（植物学专业论文）sos3调节拟南芥抗盐性的电生理学分析.pdf

告 可介 夕 学 二 二 平 月 卜四 月 w 吐: n 开 ， 七 . 生 绷: s 立创犷 二 忆 主要英文缩写 abbr e v i a t i o ns 英文缩写英文全称中文名称 2 - ( n - m o r p h o l i n o ) e t h a n e s u l f o n i c a c i d b o v i n e s e r u m a l b u mi n n - h y d r o x y o t h l p i p e r a z i n e - n - 2 - e h a n e s u l f o n i c a c i d s a l t o v e r l y s e n s i t i v e s o s s i g n a l t r a n s d u c t i o n p a t h w a y e户 写a环囚 陡se， nbh八口 s o s g e n e gs tgl u t a t h i o n e s o d i u m d o d e c y l s u l f a t e - p o l y a c ryl a m i d e g e l s ds - p age 2 - ( n - 吗啡琳) 一 乙 烷磺酸 牛血消白蛋白 n - 2 - 轻乙基呱啧- n - 2 一 乙烷 磺酸 盐超敏感性 s o s 信号转导途径 s o s基因突变体 谷脱甘肤硫转移酶 十二烷基磺酸钠一 聚丙烯酞 胺凝胶 电泳 弓 可南 大 遭 碑 二 二 平 零 四月 z 口 y 七 笼 开 究 生 遨 卜 亡 立 1 仑 文 中文摘要 土壤盐渍是影响植物生长的重要胁迫条件，严重制约着农业生产和土地利用。以拟南芥 为材料，研究分析出了与植物抗盐有重要关系的s o s , s o s , s o s 3三个基因。它们编码的 蛋白s o s i , s o s 2 , s o s 3 组成了一条信号转导途径来控制离子的内稳态。这条途径的 起始为 外 界高 盐刺 激使 细胞内c a + 水平发 生 变化， c a 2 1 为 第 二信 使与s o s 3 结 合， 然 后导 致s o s 3 与s o s 2 相互作用激活 s o s 2 的激酶活性， 形成s o s 2 - s o s 3 激酶复合体。 s o s 3 调节途径的终 端是维持离子平衡的转运系统，如s o s . ，质膜n a / h + 反转运体。后来以s o s 3 突变体为背景 用t - d n a插入法敲除掉a t h k t i 基因发现a t h k t 1 基因的失活缓解了， o s 3 突变体的 盐敏感性， 并且使， o s 3 突变体内积累了较低浓度的n a 和较高浓度的k 。结果暗示a t h k t i 可能是一个 n a 内流转运体并起了调节k , n a 吸收系统的作用， 并且野生型s o s 3 蛋白 可能抑制a t h k t i 蛋白n a 内流转运体的活性， a t h k t . 可能是s o s 途径的 调节对象之一。 但是， 至今仍缺乏s o s 3 调节k 和n a i 吸收的电生理学证据。 本文以 拟南芥盐超敏感突变 体s o s 3 /a th k t i 、 双突变体s o s 3 / a t h k t l以 及相应野生型c o lg l l (s o s 3 / a t h k t i ， 生态型为 c o lu m b ia ) 为 材料， 利用膜片钳技术就n a 对这三 种材料的 根细胞原生 质体质膜内向k 通道 全 细胞电流的影响进行了 研究，在电生理方面给出了a t h k t l 蛋白 可能介导n a 内 流并受s o s 3 蛋白抑制调节的直接证据。 结果显示， 野生型s o s 3 / a t h k t i , s o s 3 / a t h k t l内向k 通道全细胞电流在加入5 0 m m o l / l n a 后均发生减小， 而s o s 3 / a t h k t 1 内向k 通道电流在加入5 0 m m o l / l n a 后反而增大， 说明在突变体s o s 3 / a t h k t i中 这种增大的电 流可能是由n a 十 弓 起的，经和s o s 3 1 a t h k t i( 野 生型) ， s o s 3 / a t h k t l 比较， 其可能进入的途径为a t h k t i 蛋白，也即是s o s 3 l a t h k t i 突变体对 盐超敏感的原因。 而且s o s 3 蛋白在野生型s o s 3 1 a t h k t i 中 对a t h k t i 可能起到了 调控作用。 在双突变体中: o s 3 突变，同时a t h k t i 也不存在，就消除了n a y 进入细胞的途径，因而全细 胞电流减小。 实验还对n a + 在突变体， o s 3 / a t h k t l 引起的电流增大效应进行了药理学分析。结果显示 a t r k t i 蛋白 介导的电 流增大可被t t x和c a 十 部分 抑制， 对k 通道抑制剂t e a 十 不敏感， 而 畜 可洲 甘 p , 之 卜. 