（植物学专业论文）拟南芥保卫细胞微丝骨架参与细胞外钙调素调控气孔运动的研究.pdf

中文摘要 已有的研究表明细胞外钙调素( c a m ) 存在于蚕豆保卫细胞质膜外侧并能促进气孔关闭， 抑制气孔开放。而微丝骨架参与了多种细胞外信号调控的气孔运动，但还不清楚是否参与以及 如何参与细胞外c a m 在保卫细胞的信号转导。本研究在表皮条生物学分析的基础上，主要利用 激光共聚焦显微技术，转基因技术研究了微丝骨架在细胞外c a m 调控气孔运动中的作用。 免疫印迹和免疫荧光定位结果表明拟南芥的保卫细胞壁存在c a m ：外源c a m 能够促进拟 南芥气孔关闭并抑制光照诱导的气孔开放 不过膜的大分子c a m 的拮抗剂w 7 a g a r o s e 和c a m 抗血清在无外源c a m 的情况下，均能抑制气孔的正常关闭，促进气孔的正常开放，说明内源细 胞外c a m 和外源c a m 一样，也是气孔运动的一个调节因子。 以表达g f p m t n 融合蛋白的转基因拟南芥为材料，利用激光共聚焦扫描技术研究了细胞外 c a m 对保卫细胞微丝骨架动态变化的调控作用。结果表明细胞外c a m 能诱导保卫细胞微丝骨架 的解聚，这种解聚作用是时间依赖的：而微丝骨架的拈抗剂细胞松驰素d ( c d ) 和稳定剂鬼笔环 肽( p h a l l o i d i n ) 分别能促进和抑制细胞外c a m 诱导的气孔关闭。因此推测微丝骨架的解聚参 与了细胞外c a m 诱导的气孔关闭，并是细胞外c a m 诱导气孔关闭所必需的。 细胞外c a m 能诱导保卫细胞【c a 2 + 】叩升高。当【c a ”】。y l 升高被抑制后，细胞外c a m 不能诱 导微丝骨架解聚和气孔关闭。这个结果表明细胞外c a m 可能通过诱导保卫细胞 c a 2 + 】。升高， 来促进微丝骨架的解聚，进而导致气孔关闭。 利用r t * p c r 的方法克隆了拟南芥微丝解聚因子a t a d f 2e d n a 的全长，经过原核表达得 到了a t a d f 2 的融合蛋白并制备了其抗体。w e s t c m 实验证实a t a d f 2 在各个营养组织中都有表 达，其中叶片中含量最高。免疫荧光定位结果表明a d f 2 存在于保卫细胞中。利用转基因技术 得到了a d f 2 的正义和反义表达的转基因植株。a d f 2 的过量表达促进了细胞外c a m 诱导的气 孔关闭，而抑制a d f 2 的表达则有相反的结果，但c d 的处理能消除这种抑制作用。这些结果 暗示植物体内a d f 2 的过量表达能够促进保卫细胞微丝骨架的解聚，从而促进了气孔对细胞外 c a m 的反应。 利用转基因技术获得了保卫细胞中a t p r o f i l i n l 大量表达的阳性植株，生物学分析表明 a t p r o f i l i n l 的过量表达促进了细胞外c a m 诱导的气孔关闭，c d 不能促进转基因植株气孔对 细胞外c a m 的反应，而p h a l l o i d i n 却能抑制这一过程。荧光标记保卫细胞中的微丝骨架，结 果表明a t p r o f i l i n l 的过量表达使得保卫细胞中的微丝骨架解聚。这些结果表明p r o f i l i n l 的 过量表达促进了保卫细胞微丝骨架，从而促进了气孔对细胞外c a m 的反应。 a t p r o f i l i n i 和a t a d f 2 的过量表达也促进气孔对光照，黑暗和a b a 的反应，说明在复杂 的保卫细胞信号转导中，多种细胞外信号的转导是相互交错的。 在本文研究中，我们发现细胞外c a m 是通过诱导保卫细胞微丝骨架的解聚来促进气孔关闭 的，转基因植株的实验结果进一步证实了这一发现。c a m 可能是通过诱导保卫细胞 c a 2 + k 升 高，激活p r o f i l i n l 促进f - a c t i n 的解聚，或者c a m 通过激活保卫细胞中的a d f 2 ，促进f - a c t i n 解聚。 关键词：拟南芥保卫细胞细胞外c a ma d fp r o f i l i n a b s t r a c t i th a sb e e nr e p o s e dt h a te x t r a c e l l u l a rc a mi o c a l i z ei ng u a r de e l lw a l l sa n dc o n t r o ls t o m a t a l m o v e m e n t si n1 4 c i a 扣b a a c t i nf i l a m e n t si si n v o l v e di nm a n ye x t r a c e l l u l a rs i n g n a lt r a n s d u c t i o n h o w e v e r , w h e t h e ra c t i n f i l a m e n t si n g u a r d c e i l s m e d i a t i n ge x t r a c e l l u l a rc a m - i n d u c e ds t o m a t a l m o v e m e n t sh a sn