（水生生物学专业论文）蛋白酶高产海洋酵母的筛选、发酵条件优化及酶性质的研究.pdf

蛋白酶高产海洋酵母的筛选、发酵条件优化 及酶性质研究 摘要 本研究从自然界中分离筛选出一株高产蛋白酶的海洋酵母h n 3 1 1 ，经鉴 定属于类酵母属短梗霉( a u r e o b a s i d i u mp u l l u l a n s ) 。对h n 3 1 1 发酵产酶条件 进行研究确定其最适产酶培养基组分为( ，w l v ) ：可溶性淀粉2 5 ，n a n 0 3 2 0 ， 起始p h 6 0 ；最适产酶培养条件是：2 5 0 m l 锥形瓶培养基装量为5 0 m l ， 1 0 0 ( v v ) 的接种量，2 4 条件下搅拌转速为1 5 0 r p m ，通气量为8 ，培养2 4 h 。在 最适产酶条件下，培养2 4 h 时菌株h n 3 1 l 发酵液中蛋白酶比活力可达到 6 2 3 1 u m l 。该蛋白酶是一种胞外酶，s e p h a d e xg 一1 0 0 凝胶过滤、c m s e p h a r o s e f a s tf l o w 阳离子交换层析对菌株h n 3 1 1 发酵液中的蛋白酶进行了分离提纯，获 得了s d s p a g e 呈单条带的蛋白酶，分子量为3 3 k d ，k m 和v m a x 分别为 06 5 4 m g m l 、2 5 6 4 p m o l m i n m l 。对该纯酶进行部分酶学性质的研究表明该蛋白 酶的最适作用温度和最适反应p h 分别为4 5 和1 0 ，酶比活力酶在p h 偏中性环 境中相对稳定，当p h 低于6 或者p h 高于1 0 时，酶的比活力基本等于零。温度 对蛋白酶比活力的影响较为明显，并且随着时间的延长，温度对蛋白酶的影响更 为明显，5 0 。c 以上保温3 0 m i n 后酶比活力基本完全丧失。金属离子m n ”对酶比 活力有明显地促进作用，o o l m m o l l 的m n ”能够使蛋白酶比活力提高至对照 组酶比活力的近两倍，1 0 m m o l l 的m n 2 + 可以使蛋白酶的比活力提高到原来的1 1 4 倍。m g ”、c a 2 + 、和n a + 对蛋白酶比活力的影响都不太明显，o 0 1 m m o l 1 的f e ”、 f e ”、z n 2 + 和c u 2 + 对蛋白酶比活力的影响不大，但是1 0 m m o l i 的f e 3 + 、f e ”、z n 2 + 4 和c u 2 + 对酶比活力具有明显的抑制作用，尤其是h g ”在浓度为n 0 1 m m o l l 或 者是1 0 m m o l l 时即可使酶基本完全失活。p m s f 、s d s 对蛋白酶比活力具有明显 的抑制作用，可使酶基本完全失活，由此可以看出，此蛋白酶是丝氨酸型蛋白酶。 关键词：海洋酵母碱性蛋白酶发酵最适培养条件纯化 a b s t r a c t as t r a i nh n 3l1w i t hh i g hp r o t e a s ea c t i v i t yw a si s o l a t e df r o ms e d i m e n t so fs a l t e r n n e a rq i n g d a o ，c h i n a i tw a si d e n t i f i e db e l o n gt ot h ea u r e o b a s i d i u mp u l l u l a n s t h e o p t i m a lc o m p o s i t i o n so f t h e m e d i u m f o r h n 3 1 1s t r a i n w e r es t u d i e da s f o l l o w s ( ， w v ) ：s o l u b l es t a r c h2 5 ，n a n 0 31 0 ，t h ei n i t i a lp h 6 0 t h eo p t i m a lp r o d u c i n g p r o t e a s ec o n d i t i o n sf o rh n 3 1 1w e r ei l l u s t r a t e db e l o w ：a m o u n to fi n o c u l a t i o n l 0 ( v v ) ，i n c u b a t i n gt e m p e r a t u r e2 4 。