（动物学专业论文）直翅目昆虫的线粒体谱系基因组学研究.pdf

直翅目昆虫的线粒体谱系基因组学研究 钱召强 摘要：直翅目属于节肢动物门、六足总纲、昆虫纲，是一类较常见的昆虫， 包括蝗虫、蟋蟀、螽蜥、蝼蛄等昆虫，已知有2 0 0 0 0 种以上，广泛分布于世界各 地，以热带地区种类较多。目前针对直翅目的系统发育关系尚未形成统一的系统。 本研究采用了基于长p c r 的二次p c r 策略，采用p c r 直接测序和克隆测序 相结合的方法，对螽蜥总科的两种昆虫中华螽蜥和长瓣草螽的线粒体基因组部分 序列进行测定和组装，并进行了注释。通过联合g e n b a n k 收录的9 种己测昆虫的 线粒体基因组数据和本实验室2 种已测的直翅目昆虫中华稻蝗和优雅姻螽，采用 谱系基因组学研究方法，对直翅目昆虫系统发育关系进行了研究。主要结论如下： 1 、所测得的两种直翅目昆虫的线粒体基因组长度分别为中华螽蜥1 4 9 7 4 b p ， 长瓣草螽1 4 5 9 1 b p 。中华螽嘶的所测线粒体部分包括1 3 种蛋白质基因、2 1 种t r n a 基因( 未测出t r n a ) 、2 种r r n a 基因。长瓣草螽的所测线粒体部分包括1 3 种 蛋白质基因、1 9 种t r n a 基因( 未测出t r n a n 。、t r n a m a 、t r n a 锄) 、2 种r r n a 基因。两种螽蜘的控制区都未能成功扩增。 2 、所测两种螽嘶的线粒体基因在基因顺序上与东方蝼蛄一致，即t r n a l y 9 3 和t r n a a s p ( d ) 基因排序为k d ，而与飞蝗不同。中华螽蜥线粒体基因在1 6 对基因之 间存在总长度达8 8 b p 的重叠，基因问的间隔区长达2 9 6 b p 。长瓣草螽在1 5 对基因 之间存在总长度达1 2 8 b p 的重叠，t r n a o l y 几乎全部位于c o i i i 基因内部，基因间 有3 8 b p 的序列间隔区。 3 、中华螽蜥和长瓣草螽线粒体基因组的蛋白编码基因、r r n a 基因和t r n a 基因均存在很强的碱基a 汀含量偏向性，最高的两个基因为t r n a g h 和t r n a 4 单。 蛋白质基因序列的a + t 含量在密码予的1 、2 、3 位及整体水平都具有明显的a + t 碱基偏向性，这与线粒体基因组具有高a + t 偏向性的特征是一致的；蛋白质编码 基因的a + t 含量在第3 位密码子处都是最高的，这线粒体具有g c - - ，a t 突变压， 以及密码子第3 位点存在的高变异率规律是十分相符的。 4 、中华螽蜥和长瓣草螽的1 3 种蛋白质基因都使用a t n 作为起始密码子，除 n d 5 基因以单独的t 作为终止密码子外，其余的蛋白质编码基因都以完整的三联 密码子，i a a 或t a g 作为终止密码子。蛋白质基因的氨基酸组成中l e u 、s c r 、h e 、 p h e 的含量很高。 5 、除t r n a s c l ( a 6 l q ) 缺失了d 臂外，其余的t r n a 基因二级结构都可以折叠成 典型的三叶草结构，反密码子和多数六足动物一致，多为g n n 或u n n 。反密码 子环和氨基酸接受臂非常保守，其它臂环的变异较大。在t r n a 二级结构的4 个臂 上均存在不同程度的碱基错配，错配类型多为g u 配对。2 个r r n a 基因较保守。 6 、对1 3 种昆虫线粒体的蛋白质编码基因( p c g ) 数据集、蛋白质数据集、t r n a 数据集，应用谱系基因组学方法进行直翅目昆虫系统发育研究表明，蝗亚目具有 单系性，本研究所选用的数据对直翅目的系统发育关系缺乏足够解析力，在排除 长枝吸引的影响后，只有部分数据能确定直翅目的单系性。而目前大多数学者认 为直翅目是一个单系群，因此关于直翅目的单系性问题，有待于基于更多样本量 的线粒体基因组数据进行深入探讨。 关键词：线粒体基因组，谱系基因组学，系统发育，直翅目，中华螽蜥，长瓣草 螽 1 1 p h y l o g e n o m i cs t u d yo fo r t h o p t e r am i t o c h o n d r i o n o i a nz h a o q i a n g a b s t r a c t ：o r t h o p t e r ai so n eo ft h el a r g e s tf a m i l i e sa m o n gt h ei n s e c t aw i t hm o r et h a n 2 0 0 0 0d e s c r i b e ds p e c i e sw i d e l yd i s t r i b u t e dt h r o u g h o u tt h ew o r l de s p e c i a l l yi nt r o p i c a l z o n e ，s u c ha sl o c u s t ，c r i c k e t ，l o n g - h o m e dg r a s s h o p p e r , m o l ec r i c k e ta n ds oo n t h e c l a s s i f i c a t i o no fs