褐飞虱呼肠孤病毒干扰水稻锯齿叶矮缩病毒的初步研究.doc

褐飞虱呼肠孤病毒干扰水稻锯齿叶矮缩病毒的初步研究 蔡振政，刘小娟，王娟，刘显良，章松柏， （长江大学农学院，湖北荆州；福建农林大学植物病毒研究所，福州） 摘要：褐飞虱（）可携带多种病毒，其中褐飞虱呼肠孤病毒（，）和水稻锯齿叶矮缩病毒（，）均为基因组的呼肠孤病毒。通过接种、小量提取及等方法分析对传播和增殖的影响，初步探讨这两种呼肠孤病毒之间的关系。结果表明，褐飞虱携带比率高低影响褐飞虱接种效率；携带的褐飞虱种群接种后两种病毒的含量差异较大，的含量远远大于的含量，推测褐飞虱体内的某种程度上干扰了的传播和增殖。 关键词：病毒；褐飞虱呼肠孤病毒；水稻锯齿叶矮缩病毒 ：A：0439114（15）051090-04 DOI：10.14088/j.ki.issn0439-8114.xx.05.015 ： 基金项目：长江大学大学生创新创业训练计划项目（）；国家自然科学基金青年基金项目（） 作者简介：蔡振政（），男，广东韶关人，在读本科生，研究方向为植物保护，（电子信箱）；通信作者，章松柏（），男，湖北黄梅人，讲师，博士，主要从事植物病毒监测和分子病毒学的研究，（电话）（电子信箱）。 病毒学研究往往多集中在单一病毒的诸多特性方面，对寄主或介体体内病毒与病毒之间，病毒与其它生物之间的复合感染以及复合感染所引起的生物学现象关注较少，。越来越多的证据显示病毒的复合感染是一种极其普遍的现象。病毒的复合感染可以减轻或加重某种病害的发生，这主要取决于病毒之间的协同或拮抗或竞争等关系，根据这种关系可以解释病害加重或减轻发生的原因，从而采取相应措施控制病害的发生。褐飞虱（）也可以携带多种病毒，其中褐飞虱呼肠孤病毒（，）和水稻锯齿叶矮缩病毒（，）均为基因组的呼肠孤病毒。是斐济病毒属（）成员，可以经卵传播给后代，同时还可以通过水稻传染给不带毒的褐飞虱，但病毒在水稻内不复制；是水稻病毒属（）的成员，由褐飞虱持久性携卵而引发水稻锯齿叶矮缩病，并随着褐飞虱的长距离迁飞而传播扩散，两种病毒之间的关系。与褐飞虱一样，白背飞虱也是南方稻区最重要的稻飞虱之一，危害水稻和传播水稻病毒（南方水稻黑条矮缩病毒，）。但白背飞虱携带和传播的效率极高，这可能是易造成爆发和大面积流行的原因之一；而褐飞虱携带和传播的效率都较低，因此推测可能是水稻锯齿叶矮缩病一直仅限于局部地区流行的原因之一。导致褐飞虱携带和传播效率都较低的原因及与等病毒的关系一直是研究者比较感兴趣的问题。基于此，通过接种、小量提取和等方法，初步研究对传播和增殖的影响，为深入研究这两种病毒间的关系奠定基础。 材料与方法 试验材料 植物材料：水稻锯齿叶矮缩病病株于年采集于福建省龙岩市发病田间，鉴定后隔离种植；接种水稻品种为水稻锯齿叶矮缩病感病品种优航号。 昆虫介体：褐飞虱群体年采集于福建福州市郊区无水稻锯齿叶矮缩病发生的田块，并经过鉴定后于实验室网箱中饲养。 生物学接种 褐飞虱饲毒采用两种饲毒的方法。第一种方法是抓取网箱中饲养的二龄若虫于病株上饲毒，第二种方法是模拟自然条件下，抓取网箱中饲养的雌性褐飞虱成虫在病株上产卵，卵孵化成若虫后直接在病株上饲毒。饲毒后的介体度过循回期（下循回期平均为，）备用。 单管单苗接种选择饲毒后度过循回期的褐飞虱成虫（每种方法头，重复次）进行单虫单管单苗生物学接种，接种水稻苗处于叶心期（下同），传毒，然后将传毒成虫低温保存，接种苗每换一次，接种苗按编号种植于防虫温室内。 快速小量提取 介体昆虫体内的参照食用菌病毒的提取。方法如下：选用褐飞虱头，用液氮研磨成粉末；加入和酚氯仿异戊醇（）抽提处理，离心后取上清液，将上清液配制成含乙醇的溶液；注入含乙醇的溶液平衡过的纤维素（）中，充分混匀，离心后去上清，再用含乙醇的溶液反复洗涤次；最后用不含乙醇的洗脱，洗脱液经过异丙醇沉淀和乙醇漂洗，沉淀即为，干燥后溶于的水中。产物经琼脂糖凝胶电泳，染色后凝胶成像系统观察记录。 