c ，s h a k i n gc u l t i v a t i o n1 5 0r p ma n da e r a t i o n 8 l m i n t h ep r o t e a s ea c t i v i t yo ff e r m e n t e db r o t hc o u l dr e a c h6 2 3 1 u m lw h e n h n 311w a si n c u b a t e du n d e rt h eo p t i m a lc u l t i v i t i o nc o n d i t i o n s t h ep r o t e a s eo ft h e s t r a i nw a sp u r i f i e db yg e lf i l t r a t i o n ( s e p h a d e xg 一10 0c o l u m ) a n di o n e x c h a n g e c h r o m a t o g r a p h y ( c m s e p h a r o s ef a s tf l o wc o l u m ) ，s d s p a g es h o w e das i n g l e b a n df o rt h ep u r i f i e dp r o t e a s ea n dt h em o l e c u l a rw e i g h tw a se s t i m a t e dt ob e3 3 k d ， k m = 06 5 4 m g m la n dv m a x = 2 56 4 n o l m i n m l 。t h eo p t i m a lt e m p e r a t u r ea n d p hf o rh y d r o l y s i so ft h ep r o t e a s ew e r e4 5 。ca n d1 0 ，r e s p e c t i v e l y t h ec h a n g e so f p ha n dt e m p e r a t u r eh a dt h es i g n i f i c a n ti n f l u e n c e so nt h ep r o t e a s ea c t i v i t y m n 2 + i o ne n h a n c e dt h ee n z y m ea c t i v i t ys i g n i f i c a n t l y 10 m m o l lo ro o l m m o l 1m 9 2 + 、 c a 2 、a n d n a + a n d0 0 1 m m 0 1 1f e 3 + 、f e 2 + 、z n 2 + a n d c u 2 + c a n n o te f f e c t t h e p r o t e a s e a c t i v i t v w h e r e a s l o m m o l 1f e 3 + 、f e 2 + 、z n 2 + a n d c u 2 + i n h i b i t e d t h ee n z y m ea c t i v i t y t h ee n z y m es h o w e da c t i v i t yf o rh y d r o l y s i so f p r o t e i n p m s f 、s d sc a ni n h i b i tt h e e n z y m ea c t i v i t yo b v i o u s l y ，t h ee a z y m ew a st h es e r i n ep r o t e a s ew h i c hc a ns e e n f r o ma b o v e k e yw o r d s ：m a r i n ey e a s t s ；a l k a l i n ep r o t e a s e ；f e r m e n t a t i o n ；o p t i m a l c o n d i t i o n s 蛋白酶高产海洋酵母的筛选、发酵条件优化及酶性质研究 第一章综述 蛋白酶是作用于蛋白质或多肽，催化肽键水解的酶。其中水解蛋白的最适 p h 在碱性范围内( p h7 0 1 1 0 ) 的蛋白酶称为碱性蛋白酶。近年来，碱性蛋白 酶作为工业催化剂得到广泛使用，它们与传统的化学催化剂相比，具有催化能力 强，底物专一性高等优点，已应用于酿造、肉类加工，制革，废弃物的水解利用 及乳制品生产等行业( a u u u s t r u pk ，1 9 8 0 ) 。尤其是作为无磷洗衣粉的添加剂使用， 己使碱性蛋白酶商业制剂的销售占整个蛋白酶市场的1 3 以上。 此外，蛋白酶存在于所有生活有机体中，因此可以从动物、植物、微生物 中获得蛋白酶。但目前工业用酶主要来源于微生物，这是因为：微生物生长快， 适于大量陕速培养。培养基成本低。可选用作为工业生产蛋白酶的微生物种 类很多，同时可用遗传操作手段将其改良。微生物生产的蛋白酶大多是胞外酶， 易于提取( 黄文涛，t 9 8 9 ) 。但是目前应用于工业用途的主要碱性蛋白酶产生菌 是芽孢杆菌属。 这些酶的作用一般需要在特定的p h 值和温度下，然而我们所了解认识的这 些酶，还不够满足我们在工业化时代的需要。因此，我们需要不断进行新的微生 警 物来源的探索，在特殊环境和极端环境下的微生物是碱性蛋白酶的一个重要来源 ( z a m o s te ta 1 ，1 9 9 l ：林影等，2 0 0 0 ) 。 1 1 生活环境 微生物大多在接近于自然p h 值的情况下生长良好。如果p h 值与自然情况 下差别很大，微生物数量就会降低。