p e c i e si no r t h o p t e r a nh a sb e e nc o n t r o v e r s i a la n dc o m p l i c a t e i nt h i s p a p e r w er e p o r tt h em i t o c h o n d r i a lg e n o m eo ft e t t i g o n i a c h i n e n s i $ a n d c o n o c e p h a l u sg 肠d m t u sd e t e r m i n d e db ys u b p c rm e t h o d , w h i c ha r er e p r e s e n t a t i v e i n s e c ti nt e t t i g o n i o i d e a p h y l o g e n o m i ca n a l y s i sa m o n g m i t o g e n o m e so f t c h i n e n s i sa n dc g l a d i a t u sa n do t h e ri n s e c to r d e r sw a sa c c o m p l i s h e d ，a n dt h eu t i l i t yo fm i t o g e n o m ef o r o r t h o p t e r a np h y l o g e n yc o n s t r u c t i o nw a sb r i e f l yd i s c u s s e d 1 t h ed e t e r m i n e dm i t o c h o n d r i a lg e n o m es e q u e c e so fzc h i n e n s i sa n dc g l a d i a t u $ a r e 1 4 ，9 7 4b pa n d1 4 ，5 9 1b pl o n gr e s p e c t i v e l y tc h i n e i sm i t g e n o m ee n c o d e s1 3p u t a t i v e p r o t e i n s ，2r r n a sa n d2 1t r n a s ( e x c l u d i n gt r n a i w h i l et h ecg 触a t u sm i t g e n o m e e n c o d e s1 3p u t a t i v ep r o t e i n s ，2r r n a sa n d1 9t r n a s ( e x c l u d i n gt r n a h e , t r n a m e t , t r n a g “) w i t h o u ta 斗t - r i c hr e g i o n 2 t h ea r r a n g e m e n to fm i t o c h o n d r i a lc o d i n gg e n e sm a t c h e sa l m o s tw i t ht h o s eo f g r y l l o t a l p ao r i e n t a l i s at o t a lo f8 8b po v e r l a pr e g i o n sa m o n gzc h m e 础m tg e n o m e s a r ef o u n di ns i x t e e nl o c a t i o n sw i t hat o t a lo f2 9 6 b po fi n t e r g e n i cs p a c e r cg l a d i a t u sh a s a1 2 8 b p - o v e r l a pr e g i o na n da3 8 b p i n t e r g e n i cs p a c c rw h i l et h et r n a o l a l m o s tl o c a t e d i nc o i i ie n t i r e l y 3 t h ea v e r a g ea + tc o n t e n to ft h ezc h i n e n s i sa n dc g l a d i a t u sm i t o c h o n d f i a lg e n o m e p r o t e i nc o d i n gs e q u e n c e r r n aa n dt r n ag e n ew a sc o r r e s p o n d i n gw e l lt ot h ea + tb i a s g e n e r a l l yo b s e r v e di ni n s e c tm i t o c h o n d r i a lg e n o m e s t h es t r o n g e s ta + t b i a s ei sf o u n d a tt h et r n a g | ”a n dt r n a a 即a n da tt h i r dc o d o