o tb e e ns t u d i e d b a s e do ne p i d e r m a ls t r i pb i o a s s a y , t h er o l eo fm i c r o f i l a m e n t si n e x t r a c e l l u l a rc a m - i n d u c e ds t o m a t a lm o v e m e n t sw a si n v e s t i g a t e d b y l a s e r s c a n n i n g e o n f o c a l m i c r o s c o p ya n d t r a n d s f o r m a t i o n t e c h n i q u e u s i n gl o w e re p i d e r m a lp e e l so f a r a b i d o p s i s ，c a mp r e s e n t i n gi ng u a r dc e l lw a l l sw a sf o u n db y p r o t e i ng e la n a l y s i sa n di m m u n o - f l u o r e s c e n c em i c r o s c o p yt e c h n i q u e b i o a s s a yr e s u l t ss u g g e s t e dt h a t e x t r a c e l l u l a rc a mp r o m o t e ds t o m a t a lc l o s u r ea n d d e l a y e d s t o m a t a l o p e n i n g c a ma n t a g o n i s t w 7 一a g a r o s e a n da n t i c a ms e n l n l ，w h i c ha r e m e m b r a n e - i m p e r m e a b l em a c r o m o l e c u l e s ，i n h i b i t e d s t o m a t a lc l o s u r ea n d p r o m o t e d s t o m a t a l o p e n i n g t h e s e r e s u l t si n d i c a t e dt h a t e n d o g e n o u s e x t r a c e l l u l a rc a mh a st h es a m ef u n c t i o na s e x o g e n o u sc a mi nr e g u l a t i n ga r a b i d o p s i ss t o m t a l m o v e m e n t s u s i n gc o n f o c a lm i c r o s c o p y , w es t u d i e dt h ee f f e c t so f e x t r a c e l l u l a rc a mo na c t i no r g a n i z a t i o ni n t h et r a n s g e n i cl i n e se x p r e s s i n gg f p m t n o u rr e s u l t sd e m o n s t r a t e dt h a te x t r a c e l l u l a rc a mi n d u c e d t h ea c t i n c y t o s k e l e t a ld e p l o y m e r i z a t i o n i na t i m e - d e p e n d e n tm a n n e r w es p e c u l a t e d t h a ta e t i n c y t o s k e l e t a ld e p l o y m e r i z a t i o nw a sn e c e s s a r yf o re x t r a c e l l u l a rc a m - i n d u c e ds t o m a t a lc l o s u r e t h e c o n c l u s i o nw a s s u p p o r t e db y t h er e s u l t st h a t c y t o c h a l a s i nd ( c d ) i n c r e a s e d e x t r a c e l l u l a r c a m - i n d u c e ds t o m a t a lc l o s u r ea n dp h a l l o i d i nh a dt h eo p p o s i t ee f f e c t f u r t h e re x p e r i m e n t si n d i c a t e dt h a te x t r a c e l l u l a rc a m t r