在土壤中发现碱性微生物大约占1 1 0 ，这 些微生物能够在极端p h 值下生长，是由于它们大多具有特殊的生理特性和新陈 代谢系统，或者通过改变生物膜的特性和能量转移的机制，以使自身能在这种极 端环境中生存( 胡学智等，1 9 9 3 ；徐恒平等，1 9 9 7 ) 。 碱性微生物广泛存在于自然环境下，有些自然界的碱性环境，如：碱性土壤、 湖泊和沙漠，还有很多碱性的海港( g r a n t ，1 9 8 6 ) ，其他包括较低碱性泉水、沙 漠土壤、森林土壤，这些环境中的p h 值一般在l o 左右或者更高。此外，我们 蛋白酶高产海洋酵母的筛选、发酵条件优化及酶性质研究 可以从食品的流出物、纺织品、罐头、马铃薯加工过程、纸张加工过程、碳酸钙 窑、清洁剂和其它工业体系中得到人工碱性环境。 1 2 分离和筛选 1 9 3 4 年v e d d e r 首次从动物粪便和人体中分离到嗜碱性微生物，简要地描述 了这种微生物并且命名为嗜碱芽孢杆菌( b a c i l l u sa l c a l o p h i l u s ) ，这株菌的发现证 明生命不仅可以忍受而且有些依赖于较高碱性环境。现在，这些嗜碱性的芽孢杆 菌具有相当大的经济价值，尤其可以应用于洗涤剂工业，也可以将碱性木糖酶应 用于纸浆生产中，将嗜碱环状糊精葡聚糖转移酶应用于从淀粉生产环状糊精过程 中。这种工业化应用促进了从自然和人工碱性环境中分离嗜碱微生物( h o r i k o s h i e ta 1 ，1 9 8 2 ) 。一般的花园土壤是分离这种微生物的重要来源，大概因为生物体自 身的活动可以使环境中出现暂时的碱性状态。 对于许多碱性环境中的微生物来说，其中最为重要和最引人注目的是它们能 调整环境中的酸碱度。它们或者可以提高培养基中的p h 值，或者使碱性培养基 的酸碱度降低，将培养基调节到适合菌体生长的p h 值，使这些碱性微生物细胞 内的p h 值总能够维持在7 - - 9 之间，总是比外界培养基中的p h 值低。研究发现， 它们通过生物膜特性和转移机制使渗透压保持平衡，不需要依赖体内的抗碱性酶 。二 的作用( k r u l w i c he ta 1 ，1 9 8 3 ) 。 1 3 富集和筛选 现在所知道的土壤中碱性微生物数目总体来说是非常低的，因此我们在筛选 之前富集这些嗜碱性微生物是非常必要的。 现在已经报道过的几种不同的培养基，其中包括营养琼脂培养基、葡萄糖一 酵母浸出粉一天冬氨酸( g y a ) 琼脂培养基、m y g p 琼脂培养基蛋白胨一酵母 浸出粉一葡萄糖培养基( p p y g ) ，和其他未命名的培养基，例如碱性酪蛋白琼脂 培养基、玉米粉琼脂培养基都可以用来富集和分离嗜碱微生物。人们通过改变不 同的培养基成分来选择性地分离筛选具有不同性质的微生物，例如那些具有产高 蛋白酶活力的菌株。 蛋白酶高产海洋酵母的筛选、发酵条件优化及酶性质研究 1 4 产碱性蛋白酶的微生物 分离所有产碱性蛋白酶的微生物的主要目的是把它们应用于工业生产中，大 量的芽孢杆菌属是主要的碱性蛋白酶产生菌。产生碱性蛋白酶的许多半知真菌如 d e n d r y p h i e l l a 属和s c o l e b a s i d i u m 属已经被广泛应用于洗涤剂工业中。 酵母菌中能产生碱性蛋白酶的包括：解脂假丝酵母菌( c a n d i d al i p o l y t i c a ) 和妇r r o w i al i p o l y t i c a 。放线茵中也有许多种可以产生碱性蛋白酶，如链霉菌属 ( s t r e p t o m y c e s ) 的许多菌株都能够产生碱性蛋白酶，它们包括s t r e p t o m y c e sr e c t u s v a r ：s t r e p t o m y c e sg r i s e u s ；s t r e p t o m y c e ss p ；s t r e p t o m y c e sm o d e r a t u sn r r l3 1 5 0 ； s t r e p t o m y c e ss p y s a 一1 3 0 ：s d i a s t a t i c u ss s l ：sc o r c h o r u s i is t 3 6 和s p a c t u md s m 4 0 5 3 0 。对于能够产生碱性蛋白酶的曲霉属( a s p e r g i l l u s ) 已经进行了广泛的研究。 其他种类的能产生碱性蛋白酶的放线菌包括：拟诺卡氏菌n o c a r d i o p s i s d a s s o n v i l l e i 和o e r d k o v i ax a n t h i n e o l y t i c ay k l 。 己经证明许多革兰氏阴性细菌如铜绿色假单胞菌( p s e u d o m o n a s a e r u g i n o s a ) ，嗜麦芽糖假单胞菌( p s e u d o m o n a sm a h o p h i l aj 、p s e u d o m o n a sb 4 5 、 嗜麦芽糖黄单胞菌( x a n t h o m o n a sm a h o p h i l a ) 和弧菌b r i om e t s c h n i k o v i ir h 5 3 0 己经证明是能够产生碱性蛋白酶。 