np o s i t i o n sw h i c ha r eu n d e rt h el o w p u r i f y i n gs e l e c t i o n 4 c o m m o nm e ts t a r tc o d o n sc o u l db ea s s i g n e dt on i n ea n ds i xo ft h ep r o t e i n c o d i n gg e n e si nzc h i n e n s i sa n dc 咖扔觚m i t o g e n o m er e s p e c t i v e l y c o m m o ns t o p c o d o n s ( t a aa n dt a g ) c o u l db ea s s i g n e dt om o s to ft h ep u t a t i v ep r o t e i ns e q u e n c e s o n l yt h en d 5g e n e st e r m i n a t ei n t oas i n g l etr e s i d u e l c u c i n e ，i s o l e u c i n e ，s e r i n e ， p h e n y l a l a n i n e a r ea r et h em o s tf r e q u e n t l yu s e da m i n oa c i d si nt h em tp r o t e i n - c o d i n g m g e n e s 5 a i io ft r n a ss h o w e d t y p i c a lc l o v e rl e a fs e c o n d a r ys t r u c t u r e sa n dt h e i r a n t i c o d o n sa r es i m i l a rt ot h o s ef o u n di n o t h e rh e x a p o d aa n i m a l s t r n a sp o s s e s s i n v a r i a b l ea m i n o a c y ls t e m ，a n t i c o d o nl o o p ，a n da n t i c o d o ns t e m m o s to ft h es i z e v a r i a t i o na m o n gt r n a ss t e m m e df r o ml e n g t hv a r i a t i o ni nt h e 个掣ca n dd h u a i m s t h e g - u p a i ri sf o u n di na l lt h et r n ag e n e s t h et w or r n ag e n e sa l ec o n s e r v a t i v ei nz c h i n e n s i sa n dc g l a d i a t u s 6 p h y l o g e n o m i ea n a l y s i s o fm i t o c h o n d r i o nw e r ep e r f o r m e dw i t hm a x i m u m p a r s i m o n y , m a x i m u ml i k e l i h o o da n db a y e s i a ni n f e r e n c em e t h o d sw i t hp r o t e i n c o d i n g g e n e d a t a s e t ，p u t a t i v ep r o t e i nd a t as e ta n dt r n ag e n ed a t as e t c a e l i f e r ai s m o n o p h y l e t i ci n t h i ss t u d y e x c l u d i n gt h el o n g - b r n a c ha t t r a c t i o n ，am o n o p h y l yo ft h e a n c i e n ti n s e c to r d e ro r t h o p t e r aw a ss t i l ln o tr e c o v e r e d t h er e a s o nf o rt h el a c ko f s u p p o r tb yt h em i t o g e n o m es e q u e n c e si sn o to b v i o u s w h e t h e rt h ep a r a p h y l yo r m o n o p h y l yo ft h eo r t h o p t e r ac a n tb ec o n c l u d e di nt h ep a p e r t of u r t h e rr a v e lt h e p h y l o g e n e t i cr e l a t i o n s h i p so