i g g e r e da l li n c r e a s ei n 【c a 2 + 】c y t i f 【c a 2 t 】c ” i n c r e a s ew a sb l o c k e d ，e x t r a c e l i u l a rc a mi n d u c e d - a c t i nc y t o s k e l e t a ld i s r u p t i o na n ds t o m a t a lc l o s u r e w e r ei n h i b i t e d t h er e s u l t si n d i c a t e dt h a t c a 2 + 】c y | m i g h tb ea nu p s t r e a m r e g u l a t o ro f a c t i nf i l a m e n t s t h ew h o l es e q u e n c eo fa t a d f 2e d n aw a sc l o n e df r o ma r a b i d o p s i sb yr t - p c r a4 11 b p c o n s e r v a t i v ef r a g m e n tf r o mi tw a su s e dt oc o n s t r u c tt h ep r o k a r y o t i ce x p r e s s i o nv e c t o r , a n dt h ef u s e d p r o t e i nw a sp u r i f i e da n d u s e dt op r e p a r ea n t i s e r u ma g a i n s tr a b b i t w e s t e r nb l o ta n a l y s i ss h o w e dt h a t a t a d f 2 e x p r e s s e di na l lv e g e t m i v et i s s u e s ，a n dl e a f h a d t h eh i g h e s t e x p r e s s i o nl e v e l a t a d f 2e x i s t e d i ng u a r dc e l l sb yi m m u n o f l u o r e s c e n c em i c r o s c o p yt e c h n i q u e t h ew h o l e s e q u e n c eo f a t a d f 2 e d n a w e r eu s e dt oc o n s t r u c te u k a r y o t i c e x p r e s s i o nv e c t o ra n di n t r o d u c e di n t oa r a b i d o p s i s b i o a s s a y s h o w e dt h a to v e r e x p r e s s i o na t a d f 2a c c e l e r a t e ds t o m a t a lc l o s u r ei n d u e e db ye x t r a c e l l u l a rc a m i i c o n v e r s e l y , u n d e r e x p r e s s i o ni n h i b i t e ds t o m a t a lm o v e m e n t s a t p r o f i l i n li sa n o t h e ri m p o r t a n ta c t i n b i n d i n g p r o t e i n i t se u k a r y o t i ce x p r e s s i o nv e c t o r ( p b i l 2 1 - p r o f i l i n l ) w a sa l s ot r a n s f o r m e d i n t oa r a b i d o p s i s o u rb i o a s s a yr e s u l t sf r o m t r a n s g e n i el i n e s o fo v e r e x p r e s s i o na t p r o f i l i n li ng u a r dc e l l ss h o w e dt h a ta t p r o f i l i n lp r o m o t e de x t r a c e l l u l a r c a m i n d u c e ds t o m a t a lc l o s u r e c o n t r a s tt ow t t h i c ka c t i nc a b l e si ng u a r dc e l l so f t r a n s g e n i cl i n e s d i s a p p e a r e dn e a r l y t h e s er e s u l t s s u g g e s