许多不大常见的微生物也可以产生碱性蛋白酶， 如k u r t h i as p i r o f o r m e 是革 兰氏阴性菌，它与杆菌的亲缘关系较远，现研究发现它可以产生碱性蛋白酶。 而且，分离出的能够产生碱性蛋白酶的细菌与船蛆有共生关系，g r e n n e 报道 p s i l o t e r e d oh e a l d i 也可产生碱性蛋白酶( g r e e n ee ta 1 ，1 9 8 9 ) 。 嗜盐菌中已经证明可以产生碱性蛋白酶的包括嗜盐杆菌属( h a l o b a c t e r i u m ) 的h a l o b 口c t p r i “mh a l o b i u ma t c c4 3 2 1 4 和嗜盐单胞菌属的h a l o m o n a se s 一1 0 菌 株。嗜碱性细菌和嗜碱耐低温细菌是产生碱性蛋白酶的新资源( m a r g e s i nr ， 1 9 9 4 ) 。这些微生物既耐低温也可耐高碱性环境。m a r g e s i n 等人分离出的一种营 碱冷的细菌在较低温度下也能够产生较高的蛋白酶活性( m a r g e s i n ，1 9 9 2 ) 。常 见的能产生碱性蛋白酶的微生物见表l ( 张树政，1 9 9 9 ) 。 蛋白酶高产海洋酵母的筛选、发酵条件优化及酶性质研究 疑l l 碱性蠹自簿燕产藏撩 t a m 霸l q 蜘娃辫喇鼬i n 窑蛸隧矗船辩懈蝴e - h - - _ _ _ - _ 。_ _ _ - - _ _ ；_ _ - _ _ _ 。- _ _ w - _ _ _ - - _ _ - _ - - _ h - _ - - - - - _ _ _ _ _ _ _ - _ - - _ - _ _ - - - _ _ _ - - _ - _ _ - _ _ _ - 。- _ - _ - _ _ - _ _ - _ - _ _ _ - _ - _ 一 穗撵麓糠 糖攀扦蘑辫蒯蓟雾愆释鞠国g 激岱脑| 搿$ m 瓣 塌骧牲芽熬扦l 溅硪稿酾礴盎镶蠛霉藕( & 蔺激的 翻翅撼磁m 镕辅随魅嚣z f 妫 赞蹙镪蠢越漆崩舭瞬 艇枣棼麴徽胆蒯埘巍琶熊燃删融嚣 避袭簿辩降落辫船矗船畸脚鹚 毙奉藏鲫妇嘲盹镕 马镄惹姆藏：c 巍m m 鼢如神麓撩帮壤憾o i 钟 # s 自，疗 辍攒瑟臻释藏霸胛疵妇硎群哟 翱擐链格掩翻触懒劬删静妇蛹 麴糕棼穗群薅漆燃 嗜热措黼撇媾 稼魏j i 翻h 妨 枣簿强秘摄m d 鞠幽辫黼l 婚 岽盛l i 翻，哪哟 装獠撵( c 嘴轴黼辫髓 筵艟霸蕊算细嘲麓耪璃( 触磷簖”嚣) 蔷潘藏霉黼删 彀筚壤蘧睡跫娴两辨妊艰 獭盎蹲霉弛艘蟪尊嫡镰万燕萨锄渤韶) 萨菠秘攀搿华q 搿酶薅鼢瓣) 绷缓篓罄姆筛| 捌巅融趣划蛾啦 瓣赫鞲秘喇觚勰嚣嚣瞬慨删 蜂窳盛蒜翟学唧池m # 鼢啦 1 5 碱性蛋白酶的产生 几乎所有微生物所产生的碱性蛋白酶都是胞外酶，从生态角度来看这些微生 物可分为两类：一类在中性p h 能良好生长并能够产生碱性蛋白酶的微生物，例 如枯草杆菌、地衣芽孢杆菌及短小芽孢杆菌等等；另一类则是嗜碱微生物，它们 只在d h8 - - 1 0 环境中生长和产酶。微生物生长的培养环境必然是有利于酶产生 的条件，但是有利于酶产生的最佳培养条件和微生物细胞生长的最佳培养条件有 可能是不同的( m o o ne ta t ，1 9 9 1 ) 。在工业化生产碱性蛋白酶的过程中，通常采 用的培养基具有较高浓度的碳水化合物、蛋白质和其他营养成分( 1 0 0 一1 5 0 9 l ) 。 为了发展经济可行的技术，以后研究的方向重点在于：( 1 ) 提高碱性蛋白酶的产 量( 2 ) 优化发酵培养基和产酶条件。 1 6 提高产量 通过特殊培养基进行筛选也能够挑选出高产蛋白酶的微生物菌株( a i m s t r u p k ，1 9 7 4 ) 。然后通过采用诱变剂或抗生素的选择作用筛选高产突变株， 也可以 提高产量。s h a h 发现了地衣芽孢杆菌( 口1 i c h e n i f o r m i s ) 的半胱氨酸营养缺陷型 可以提高蛋白酶的产量。通过这个方法不仅很容易从野生型菌株分离出半胱氨酸 4 蛋白酶高产海洋酵母的筛选、发酵条件优化及酶性质研究 营养缺陷型，而且得到的突变株的碱性蛋白酶产量也可以提高。发现这种芽孢杆 菌营养缺陷型还可以抵抗如万古霉素和瑞斯托菌素等的作用( s t e e l ed be ta 1 ， 1 9 9 2 ) 。 蛋白质工程和大分子技术的发展，为我们从碱性微生物中筛选新型的酶类和 人工合成蛋白质提供了可能。微生物之间基因的转移重组，可以形成具有新特性 的高产突变株。这些技术的应用：街会提高蛋白酶的产量，有利于某些特定的经济 用途。 而且，运用蛋白质工程的方法使碱性蛋白酶活性进一步提高。现在，一般采 用了两种不同的方法得到蛋白质工程突变株：随机诱变和定点诱变。随机诱变会 产生各种各样突变株，但是这一方法的成功与否绝大部分取决于有效的筛选方 法，以确定突变株是否具有所需要的特性。定点突变依赖于对于编码有关产物的 基因序列和蛋白质结构的了解，以减少筛选可能突变株的数量，最后应该纯化有 关蛋白质并且逐个测定其是否能具有新的蛋白酶活性。