（药物化学专业论文）微流控芯片分析系统中固相萃取预处理单元构建.pdf

重庆大学硕士学位论文 中文摘要 摘要 由于微全分析系统0 x t a s ) 具备在芯片实验室上实现分析过程集成化、自动化 和缩微化的特点，能够极大地减少试剂的消耗量、缩短分析时间、提高分析检测 效率，因此，在疾病诊断、生化分析、l 隘床检测等领域获得了普遍关注。通过不 同结构和功能芯片的使用，达到分析全过程多种功能的集成，是实现微全分析系 统集成化的有效途径之一。针对复杂生化样品体系，样品预处理是实现整个t t t t a s 分析的前提，目前样品预处理技术正成为t t t a s 向集成化、高效率、连续化发展必 须突破的瓶颈之一。 本论文在综述国内外微流控芯片分析系统分离富集技术的基础上，提出将色 谱领域中的硅胶整体柱作为微流控芯片分析系统中固相萃取介质材料。首先采用 1 g c l 法制备了具有双孔结构的硅胶整体桂，再利用酯型改性技术，获得c 1 8 酯 型改性硅胶整体柱，然后用扫描电镜法、红外光谱法等手段对其形貌结构和特性 进行了表征。结合微流控芯片公析系统的需求和整体柱特点，初步构建了简易的 固相萃取预处理单元，以经过优化的盐酸多巴酚丁胺k m n 0 4 一l 哪i n o l 化学发光 体系测试其吸附效能，得到单位质量的反相硅胶整体柱对盐酸多巴酚丁胺的柱容 量为o 0 1 9 8 t t g m g 1 ，富集倍数可达到9 5 倍；进一步测试了c 1 8 反相硅胶整体柱对 血清中痕量盐酸多巴酚丁胺的富集效率，锝到其平均富集效率为8 5 倍，r s d 为 1 1 7 9 。显然，这种结构单元缺乏适合的测试精度，这是由于血清内大分子组分 易堵塞硅胶整体柱，从而降低了分析结果的重现性。进而考虑在预处理单元中加 装亲和膜，以除去血清内自蛋白等大分子组分的干扰，提高测试的精度。实验以 商品聚酰胺膜为基体，通过表面改性，键合辛巴蓝f 3 g a 使膜对白蛋白组分有选 择性吸附。亲和膜与微流控芯片采用原位式及外接式组合，分别以盐酸多巴酚丁 胺k h m o r - i 姗i n o l 化学发光体系对两者进行测试，进而优化并选取外接式为最 佳缀合方式，设计了硅胶整体牲亲和膜一微芯片预处理单元。用此该预处理单元， 测试出反相硅胶整体柱对血清痕量盐酸多巴酚丁胺的平均富集倍数为8 9 3 6 ，r s d 为4 3 7 ，结果显示出该预处理单元用于血清中痕量药物富集的可行性和有效性。 关键词：微流控芯片分析系统，固相萃取预处理单元，硅胶整体柱，亲和膜 重庆大学硕士学位论文英文摘要 a b s t r a c t d u et om i n i a t u r i z e dt o t a la n a l y t i c a ls y s t e m ( p - t a s ) b ep r o n et or e a l i z ea n a l y s i s p r o c e s si n t e g r a t i o n , a u t o m a t i z a t i o na n dm i c r o m a t i o no ns h i p , t h u si tc a ng r e a t l yr e d u c e r e a g e n tw a s t a g e , s h o r t e na n a l y s i st i m ea n di m p r o v et e s t i n ge f f i c i e n c y , w h i c hm a k ei t p a i du n i v e r s a la t t e n t i o ni nf i e l d so fd i s e a s ed i a g n o s e s ，b i o c h e m i c a la n a l y s i s ，c l i n i ct e s t a n ds oo n o n eo fe f f e c t u a la p p r o a c h e st or e a l i z ei n t e g r a t i o ni su s i n gc h i p sw i t h d i f f e r e n tc o n f i g u r a t i o na n df u n c t i o nt oc o n s t i t u t et h ew h o l ea n a l y s i sp r o c e s s a i ma t c o m p l e xb i o c h e m i c a ls y s t e m ；s a m p l ep r e t r e a t m e n ti sp r e c o n d i t i o nt oa c t u a l i z ei _ l - t a s a n a l y s i s ，p r e s e n t l y , t h ep r c t r e a t m e n tt e c h n o l o g yb e c o m eb o t t l e n e c kt h a tm u s tb eb r o k e n t h r o u g hf o ri n t e g r a t i o n , g r e a te