t e dt h a tp r o f i l l np r o m o t e ds t o m a t a lm o v e m e n t sb y p r o m o t i n g m i c r o f i l a m e n t sd e p o l y m e r i z a t i o na n d b e s i d e st h e s e ，s t o m a t ai nt r a n s g e n i cl i n e so fo v e r e x p r e s s i o na t a d f 2a n da t p r o f i l i n lw e r e s e n s i t i v et oa b a ，d a r k n e s sa n dl i g h t ，w h i c ha l er e g u l a t o r so f a c f i n c y t o s k e l a t a ls t r u c t u r ei ng u a r dc e i l s t h er e s u l t ss u g g e s t e dt h a tt h e r ew e r es o m ec o m m o n c o m p o n e n t s i ne x t r a c e l l u l a rs i g n a lt r a n s d u c t i o n i nc o n c l u s i o n ，w ep r o v i d e dt h ee v i d e n c e st h a ta e t i nc y t o s k e l e t a ld e p o l y m e r i z a t i o nw a si n v o l v e d i ne x t r a c e l l u l a rc a mi n d u c e ds t o m a t a lc l o s u r e 。r e s u i t s f r o m 仃a n s g e n i ci i n e s 鼬e rt e s t e dt h i s c o n c l u s i o n c a mi n c r e a s e dt h el e v e lo f 【c 矿k ，t h e ns t i m u l a t e da e t i n - b i n d i n gp r o t e i np r o f i l i n i ， f i n a l l y , t h ea c t i nc a b l e sw a sd i s r u p t e d o rc a m a c t i v a t e da t a d f 2i ng u a r dc e i l s ，t h e nd e p o l u m e r i z e a c t i nc a b l e s k e yw o r d s ：a r a b i d o p s i s ，g u a r dc e l l se x t r a c e l l u l a rc a m ，a d f , p r o f i l i n 1 i i 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业大学或其它教育机构的学位或证书 而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示了谢意。 研究生签名时间：年月日 关于论文使用授权的说明 本人完全了解中国农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留 送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复 制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、 传播学位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名时间：年月日 新编磁r帆护了年舌月r 乡日 英文缩写 a b a b s a c a m c d c a 2 + 。 d m s o d n a d n t p e b e d l a f c f i t c g p r o t e i n h ，d c f d a i p t 0 k a n l 砒- b l b m e s m o p s m s n b t o d p b s p c r p i p e s r t p c r r i f s d s s d s - p a g e s s c t e m e d x - g a l w 7 缩写词 英文名称 a b s c i s i ca c i d b o v i n es e r u ma l b u m i n c a l m o d u l i n c y t o c h a l a s i nd c y t o s o l i cf l e ec a l c i u mc o n c e n t r a t i o n d i m e t h y ls u l f o x