为了得到较高的产蛋白酶 突变株，这两种方法通常是相互结合使用。经随机突变后确定有较高蛋白酶活力 ： 0 的突变株，可以通过正向定点突变进一步提高其蛋白酶活力。 ” 毒 ， 1 7 碱性蛋白酶的分类 目前，较为流行的分类方法是h a r t l e y 于1 9 6 0 年提出来的。根据蛋白酶活性 。 中心可将碱性蛋白酶分为丝氨酸蛋白酶和金属蛋白酶。 表1 2 蛋白酶的分类 ( 摘自酶制剂工业( 下册) ，张树政主编，1 9 8 4 ) 蛋白酶高产海洋酵母的筛选、发酵条件优化及酶性质研究 1 8 碱性蛋白酶的性质 碱性蛋白酶的分子量一般比中性蛋白酶小，多数在2 0 ，0 0 0 - - 3 4 ，0 0 0 d a ， 而等电点高( p h8 - 9 ) ，在碱性条件下( p h7 - 1 1 ) 有活性。在以酪蛋白为底物时 的最适p h 以9 5 1 0 5 为多，这类酶除水解肽键外，还具有水解酯键、酰胺键 和转酯及转肽能力。 多数微生物碱性蛋白酶不耐热，在5 0 - - 6 0 。c 2 热1 0 m i n - - 1 5 r a i n ，几乎一半 的酶活性将下降5 0 ，只有费氏链霉菌与立德链霉菌等的碱性蛋白酶( w e a v e r ， 1 9 7 6 ) ，经7 0 。c 处理3 0 分钟，酶活性仅损失1 0 - - 1 5 。费氏链霉菌碱性蛋白 酶即耐热又耐碱( 最适p h1 1 0 - - 1 1 5 ) ，不少链霉菌碱性蛋白酶即使在p h1 2 0 1 3 0 仍有活性。 表1 3 几种碱性蛋白酶的性质 ( 摘自酶制剂工业( 下册) ，张树政主编，1 9 8 4 ) 1 9 作用机制 碱性蛋白酶的主要作用是水解蛋白质，它可以按以下的方式进行水解： 切开蛋白质分子内部肽键一c 0 一n h 一，生成分子量较小的多肽类，被称为内 切酶。f 切开蛋白质或多肽分子氨基或羧基末端的肽键，而游离出氨基酸，被称为外切 酶。 蛋白酶高产海洋酵母的筛选、发酵条件优化及酶性质研究 水解蛋白质或多肽的脂键 水解蛋白质或多肽的脂键 n h c h c 0 一o r f r n h c h c o o r f r 1 1 0 碱性蛋白酶的结构与功能 1 1 0 1 酶的结构和活性中心 多数已知的微生物碱性蛋白酶都是丝氨酸酶，分子量较小，等电点较高。 除d f p 外，一般认为p m s f ( 对甲基磺酰氟) 和其他磺酰卤化物以及来自马铃 薯、大麦和大豆的蛋白酶抑制剂均可引起碱性蛋白酶失活( w h i c a k e r , 1 9 7 4 ) ，而 金属螯合剂如e d t a 能引起中性蛋白酶的失活，但不抑制碱性蛋白酶活性( 胡学 智，1 9 8 4 ) 。 1 1 0 2 底物专一性 微生物碱性蛋白酶具有强烈的酯酶活性，可水解甲苯磺酰替精氨酸甲醋 ( t a m e ) 和各种对硝基苯基酯，例如，苯酯基甘氨酸对硝基苯酯等，因此能够 以此作为底物，在有中性蛋白酶共存下精确的测定碱性蛋白酶( k e a y ，1 9 7 6 ) 。 枯草杆菌与糜蛋白酶一样，最佳的合成底物是乙酰基酪氨酸乙酯：a c t y r o e 【，它要求切开点的- n 是芳香族疏水性的氨基酸残基( 酪氨酸、苯丙氨酸等) 。 专一性强烈的受到切开点两侧的氨基酸残基，尤其是p - - p 。一氨基酸的影响，它 对酪蛋白的作用比对血红蛋白或牛血清蛋白更容易，在蛋白酶活性测定时需加注 意。 根据微生物碱性蛋白酶对切开点羧基侧的专一性，分为四群：类似于胰蛋 白酶的碱性蛋白酶，对碱性氨基酸例如精、赖氨酸残基有专一性。对芳香族或 疏水性氨基酸残基有专一性。例如枯草杆菌碱性蛋白酶。如粘细菌a 裂解型蛋 蛋白酶高产海洋酵母的筛选、发酵条件优化及酶性质研究 白酶，这是一种溶解细菌细胞壁的蛋白酶，对酸性残基有专一性，如葡萄球菌碱 性蛋白酶。这样根据底物专一性来进行分类更为合理。 1 1 l 碱性蛋白酶的分子生物学研究 国内外学者对碱性蛋白酶的基因工程研究作了大量的工作，取得了很多重要 的成果。m y r sj a c o b s 等对地衣芽孢杆菌( b a c i l l u sl i c h e n i f o t r o i s ) 碱性蛋白酶进行 了克隆、测序和表达研究( m y r s ，e ta 1 1 9 8 5 ) 。j a m e s 从枯草芽孢杆菌( b a c i l l u s s u b t i l i s i n ) 中克隆到了芽孢杆菌碱性蛋白酶的基因( j a m e se ta 1 ，1 9 8 3 ) 。我国在 这方面的技术研究进展很快，在碱性蛋白酶基因的克隆、表达等方面取得了许多 重大的成果。江盛梅等利用p u c l 8 质粒作载体，将嗜麦芽假单胞菌的碱性蛋白 酶基因克隆到e c o l i ( t g i ) 中，酶活是出发菌的3 4 倍( i 3 2 盛梅，1 9 9 3 ) 。赵 云德等对地衣芽孢杆菌2 7 0 9 中碱性蛋白酶进行了克隆和序列分析( 赵云德等， 1 9 9 3 ) 。 1 1 2 碱性蛋白酶的功能与应用 碱性蛋白酶是用途很广的酶制剂，蛋白酶已在工业和医药方面有广泛的应 用，是目前世界上产销量最大的一种商品酶( b a n e r j e e ，1 9 9 2 ) 。