f f i c i e n c ya n dc o n c a t e n a t i o no f d e v e l o p i n g 一t a s b a s eo ns u m m a r i z a t i o ns e p a r a t e n e s se n r i c h m e n tt e c h n o l o 百铭i n t e r n a la n do v e r s e a s i nm i c r o f l u i d i c a n a l y t i c a ls y s t e m - , s i l i c a m o n o l i t h i cc o l u m n e m e r g i n g f r o m c h r o m a t n g r a mr e a l mw a sm a d eu s eo fs o l i d - p h a s ee x t r a c t i o nm e d i u mm a t e r i a li nt t - t a s i no u rr e s e a r c h f i r s t l y , s i l i c am o n o l i t h i cc o l u m nw i t l ld o u b l eh o l ew a sp r e p a r e db y s o l - g e lt e c h n i q u e ，t h e nv i am o d i f i e d 、i t l l e s t e r i f i e dg r o u p ，c 1 8e s t e r i f i e ds i f i c a m o n o l i t h i cc o l u m nw a so b t a i n e d f u r t h e r , i t sf r a m e w o r ka n ds p e c i a l i t yw a sc h a r a c t e r e d b y to m em e t h o d ss u c ha ss c a ne l e c t r o nm i c r o s c o p e ( s e m ) a n di n f r a r e ds p e c t r u m ( 瓜) c o m b i n i n gt h er e q u i r e m e n to fm - t a sa n a l y t i c a ls y s t e ma n dt h ec h a r a c t e r i s t i co fs i l i c a m o n o l i t h i cc o l u m n , s i m p l es o l i d p h a s ee x t r a c t i o np r e t r e a t m e n tu n i tw a ss e tu p ； s u b s e q u e n t l yi t sp r e t r e a t m e n te f f i c i e n c y a l s ow a st e s t e db yo p t i m a ld o b u t a m i n e h y d r o c h l o r i d e - k _ m n 0 4 - l u m i n o lc h e m i l u m i n e s c e n c es y s t e m t h er e s u l t ss h o w e dt h a t c o l m r mc o n t e n to fc 1 8e s t e r i f i e ds i l i c am o n o l i t h i cc o l u m nt od o b u t a m i n e h y d r o c h l o r i d ew a s0 0 1 9 8 1 1 9 m g 1 a n de n r i c h m e n tm u l t i p l ec a nr e a c h9 5 f u r t h e rm o r e , t r a c ed o b u t a m i n eh y d r o c h l o r i d ei ns e r u mw a se n r i c h m e n tb yc 1 8e s t e d f i e ds i l i c a m o n o l i t h i cc o l u n m , f r o mt h et e s t i n g , a v e r a g ee n r i c h m e n tm u l t i p l ew a sg e t8 5 ，r s dg e t 1 1 7 9 a p p a r e n t l y , t h ek i n do f p r e t r e a t r n e n tu n i tw a ss h o r to f c o n f o r m a b l ep r e c i s i o n ， w h i c ha s c r i b i n gt ol a r g em o l e c u l es t o pu pc 1 8e s t e r i f