fo r t h o p t e r ai n s e c t s ，al a r g e rn u m b e ro fi n s e c to r d e r sa n d m i t o g e n o m ea r er e q u i r e d k e y w o r d ：m i t o c h o n d r i a ig e n o m e ，p h y l o g e n o m i c s ，p h y l o g e n y , o r t h o p t e r a , t e t t i g o n i a c h i n e n s i s ，c o n o c e p h a l u sg l a d i a t u s i v 学位论文独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是我在导师的指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。尽我所知，除文中已经注明引用的内容外，论文中不包含其他个人 已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得陕西师范大学或其它教育机构 的学位或证书而使用过的材料。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均 已在文中作了明确说明并表示谢意。 作者签名：日期：迦盗五商 学位论文使用授权声明 本人同意研究生在校攻读学位期间论文工作的知识产权单位属陕西师范大 学。本人保证毕业离校后，发表本论文或使用本论文成果时署名单位仍为陕西 师范大学学校有权保留学位论文并向国家主管部门或其它指定机构送交论文 的电子版和纸质版；有权将学位论文用于非赢利目的的少量复制并允许论文进 入学校图书馆、院系资料室被查阅；有权将学位论文的内容编入有关数据库进 行检索；有权将学位论文的标题和摘要汇编出版。 作者签名：日期：鲨z 生翻 1 基因组学 第一部分前言 基因组( g e n o m e ) 一词是1 9 2 0 年w i n k l e s 提出，从g e n e s 和c h r o m o s o m e s 组成的【l l ，用于描述生物的全部基因和染色体组成的概念。 基因组学( g e n o m i e s ) 是在1 9 8 6 年由美国科学家t h o m a s 和r o d e r i c k 提出的， 指对所有基因进行基因组作图( 包括遗传图谱、物理图谱、转录本图谱) ，核苷酸 序列分析，基因定位和基因功能分析的- - f 科学1 2 】。已发展成了一门生命科学的前 沿和热点领域。自1 9 9 5 年c r a i gv e n t e r 首次报道h a e m o p h i l u si n f l u e n z a e 的基因组 序列【3 】标志着生物学研究进入了基因组时代。到2 0 0 7 年5 月已经完成了3 9 种古 细菌、4 5 9 种真细菌和2 6 种真核生物的全部基因组测序工作，4 2 5 种生物基因组 的测序草图已经完成，正在进行5 2 2 种生物全基因组测序工作( 见 h t t p ：w w w n c b i n l m n i h g o v g e n o m e s s t a t i c g p s t a t h t m l ) 。 基因组研究包括两方面的内容：以全基因组测序为目标的结构基因组学 ( s t r u c t u r a lg e n o m i c s ) 和以基因功能鉴定为目标的功能基因组学( f u n c t i o n a l g e n o m i c s ) 。结构基因组学是基因组分析的早期阶段，主要任务是建立生物体高分 辨率遗传、物理和转录图谱，为以后揭示基因的功能奠定了基础1 4 j 。功能基因组学 是基因分析的新阶段，又称为“后基因组学( p o s t g e n o m i c s ) ”，利用结构基因组学 提供的信息系统地研究基因功能使得生物学研究从单一基因或蛋白质的研究转向 对多个基因或蛋白质同时进行系统的研究。研究包括基因功能发现、基因表达分 析及其突变检测，以高通量、大规模试验方法、统计与计算机分析为主要特征【5 1 。 1 9 9 0 年人类基因组计划( h u m a ng e n o m ep r o j e c t ，h g p ) 6 1 开始实施，并取得巨大 成就，同时模式生物基因组计划( m o d e lo r g a n i s mg e n o m ep f o j e c t ，m o g p ) 也在进行， 并先后完成了多种生物的序列分析，使得基因组学的研究重心从开始揭示生命的 所有遗传信息转移到从分子整体水平对功能的研究上。 2 谱系基因组学 重建生物类群的系统发育，追溯不同生物类群的起源及进化关系己经成为进 化生物学领域中一个十分重要的内容。化石是生物进化史唯一的直接证据，因而 早先的生物学家认为可以直接从化石记录获得不同生物的进化史 7 1 ，但是化石记录 往往零散且不完整，总是缺少很多必要的中间环节的化石。 随着研究技术的不断进步，系统发育学逐步由单纯的形态学研究转到应用分 子标记来研究生物的系统发育关系上来。