据估计，当前世 界工业用酶的市场价值约有2 5 亿美元，其中蛋白酶销售额占酶制剂总销售额的 6 0 。 1 1 2 1 清洁剂 不论从生理还是经济角度来说，碱性蛋白酶都是大部分清洁剂的添加剂中 的重要组成部分。他们在蛋白质水解过程中起到了不容替代的作用。在1 9 9 4 年， 酶工业产值大约可达4 0 千万美元，其中应用于清洁剂生产的酶的产值可达1 1 2 千万美元。在日本，1 9 9 4 年一年碱性蛋白酶的销售量估计在1 5 0 亿目元。有迹 象表明，对于碱性蛋白酶的应用呈上升趋势，因此到本世纪末工业化酶生产总值 有望达到7 亿美元或者更多( c h i e ta 1 ，2 0 0 3 ) 从家用洗衣粉到镜头和假牙清洁所使用的清洁剂范围内，蛋白酶是一种常见 蛋白酶高产海洋酵母的筛选、发酵条件优化及酶性质研究 的组分。洗衣粉的蛋白酶用量大约占整个市场的2 5 ( h a n se ta 1 ，2 0 0 0 ) 。1 9 1 3 年出现了第一个加酶制品“b u m u s ”，它由n a 2 c 0 3 和胰腺的粗提取物组成。1 9 5 6 年出现了第一个含有细菌酶的清洁剂，当时称为b i o - - 4 0 。1 9 6 0 年n o v o 公司 开发出a l c a l a s e ，它由地衣芽孢杆菌( b a c i l l u sl i c h e n i f o r m i s ) 产生，商品名为 b i o t e x 。清洁剂最大的市场是洗衣工业，估计每年需1 3 0 亿吨。理想的清洁用 蛋白酶在除去由食物、血和其他身体分泌物所产生的污渍方面应该具有广谱性。 清洁剂中使用的蛋白酶必须具有如下特性：在高p h 下具有活性并且稳定，与清 洁剂中的螯合剂和氧化剂相容。清洁用酶是否能发挥其最好效果，主要在于其等 电点的高低。众所周知，如果蛋白酶的等电点与清洁剂的d h 相同，那么此酶最 适合于在此种清洁剂中使用。 1 1 2 2 皮革工业 皮革处理包括浸泡、脱毛、洗涤、制革等几个工程。皮毛的主要成分为蛋白 类物质。传统的皮革处理法涉及诸如n a 2 s o 。等有毒化学物质，它们引起了污染 防治和污水处理的问题。已经证明用酶法替代化学方法，在提高皮革质量和减少 环境污染等方面的优越性。蛋白酶可选择性的水解非胶态的皮革组分，也可以去 除诸如白蛋白、球蛋白等非纤维蛋白。浸泡的目的是增加毛孔的体积，这一步骤 传统上是用碱处理。目前使用微生物碱性蛋白酶可以使水份吸收更快，减少浸泡 时间。 传统的脱毛、软化法是在极端碱性条件下用硫化物处理溶解毛根的蛋白质。 现在用加有c a ( o h ) 2 和n a c l 的碱性蛋白酶来处理脱毛可以减少废水的产生量。 早期洗涤法是动物尿作为蛋白酶的来源，这种方法气味难闻并且不可靠，后来用 乙酰代替了动物尿。现在用加有胰岛素的蛋白酶来洗涤，酶的用量大小依赖于所 处理的皮革的类型( 软或硬) 。脱毛和洗涤中酶的广泛使用不仅可以减少环境污 染，而且可以降低能源的消耗。n o v o 公司产生了三种蛋白酶a q u a d e r m 、n u e 和p y r a s e 分别用于浸泡、脱毛和洗涤。 1 1 2 3 食品工业 食品工业：蛋白酶的使用可以追溯到古代，那时在奶酪制作、面包制作、 蛋白酶高产海洋酵母的筛选、发酵条件优化及酶性质研究 水解大豆和肉类的软化方面蛋白酶已经常使用。 奶制品工业：奶制品工业中蛋白酶的主要应用是奶酪的制作，属于酸性天 门冬氨酸苯丙氨酸甲酯类蛋白酶，分子量为3 0 0 0 - - 4 0 0 0 0 d a 。在未断奶的小牛第 四胃的粘膜粗提物中发现有比胃蛋白酶活性高的多的凝乳酶。由于奶酪制品的需 求而导致的小牛胃粘膜的短缺，迫使人们寻求一种微生物牛奶凝结酶作为替代 品。微生物酶类也有两个缺点，即：( 1 ) 由于其非特异性和热稳定性，并且蛋白 酶的含量较高，因此奶酪经过一定时间的储存后就会有苦味；( 2 ) 产量较低。 正常的巴氏消毒法温度对酶的产量并无影响，并且酶中含有少量非特异性的 蛋白酶。在奶酪制作中酶的主要功能是水解肽键。凝乳酶由于其对酪蛋白的高度 特异性，在奶酪制作中可以发挥极好的效果。由于g r a s 产生的蛋白酶可以降 解诸如毛霉菌，枯草芽孢杆菌( b a c i l l u ss u b t i l i s ) 芹de n d o t h i ap a r a s i t i c a 等微生物， 因此代替了奶制品工业中使用的凝乳酶。 面包工业：面粉是面包制作过程的主要材料。它含有不溶解的谷蛋白，这 决定了面包的质量。由米曲霉( a s p e r g i l l u so r y z a e ) 产生的内切和外切蛋白酶可 以通过限制性降解来修饰小麦谷蛋白。酶处理的面团可以增加其韧性和机械强度 从而增加其应用范围。过量使用蛋白酶可以减少面团的混合时间和增加面包的产 量。使用细菌蛋白酶可以增加面团的筋骨和延展性。 豆制品工业：大豆由于其含有高质量的蛋白质而作为一种富含营养的食物。 很早以前蛋白酶就作为大豆酱和其他豆制品的一种配料。真菌来源的碱性和中性 蛋白酶在大豆酱制作中发挥着重要的作用。经蛋白水解后的大豆蛋白可提高其功 能。