i e ds i l i c am o n o l i t h i cc o l u m nt o d e c r e a s er e c u r r e n c e t h e r e f o r e , a f f i n i t ym e m b r a n ew a si n t r o d u c e di n t op r e t r e a t m e n t u n i tt og e tr i do fi n t e r f e r e rf r o ml a r g em o l e c u l es u c ha sa l b u m i ni ns e r u ma n dt o i m p r o v er e c u r r e n c e p o l y a m i d em e m b r a n ew a ss e l e c t e da sb a s i cm a t e r i a lt of u r t h e r m o d i f yb yc i b a c r o nb l u ef 3 g ai no r d e rt oa d s o r ba l b u m i ns e l e c t i v i t y a f f m i t y m e m b r a n ec o m b i n e dw i t l lm i c r o - f l u i d i cc h i pb yi n b u i l ta n de x t e r n a lm e t h o d s a n d 重庆大学硕士学位论文 英文摘要 e x t e r n a l c o m b i n a t i o nw a sc h o o s e df i n a l l yf r o mt h er e s u l to fo p t i m a ld o b u t a m i n e h y d r o c h l o r i d e - k m n 0 4 一l u m i n o lc h e m i l u m i n e s c e n c es y s t e m t h e nc 1 8e s t e r i f i e ds i l i c a m o n o l i t h i cc o l u m n - a f f i n i t ym e m b r a n e - m i c r o c h i pp r e t r e a t m e n tu n i tw a ss e tu p u s i n g t h i sp r e t r e a i m e n tu n i t , t r a c ed o b u t a m i n eh y d r o c h l o r i d ei ns e r u mw a se n r i c h m e n tb y c 1 8e s t e r i f i e x ls i l i c am o n o l i t h i cc o l u m n , a n da v e r a g ee n r i c h m e n tm u l t i p l ew a sg e t8 9 3 6 ， r s dg e t4 3 7 t h er e s u l ti n d i c a t e dt h a tf e a s i b i l i t ya n dv a l i d i t yo f t h ep r e t r e a t m e n tu n i t f o re n r i c h m e n tt r a c em e d i c a m e n ti ns e y u m k e yw o r d s ：m i c r o - f l u i d i ca n a l y t i c a ls y s t e m ，s o l i d p h a s ee x t r a c t i o np r e t r e a t m e n tu n i t , s i l i c am o n o l i t h i cc o l u m n ，a f f i n i t ym e m b r a n e i i i 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取 得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文 中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得重废太堂 或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本 研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名： 张肋1 签字日期： 2 7 年争月，口e l 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解重废太堂有关保留、使用学位论文的 规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许 论文被查阅和借阅。