由于许多生物的全基因组测序的陆续启 动和完成导致大量核酸和蛋白质序列的迅猛激增，对己获得的基因组序列的分析 技术成为研究中的一个关键因素。“谱系基因组学”i s , 9 l i t 是在这一背景下产生的。 作为进化生物学领域中一门崭新的交叉学科，谱系基因组学( p h y l o g e n o m i c s ) 概念最 早由e i s e nj a l 埘在1 9 9 8 年提出。 谱系基因组学是基因组学( g e n o m i c s ) 和系统发育学( p h y l o g e n e t i c s ) 相互交叉的 学科，是在基因组水平上大规模的系统发育分析1 1 0 l ，通过对生物基因组数据的全 面分析，重建生物的系统发育关系，演绎其进化历史。谱系基因组学还可以对未 被描述过的基因进行功能预测1 8 】。大量的基因组数据的大量信息将为重建生物间进 化关系提供海量分子性状，能够克服应用单个和多个分子标志进行系统发育分析 时的片面性，有望解决以往系统发育中存在的很多问题。已有的研究证明谱系基 因组学在解决一些生物进化的基本问题方面有巨大的潜力i l “。 谱系基因组学重建系统发育关系的方法主要有2 种：基于序列分析和基于全 基因组特征( 或称非序列分析方法) 。基于序列的方法是比较经典的研究方法，通 过对直源基因( o r t h o l o g o u sg e n e s ) 的序列比对，比较序列间差异，根据单基因或多 基因序列重建系统发育树。基于全基因组的方法不需要复杂的基因排序，而是直 接对同源基因或直源基因进行序列和含量比较，从而确定系统发育树。 ( 1 ) 、序列分析方法 通过比较原始序列，由序列比对来推断谱系关系，这种分析方法在目前使用 最广泛。在同源d n a 序列比对确定以后，通常采用以下办法进行系统发育重建： 1 ) 、基于联合比对的方法 多组比对后的序列数据合并为一组，然后在这一合并的序列数据基础上应用 标准的建树方法( 如最大简约法、最大似然法、距离法和贝叶斯法等) 构建系统 树。多组比对数据的合并有助于解决单基因在进行系统发育时信号位点不足，不 同世系间进化速率的差异，以及基因水平转移带来的影响等缺点。通常情况下这 种方法可以得到较好的分析结果，但存在着缺陷：必须在合并序列中包含一组相 同的物种，物种的前后排列次序必须完全一致；由于合并为一个数据集，因而只 能使用同一个进化模型对联合的序列数据进行分析，由于并非所有的基因有着相 同的历史，所以很多基因的进化模式发生改变。 2 ) 、基于多树的方法 由各个基因分别构建自身的系统发育树，然后将它们进行优化，合并成为一 个s u p e r t r e e ( 超树) 。 这两种方法目前在研究中已经得到了广泛的应用。其中基于联合比对的方法 2 是晟为常用的方法，也是本研究中采用的方法。 ( 2 ) 、非序列分析方法 谱系基因组学研究还可以使用基于基因含量( g e n tc o n t e n t ) ，基因顺序( g e n e o r d e r ) 等非比对的方法构建系统发育树。通常认为全基因组最能准确反映分类单元 的进化历史，全基因组水平数据集，对于特定类群的系统学研究和重建所有分类 单元的系统发育有重大意义。 1 ) 、基于基因含量的方法 关系较近的物种会含有大量共同的基因，关系较远的物种含有的共同基因较 少，因而基因含量与其亲缘关系相对应i m 。这种方法的关键问题就是确定基因间的 同源和直源关系以及将基因出现或缺失的数据如何转变成树结构。 2 ) 、基于基因顺序的方法 基因顺序方法将基因组之间断裂点数量最小化，或先挑选那些在基因组中很 保守的物理邻近蛋白对，然后对这些蛋白对的出现或缺失矩阵进行分析等。 以上两种方法基于大量信息进行同源基因的识别，提高准确性；不需进行序 列比对；研究中使用的数据是整个基因组信息，不涉及基因树和物种树；不易出 现趋同或回复突变等非同源相似，能够追溯古老类群的进化历史等。但是目前由 于缺乏数据和进化模型，以及较大的数据运算强度使它们在谱系基因组学中的应 用还受较大限制。另外，一些研究还表明这两种方法还不能很好的解决分歧度中 等的物种系统发育关系。由于这两种方法基于基因含量和顺序，因而很容易受到 基因丢失和水平基因转移的影响。 3 线粒体基因组学研究概况 3 1 线粒体介绍 1 8 9 0 年德国生物学家a l t a m a n r 在动物细胞中发现线粒体，认为可能是共生 于细胞内可以营独立生活的细菌，命名为生命小体( b i o b l a s t ) 。1 8 9 7 年b e n d a 重 复a l t a m a n r 的实验并将其命名为线粒体( m i t o c h o n d r i o n ) ，1 9 0 4 年m e v e s 在植物 细胞中也发现了线粒体，从而确认线粒体是普遍存在于真核生物所有细胞中的一 种重要细胞器。1 9 0 0 年lm i c h a e l i s 和j a n u sg r e e n 对线粒体进行染色，发现线粒 体具有氧化作用，1 9 1 2 年k i n g s b u r y 第一个提出线粒体是细胞内氧化还原反应的 场所。1 9 4 3 1 9 5 0 年，k i n g s b u r y 和l e l m i n g e r 进一步证明柠檬酸循环，氧化磷酸化 和脂肪酸氧化均发生在线粒体内。