在p h 8 条件下用碱性蛋白酶处理大豆蛋白，其水解产物具有溶解度高、产 量高、苦味低的特点，水解产物也应用于添加蛋白质的软饮料和食疗食物中。 1 1 2 4 碱性蛋白酶在丝绸脱胶中的应用 生丝织物必须脱胶，去除外层丝胶才能具有柔软的手感和特有的丝呜现象。 丝胶是一种蛋白质，在桑蚕丝中含2 0 3 0 ，在柞蚕丝中含5 8 5 ，中间还夹杂着大 量尿酸钙。我国历来用碱皂法高温炼丝进行脱胶，缺点很多，碱质侵袭丝素，易 引起发毛影响光泽柞蚕丝则由于丝胶中含钙盐易生成钙皂，附于绸面难以去除， 致使成品手感粗糙，成品光泽黯淡，使用蛋自酶脱胶则可以克服上述缺点。 1 0 蛋白酶高产海洋酵母的筛选、发酵条件优化及酶性质研究 用蛋白酶脱胶的优点是：成品手感润滑柔软，光泽鲜艳，脱胶时间缩短，操作 温度降低，劳动生产率提高。 1 1 2 5 制药工业 蛋白酶的多样性和特异性使得它在寻找有效的治疗剂方面具有很大的优势。 梭菌胶原酶或枯草杆菌蛋白酶可以和广谱抗菌素复合使用来处理烧伤和碰伤。从 大肠杆菌分离的天冬酸胺酶可用来除去各种淋巴细胞白血病血液中的天冬酸胺 酸。c o n i d i o b o l u sr o r o n a t u s 产生的碱性蛋白酶可以取代动物细胞培养中所使用的 胰岛素。 1 1 2 6 碱性蛋白酶在其它方面的应用 废物处理：碱性蛋白酶提供了有潜力的处理各种食品工业、家庭生活废弃物 的方法，它可变废为宝，提供大量的鱼或家畜的饲料，如一种使用枯草杆菌碱性 蛋白酶处理家禽屠宰场废弃羽毛的方法，可使羽毛变为高蛋白质的饲料添加剂。 银的回收：在x 一射线胶片生物处理回收银中，碱性蛋白酶有应用的潜力， 使用过的x 射线胶片中含有15 一2 0 ( w w ) 的银，传统回收的方法是燃烧 这些胶片，这导致了环境污染，使用碱性蛋白酶处理，不仅可使银得到回收，同 时减少了污染。 基础研究：碱性蛋白酶对肽键断裂的选择性可以解释结构与功能、肽链的合 成以及蛋白质序列等方面的问题。 从本质上说，碱性蛋白酶水解作用的广泛性和特异性可以应用在食物、清洁 剂、皮革和制药等业中，同时也应用于说明蛋白质的结构。 1 1 3 本实验研究的目的和意义 目前，工业生产用的菌种主要是枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、淀粉液化芽 孢杆菌及地衣芽孢杆菌等。我国用于生产碱性蛋白酶的菌种主要有：地衣芽孢杆 菌2 7 0 9 及其突变株( c 1 2 1 3 ，a 5 7 ，3 3 2 6 ) ，短小芽孢杆菌2 8 9 和2 0 9 菌株，地衣芽 孢杆菌5 3 3 f 1 3 ，嗜碱性芽孢杆菌s m j p 等。 蛋白酶高产海洋酵母的筛选、发酵条件优化及酶性质研究 目前所知的酵母菌中能产生碱性蛋白酶主要是解脂假丝酵母菌( c a n d i d a l i p o l y t i c a ) ，这些产蛋白酶酵母菌菌株为陆地微生物。对于海洋酵母菌碱性蛋白 酶的研究现在还处于刚刚起步阶段，国外在这方面也研究非常少。海洋酵母作为 蛋白酶的一种新来源，逐渐被人们所重视。近几年，研究表明水产动物肠道内的 碱性蛋白酶可以有助于饲料中蛋白质的消化，而且肠道内碱性蛋白酶活力的不 同，决定了应该在复合饲料中添加哪种营养成分，并且能够反映水产动物的发育 情况。因此海洋生物肠道内的蛋白酶受到了越来越多人的关注。在饲料中添加一 定量的酵母类碱性蛋白酶可以有助于养殖动物的生长发育和对饲料中蛋白质的 利用。蛋白质水解产生生物活性肽具有多种功能，所以酵母菌产生的碱性蛋自酶 还可以用于水解各种海洋动物、藻类和微生物的蛋白质产生生物活性肽。 本文研究的目的是从海洋中广泛采集海洋酵母，以期从中找到一株产蛋白酶 活力较高的海洋酵母，并且对其进行优化，了解其酶学性质。 ( 1 ) 从青岛沿海近岸海水和海洋动物肠道内，及南海和南极海水及海泥样品 中，筛选一株初始产碱性蛋白酶活力高，易培养的海洋酵母菌株，进行菌种鉴定。 ( 2 ) 优化培养基组成，考查不同因素对产酶的影响，确定最适产酶的发酵培养 基和发酵培养条件，并且研究其发酵罐发酵条件。 ( 3 ) 对选育的菌株分泌的碱性蛋白酶进行分离纯化，确定分子量，研究其基本 酶学性质。 蛋白酶高产海洋酵母的筛选、发酵条件优化及酶性质研究 第二章产蛋白酶酵母茵的分离和筛选 碱性蛋白酶最早发现于猪胰脏中，1 9 1 3 年r h o m 首先将胰蛋白酶作为洗涤 浸泡剂使用( 王凡强等，2 0 0 0 ) ，后来dr j a g g ( 薛林贵等，1 9 9 7 ) ，h o r i k o s h i ( 徐 子渊等，1 9 8 4 ) 和a u r t s t r u p t a l 等相继报道了利用微生物生产碱性蛋白酶的研究。 碱性蛋白酶广泛用于洗涤剂、制革、丝绸等多种行业。特别是用于生产加酶洗涤 剂，帮助去除血渍、奶渍、汗渍等各种蛋白污垢( 冯清平等，1 9 9 6 ：郑铁昌，1 9 9 3 ： w r i g h ! e ta l ，1 9 6 9 ) 。 近年来对碱性蛋白酶的研究更加广泛，主要源于地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆 菌、短小芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌、及南极嗜冷芽孢杆菌等。