本人授权重庆太堂可以将学位论文的全部或部 分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段 保存、汇编学位论文。 保密() ，在年解密后适用本授权书。 本学位论文属于 不保密( ) 。 ( 请只在上述一个括号内打“”) 学位论文作者签名：璩励l导师签名： 泪。多 签字日期：川年年月，口日 签字日期：舛争月，1 3 重庆大学硕士学位论文1 绪论 1 绪论 1 1 微流控芯片分析系统中分离富集技术 i | ；土_ 微机电加工技术( m e m s ) 为基础的微全分析系统( p t a s ，又称芯片实验室， l a b o n - a - c h i p l ，由于具备可实现自动化、连续化和缩微化分析的特点，从而能够极 大地减少试剂的消耗量、缩短分析时间、提高分析检测效率。经过十几年的发展， t t a s 在疾病诊断、生化分析、临床检测等领域获得了广泛的应用。目前k t t a s 的 主要应用对象是生命体系，其基底和成分复杂，基体效应与各种干扰组分共存， 以致在微流控芯片系统的实际应用中，生化样品的分离富集预处理较为困难。目 前大部分预处理过程都是在微芯片外实现的，这必然会造成样品的损失与污染， 同时不利于p t t a s 的集成化。由于样品预处理的优劣程度是最终能否实现有效分析 的关键，而微流控芯片上的样品预处理过程制约着整个p , t a s 集成化的发展，因此， 发展微流控芯片系统中的分离富集技术，是微系统发展必须突破的瓶颈之一。 国内外针对微流控芯片分析系统中的样品预处理方法和技术的研究正方兴未 艾，目前已提出了多种相关的方法和技术【1 棚，基于电驱动的场放大堆积、等速电 泳、等电聚焦；基于磁场、声场作用的场效应分离、超声波分离；基于液液双相 相互作用的多相层流、液液萃取；以及基予固液双相相互作用的过滤、膜分离、 固相萃取等，这些方法各有特色和优势。其中，固液双相分离富集是一种既可实 现待测物的浓缩富集又能够去除杂质组分干扰的样品预处理技术，而且它比较容 易与微流控芯片系统结合实现片上操作。与微流控芯片系统中的其它样品预处理 方法相比，微流控芯片系统中固液双相分离富集技术具有很多优势，如：操作过 程简单易于在微芯片上实现集成与控制；通过选择合适的固相载体可以提高对目 标分析物的选择性等。因此，在前期对t t t a s 中微分离技术已有的实验和研究基础 之上m ，本章重点针对微流控芯片分析系统中的固液双楣分离富集方法和技术， 根据操作模式的不同，分别介绍徼流控芯片分析系统中过滤式、膜分离式和固相 萃取式分离富集的特点及其应用，尤其对固相萃取分离富集进行较为详细的探讨。 1 2 微流控芯片分析系统中固液双楣分离富集方法和技术 1 2 1 过滤式分离富集 过滤式分离富集即指在微通道内加工制作成堰、栅栏、柱、筛等微器件，当 含有不同粒径颗粒的分析试样流经微器件时，根据颗粒大小不同，能截留某些颗 粒，而让另一组分渗透通过过滤器件实现固液分离的过程。它具有工作原理简单， 不需要选择特殊溶液进行洗脱的优点，然而其制作微器件过程相对复杂，且要求 重庆大学硕士学位论文1 绪论 目标分析物与杂质颗粒有明显的尺寸差异。 微过滤器件的制作是实现分离预处理的前提。基于微加工技术的芯片研制方 法及其在生化分析中的应用国内外均有报道( 7 捌。根据不同的芯片材料，加工技术 有差异。对于硅、玻璃、石英芯片，常见的加工技术有光刻、蚀刻等：对于聚合 物芯片两言，常见的加工技术有l i g a 、激光烧蚀等。根据过滤性能指标参数，制 作不同形状、大小、深度的过滤器件以满足不同场合的过滤需要是实现有效分离 富集的重要因素。 w i l d i n gp t 9 l 等制作了平行于芯片微通道的轴向矩形过滤床，当试样沿着微通道 轴向进入芯片时，小于滤孔尺寸的微粒就流出芯片系统，从而在血液样品流经芯 片时，分离了不同大小的细胞，但是，轴向过滤床的过滤容量有限。h e 等【m 】采用 深度反应离子刻蚀技术( d r i e ) ，在芯片微通道内刻蚀出立方形微柱阵列横向过滤 床，该过滤床在增大过滤容量的同时，有效地除去了溶液中细胞、灰尘等大小不 等的颗粒，实现了对目标分析物的纯化过程，此过程中的过滤吸附为物理式吸附， 故仍需与其它功能配件连用以增加检测灵敏度。b r o y l e s 等在微芯片样品入口端制 作了如图1 1 所示的7 个i t u n 深，18 t t m 宽的阵列式通道，对样品进行过滤式预处 理，随后在5 p m 深，2 5 p r o 宽的通道内涂覆c 1 8 固定相，进行待测物的预浓缩和 分离，使分析信号增大了4 0 0 倍【1 1 】。 c o v e rd l a t e 1 1 y 譬r r u b s 靠：咖 * l 酬聃瞧 e d 9 o f c o v e rp 衄e 7 m 酗i 咖m 蝻 a m p l e d q n a 啊 图1 i带有阵列式过滤通道的芯片结构示意图”】 f i 9 1 1s c h e m a t i c o f t h e m i c r o c h i p w i t ha r r a y f i l t e r c h a n n e l s s ，s w , b i ，b 2 ，a w , t ，v ：样品、样品废液、缓冲液l 、缓冲液2 ，分析废液、交点、阔 在微流控芯片系统中，在设计和制作满足样品分析需求的微器件的前提下， 即可实现样品中不同粒径组分的简单分离富集。