二 导 月 卜四 月 不 比刊 七龙 开究 泪 七学 士 七论 文 且对l i+ 有相似的选择性， 表明a t h k t i 蛋白 可能为一种n a 通透型阳离子通道，其蛋白 活性 受到 s o s 3 蛋白的抑制调节。 关键词: 盐胁迫，s o s 3 , a t h k t i ， 突变体 饲 甫 大 学 二 二 月 卜 华 四 月 石 目 创 卜 : 开 究 生. 学 七 比 论 文 ab s t r a c t s o i l s a l i n it y i s o n e o f t h e m o s t s i g i n i f i c a n t a b i o t i c s t r e s s f o r p l a n t a g r i c u l t u r e . mo re r e c e n t ly , t h e s o s s a l t s t r e s s s i g n a l i n gin a r a b i d o p s i s t h a t i a n a w a s d e t e r m i n e d t o h a v e a p i v o t a l r e g u l a t o r y f u n c t i o n i n s a l t t o l e r a n c e , f u n d a m e n t a l o f w h i c h i s t h e c o n t r o l f a c t o r o f i o n h o m e o s t a s i s t h e p r o t e i n s o s i , s o s 2 , a n d s o s 3 a r e c o m p o n e n t s o f s o s s a l t s t r e s s s i g n a l i n g p a t h w a y t h a t c o n t r o l s io n h o m e o s t as i s a n d s a lt to le r a n c e . t h e e l ic it o r o f t h i s p a t h w a y i s c a 2 , c a t b in d s to s o s 3 , w h i c h l e a d s t o i n t e r a c t i o n w it h s o s 2 , a s e r l t h r p r o t e i n k i n a s e o f 4 4 6 a m i n o a c i d s , a n d a c t i v a t e d t h e k in as e . t h e t r a n s c r i p t i o n a n d p o s t - t r a n s c r i p t io n o f s o s i , a n p u t a t iv e n a / h a n t ip o r te r o n t h e m e m b r a n e i s c o n t r o l l e d b y t h e s o s 3 - s o s 2 c o m p l e x . i n a d d i t i o n t o re g u l a t i n g s o s i e x c h a n g e a c it iv it y , s o s 3 - s o s 2 m a y r e g u l a t e o t h e r s a lt t o le r a n c e e f f e c t o r s . o n e s u c h e f f e c t o r m i g h t b e t h e n a t r a n s p o r t e r a t h k t 1 . r e c e n t l y , r e s e a r c h o n t h e s o s 3 l a t h k i l d o u b l e m u t a n t s i n a r a b i d 勿 n s i s s h o w e d f u n c t i o n a l d i s r u p t i o n o f a t h k t 1 w as s h o w n t o s u p p re s s t h e s a l t s e n s i t i v e p h e n o t y p e o f s o s 3 m u t a n t i n d i c a t in g t h a t w i l d - t y p e s o s 3 m a y in h ib it t h e a c t iv it y o f a t i4 k t i as a n a in fl u x t r a n s p o r te r . b u t h it h e r to t h e r e is n