1 9 4 9 年e p h r u s s i 等在啤酒酵母中首次发现线粒 体具有其自身的基因组，即线粒体基因组( m t d n a ) 。线粒体具有环状d n a 及自身 转录r n a 与翻译蛋白质的体系，具有相对独立的遗传体系1 1 2 】。通常把线粒体称为 3 半自主性细胞器1 1 3 1 ，组成线粒体及完成线粒体生理功能所需的大多数蛋白质要依 赖核基因组来编码和翻译，并且核基因组通常调节线粒体基因组的转录、翻译等 过程。内共生学说( e n d o s y m b i o n tt h e o r y ) 是目i j 人们解释真核细胞中细胞器起源 的最普遍的假说l l “。 3 2 昆虫m t d n a 结构 昆虫m t d n a 通常为双链裸露的超螺旋共价闭合环状分子，在极个别生物中也 发现有线状线粒体基因组的存在【1 4 l 。昆虫的线粒体d n a 大小一般为1 5 4 1 6 3 k b l l 5 6 1 ，大小的差异主要是( a + d 丰富区长度差异造成的1 1 7 1 ，以高拷贝数目存 在于线粒体内【1 8 1 。一般包含1 3 个蛋白质编码基l 因( p r o t e i n c o d i n g g e n e ) ，2 2 个转运 r n a 基因( t r a n s f e rr n ag e n e ) ，两个核糖体基因( r i b o s o m a lr n ag e n e ) ，及1 个包含 复制起点的控制区r n t r o lr e g i o n ) ，称为a + t - r i c h 区，也称为d l o o p 区。1 3 个蛋 白质编码基因包括1 个细胞色素b 基因，2 个a t p 酶亚基基因( 6 和8 ) ，3 个细胞 色素氧化酶亚基基因( c o i ，c o i l ，c o n l ) ，7 个n a d p 还原酶复合体的亚单位基因 ( n d l 6 及n d 4 l ) 1 9 ，捌。根据碱性氯化艳梯度密度离心可将其两条链分为重链( h 链) 和轻链( i ，链) 。线粒体基因组中的大多数基因由h 链转录。线粒体的基因排 列非常紧凑，部分基因间会发生相互重叠，很多线粒体蛋白质基因含有不完整的t 或t a 终止密码子，通过转录后加工时补全终止密码子1 2 1 j ，碱基的使用节约、高效。 线粒体基因组的这种经济、结构紧密的特点是适应于细胞器快速复制的选择结果。 3 3 线粒体d n a 的进化 线粒体d n a 的结构特点使其具有独特的进化特点【翻。1 ) 紧密排列的线粒体 基因降低了基因重排的发生频率。2 ) 错误复制和不完善的修复加剧了突变速率。 3 ) m t d n a 的周转时间很短，在一定程度上增加了单位时间内突变及错误复制的 数目。4 ) 线粒体内具有较高浓度的内外源诱变剂，可能提高d n a 突变速率。5 ) 细胞中冗余的线粒体和较小的d n a 长度增加了对突变的固定速率。 m t d n a 的进化以碱基替换为主，插入和缺失较少，序列进化速率比核d n a 快，是核d n a 的5 1 0 倍【1 9 l ，无重组现象，但不同门的动物之间发生过基因重排， 门内各单元某些t r n a 基因有倒位和转位的变化。碱基替换形式以转换( t r a n s i t i o n ) 为主，主要发生在基因间隔区和控制区，不同部位替换速率不同，在控制区进化 速率最快，蛋白质和t r n a 次之，r r n a 基因最慢。 m t d n a 也存在一些限制因素影响了它的应用，主要包括线粒体异质性、多重 替换以及祖先多态性。虽然在一些动物中发现了异质性，但一般认为，异质性的 范围和程度不是很大，在目前的检测条件下不影响m t d n a 分析；多重替换会影响 快速进化的序列和远缘种类的分析；祖先多态性则对于新近形成物种的分析影响 4 较大。 3 4 六足动物全线粒体基因组测序现状 自人类线粒体基因组1 2 3 j 的全序列测定到2 0 0 7 年5 月，已有1 1 2 6 种生物的线 粒体基因组全序列被测定出来，还有一些动物的全线粒体基因组序列测定正在进 行中。后生动物己测序列有1 0 1 5 个，包括六足动物1 2 6 种，其中六足类动物共6 5 种( 表1 - 1 ) ，其中昆虫纲5 8 种。直翅目昆虫只有非洲飞蝗( l o c u s t am i g r a t o r i a m i g r a t o r i o i d e s ) t 2 4 】和东方蝼蛄( g r ) ，肋f 哟o r i e n t a l i s ) l z s l 两种全m t d n a 被测出。 