i d e d e o x y r i b o n u c l e i ca c i d d e o x y n u c l e o t i d et r i p h o s p h a t e s ( u s u a l l y am i xo f d a t p ，d t t p ，d c t p d g t p ) e t h i d i u mb r o m i d e e t h y l e n e d i a m i n e t e t r a a c e t i ca c i d f u s i c o c c i n f l u o r e s c e i ni s o t h i o c y a n a t e g t p - b i n d i n gr e g u l a t o r yp r o t e i n 2 ，7 一d i c h l o r o f l u o r s c i nd i a c e t a t e i s o p r o p y l t h i o - 1 3 d - g a l a c t o p y r a n o s i d e k a n a m y e i n l a t r u n c u l i nb l u r i a - b e r t a n im e d i a 2 一n q m o r p h o l i n o ) e t h a n e s u l f o n i c a c i d 3 - n - m o r p h o l i n o - p r o p a n e s u l f o n i ca c i d m u r a s h i g e - s k o o g m e d i a n i t r ob l u et e t r a z o l i u mc h l o r i d e o p t i c a ld e n s t p h o s p h a t e b u f f e rs o l u t i o n p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n p i p e r a z i n e - n ，n - b i s - ( 2 - e t h a n e s u l f o n i ca c i d ) r e v e r s et r a n s c r i p t a s ep o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n r i f a m p i c i n s o d i u md o d e c y ls u l f a t e s d s p o l y a c r y l a m i d eg e le l e c t r o p h o r e s i s s t a n d a r ds a l i n ec i t r a t e n ，n ，n ，n - t e t m m e t h y le t h y l e n e d i a m i n e 5 - b r o m o - 4 - c h l o r o 一3 - i n d o l y l b d g a l a c t o s i d e n - f 6 a m i n o h e x y l ) - 5 一c h l o r o 1 n a p h a l e n es u l f o n a m i d e 第一章文献综述 第一章文献综述 1 1 微丝骨架在植物生理活动中的功能 生物体中的微丝骨架处在不断的聚合和解聚的动态变化中，这种动态变化使它参与了各种细 胞活动。在植物中，微丝骨架在细胞分裂，细胞伸长，细胞分化，细胞形态建成等生理过程都执 行着重要的功能( m e a g h e r 等，1 9 9 9 b ，2 0 0 0 ) 。最近又有大量的实验证实微丝骨架也是一个信号 传导物接受胞外刺激后，微丝骨架迅速重组，这种结构的变化会影响激活其他信号调节分子，并 募集这些信号分子到他们的作用位点( c a n t i e l l o 等，1 9 9 1 ：c a r r a w a y 等，1 9 9 5 ；l e e u w 等，1 9 9 5 ) 。 1 1 1 在细胞分裂中的功能 植物细胞骨架是细胞核和细胞质分裂的重要调节因子之一。核分裂后，在两个细胞核之间形 成细胞板，进而形成细胞壁，最后形成两个子细胞。其中细胞板对植物形态建成是至关重要的， 它的定位和形成是受细胞骨架调节的。在细胞分裂的早期，周质微管组装成环状微管束，微管束 间是平行的，这就是所谓的早前期带( p p b ) ，p p b 能确定成熟的细胞板融合成细胞壁的位置，微 丝骨架也出现在p p b 处，它的作用是使得p p b 形成一个窄的环。当纺锤体形成后，p p b 完全消失， 但它仍能在细胞周质处作为一个标志物，指导细胞板继续形成及进行融合形成细胞壁。当p p b 消 失后，微丝骨架仍然存在，使用微丝骨架的解聚剂导致细胞板定位的异常( m i n e y u k i 等，1 9 9 0 ； e l e f i h e r i o u 等，1 9 9 2 ) ，这表明微丝骨架在细胞板的定位中有重要功能。 