有资料称，国外市 场上9 0 是加酶洗涤剂，国内1 9 9 0 年枯草杆菌蛋白酶产量约为1 3 万吨。鉴于 市场的需求，选育出酶产量高又有良好性能的碱性蛋白酶产生菌有着重要的应用 价值。 d o i 等早在6 0 年代就开始对酿酒酵母蛋白酶进行了研究，至今，国际上已 对酿酒酵母产生的蛋白酶a ，蛋白酶b ，梭肽酶y 和氨肽酶i 等多种蛋白酶在细 胞内存在的部位，生物学功能，酶学性质性质和基因结构等做了详细的研究。但 是对酿酒酵母以外的其他酵母的研究还很少报道。 海洋是个资源宝库，但是我们对于海洋微生物的了解却并不多，而且对于海 洋酵母产蛋白酶性质的研究更是匮乏。本研究通过合适的分离和筛选手段，从自 然界中获得一株高活力的产蛋白酶海洋酵母，以期为蛋白酶的研究和应用提供新 的来源。 2 1 实验材料 2 1 1 试剂 2 1 1 1 磷酸缓冲液( p h = 7 o ) o 2 m o u ln a z h p 0 4 ( 6 1 0 m l ) o 2 m o l ln a i l z p 0 4 ( 3 9 0 m l ) 2 1 1 2f o l i n 。酚试剂 蛋白酶高产海洋酵母的筛选、发酵条件优化及酶性质研究 于2 0 0 m l 磨口回流装置内加入钨酸钠( n a 2 w o a * 2 h 2 0 ) 1 0 0 9 ，钼酸钠 ( n a z m 0 4 * 2 h 2 0 ) 2 5 9 ，水7 0 0 m l ，8 5 ( v v ) 磷酸5 0 m l ，浓盐酸1 0 0 m l ， 微火回流1 0 h 后加入硫酸锂1 5 0 9 ，蒸馏水5 0 m l 和溴数滴摇匀。煮沸1 5 m i n ，以 驱逐残溴，溶液呈黄色。冷却后定容至1 0 0 0 m l ，过滤，至于棕色瓶，使用时稀 释两倍。 2 1 1 3 酪蛋白底物溶液 将2 9 的酪蛋白溶于少许的p h = 7 0 的磷酸缓冲液中，用1 nn a o h 溶液把p h 调到1 0 0 左右，8 0 。c 水浴溶解3 0 m i n ，冷却后，用1 nh c l 将p h 调至7 0 ，并用 缓冲液补足1 0 0 m l ，备用。 2 1 1 4 考马斯亮蓝g 2 5 0 1 0 0 r a g 考马斯亮蓝，溶于5 0 m l9 5 ( v v ) 乙醇中，加入1 0 0 m l 8 5 ( v v ) 磷酸，用蒸馏水稀释至1 0 0 0 m l ，滤纸过滤，最终试剂中含：o 0 1 ( w ，v ) 考马斯 亮蓝g 2 5 0 ，4 7 ( w v ) 乙醇；8 5 ( w ，v ) 磷酸 2 1 2 培养基 ( 1 ) y p d ：葡萄糖2 0 ( w v ) ，蛋白胨2 0 ( w ，v ) ，酵母粉1 0 ( w v ) ，海水 ( 2 ) 酪蛋白双层培养基：溶液a ：蛋白胨2 0 ( w v ) ，酵母粉o 6 ( w v ) ，琼脂 2 0 ( w v ) ，海水； 溶液b ：酪蛋白4 0 ( w v ) ； 溶液c ：琼脂4 0 ( w v ) 。 酪蛋白需在碱性条件下溶解，所以配制溶液b 时，及时滴加1 n n a o h 溶液， 使酪蛋白刚好全部溶解，1 2 1 灭菌，灭菌后，先混合b 和c 液，倒入平板形成 一薄层，再倒入a 液，双层平板。 2 2 实验方法 2 2 1 采样 蛋白酶高产海洋酵母的筛选、发酵条件优化及酶性质研究 利用2 0 0 4 年的南极考察，从南极、太平洋和中国南海的不同区域采集海水 样品以及海泥样品，并且从青岛沿海广泛采集海水及海泥，以及不同种类海水鱼 类的肠道和海藻作为样品。 2 2 2 海洋酵母的筛选 在不同区域采集的2 m l 的海水和2 9 的海泥，迅速加入到预先加入了o 0 5 ( w v ) 的氯霉素的2 0 m l 无菌y p d 培养基中，在室温环境培养5 d ，通过细胞记 数法得知其浓度，经过适当的稀释后，将经过无菌水稀释后的菌液涂布在含有 o 0 5 ( w ，v ) 氯霉素的y p d 平板上，2 0 一2 5 培养5 d ，挑选出不同的单菌落，并且 在平板上进行纯培养，然后对其单菌落，逐个镜检，检测出酵母菌。 2 2 3 产蛋白酶菌株的初筛 将筛选出的全部酵母菌在y p d 平板上划线分离，在2 8 。c 培养2 d 长出单菌 落，用牙签挑取单菌落点种在酪蛋白双层平板上，再培养3 d ，每天观察水解圈 情况，将能产生水解圈的所有菌株作为复筛的出发菌株。 2 2 4 产蛋白酶菌株的复筛 将复筛菌株分别挑取两环，接种到装有5 0 m l y p d 液体培养基的2 5 0 m l 三 角瓶中，2 8 ，1 8 0 r p m 振荡摇床培养2 4 h ，然后通过适当的稀释将5 m l 种子液 ( o d 6 0 0 h m = 29 2 ) ，接种到4 5 m l 的发酵培养基中，2 8 ，1 8 0 r m i n 振荡摇床培养 4 8 h ，最后取1 0 m l 培养液，再以5 0 0 0r p m 离心1 0r a i n ，离心收集上清液，进行酶 活测定。 2 2 5 蛋白酶比活力的测定 2 2 5 1