目前，基于微过滤原理的细胞分 离芯片已在微流控系统中实现了样品预处理。但是，微器件的制作稠对困难，同 时，增大过滤容量、有效处理过滤物以及过滤器件与后续分析功能相集成也是有 待解决的问题。 2 重庆大学硕士学位论文1 绪论 1 2 2 膜分离富集 膜对试样中待测物质的分离富集作用，主要是利用膜的选择性，以膜的两侧 存在一定量的能量差作为推动力，由于溶液中各组分透过膜的迁移率不同而实现 分离，其操作过程属于速率控制的传质。包括物理与化学两种选择方式。前者主 要是根据组分质量，体积、形态等差异将其分离；后者则是由于组分与膜材料之 间化学性质的差异而实现分离富集。 性能优良而适宜的膜材料是实现分离富集的关键。用于试样预处理的膜材料 有：聚酰亚胺、纤维素、有机硅、硅酸钠、双层磷脂等。另外，利用膜作为生物 催化剂的固定化载体，对膜材料进行改性，所获得的多种类型的改性膜材料也多 有应用，其可以增加对目标物的选择性，获得更好的分离富集效果旧”】。微流控芯 片系统中，膜对目标物的富集程度除与膜材料的结构和性能有关外，还受到富集 时间、溶剂条件、最初的样品体积、膜所在的预富集通道体积之比等因素的影响。 f o o t e 等f i 】在样品储备池与预富集通道体积比为1 0 6 的微流控芯片上，利用多 孔膜对蛋白质样品进行富集，以s d s c g e 分离，最终使信号增大了6 0 0 倍。 微流控芯片系统中，膜主要用于生物样品中小分子与大分子组分之间的分离 富集。x i a n g 等在聚碳酸酯芯片系统中设计了双微渗析膜装置，激光刻蚀出微通 道，两张不同分子量的截留膜像三明治一样夹在三块聚碳酸酯芯片之间，对生物 试样进行了快速而有效的脱盐、去除大分子的在线预处理，随后的质谱分析获得 的结果与试样不通过透析膜相比，信噪比大大地增强了。但是，该膜尺寸与芯片 相近，分析过程需要大量的样品，以致分析过程耗时。为了克服这一缺点，微透 析膜逐渐发展起来了。微透析膜主要有三类：三明治式膜、透析管、微透析探针。 k h a n d u r i n a 等【1 6 1 在利用电泳对试样中d n a 组分进行分析之前，在试样口与侧通道 之间加装了硅酸钠多孔膜，该膜允许溶剂和小分子通过，d n a 则被阻挡、聚集， 而导致浓度不断提高，该膜的引入使d n a 的富集倍数提高了两个数量级。最近， s o n g 等1 1 7 1 提出了采用激光诱导相分离聚合反应，在玻璃微芯片上原位制备了厚度 为7 - 5 0 9 i n 的纳米级多孔微透析膜的新方法。通过控制相分离过程，可以获得不同 孔径以满足不同需要的膜材料。该膜在宽p h 值范围、极性溶剂条件下，经多次重 复使用，均获得较好的稳定性和结果的重现性。 利用膜对微量样品预处理的技术得到了广泛发展，但在微流控芯片分析系统 中相关的研究和应用相对较少，但其具有很好的应用前景。本文利用膜材料简便 易操作等优点，以商品化聚酰胺膜为基体，通过表面键合染料辛巴蓝f 3 g a 配基， 制备而成具有亲和作用的膜材料，探讨膜片与微流控芯片的结合方式，以期实现 对血清白蛋白的特异性吸附以及对血清中其它大分子组分的过滤。 3 重庆大学硕士学位论文1 绪论 1 2 3 固相萃取分离富集 固相萃取( s o l i d p h a s ee x t r a c t i o n ，s p e ) 利用选择性吸附与选择性洗脱的分离原 理，可实现样品的分离、纯化和富集。利用固体吸附剂将液体样品中的目标化合 物吸附，与样品的基体和干扰化合物分离，再选用适当的溶剂冲去杂质，然后用 少量溶剂迅速洗脱，从而达到快速分离和富集目标化合物的目的。与宏观体系中 固相萃取不同的是，在微流控芯片系统中，由于微体系的缩微化，大大减小了样 品及试剂的用量，缩短了萃取所需要的时间，提高了萃取效率。 固相萃取的效能从本质上讲取决于吸附剂的结构和性能。体现为对复杂样品 体系分离能力的高低以及获得的富集倍数的大小。在微流控芯片系统中，按照吸 附剂存在形式的不同，固相萃取可分为开口管、填充柱和整体柱三种类型。 基于开管式的分离富集 基于开管式吸附剂的制备通常是将固定相以液体状态充入芯片微通道中，含 有所需功能团的固定相通过涂渍、键合等方法结合到微通道内壁从而形成开管式 固相萃取吸附剂。 涂渍法是一种简单的基于物理吸附的开口管制备方法，只需要将涂渍试剂加 入微通道中即可。一些研究小组【墙- 2 0 1 在微通道内涂渍十八烷基硅烷固相萃取吸附 剂，并在电色谱模式下，对试样组分进行分离富集，有效地增强了检测信号。k u t t e r 等【2 0 】在玻璃芯片通道内涂渍c 1 8 固定相，成功地对中性香豆精染料c 4 6 0 进行了 富集，当8 7 n m 样品通过电动进样进入微通道后，通过改变缓冲液乙腈的浓度进 行洗脱，在1 6 0 s 的富集时间内，香豆精染料浓度增加了8 0 倍。d o d g e 掣2 1 】在玻璃 芯片通道内设计了一个皮升级的免疫反应池，在池内涂渍蛋白a ，利用蛋白a 对 兔免疫球蛋白( r l g g ) 极强的亲和作用，在免疫亲和色谱模式下，电驱动试样通过反 应池，则稀溶液中的r l g c 抗体浓缩到固定相表面，温育2 0 0 s 之后，获得r l g g 的 最低检测限为5 0 n m o l l 。 