o e v i d e n c e s in e le c t r o p h y s io lo g y a b o u t r e g u l a t i o n o f k a n d n a in fl u x b y s o s 3 p r o t e i n . h e r e w e a n a ly s i z e d th e c h a n g e s o f w h o le c e l l in w a r d k c u r re n t b y u s i n g p a t c h - c l a m p t e c h n i q u e s i n wt , s o s 3 a n d s o s 3 l a t h k i l p l a n t s . t h e d a t a s h o w e d t h a t t h e i n w a r d w h o le c e l l k c u r r e n t i n t h e r o o t p r o t o p las t s o f b o t h w il d - t y p e ( s o s 3 1 a t h k t i , e c o t y p e c o l u m b i a ) a n d t h e d o u b le m u t a n t ( s o s 3 / a t h k t l ) d e c re as e d 5 m i n u t e s a ft e r a d d e d 5 0 m m o l / l n a t o t h e b a th s o l u t i o n . b u t t h e i n w a r d w h o l e c e l l k c u r r e n t o f s in g l e m u t a n t ( s o s 3 / a t h k t l ) i n c r e as e d a f t e r t h e s a m e t r e a t m e n t . i t s u g g e s t t h a t i n t h e s i n g l e m u t a n t ( s o s 3 1 a t h k t 1 ) t h e i n c r e as e d c u r r e n t m o s t p o s s ib ly is t h e n a in fl u x , a n d t h a t t h e p ro t e in a th k t i i s a n a in fl u x t h r a n s p o rt e r w h i c h i n d u c e d t h e o v e r l y s a lt s e n s i t i v i t y i n s o s 3 l a t h k t i . f u r th e r m o r e , t h e w i l d - t y p e p ro t e i n s o s 3 m a y b e d o w n r e g u l a t e d t h e p ro t e i n a t h k t 1 . b e c a u s e w h e n b o t h t h e g e n e s o s 3 a n d t h e g e n e a t h k t i d e c r e ase d a r e m u t a n t e d in t h e d o u b l e m u t a n t ( s o s 3 l a th k t l ) t h e i n w a r d w h o l e c e l l k c u r r e n t 一 4 弓 可甫 大 学 二 二 早 攀 四 月 不 泣 t 研 究 生 学 位 论 文 t h e p h a r m a c o l o g y a n a l y s i s o n t h e i n c re a s e d c u r r e n t i n t h e s i n g l e m u t a n t ( s o s 3 / a t h k t l ) i n d i c a t e d t h a t t h e i n c r e a s e d c u r r e n t , p o s s i b ly c o n t r i b u t e d b y a t h k t l a c t i v i t y , c o u l d b e i n h i b i t e d b y t t x a n d c a . it i s in s e n s it iv e t o t e a a n d h a v e t h e s a m e s e le c t iv it y t o l i . t h e d a t a s u g g e s t t h a t t h e p r o t e in a t h k t l p e r h a p s i s a n a - p e r m e a b le c h a n n e l . t h e p ro t e i n s o s 3 d o w n r e g u la t e d it . k e y w o r d s : s a l t t o l e r a n c e , s o s 3 , a t h k t l , m u t a n t 巴 可育 大 学 二 二 早 早 四 月 硕 士 龙 踌 免 生 月 卜 亡 比 论 文 1 . 