 目的片断的纯化与回收 纯化的目的是为了除去反应体系中的d n t p 、引物、聚合酶等，得到高纯度 和高浓度的目的片断。 ( 1 ) 灌制1 的普通凝胶，将样品集中加到加样孔，1 2 0 v 电压下电泳约3 0 m i n 。 ( 2 ) 在紫外灯下，用刀片切下含目的片断的凝胶条带，放入1 5 m l 的无菌离心 管中，切取的凝胶块要尽可能小。 ( 3 ) 用上海舜华生物有限公司的少量胶回收试剂盒回收纯化目的片断，操作按 说明书上建议的步骤进行。 2 5 3 3 2 目的片断的体外连接 在d n a 连接酶的作用下，目的片