尽管通过涂渍方法制备吸附剂比较简单，但涂层会因为时间的消耗变得厚度 不均匀，分析稳定性变差，使其应用受到了一定的限制。因此，在通道内壁通过 化学键合以制备固相萃取吸附剂的方法得到了发展。基于玻璃、硅、有机聚合物 等表面键合的方法已有大量报道。其中，玻璃或硅材料制成的芯片，其表面通过 酸或碱处理后可产生较多的可与硅烷化试剂反应的硅羟基，因此广泛地作为表面 键合的基质；另外，有机聚合物微流控芯片由于加工制作过程简单、价格便宜， 有望在商业上获得大规模的使用【捌，因而成为目前研究的热点。 h e n r y 等 2 卅利用氨解作用，在p m m a 表面键合上氨基功能团，通过烷烃桥联作 用，能进一步吸附有氨基基团的化合物。实验获得了末端键合有氨基基团的p m m a 芯片，有效地实现了对d n a 限制性酶的固定，而限制了d s d n a 的吸附。氨基修饰 4 重庆大学硕士学位论文1 绪论 的p m m a 芯片可进一步与各种试剂( 如n - c 1 8 h 3 7 等) 反应，提供带有不同功能基团的 p m m a 表面，对不同目标物质进行分离。 为了获得性能优异的通道表面以实现对目标分析物高选择性的分离富集，对 各种表面修饰材料的研究成为一个重点。聚硅烷、聚酰胺、树脂等被广泛地用作 修饰的材料；将蛋自质、酶等生物分子固定在微通道表面作为固相萃取的吸附剂 也是一种新的方法1 。与此同时，生物分子的固定化技术也得到了极大的发展【2 5 1 。 其中，s o l g e l 技术被普遍认为是一种相对温和的固定化方法，在固定化过程中， 生物分子被捕获在不断增长的凝胶网络中，而不是被物理或化学地吸附在通道上， 因此得到的固定相使得生物分子更能够抵抗热或某些化学环境下可能引起的失活 现象，大大提高了吸附容量及操作的稳定性2 6 1 。q u 等【2 7 】在p m m a 芯片微通道内 引入硅烷试剂，进行溶胶凝胶反应，所得的凝胶具有大的表面积、多孔性、亲水 性，蛋白质被固定在凝胶网络中，对该固定相性能进行评价，实验获得了优良的 重现性和稳定性。 在开管式固相萃取模式下，吸附容量受到通道比表面积的限制，较厚的液膜 会增大传质阻力，因此，发展新型的吸附材料以及修饰技术，合理地选择芯片材 科和设计微通道成为提高固定相分离富集效率的需要。 基于填充式的分离富集 固定相填充柱对试样中目标化合物的吸附表现为物理吸附和化学吸附两种形 式。物理吸附主要指利用填充微粒对试样中不同粒径组分的拦截作用，选择性地 让一部分组分通过而截留另一部分组分，达到分离纯化的目的；化学吸附指对填 充微粒表面进行化学修饰后，使其具有选择性吸附某类物质的能力，而实现分离 富集。 利用填充式吸附剂进行分离富集的操作过程为：首先通过微加工技术直接在 芯片通道中形成围堰、栅栏、坝等微结构以作为固定相填充床，再将硅胶、微珠 等颗粒通过电驱动或压力驱动引入填充床作为固相萃取吸附剂，然后对试样中目 标物进行分离富集。与开管式围相萃取相比，填充式固褶萃取能获得更大的比表 面积，有利于提高对目标物的分离富集效率。 c c r i o t t i 等【2 s 】在p d m s 芯片上设计了一个双t 通道和一个与之相通的锥形通 道，将3 p r o 的十八烷基硅胶微粒引入到锥形通道内，通过“楔石效应”使其形成填 充柱吸附剂，在电泳模式下，以f i t c 标记的氨基酸作为样品对象，对该吸附剂的 稳定性及吸附性能进行评价，效果良好。o l e s c h u k 掣2 9 】在玻璃芯片上制作了3 3 0 p l 的双围堰式填充床，在电渗流的驱动下使1 5 4 叫i 的o d s 颗粒沿着芯片上的微 通道进入填充床并使其固定，作为固相萃取吸附剂，对荧光试剂b o d i p y 进行富 集，当富集时间从1 2 0 s 到5 3 2 s 时，富集倍数从8 0 增大到5 0 0 倍；使用该装置， 5 重庆大学硕士学位论文1 绪论 消除了死体积，不存在由于离线富集而引起的样品损失与污染的现象，极大地提 高了富集效率。a n d e r s s o n 等【3 0 】提出了用于固定填充剂的微结构的设计应满足的要 求，即：对流动相有较小的流体阻力；能有效截留杂质微粒；体积应相对集中以 便于检测，并在微流控芯片系统中设计了如图2 所示的三种不同形状的过滤器， 对三者性能进行了比较后认为，c 形填充结构能够获得较小的流体阻力，较高的吸 附容量，而不影响检测灵敏度。 图1 2 固定填充剂的微结构设计图 3 0 1 f i 9 1 2 s c h e m a t i c so f m i c r od e v i c ef o rf i x i n gp a r t i c l e s 在微流控芯片分析系统中进行非均相免疫分析是一种非常重要的分析方法。 将抗体固定在固体表面，这是在微流控芯片系统中进行非均相免疫分析最关键的 步骤。其中，通过在微珠表面固定抗体，再将其填充到芯片的通道中，对抗原进 行吸附富集，是一种重要的分离富集方法。常用的微珠有聚苯乙烯微珠、琼脂凝 胶微珠及磁性微珠等。s a t o 等 3 1 , 3 2 先后将抗体固定在聚苯乙烯微珠上，然后填充 在具有堤坝结构的通道中，使微珠保持在通道中，作为抗原的吸附剂，进行免疫 反应，该方法获得了极低的检测限。