前言 1 . 1 简介 盐胁迫是影响植物生长最重要的非生物胁迫因子之一，它直接影响作物的产量和土地的 使用效 率n 1 。目 前， 世界大约 有2 0 % 的可耕地和将近一半的 灌溉土 地受到 盐胁迫的 影响 12 1所 以 对植物抗盐机制的研究成为植物基础生物学研究中很重要的一部分，揭示植物的 抗盐机制 有助于了 解植物 基因 调节、 信号转导、 离子转运和矿质营养等各个方面 13 1 。 植物从 感受盐 胁迫 信号到作出一系列的应激反应是一个非常复杂的过程，包括离子渗透胁迫反应和由此引起的 二 级 胁 迫 反 应( 如， 活 性 氧 胁 迫) ， 以 及 植 物 整 体的 调 节反 应 等 13 1 。 早 在 六 十 年 代e p s t e in 等 人 1 i 就已深入的 研究了 植物的离子吸收，发现 k 作为植物生长所必需的三大主要元素之一， 其 吸收存在两种动态的吸收 机制:高 亲和吸收和低亲和吸收。 正常土 壤中的k 浓度在1 m m o l / l 以 下， 这时 植物主要以 高亲和的 机制吸收k+， 在高盐 环境中n a + 是最主要的 毒害离子， 对植 物最大的 影响就是干扰了 植物k 的营养吸收15 1 ， 导致生长受到抑制。 最近研究发 现k 高亲和吸收 转运体a t h k t 1 在盐 胁迫下 介导了n a i 的内 流 16 .7 .8 .9 1盐 胁迫 下植物的生 长状况主要是 细胞n a . k 等离子的 平衡 状态决定的， 近来对拟南芥( a r a b id o p s is t h a l i a n a )的 研究发现了几个特有的抗盐决定基因 ( s o s , s o s 2 , s o s 3 ) ，并在分子水平鉴定 出 了 几 个 对 植物 抗盐性非 常 重要的 离 子转 运 体( s o s , , a t h k t i ) 16 1 。 植 物在 盐 胁 迫下 启 动了 由s o s 1 , s o s 2 , s o s 3 蛋白 组成的一条信号转导 途径( s o s s i g n a l t r a n s d u c t i o n p a t h w a y ) , s o s 信号转导途 径对植物抗盐性有很重要的作用 尤 其是在调 节n a , k 离子内 稳态 方面16 ,1 0 .3 1 下面主要对拟南芥盐敏感突变体的研究、 s o s 信号转导途径的组成部分以及盐胁迫下钠、 钾离 子内 稳态的调节加以介绍。 1 . 2 s o s突变体 敏感突变体是其相应野生型显性基因发生隐性突变得到的。在微生物如埃希氏菌 ( e s c h e r i c h i a c o l i ) 和 酵母中已 经 成 功的 筛 选出 了 盐 敏感 突 变 体 18 ,9 1 ， 并 成 功的 揭示了 在 其 抗 盐过程中很重要的转运体和信号元件，表明筛选盐敏感突变体已 成为一种阐明抗盐机制很有 效的研究手段。 最 近， 在植 物中利用拟南芥盐 超敏感 ( 。 ， s a lt o v e r l y s e n s it iv it y ) 突 变体 研究植物的抗 盐 机 制取 得了 突 破 性的 进展 17 .11 ,1 2 1 。 通 过 根弯曲 实 验 在高 浓 度 ( 1 0 0 m m o l / l ) 盐 培养 基 上 筛 选 弓 可 甫 大 学 = 辱 争 四 居 不 峨 士 研 究 生 $ 论 文 出了4 0 余株 e m s诱变盐 超敏感突 变体1 1 ,1 2 1 。 通过等位杂交分析表明 这些突变体分 别属于5 个基因突变所得:s o s l ， ， ， s o s 2 1 2 , s o s 3 7 , s o s 4 1 3 1 a n d s o s s 1 0 o 其中s o s i , s o s 2 , s o s 3 组成了 一条盐胁迫信号转导途径来控制离子的内 稳态7 ,3 ,1 5 , 1 6 1 s o s l , s o s 2 , s o s 3 二种突变体都对盐表现出超敏感性但又稍有区别。在含有5 0 m m o l几n a 的 培养基上这三种突变体的生长 状况都与野生型相同，随着盐浓度的提高它们的生长 相对于 野 生型来说都受到了较大的抑制， s o s 突变体的 被抑制程度尤其显著，表现出对盐的极为敏感 特性7 ,11 ,1 2 1遗传分析表明 : s o s 基因 上 位于 o s 2 , s o s 3 基因， 因为 对s o s l / s o s 2 和s o s l / s o s 3 双突 变体的 研究显示 它们的表型 和对盐的 反 应程 度更类似于s o s 突变体3 1 ， 因 此与 o s 2 , s o s 3 相比 s o s l 基因 在植物抗盐生长 过程中的 作用更为重 要。 