法检测褐飞虱介体带毒率 取传毒后低温保存的成虫各头，用法检测褐飞虱携带两种病毒的情况，和两种病毒的作为阳性对照。的检测引物为（： ，：），根据泰国分离物片段（）设计，扩增片段大小为；的检测引物为/（：，：），根据已发表的的序列，扩增片段大小为。单头褐飞虱总采用试剂盒（北京天根）提取，参照说明进行，最后用的无核酸酶灭菌水溶解。反转录按照反转录试剂盒（）说明进行操作。反应体系按照的酶使用说明进行，反应程序为：变性，个循环的扩增（，），最后延伸，产物经琼脂糖凝胶电泳，染色后凝胶成像系统观察记录。 结果与分析 生物学接种结果 两种饲毒方法获得的褐飞虱成虫单管单苗生物学接种结果见表。从表中得出，能够传毒的褐飞虱成虫分别占试验成虫总数的0、.00；生物学接种株水稻分别有株、株发病，发病率为0、。 褐飞虱体内的提取和检测结果 收集接种和未接种的褐飞虱种群，提取并检测褐飞虱种群体内的情况，以协助了解介体体内的带毒情况以及病毒种类。经过反复试验，从褐飞虱体内提取以为宜（头）。图是褐飞虱（头）体内的，从其基因图谱中可清晰地看到褐飞虱体内存在，饲毒后体内的病毒除了外，还有，但两种病毒的含量差别较大，含量远大于。 褐飞虱介体带毒率 由图可知，在方法和方法中，头成虫中携带分别有头和头，带毒率分别为7、，带毒率差异较大；而携带分别为头、头，带毒率分别为、，带毒率差异较小。 小结与讨论 生物学接种试验和褐飞虱带毒率检测结果表明，在方法中，使用二龄若虫饲毒，度过循回期后成虫带毒率为，带毒且能够传毒的成虫为，这些数据与以往报道的数据相符合，；在方法中，模拟自然条件下在病株上产卵、饲毒和度过循回期后，带毒率较高，成虫带毒率约为，带毒且能够传毒的成虫约为，这些数据皆比以往报道的数据高一些，。两种方法不同点之处在于饲毒时褐飞虱携带的差异。可以经卵传播，经卵传播比率为，在方法中，卵孵化成若虫后携带的比率低于，多数介体首先接种的是；而室内饲养的褐飞虱种群带毒率一般都在以上，。在方法中，二龄褐飞虱若虫在饲毒之前多数都携带了。因此，根据生物学接种和褐飞虱带毒率检测结果初步推测能在一定程度上影响褐飞虱生物学接种以及褐飞虱的传毒效率。此外，和都是褐飞虱体内增殖性病毒，但两者同时存在时，的含量远远大于（如图），这也说明可能某种程度上干扰了在体内的增殖。褐飞虱是一种典型的迁飞性害虫，每年春季或夏季由南向北迁移、秋季由北向南回迁，在中国境内分布范围几乎覆盖全境，褐飞虱一旦带毒，则可以将水稻锯齿叶矮缩病毒传进迁入地区，。水稻锯齿叶矮缩病首先发现于菲律宾和印度尼西亚，并于世纪年代末在日本、印度及东南亚一些国家局部地区引起水稻大面积减产；在中国该病自年以来，先后在台湾、福建、广东和江西等省发生流行，对水稻生产造成了一定的影响，。但相对于白背飞虱传播的水稻南方黑条矮缩病毒病等大面积流行病害来说，水稻锯齿叶矮缩病一直仅限于局部地区流行，危害程度远不及水稻南方黑条矮缩病毒病，具体原因鲜见报道。本研究发现可能某种程度上干扰了在褐飞虱体内的增殖以及传播，从病毒与病毒之间的拮抗方面初步分析了的存在可以减轻水稻锯齿叶矮缩病的发生和流行，从某种程度上解释了水稻锯齿叶矮缩病一直仅限于局部地区流行的现象。 参考文献： ，： ？魱，？魣，：，（）： ，-，： pp，： ？魣，？魱？魱，pp，： ，c，： ，： ，？魻，： 张宝琴，张传溪迁飞稻飞虱与病毒入侵第三届全国生物入侵大会论文摘要集全球变化与生物入侵海口： ，： ，：，（）： ，： ，（）：（），. ，： 郑璐平，谢荔岩，连玲丽，等水稻齿叶矮缩病毒的研究进展中国农业科技导报，（）： 巫国瑞，胡萃稻飞虱北京：农业出版社， ，：IRPS：， 翟保平，周国辉，陶小荣，等稻飞虱爆发与水稻病毒病的宏观规律和微观机制应用昆虫学报，（）： ，： ，：M，： ，： 方中达，陆家云，叶钟音.中国农业百科全书植物病理学卷北京：中国农业出版社， 郭灵芳，张长