c h o i 等【3 3 】通过磁场将表面固定有生物素标记 抗体的磁珠固定在芯片通道中，通过控制磁场，可以方便地引入或排出磁珠，操 作简单。另外，多孔硅由于具有高的比表面积、优异可控制的孔性能、非特异性 吸附少、稳定性好等优点，目前在微流控芯片系统非均相免疫分析中也被广泛地 用作蛋白质或d n a 等生物分子的固定载体【3 4 3 6 1 。b r e a d m o r e 等【3 5 ，q 通过s 0 1 g e l 反 应将d n a 固定在凝胶网络中，制备多孔硅颗粒，经冲洗后，获得d n a 的模板结 构，将其引入玻璃芯片微通道，以人全血为分析对象，优化实验条件，有效地将 d n a 从全血中萃取到硅表面上萃取时间少于1 5 m i n 。 填充式固相萃取吸附剂能提供较大的比表面积，可获得较大的吸附容量，但 吸附剂需要保持在微坝或其它特殊结构中，因此多数填充过程相对复杂，且对微 芯片加工技术也提出了更高的要求。 基于整体柱的分离富集 整体柱( m o n o l i t h i cc o l u m n ) ，又称整体固定相( m o n o l i t h i cs t a t i o n a r yp h a s e ) 、棒 6 重庆大学硕士学位论文1 绪论 柱( r o d ) 、连续床层( c o n t i n u o u sb e d ) ，是一种用有机或无机聚合方法，用功能单体、 引发剂、致孔剂、交联剂等混合物在色谱柱内通过原位聚合形成一个连续床固定 相的色谱柱，是近几年在色谱领域发展起来的一种新型色谱填料，具有结构均匀、 可获得较大比表面积的吸附表面，以及优异的通透性、高空间利用率、制备过程 简单等优点1 3 ”，因此被喻为继多聚糖、交联与涂渍、单分散之后的第四代色谱填 料。近十年来，随着整体柱技术的完善和发展，整体柱在高效液相色谱( h p l c ) 、 毛细管电色i 普( c e c ) 、微分析系统( “t a s ) 等领域获得应用，并已成功地应用于生命 科学、环境科学等领域的分离分析。 鉴于整体柱的特点，本论文将其作为固相萃取分离富集介质，探讨其在微流 控芯片分析系统中的应用。 1 2 4 微流控芯片分析系统中整体柱分离富集 按照微流控芯片分析系统中的整体柱吸附剂类型的不同，主要分为有机聚合 物整体柱和无机硅胶整体柱两大类。有机聚合物整体柱是由单体、引发剂、制孔 剂等混合物通过原位聚合制备而成的棒状整体，由于聚合物整体柱在制备时选材 较广，因而可有不同的选择性，可适用的p r i 范围也较宽，且制备方法简单、省时、 结构均匀、重现性较好、柱效较高及可进行快速分离等优点。原位聚合反应制备 整体柱避免了在微通道中填充固定相的困难以及高精度的微结构加工技术的需 要，因而在微流控芯片系统分离富集技术的发展与应用中极具潜力【3 ”。根据所用 单体类型不同，有机聚合物整体柱吸附剂包含了聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酸酯、 聚苯乙烯及分子印迹等四类整体柱吸附剂。根据不同的作用力，可对不同的目标 物产生吸附富集效能。然而，有机聚合物整体柱存在着固有的缺点，如：机械强 度相对较差，特别是在有机溶剂的作用下，柱体会发生收缩或溶胀现象，致使柱 性能发生变化，导致柱寿命缩短的缺点。 图1 3 芯片上的整体柱固定相结构图f 3 s l f i 9 1 3s c h e m a t i c s o f m o n o l i t ha ss o l i d p h a s e o l l t h e c h i p b ，s ，8 w , s w 分别为缓冲液、样品、缓冲液废液、样品废液 7 重庆大学硕士学位论文1 绪论 相比之下，无机硅胶整体柱以烷氧基硅烷试剂为反应初始物，通过1 眢e l 反 应制备而成，这种整体柱材料则不存在上述缺点。硅胶整体柱的多孔体系是由完 全创新的两种孔结构组成：遥孔结构和中孔结构微米级的骨架和通孔、纳米 级的中孔。骨架上的纳米级中孔保证了填料的比表面积，比颗粒型色谱柱的比表 面积高1 5 ( 传统颗粒型色谱柱的比表面积为6 5 7 0 ) ，这保证了高的柱效。由于 硅胶整体柱特殊的结构，使其具有极好的通透性，柱容量和柱效高，机械稳定性 好，高流速下硅胶整体柱仍具有较高的柱效和较低的柱压降，这是颗粒型填充柱 无法实现的p 9 j 。通孔与中孔通过相互交联形成多孔网络结构，由于该类基质加速 了吸附和脱附的过程，使在高流速下进行分离变为现实，目标化合物在流出时可 以选用合适的流速，待目标组分完全流出后增大流速，使其它的组分快速流出， 从而大大地减少了样品的分析时间，由此使得一种全新的概念“流速梯度”成为现 实，这保证了在最短的时间内获得最佳的分离，极其适合蛋白质等生物大分子的 高效快速分离【帅】。虽然硅胶整体柱具有许多优异特性，但仍然存在一定局限，如硅 胶整体柱需经包覆后才能使用，这无疑增加了制备工作的复杂性；另外，硅胶整 体柱的制备和化学修饰不能同时进行，化学修饰需待包覆后于柱上完成。尽管如 此，硅胶整体柱的优异特性决定了其在分离分析领域必将发挥越来越重要的作用， 因此有人将它的产生称为吸附剂新时代的伟大创掣4 1 1 。 整体柱作为微流控芯片分析系统中的固相萃取吸附剂，目前报道的其在微流 控芯片分析系统中的存在形式主要有芯片上整体柱和芯片外联整体柱两种。