另 外， s o s l , s o s 2 , s o s 3 突 变体在州 k i e x 1 和 低 c a ), 。 的 培 养 基 上 都 表 现出k 缺 乏 症 状， 生 长 受 到 抑 制， 但是、 o s 2 , s o s 3 突 变 体 的k 缺 乏 症 状 可以 被 外 源m m c a 2 + _ 缓 解， 而 外 源m m ca 不 能 缓 解3 0 9 1 的 生长 ， 表 明 该条转导途径与调节植物的k 十 营养吸收有关， 而且。 os 基因的缺失严重影响了k + 的营养吸收， 导 致 不 可逆转的k 缺乏7 ,1 1 ,1 2 1 . s o s 2 , s o s 3 突 变体的k 缺乏 症状 可以 被 外 源c a t 缓 解， 因 此 c a t 在植 物的抗盐过程中也起很重要的 作用， 而后 对 o s 蛋白 的 研究更加明 确了 这条 信号 转 导途径过程。 1 . 3 s o s蛋白 s o s 3 基因 位于5 号染色体上7 ， 它 编码一个c a t 结合蛋白 ， 具有三个e f 臂环构型 1 7 1 和c 扩 + 有较高的 亲和性 。 s o s 3 的 功能 特征以 及氨基酸序列与蛋白 磷酸酶2 b的b 亚基( c n b ) 和神 经c 矛 十 结合因 子 ( n c s ) 极为相似 17 1 . s o s 3 的n 一 末端 包含有一 个十四 酞化 ( 豆范 酞化) 的位点，体外用放射元素标记的豆益酸和豆落酞转移酶对 s o s 3 m r n a进行处理观察表明 s o s 3 n 一 末端g ly - 2 被十四 酞化。 十四 酞化 对s o s 3 的 活性非常重要， 若把g ly - 2 突 变为a la 致使十四 酞化失 败则消除了s o s 3 蛋白 互补， o s 3 突变植株盐敏感表型的 能力 1 1$ 1 。 对 十四 酞化 的需求表明s o s 3 可能调节结合于质膜上的离子载体的活性。 s o s 2 基因 也 被定 位于5 号 染 色体 上 12 ) . s o s 2 为 一个s e r / t h r 类 蛋白 激 酶， 共 有4 4 6 个 氨 基 酸， 分子量大约有5 1 k d i 9 1 a 激酶活 性对s o s 2 抗盐功能非常重要1 9 1 。 它的n 一 末 端有一个 长为2 6 个 氨基酸的 催化区 域， 这段序列同 酵 母的 蔗糖不发酵激酶( s n f 1 ) 和哺乳动物a m p k激 酶的 催化序列有很大的同 源 性3 .1 9 1 。 它的c 一 末端有 一个长 为2 1 个氨基酸的 调节区域( f i s l 结 河 甫 大 学 . 训 卜 平 四 月 wt-rr究 月 匕 嵘 七 立 vie 文 构) ， 这段序列同它的n 一 末端催化区域结合引 起s o s 2 激酶活性的自 我抑制， 这种抑制作用可 能是通过阻止底物进入催化位点来实现的。 s o s 3 蛋白 可以和f i s l 结构结合， 可能使s o s 2 暴露了 催化位点而使得底物有机会进入催化位点， 从而解除s o s 2 的这种自 我抑制作用， 恢复 其激酶活性。 若是删除调节区域则会导致s o s 2 的持续的激酶活性而不依赖于s o s 3 蛋白的结 合 调 节 201 研究 表明s o s 1 为一个定位于 质膜上的n a 勿r 反转 运体， 分子量大约为1 2 7 k d 2 11 。 它的 n 一 末端由 1 0 - 1 2个跨膜脂性区域组成， 跨膜区域的氨基酸序列同微生物和动物体内的n a 勺 h 反转运体序列相似。 s o s i蛋白 代表了一类在质膜上行使功能的新的 n a / h 十 反转运体。s o s 1 的 c 一 末端是一段亲水性的 “ 尾巴， 位于细胞质内， 这段序列可能 提供了 和某一蛋白 结合的 位 点 从 而 使自 身 受到 调节 12 1 1 , s o s , 还可能 具 有 感 应自 身 转 运 底物的 功能。 在酵 母 和 植 物中 的 功 能研究表明: s o s i 受s o s 2 - s o s 3 激酶复合体的激活， 只将s o s i 引入缺乏所有内源n a + - a t p a s e 和n a / 1-i 交换体的酵母突变体中， 该突变体的耐盐性仅有轻微提高。 而当 将s o s 2 和s o s 3 跟 s o s 共表达时， 极大地提高了酵母的耐盐性， 结果表明s o s i 蛋白n a 1 h + 反转运体功能的行 使需要s o s 2 - s o s 3 激酶复合体的 激活4 1 1 . 4 s o s 信号转导途径 经过 遗传学和生物化学的深入研究， s o s 信号 转导 途径过程如图1 - 1 所示6 ,10 ,1 6 ,2 2 1 。 外界 高 盐刺激信号使细胞内c a 2 1 水平发生变化， c a l 十 作为第二信 使与s o s 3 结 合， 然后导 致s o s 3 与s o s 2 相互作用激活s o s 2 的激酶活性，形成s o s 2 - s o s 3 激酶复合体。