1 1 2 在发育组织细胞扩张中的功能 经过细胞周期后，分化的植物细胞迅速扩张。植物细胞是从各个方向扩张的，但又优先沿轴 向以极化的方式进行扩张，这是有利于器官形成的。细胞骨架在极性生长中发挥着重要的作用。 纤维素微纤丝是由整合到质膜上的纤维素合成酶合成的。纤维素合成酶沿周质微管移动并以他们 为模板来定向细胞壁中的微纤丝。根据这一假说，微管骨架的定向排列决定了细胞的极性生长， 微管解聚剂导致细胞生长的去极化证实了这一推测。植物激素如a b a 。g a 通过微管的定向排列 而影响茎细胞的扩张，微丝解聚剂也能引起微纤丝沉积异常和极化生长，在不同类型的植物细胞 中也证实微丝骨架能调控微管骨架的重组( m e a g h e r 等，2 0 0 0 ) 。 1 1 3 在花粉荫发和花粉管伸长中的功能 花粉发育的各个关键阶段，包括细胞的极性建立，不对称有丝分裂及随后的发育过程等，微 丝骨架均发挥着重要的作用( z o n i a ，2 0 0 0 ；z o n i a 等，1 9 9 9 ) 。在花粉小孢子的不对称有丝分 裂中，微丝束的排列决定着细胞壁沉积的方向；在有丝分裂后的发育阶段，微丝束能使生殖 中国农业大学博士学位论文 细胞和营养细胞紧密相连，使二者以整体方式向花粉中央细胞靠近；成熟后的花粉在其萌发 孔处的质膜内侧有一个由微丝组成的片状结构，这决定了后来花粉萌发时花粉管伸出的位 置。 花粉管的直径约l o 2 0um ，但它却可伸长到几厘米，这种迅速的伸长就叫“顶端生长”，雄性 生殖细胞借助花粉管通过花柱进入到胚囊中并在此完成受精过程。目前人们对花粉管顶端生长机 制的了解还是很有限的，但有一点是很清楚的，就是这一过程是依赖于微丝骨架的，聚合态的微丝 骨架是花粉管进行顶端生长所必须的。 花粉管中沿纵轴方向分布着粗的微丝束，从末端到顶端，微丝束由粗变细，而在极端，成束的 微丝已大大减少且与质膜相连( m i l l e r 等，1 9 9 9 ) 。关于微丝骨架参与花粉管伸长的机制有不同的 解释。其中最为简单的一种解释是微丝骨架通过控制胞质环流，来控制顶端生长所需的囊泡运输 ( g e i t m a n n 等2 0 0 0 ) ，因此抑制肌动蛋白的聚合就会抑制囊泡向顶端运输，也就会抑制顶端生 长。另外一种解释是除了调控胞质环流外，聚合态的微丝本身可作为强力的“发电机”或作为顶 端胞质的组织者参与花粉管的伸长过程( v i d a l i 等，2 0 0 1 ) 。第一种解释认为顶端生长是与胞质 环流紧密相关的，任何一种微丝骨架抑制剂对两者的影响也应该是一致的。然而最近的研究表明 顶端生长与胞质环流并没有直接关联：v i d a l i 等( 2 0 0 1 ) 的研究结果表明p r o f i l i n ，d n a s ei ， l a t r u n c u l i nb ，c y t o c h a l a s i nd 等都能在很低的浓度下明显的抑制顶端生长，在此浓度下却对胞质 环流没有影响。这说明微丝参与花粉管顶端生长仅仅是通过诱导囊泡运输到顶端是值得重新考虑 的这一结果也表明聚合态微丝骨架的存在是花粉管伸长的主要原因，且一过程是与胞质环流独 立的。这一观点也得到了许多人实验结果的支持( g i b b o n 等，1 9 9 9 ；m i l l e r 等，1 9 9 9 ) 。受精过 程中若发生近交反应微丝骨架解聚，花粉管伸长停止。 1 1 4 在根毛伸长中的功能 根毛是高度延伸的垂直突出根表面的表皮细胞。根毛的主要功能就是从土壤中吸收水分和营 养物质。根毛的生长分为两个阶段：首先在分化着的根表皮细胞上形成一个突出的部分：然后这 个突出的部分延伸成根毛。最近研究表明根毛的延伸是依赖f - a c t i n 的，在微丝解聚剂的存在下， 突出部分仍能正常形成，但会抑制突出部分的延伸。根毛生长的行为与花粉管极为类似：有胞质 环流和c a 2 + 浓度梯度，微丝的解聚剂将抑制根毛的伸长( m i l l e r 等，1 9 9 9 ；s t a i g e r 等，1 9 9 4 ；v a l s t e r 等，1 9 9 7 ) 。在根毛中，胞质环流好似披逆转的喷泉，粗的沿纵向分布的微丝束穿过根毛液泡的 周质，并分出很多细的微丝束延伸至胞质更为浓密的靠近顶端的区域，此区域的微丝完全是纵向 分布的聚合的微丝，顶部的微丝束不仅可将小泡运输到小泡富集的区域，而且还能作为顶端小泡 分布的一个缓冲器和阻止其他器官进入顶端的一个筛子，根毛顶端生长需要一个最小量的成束的 微丝( d e r 叫t e r 等，1 9 9 9 ) 。 另外，在香毛簇的形态建成中，微丝骨架也有一定的功能。香毛簇即叶毛，分布在高等植物 的气生组织部位，推测其作用是有助于植物适应气候的变化或抑制病原菌的侵入。拟南芥的香毛 簇是包括一个茎的单细胞，它垂赢于叶表皮；茎的顶端有三个分支，关于微丝骨架在香毛簇形态 建成中的作用，最近的结果表明微丝骨架解聚，对香毛簇茎的形成没有影响，但却导致后期三个 2 第一章文献综述 分支形态的异常，表现为三个分支之间的角度变小，推测其原因可能是由于解聚态的微丝不能将 高尔基体分泌的小泡运输到胞吐作用位点，从而使得生长停止( m a t h u r 等，1 9 9 9 ；s z y m a n s k 等， 1 9 9 9 ) 。 