y u 等 心在特定区域的微流控芯片通道内，采用光引发原位聚合反应，通过改变单体溶 液的配比和组成，分别制备了基于甲基丙烯酸酯类的疏水型和离子交换型聚合物 整体柱，作为固相萃取的吸附剂，并对香豆精5 1 9 ，香豆精5 1 9 一肽化合物、绿色 荧光蛋白质等分子量不同的化合物进行富集，获得1 0 3 以上的富集倍数；通过改变 不同的聚合物条件，可以获得满足不同需要的吸附剂类型。 芯片外联式整体柱可以通过热引发有机单体原位聚合反应来制备【删；另外， 对制备过程要求严格的无机硅胶整体柱与芯片的连接也可以考虑外联方式。在这 种外联方式下，只需选择合适的接口方式，即可实现整体柱与芯片的连接，该方 法具有较好的灵活性，可方便地更换固相吸附剂而不影响芯片其它单元的操作， 但是由于有接口的存在，易产生死体积，降低分析效率，因此，合理的接口设计 是芯片外联式整体柱实现有效分离富集应考虑的重要因素。 微流控芯片分析系统的目标是对样品进行快速、准确和高通量分析。然而，现 实样品成分复杂，针对样品每一种成分，预处理的要求是有差别的。由于整体柱 吸附剂具有制备过程简单、聚合过程容易控制、可获得不同性质的化学表面等优 势，因此，在芯片上集成阵列式整体柱吸附剂，在增大样品吸附容量的同时，还 重庆大学硕士学位论文1 绪论 能够有效分离富集得到目标物质，是一种有效可行的方法。t a n 等4 3 1 在带有8 个平 行通道( 1 0 m m 长，3 6 0 1 m li d ) 的有机聚合物芯片上，在微通道内利用紫外引发单体 溶液发生原位聚合反应制备整体柱，从而获得了具有分离富集能力的八阵列式微 整体柱芯片。进一步实现了人尿样品及p 4 5 0 药物的固相萃取分析。 图1 4 八阵列式微整体柱芯片示意图【4 3 】 f i 9 1 4 s c h e m a t i c so f m i c r o c h i po f e i g h tc h a n n e l sw i t hm o n o l i t h s ，n ，h ，c ，c i ，c o ，u 、v 分别为l o m l 塑料泵、纳米孔真空分配盒、排气孔、底片、连 接毛细管的入口端、连接毛细管的出口端、紫外光、通过含有单体的混合液 基于整体柱固相萃取吸附剂结构均匀、可获得的吸附表面较大、通透性好、 空间利用率高、制备过程简单等优点，尤其是硅胶整体柱独特的双孔结构特征， 以及经表面改性之后获得的针对样品对象的吸附特性，本论文将制备并改性硅胶 整体柱，并将其作为微流控芯片分析系统中的固相萃取吸附剂，设计制作样品预 处理单元，以期实现血清中药物样品的预富集。 1 3 课题研究意义和目标 通过对国内外研究现状的分析可知，固液双相分离富集技术以其灵活多变的处 理介质、操作方式等特点，已成为微流控芯片系统中一种重要且极有前景的样品 预处理技术。针对生化、临床等复杂样品体系中微量目标物的分析检测，选择合 理的手段首先将其分离富集之后以进行进一步的分析，在发展微流控芯片系统的 集成化方面具有及其重要的意义。然而，现有的固相材料种类有限，因此针对样 品体系开发新型的固相材料以实现高效样品分析更具有广阔的前景。 课题研究的目标在于：将色谱领域中的硅胶整体柱进行改性，并作为固相萃 取介质材料，以在微流控芯片系统中实现固相萃取分离富集技术的应用；进而将 硅胶整体柱固相萃取介质材料引入到微流控芯片上，针对临床检测药物样品体系， 进行芯片设计的探讨，并形成预处理单元，实现对血清中痕量盐酸多巴酚丁胺的 9 重庆大学硕士学位论文1 绪论 复杂样品体系的分离富集及检测。 本论文利用溶胶凝胶技术，以四甲氧基硅烷( t o m s ) 、聚乙二醇( p e g ) 、乙酸、 氨水等作为反应初始物，制备正相硅胶整体柱，进一步通过改性实验，在硅羟基 上键合c 1 8 基团使其具有反相特征，以便扩大整体柱的应用范围。通过对制备过 程的分析，优化各反应条件；同时结合扫描电子显微镜( s e m ) 、红外光谱( i r ) 等手 段，表征整体柱的形貌及表面性质。将改性制备得到的硅胶整体柱作为微流控芯 系统中的固相萃取介质材料，在固相萃取双相分离富集模式下，以期实现对临床 药物体系中微量目标物质的富集。 本论文进一步探讨微流控芯片系统中的固相萃取预处理单元的构建。通过对 硅胶整体柱柱容量、富集效率等参数的考察，在初步构建的外接式硅胶整体柱微 芯片预处理单元的基础上，引入亲和膜作为预处理单元的一部分，优化亲和膜与 微芯片的连接结构，进而设计外接式硅胶整体柱亲和膜微芯片三位一体的预处理 单元。以盐酸多巴酚丁胺- k h 恤0 4 - i 】m i n o l 的化学发光体系为测试对象，以期实 现血清中痕量盐酸多巴酚丁胺的富集预处理及分析检测。 1 0 重庆大学硕士学位论文2 实验原理 2 实验原理 2 1 固相萃取预处理 固相萃取( s o l i dp h a 8 ee x t r a c t i o n ，s p e ) 常被用于试样的预分离富集，它利用选择 性吸附与选择性洗脱的分离原理，使液体试样通过固体吸附剂，液体样品中的目 标化合物被保留吸附，与样品的基体和干扰化合物分离，再选用适当的溶剂冲去 杂质，然后用少量溶剂迅速洗脱，固相萃取过程可分为吸附和洗脱两个部分。在 吸附过程中，当溶液通过吸附剂时，由于吸附剂对目标物质的吸附力大于溶剂的 吸