表1 1 已测出的六足类动物全线粒体基因组统计 ( 参见h t t p ：w w w n c b i n l m n i h g o v g e n o m e s o r g a n e l l e s m i t o s t a t h t m l ) 分类地位物种序列长度g e n e b a n k 检索号 5 膜翅目h y m e n o p t e r a 虱日p h t h i r a p t e r a 直翅日o r t h o p t c r a 螳蝴m a n t o p h a s m a t o d e a 螳螂目m a n t o d e a 缨翅日t h y s a n o p t e r a 镇翅日p l e c o p t c r a 啮虫目p s o c o p t e r a 蜚蠛目b l a t t a r i a 硇炳日a r c h a c o g n a t h a 缨尾目t h y s a n u r a 双尾纲d i p l u r a 双尾目e n t o t r o p h i p h i l a e n u ss p u m a r i u s s c h i z a p h i sg r a m i n u m t e t r a l e u r o d e sa c a c i a e t r i a l e u r o d e sv a p o r a r i o r u m t r i a t o m ad i m i d i a t a a d o x o p h y e s h o n m a i a n t h e r a e a p e r n y i b o m b y xm a n d a r i n a b o m b y xm o r i c o r e a n ar a p h a e l i s o s t r i n i a f u r n a c a l i s o s t r i n i an u b i l a 如 a n o p l o p h o r ag l a b r i p e n n i s c r i o c e r i sd u o d e c i m p u n c t a t a p y r o c o e l i a , u f a t r i b o l i u mc a s f a n e l g e n a p i sm e l l i f e r al i g u s t i c a m e l i p o n ab i c o l o r v a n h o r n i ae u c n e m i d a r u m c a m p a n u l o t e sb i d e n t a t u s h e t e t o d o “m a c r o p u s g r y l l o t a l p ao r i e n t a l i s l o c u s t am i g r a t o r i a s c l e r o p h a s m a p a r e s i s e t t s e t a 月”l a n i c at a m o l a n a t h r i p s 胁咖括 p t e r o n a r c y s t r n c e p s l e p i d o p s o c i d a es p r s - 2 0 0 1 p a c h y p s y h av c n u s t a n e s o m a c h u i sa u s t r a l i c a p e t r o b i u sb r e v i a t y l i s t h e r m o b i ad o m e s t i c a t r i c h o l e p i d i o ng e r 捃c h i c a m p o d e a f f a g i l i s c a m p o d e al u b b o c k i 6 1 6 3 2 4 1 5 7 2 1 1 5 0 舯 1 8 4 1 4 1 7 0 1 9 1 5 6 8 0 1 5 5 7 5 1 5 9 2 8 1 5 “3 1 5 3 1 4 1 4 5 3 6 1 4 5 3 5 1 5 7 7 4 1 5 啪 1 7 7 3 9 1 5 鼯1 1 6 3 4 3 1 4 4 2 2 1 6 5 7 4 1 4 8 0 4 1 4 6 7 0 1 5 5 2 1 1 5 7 2 2 1 5 5 0 0 1 6 0 5 5 1 5 4 0 7 1 6 4 1 6 9 2 4 1 4 9 9 6 1 5 4 7 4 1 5 6 9 8 1 5 1 5 2 1 5 2 6 7 1 4 9 6 5 1 4 9 7 4 1 5 7 8 5 n c0 0 5 9 4 4 n c _ 0 0 6 1 5 8 n c0 0 6 2 9 2 n c0 0 6 2 8 0 n c _ 0 0 2 6 0 9 n c 一8 1 4 1 n c0 0 4 6 2 2 n c0 0 3 3 9 5 n c0 0 2 3 5 5 n c _ 一0 0 7 9 7 6 n c 3 3 6 8 n c0 0 3 3 6 7 n c _ 一8 2 2 1 n c _ 0 0 3 3 7 2 n c _ _ 0 0 3 9 7 0 n c _ 一3 0 8 l n c 1 5 6 6 n c _ 0 0 4 5 2 9 n c0 0 8 3 2 3 n c0 0 7 8 8 4 n c0 0 2 6 5 l n c0 0 6 6 7 8 n c0 0 1 7 1 2 n c0 0 7 7 0 1 n c0 0 7 7 0 2 n c0 0 4 3 7 1 n c0 0 6 