1 1 5 在细胞伸长中的作用 植物细胞的伸长是依赖于聚合态微丝的。t h i m a n n 等( 1 9 9 2 ) 的研究表明用c d 处理使微丝 解聚后，燕麦胚芽鞘细胞的伸长降低了5 0 ，f a c t i n 将细胞的伸长和调节高等植物形态建成的刺 激联系起来，他们又同光敏素密切相关。例如胚芽鞘对生长素的反应和向重性在突变体“l q n y a n g ” 中消失，这种现象与c d 处理的结果是一致的( w a n g 等，1 9 9 8 ；w a l l e r 等，2 0 0 0 ) 。b a l u s k a 等( 2 0 0 1 ) 对细胞的伸长是依赖f - a c t i n 进行了详尽的研究：鉴于1 0 l x ml a t b 能迅速使玉米根细胞中的微丝 解聚，而拟南芥的根细胞直径仅为玉米的十分之一( o 1 m m ) 应该对l a t - b 更为敏感，实验结果 证实了作者的推测。拟南芥种子的萌发到胚后期的生长一直置于含l a t - b 的培养基中，结果幼苗 的形态建成是正常的，但幼苗表现出极为明显的矮状型，下胚轴和叶柄都比对照短，同时下胚轴 略微膨大，在黑暗中，子叶有一定的生长。以上表型与许多矮型的突变体的表型是相似的。l a t b 的处理使拟南芥表现出了明显的矮性状，主要是抑制细胞伸长的结果，经测定发现下胚轴细胞比 对照下降了8 0 ( s a l c h e r t 等，1 9 9 8 ；c h e n g 等，2 0 0 0 ) 。 关于植物细胞伸长是依赖于f a c t i n 的机制，人们做了如下推测：高尔基体囊泡的产生、运输， 及外排过程是依赖于f - a c t i n 的；另外，基于植物细胞中微丝骨架能调控离子通道的活性( h u a n g 等，2 0 0 0 ) ，拟南芥d e t 3 矮状突变体突变位点是一个编码液泡膜h + - a t p a s e 的基 ( s c h u m a c h e r 等。 1 9 9 9 ) ，f a c t i n 解聚剂c d ( m i l i e r 等，1 9 9 9 ) 和l a t - b ( b a l u s k a 等，2 0 0 0 ) 都能在外突阶段抑制根毛的 生成，目前人们已从与此具有相类似表型的拟南界突变体中克隆到了k 突变体基因。 1 ，1 6 在冷胁迫中的功能 植物能忍受高于冰点低温是因为内部发生了一些生理和生化的适应性变化，其中包括大量的 受冷诱导的基因的表达( t h o m a s h o w ，1 9 9 9 ) ，其中有一种基因被命名为b n l 5 。它是在芸苔n a p u s 中表达，与在拟南芥中表达的c o r l 5 是同功型的( t h o m h o w 。1 9 9 9 ) 。c o r l 5 基因编码一个叶绿 体的靶蛋i 刍( l i n 等，1 9 9 2 ) ，当它表达时，能够抑制冷导致的膜损伤( s t e p o n k u s 等，1 9 9 8 ) 。o r v a r 等( 2 0 0 0 ) 的研究表明微丝和微管骨架的重组是冷忍受过程所必需的。微丝的稳定剂j a s p t a k i n o l i d e ( j k ) 和微管的稳定剂t a x o l ( t a x ) 都抑制了冷诱导的b n l 5 基因的表达并导致细胞液从叶子中 的渗漏，因此d h i n d s a 研究小组推测微丝和微管稳定剂抑制了冷诱导的b n l 5 的表达，并由此而降 低了植物冷忍受能力。微丝的解聚剂l a t - b 及微管的解聚剂o r y z a l i n ( o r y ) 增加了2 5 c 下b n l 5 的表达，但奇怪的是并不能抑制此温度下胞液从叶子的渗漏，也就是并没有提高植物的冷忍受能 力( s a n g w a n 等，2 0 0 1 ) ，c d 对苜蓿的作用结果与上述结果是一致的( o r v a r 等。2 0 0 0 ) 。s a r i g w a n 等( 1 9 9 9 ) 推测其原因可能是微丝或微管的解聚剂持续存在抑制了微丝骨架的的重新聚合，而这 种重新聚合是冷忍受所必须的另一种模式。 中国农业大学博士学位论文 1 1 7 在向重力性中的功能 现有的研究表明微丝骨架在植物的根，花序和下胚轴的重力感知及传导机制中有着重要 的功能。植物能感知许多环境信号，其中向重力性在植物的早期发育中对植物生长方向起着重要 的作用。向重力性可被分为三个时间段：感知。传导和反应( k i s s ，2 0 0 0 ) 。向重力性感知的部位 是根中的柱状细胞，下胚轴和茎中的内皮层细胞。除了造粉体外，微丝骨架在向重性信号的感知 中有重要的功能。与根的柱状细胞中的微丝骨架分布是不同的，微丝骨架是非定向分布的，而沉 积的质体是分布在网状的微丝内的。y a m a m o t o 等( 2 0 0 2 ) 的研究结果表明用l a t b 处理后，明显 的促进了拟南芥的下胚轴和花序茎的向重力性，但却抑制了根的向重力性。这表明下胚轴和化序 茎的向重力性是不依赖聚合态的微丝骨架的，而根的向重力性是依赖于聚合态的微丝骨架的，推 测其原因可能是微丝骨架的解聚促进了内部质体的运动导致。 