这一调节途径的终 端是维持离子平衡的转运系统，它分别 在转录水平 和转录 后水平上对s o s 1 一 一 一 r 犷 用十 反 转运 体 进 行 调 一倒 m a s ) o s o s 2 - s o s 3 复 合体 同 时 还 调 节 其 它 的 抗 盐 因 子 。 其中 一 个 可 能 是n a 内 流 转 运体a t h k t 1 iz 。 最初认为a t h k t i 蛋白 是一 个高 亲和k 转 运体， 后来以: o s 3 突变体为 背景 用t - d n a 插入 法 敲 除 掉a th k t i 基因 发 现a th k t 1 基因 的 失 活 缓 解了 s o s 3 突 变 体 的 盐 敏 感 性 ， 并 且 使 o s 3 突变体内 积累了 较低 浓 度的n a 和 较 高 浓 度的k a 12 n ,7 1 . 结 果暗 示a t h k t i 可能 是 一 个n a 内 流转运体并调节k 十 、 n a 吸收系 统， 并且野生型s o s 3 蛋白 可能 抑制a t h k t i 蛋白 n a 内 流转运体的活性， a t h k t i可能是 s o s途径的调节对象之一。除此之外，s o s 2 - s o s 3 还调节 液泡 膜n a 十 1 h + 反向 转运体的 活性， 使大 量的n a 价 进入 液泡， 降 低其在胞质内 的 积累 浓度 d l o 因 此， 通过s o s 信号转导途径可以 调 节细胞内k , n a , 等离 子平衡， 对于细 胞在盐胁 6 可索 大 学 二 二 平 华 四 用 s 颐 d 二 研 究 生 学 位 七 仑 文 迫环境 卜 维持胞内各离子的止常浓度及细胞的正常代谢水平至关重要。 娜如 n s 4 v-汀p 翻 分 e 、 t r ans c o 网c n a l s p u s i t r a n s e d 州 肠a l g e n e r e w a s 妞 知 k * 图1 - l : s o s 信号转导 途径及其调控图 f ig . i - l : s o s s ig n a l t r a n s d u c t io n p a t h w a y a n d it s r e g u la t i o n ( a n n u . r e v . p l a n t b i o l . 2 0 0 2 . 5 3 : 2 4 7 - 7 3 h a n - k a n g z h u ) 1 . 5 k 的吸收与s o s 途径 k i 是植物营养的二大要素之一。也是植物体内 含量最丰富的阳离子。它是高等植物生长 发育所必需的唯一的一价阳离子， 在植物生命活动中具有许多重要的生理功能，如酶的激活、 蛋白 质的合成、叶片运动和渗透调节等。植物吸收k + 的主要机制之一是通过其根细胞质膜上 的内向k+通道进行的， k 的跨膜传递与植物生长发育过程如萌发、叶运动、气孔运动、 根系 s 可育 大 掌 二 二 平 平 四月 刁 翅d 卜 布 开 究 生 学 t a 七 七 文 中的离子吸收、韧皮部运输和养分贮存等都密切相关n 1 e p s t e in 等 11 4 1提 出 植 物 根 系 对k + 的 吸 收 至 少 存 在 两 种 机 制 : 机 制i ， 高 亲 和 性k 吸 收 机 制: 机制11 ， 低亲 和性k 吸收 机制。 当 根部 k ) “降至。 .0 0 2 m m o u l 时， 植物还有明 显的k+ 吸收，即当 根部 k l + 在 p m o v l 水平时， k 的 摄入由k + / i i + 同向 转运体负责，称为 机制i ; 而当 根部k .超过1 m m o u l 时， 机制11 才发生作用，由 离子通道 ( 如，内向k j i 道) 介 导 离子转运 ( 被动运输) ， 称为机制ii a 细胞质是细胞生化反应最频繁的地方，需要保持稳态离子内 环境。如蛋白 质合成大约需 要1 0 01 5 0 m m o l几的 胞内k ，当 胞内k 十 浓度发生变化时， 就会影响以k 为 激活剂的 蛋白 质 合成，从而降低生长速率。另外胞内 大量的反应也都是由k *活的， 其中包括某些代谢过程 ( 如糖酵解中从磷酸烯醇式丙酮酸到丙酮酸的 过程) 和m r n a翻译的许多阶段都需要k 的 参 与2 6 1 k 营养吸收发生障碍可严重影响植物的生长状况、离子平衡状态和代谢水平等多方面的 生 理 。 最 近 研 究 发 现s o s l , s o s 2 , s o s 3 突 变 体 在则 k l e 。 和 低 c 内， . 的 培 养 基 上 都 表 现 出 k 缺 乏 症 状， 生 长 受 到 抑 制， 但是s o s 2 , s o s 3 突 变 体 的k 缺 乏 症 状 可以 被 外 源m m c a j . 缓解， 而不能恢复s o s l 的生长， 表明 该条转导途径与调节植物的k 营养吸收有关， 而且， o s l 基因的 缺失严重影响了k 的营养吸收， 导致不可逆转的k 缺乏。 