1 3 3 n c0 0 4 8 1 6 n c _ _ 0 0 6 0 7 6 n c0 0 6 8 9 5 n c w 0 0 7 6 8 8 n c _ _ _ 0 0 6 0 s 0 n c0 0 5 4 3 7 n c0 0 8 2 3 3 n c0 0 8 2 3 4 n c 一0 0 7 2 1 4 缺尾纲e l l i p u r a 弹尾目c o l i e m b o l a g o m p h i o c e p h a l u sh o d g s o n i o n y c h i u r u s o r i e n t a l i s p o d u r aa q u a t i c a t e t r o d o n t o p h o r ab i e l a n e n s i s 1 5 0 7 5 1 2 9 8 4 1 3 8 0 9 n c _ 0 0 5 4 3 8 n c0 0 6 0 7 4 n c0 0 6 0 7 5 n c 一0 0 2 7 3 5 4 线粒体基因组的研究方法 4 1 线粒体基因组的纯化 已有的动物m t d n a 提取方法有氯化铯密度梯度离心法、柱层析法、d n a s e 法 柱层析法、碱变性法、基于长p c r 的方法等。 4 1 1 氯化铯密度梯度离心法 氯化铯密度梯度离心法f 2 6 】就是以氯化铯为密度梯度介质进行离心，将线粒体 d n a 与其它组分分离开来。离心时，离轴心越远介质密度越大。此方法具有良好 的分辨能力，可以同时使样品中几个或全部组分分离，以前常用于线粒体的分离， 但需要高昂的设备，实验时间较长。 4 1 2 柱层析法 层析法l 卅是利用不同物质理化性质的差异而建立起来的技术。所有的层析系 统都由固定相和流动相组成。当待分离的混合物随溶媒( 流动相) 通过固定相时， 由于各组份的理化性质存在差异，各组分以不同程度分布在两相中，从而使各组 分以不同速度移动而达到分离的目的。柱层析法是利用各分子形状和大小不同， 在层析柱中的流速不同而将各组分分离。此方法操作简单，效果好，重复性高， 应用广泛，但需要高昂的设备，分辨率较低，实验时间较长。 4 1 3 d n a s e 法 该法在差速离心获得线粒体后，通过一定浓度的d n a s e 消化，有效地去除线 粒体表面附着的核d n a 。d n a s e 法能有效去除核d n a 污染，药品较贵，实验时 间较长。 4 1 4 碱变性法 碱变性法是在质粒快速提取法基础上建立的，在差速离心获得线粒体后， 通过碱变性，高盐溶液复性，分离环状的m t d n a 和线状的核d n a ，从而获得 m t d n a 。碱裂解法所需费用少，时间短，基本上能去除核d n a 污染，提取的m t d n a 可能有环状和开环两种结构。 4 1 5 基于长p c r 的方法 长p c r 技术专指扩增大于5 k b 的p c r 反应f 2 9 1 ，在线粒体基因组研究中得到了 广泛的应用。通过酚一氯仿抽提法、c t a b 法等将提纯含有核d n a 与m t d n a 7 的总d n a ，设计一对或几对的特异性长p c r 引物进行长p c r 扩增，从总d n a 中 特异性的扩增出长度为几k b 至全长的m t d n a 大片段。长p c r 方法不仅能保证得 到足够的线粒体全基因组数量，而且排除了核中线粒体假基因的干扰【3 “。 4 2 测序方法 d n a 测序方法在2 0 世纪7 0 年代中期，是在高分辨率变性聚丙烯酰胺凝胶电 泳( p a g e ) 技术的基础上建立起来的。目前d n a 测序主要有两种方法：双脱氧 链终止法【3 1 i ( s a n g e r 法) 和化学降解法【3 2 l ( m a x a m g i l b e r t 法) 。四色荧光标记双脱氧 核苷酸链终止法已经成为传统的手工测序及仪器自动测序最广泛使用的d n a 测序 方法。目前研究中使用的测序仪主要有a p p l i e db i o s y s t e mc o ( a b ic o ) 、b a c k m a n c o u l t e rc o 以及m o l e c u l a rd y n a m i c sc o 的产品，较广泛使用的测序试剂有a b i 公 司的b i gd y et e r m i n a t o r ( b d t ) 、b a c k m a n 公司的d y et e r m i n a t o rc y c l e s e q u e n c i n g ( d t c s ) 等。 4 3 线粒体基因组测序策略 目前已有6 5 种六足总纲动物的全线粒体基因组序列被测出( 表1 - 1 ) ，数量远 多于核基因组。由于线粒体长度在1 6 k b 左右，而全自动测序仪的单向有效测序长 度约5 0 0 8 0 0 b p ，所以需要将m t d n a 通过其分成测序有效长度范围内的短片段后 进行测序，最后再通过软件或手工组装为m t d n a 全序列。目前线粒体基因组的测 序策略主要有以下几种： 4 3 1 酶切建亚库 通过氯化铯密度梯度离心法分离得到m t d n a ，然后再用核酸限制性内切酶对 m t d n a 进行一次或两次的