1 2 植物中的微丝结合蛋白p r o f i l i n ( 前纤维蛋白) 植物细胞通过迅速的改变其细胞质而对内部或外界环境进行相应的反应。这种细胞质的变化 是由细胞骨架调节的，主要是由微丝、微管及他们的结合蛋白来调控的。越来越多的证据表明许 多基本的反应和信号转导都汇集到骨架结合蛋白上。微丝结合蛋白可作为细胞内部个有效的感 应器并有可能处于信号与胞质重建的十字路口。骨架的动力学特征取决于胞质微丝结合蛋白的组 织配合、空间分布和激活。微丝结合蛋白也能控制徽丝单体的量和活性( a y s c o u g h 等，1 9 9 8 ； m c g o u 【g h 等，1 9 9 8 ：t a k e m o t o 等，1 9 9 9 ) 。根据微丝结合蛋白的生物活性可将其分成以下几类： ( 1 ) 调节聚合和解聚的单体蛋白，( 2 ) 稳定微丝，使其形成互相垂直的网状结合蛋白，或作为边 结合蛋白使微丝形成更有序的微丝束，( 3 ) 封端蛋白和截断蛋白，( 4 ) 成核结晶因子及动力分子。 理论上这些蛋白在植物体内都存在，但目前仅有单体结合蛋白p r o f l l i n 和a d f e o f i l i n ，边结合蛋 白f i m b r i n ，v i l l i n 和e f 1 2 及m y o s i n 已被分离并被定性( a s a d a 等，1 9 9 7 d e r u i j t e r 等。1 9 9 9 ) 。 但随着基因标签技术及先进的细胞生物学手段的应用，可能会在几年内分离出更多的微丝结合蛋 白。目前在植物中定性并被广泛研究的徽丝结合蛋白主要是p r o f i t i n 和a d f 家族，其它向v i l l i n 。 p - 1 3 5 a b p ，g e n s o l i n 等的研究还刚刚起步。这里我们首先介绍p r o f l l i n 蛋白家族。 1 2 1p r o f i l i n 的结构及存在形式 p r o f i l i n 是含量最为丰富的微丝结合蛋白分子量约1 2 1 5 k d a ，广泛的分布在真核细胞内( s u n 等，1 9 9 5 ) 。目前发现p r o f l l i n 均以复合物的形式存在：例如在刺头虫中的p r o f i l i n 能和包括两个 微丝相关蛋白( a r p 2 3 ) 等七个蛋白相结台( m a c h e s k y 等，1 9 9 4 ) 。在体外可与p l p 结合( a r e h e r 等，1 9 9 4 ) 。p r o f i l i n 也可与b n i i p h 和b n r l p 及相关蛋白相结合，这两个蛋白都是r h o 家族的小 g 蛋白( w a t a n a b e 等，1 9 9 7 ) 。而且无论是橙物还是动物中p r o f i t i n 都与磷脂酰肌g - 4 一磷酸， 磷脂酰肌醇一4 ，5 - 二磷酸有很高的亲台性( c l a r k e 等，1 9 9 8 ：g i b b o n 等，1 9 9 8 ) 。 4 第一肇文献综述 蔓! 舅燃曼皇纂蔓! 烹蔓置葛燃皇曼蠛皇曼寰糟! 篁麓皇篡群笪曼曹堂曼舅簟! 曼曼皇量舅鲁曹鼍世皇曼尊皇詈鼍基! 曼燃皇一i , i 曼曼冀皇 黧1p r o l i l i n 麴三缨结构( 赤糖花糖) 龄色和筵色热带显示赤捶芯耪p r o f i l l n l 与a c t i n 缝舍疆上豹螺旋和折叠 1 。2 2 对微丝动态变化的调控作用 体外研究结果表明p r o f i l i n 对微丝动态变化的调控有促进聚合的正调控和促进解聚的负调控 的双重功能，究竟执彳亍哪一种功能取决于p r o f i l i n 与g a c t i n 的比率关系，所处介质的离子条件及其 它结合赞自的存在及活性( p a n t a l o n i 等，1 9 9 3 ig i b b o n 等。2 0 0 0 ) 。p r o f i l i n 与g - a c t i n 形成l ；l 静复 合物起列稳定肮动蛋舀单体库豹作糟，戳诧来降低参与聚台的a c t i n 的蚕( p e r e l r o i z e n 等，1 9 9 6 ) ， 这样表现出解聚的动辘：毽当g 一毫c l 弧豹浓度鞍离辩，p r o f i l i n 与g - a c t i n 形成静l ：l 的复会物可以盏 接缝合到徽丝熬b a r b e d 端，这嚣貔可通过降低微她b a r b e d 端的临界浓度覆键进微丝的聚合 ( p a n t a l o n i 等，2 0 0 1 ) ；体外实验还表明脊樵动物和麟头虫的p r o f i l i n 极大地促进了由a d p - 肌动蛋 白向a t p 一肌动蛋白的转化，转化效率可以提高1 0 倍。a d p - 肌幼蛋白比舢限一肌动蛋白的聚合速度 低而临界浓度高。因此由p r o 矗l i n 引起的这种转化有利于微丝的聚合，这也同样可表现为促进徽丝 聚含( p e r e l r o i z e n 等，t 9 9 6 ) o 但拭南芥的p r o f i l i n 在体矫不能促进横苷酸的交换假仍能促谶兔子瓶 a c t i n 的聚合( p e r e l m i z e n 等，1 9 9 6 ) ，释树花粉