s o s 2 . s o s 3 突变体的k 缺乏 症状可以 被外源c a t + 缓解， 表明c a t + 可影响 。 途径对k 吸收调 控， 可能 是通过通道 进入细 胞内 起作用的。 s o s 3 / a t h k t l 双 突 变 体 在n m k l 。 和 低 c a 2 ) - - 的 培 养 基 上生 长 状 况同 野 生 型 相同 ， 说 明 a th k t j 基因 也参与了k 营养吸收调 控， 可能 是通过控制某 些高亲 和k吸收转运体实 现的 2 4 1 也说明s o s 途径对a t h k t 1 具有调节作用。 1 . 6 n a 的跨膜流动与s o s 途径 n a 是造成盐胁迫的主要离子，正常细胞内也存在一定浓度的n a, 液泡膜上的n a ! h 十 反 转运体可以 转运 n a 进入到液泡内， 起调节细胞渗透压的作用， 过去的一些研究主要集中在 n a 的 渗 透调 节 转运系 统上 6 ) 。 最 近 对于n a 跨 膜 流动的 研究 有了 许多 新的 进展 6 .2 7 .2 8 ) 。 细 胞 外 高的n a 浓度可对细胞膜造成一定的 伤害， 影响矿质离子的吸收以致破坏细胞内的离子平衡状 态， 影响 一 些酶的 活性， 造成 细 胞 代谢 紊乱 2 9 1 。 对k+吸 收的 干 扰尤为显 著， n a 可以 通 过 对 河 甫 大 掌 二. 零 冬 四用 项 士 研 兜 生 学 亡 之 舍 仑 文 k 有很高的选择性的转运系统“ 渗漏” 进入细胞， n a 还是质膜内向k + 通道的竞争离子， 通过 内向k 十 通道进入细胞内，同时外向k i9 道也介导了n a 的 外流3 0 1 。 研究 表明细 胞内 的n a 稳 定 状态和植 物的 抗盐性密切 相关并且受 c a 2 的 调节 12 9 1 ， 正 常的 细胞代谢需要细胞内 具 有很高 的k / n a 比， 而在盐环境中 胞外n a 浓度要比 胞外k 浓度高的多， 所以n a 可以很有效的 和 k 竞争转运系统进入细胞，造成细胞内高n a i 低 k 的状态，使细胞内的一些正常代谢发生紊 乱 而对细胞 造成一定程度的 伤害。 外源c a 2 十 能 够提高k / n a 选择吸收比 率和k 在细胞内 的 积 累 浓 度， 使细胞内 维持高的k / n a 比， 保证细胞内 相关生 理活 动的 正常进行2 9 ,3 11 n a 的内 流是盐胁迫对细胞造成伤害的主要途径。 研究证明从小麦中提取的高亲和k 十 转运 体( h k t ) 和 低亲 和k 十 转 运体 l c t ) 可介 导n a 内 流 27 ,3 0 1 。 最 近， 从 拟南 芥当 中 提取的 高 亲和k 十 转运蛋白 ( a t h k t i 少 也 证明是一个n a + 内 流的 入口 3 2 ,2 3 1 . a t h k t i 是 拟南芥基因 家 族 中 唯一的 一 类蛋白， 而在水稻和按树中至少 含有两个同 系物。 起初认为a t h k t 1 是r转运蛋 白， 但通过在酵母 t r k l 和。 rk 2 两种缺k 突变体中表达a t h k t i 蛋白 发现并不能缓解其缺k 缺乏性 状反 而增加了 其盐 敏感性2 3 1 ， 后来以: o s 3 突变体为背景用t - d n a 插 入法敲除 掉a th k t i 基因( s o s 3 / a t h k t l 双突变体) 发现a t h k t i 基因的失活缓解了s o s 3 突变体的盐敏感性， 并且使 s o s 3 突 变体内 积累了 较 低浓 度的n a . 和 较高 浓 度的k + 2 4 ,2 1 。 这 些结 果 表明a t h k t i 介导了n a 的内 流而并不是高亲和 k 转运体，它可能是一个n a 内流转运体并起了 调节 k , n a 吸收系 统的 作用12 4 1 a t h k t j 突变可以 抑制s o s 3 突变体的盐敏感表型， 说明正常植株中s o s 3 蛋白 可能抑制了 a t h k t i 蛋白n a 内流转运体的活行。 l 7 立题依据 综上所述，分子遗传学的证据证明s o s信号转导途径可调节多个抗盐决定子。 尽管已 经 知道a t h k t i 可能是一个n a 内 流转运体并起了调节k , n a 吸收系统的作用， 并且野生型s o s 3 蛋自 可能抑制a t h k t i 蛋白n a 内 流转运体的 活性， a t h k t i 可能是s o s 途径的调节对象之一: 但是， 从电生理学角度， 仍然没有确切的证据说明s o s 3 调节细胞离子通道活性的 变化， 以 及 a t h k t i 在植物k 十 、 n a 吸收过程中所起的作用。同时， 盐胁迫下植物如何吸收k ， 以 及n a 通过什么途径进入细胞并导致伤害，也是值得探讨的问 题。 由于分子遗传学提供的研究材料，使我们能够更精确的研究这些调控体系的作用。本文 5 可育 大 p - - 辱 零 四 月 硕 气 卜笼 开 究 生 学 位 论 文 以 拟南芥根细胞原生质体为材料，首先建立离体细胞 k 电 流的膜片钳全细胞的记录方法， 在 此基础上，以盐超敏感突变体 s o s 3 / a t h k t l 、双突变体 s o s 3 / a t h k t l以及相应野生型 c o lg l l (s o s 3 /a t h k t 刀 为材 料， 利用膜片钳全细胞电 流 记录方法对这三种材料在盐 胁迫下根细 胞原生质体质膜内向k 通道电流的变化进行了 研究，在电生理方面给出了a t h k t i 蛋白介导 n a 内流并受s o s 3 抑制调节的直接证据，对于更深一步了解植物的抗盐机制有重要意义。 一2 - 5 可甫 目 愧 侧 卜 二 翻 卜 月 卜 四 月 a 吐 创 七 振 开 究 a 匕 翅 卜 s 之 论 3 晓 2 . 材料与方法 2 . 1材料培养 野生型拟南芥 ( a r a b i d o p s i s t h a l i a n o ) 种子经0 . 1 % 升汞表面消毒6 - - 7 m i n ，用无菌水冲洗 3 - 5 次，播种于ms固体培养基上，用封口膜封好，在4 下春化2 - 3 天后，置于光照充足的 培养室中。生长条件为:光/ 暗周期 1 6 / 8 小时，温度 1 8 - 2 3 c ，相对湿度 8 0 %左右，光照强度 9 0 p m o l -m 2 - s i ， 生 长 期 间 无 任 何 胁 迫 。 2 .2实验溶液 ( 1 ) 基本溶液: 1 0 m m o l/ l 谷氨酸钾、 5 m m o l/ l m e s , 1 m m o l/ l c a c 1 2 , 2 m m o l/ l m 9 c 12 , p h 5 .5 , 用 甘露 醇调 渗透浓 度为3 4 0 m o s m o l魂 一 。 ( 2 ) 酶液: 1 . 5 % 纤维素 酶( c e ll u l a s e c - 1 7 9 4 ) , 0 . 1 % 果 胶酶 ( p e c t o ly a s e y 2 3 ) , 0 . 1 % b s a 溶于 基本溶液中， p h 5 .0 a ( 3 ) 细胞内 液: 1 0 0 m m o l/ l 谷氨酸钾、 0 . 1 m m o l / l c a c l 2 , 1 . 1 m m o l/ l e g t a . 2 m m o l/ l m g c i2 , 1 0 m m o l/ l h e p e s , 2 m m o l几 a t p - m g , p h 7 .2 ， 用 甘 露 醇 调 渗 透 浓 度 为3 8 0 m o s m o l -k g . ( 4 ) 细胞外液: 1 0 m m o l/ l 谷氨酸钾、 5 m m o l/ l m e s , 1 m m o l/ l c a c 12 , 4 m m o l/ l m g c l2 , p h 5 .5 , 用 甘 露 醇 调 渗 透 浓 度 为3 6 0 m o s m o 卜 k 9 1 , 2 . 3不同浓度的n a c l 处理 用电 子天 平 称取 不同 拟南 芥突 变 体 种 子 各5 0 0 粒 左 右( l m g 大 约5 0 粒) ， 种 植 方 法 如 前 所述，先全部分别种植在 ms培养基上，用封口膜封好，在4 下春化2 - 3 d 后，置于光照充 足的 培养室培养， 4天后一起转移到n a c l 梯度培养基上， 7 天后求各个培养皿中不同突变体 的根长平均值及平行实验中的方差，比较在不同n a c l 浓度培养基上根的生长情况。 2 . 4根细胞原生质体的制备 参 见 于 川 江 等 13 3 1f 11 m a a t h u is 等 3 4 1 的 方 法 。 取 生 长 三 周 的 拟 南 芥 幼 根， 剪 成2 m m 左 右 的 根段， 置于分离酶液中， 温度2 9 土1 0c ， 在 转速为5 0 - 6 0 r p m的 水浴摇床上酶解约3 0 m in s , 然后 用2 2 0 lt m的 尼龙网 过滤至基本溶液中， 漂洗后， 在5 5 0 , 6 0 0 r p m的条件下， 离心7 m in s , 去上清液， 再用基本溶液洗涤、 离心2 - 3 次 后， 最后弃去 上清， 用2 0 0川基本溶液 将沉 淀的 根细胞原生质体 悬浮， 4 下保存备用。 ( 注: 所有 溶液在使用前都要用孔径为。 .4 5 g m的 微孔 滤膜过滤) - 1 3 弓 可州 片j 月 卜 二 二月 卜月 卜四 月 不 班d 匕笼 开兜 生 学 t 之勺 仑文 2 .5膜片 钳实验 实验采用全细胞记录技术: 在4 m l 左右的 绝缘小 培养皿中 加入2 m l 细胞外液， 吸取1 0 川 左右拟南芥根细胞原生质悬浮液，加入小培养皿后， 置于倒置显微镜 ( n i k o n - t e 3 0 0 ) 下， 静 置一段时间，使原生质体稳固的沉于培养皿底部，选择胞质清晰、细胞膜厚实圆滑的原生质 体用于记录。玻璃微电极使用硬质有芯细玻璃毛细管，在拉制仪 ( p c - 1 0 ; n a r i s h ig e ) 上用两 步 法 拉 制 微电 极 并在 抛光仪 (