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胶州湾石油污染底泥的模拟微生物原位修复技术研究 摘要 随着石油开采及石油工业的发展，石油带来的污染也目趋严重。石油不仅污 染环境，而且危害人类的健康。因此，世界各地越来越关注石油污染问题。为了 消除石油污染，科学工作者进行了广泛的研究，以寻求安全、经济、可靠的治理 方法。生物修复因其经济有效而成为一种最有发展潜力的治理石油污染的技术。 本文对石油污染治理方法中的生物法进行了详细的论述，认为生物法是迄今 为止处理石油污染比较好的一种方法。提出了从受石油污染的沉积物中分离降解 石油的优良菌种，对优良菌种的降解性能和适宜降解的条件进行研究，通过各优 势菌的复配组合得到降解石油烃效果最好的混合菌剂，并进行沉积物底泥的实验 室模拟修复，考察接种高效混合菌剂，添加营养盐及表面活性剂对沉积物底泥修 复的效果，为石油烃污染底泥的现场修复提供技术路线、实验基础。 本论文的主要实验结果可归纳如下： ( 1 ) 从青岛娄山河入海口的底泥沉积物中分离石油烃降解菌。以胜利油田 原油为唯一碳源，在生物恒温摇床上对具有石油烃降解能力的细菌进行富集，后 经反复的平板划线分离，得到1 l 株有明显菌落差异的细菌，从中筛选得到5 株 对原油有着较高的降解能力的细菌，对l g l 的石油培养基石油降解率可达3 5 以上。 ( 2 ) 按一般分类方法，对l s l 菌- - l s 4 菌四株菌进行形态学观察和生理生 化特征研究，并通过1 6 s r d n a 序列的p c r 扩增及测序进行分析鉴定。鉴定结果 为：l s l 菌为分支戈登氏菌( 放线菌) ( g o r d o n i ab r o n c h i a l i s ) ，l s 2 菌无中文名 称( t h a l a s s o s p i r an i 抑o r e d u c e n s ) ，l s 3 菌为海杆菌属( m a r i n o b a c t e ) ，l s 4 为交 替假单胞菌属( p s e u d o a l t e r o m o n a s g a n g h w e n s i s ) 。 ( 3 ) 以i o m l l 的柴油培养基对l s l - - l s 5 菌株进行摇瓶培养，定时监测 细菌生长量，得到各菌的生长曲线，从而确定一级种子液的培养时间应该确定在 3 0 h 左右。以石油培养基对l s l - - l s 5 菌株进行摇床培养，得出5 菌株的最佳氮 源为n h 4 n o s ，最佳磷源为k 2 h p 0 4 和k i - 1 2 p 0 4 的混合物，最适生长条件为：温 度3 0 ，初始p h 值为7 5 ，摇床转速为1 8 0r m i n ，盐叫a c l ) 浓度为2 。 ( 4 ) 将l s l - - l s 5 菌株按照两株菌、三株菌、四株菌、五株菌进行搭配分 组，在3 0 ，摇床转速为1 8 0r m i n 条件下进行摇瓶实验，得到由l s l 、l s 2 、 l s 3 、l s 4 四株菌组成的高效石油烃降解菌剂，1 0 天对l g l 石油的降解效率达 6 8 8 。 ( 5 ) 石油污染底泥的模拟修复实验中，对照实验中石油降解率为3 6 1 ， 添加鼠李糖脂生物表面活性剂对石油降解率为6 2 6 6 ，添加无机n 、p 营养盐 对石油降解率为6 9 9 2 ，接种高效混合菌剂对石油降解率为6 4 7 9 ，以及同时 添加无机n 、p 营养盐和接种高效混合菌剂对石油解率为7 9 0 2 。 本课题所采用的各种措施均能提高石油污染的修复效率，因此在现场修复中 使用生物表面活性剂，添加n 、p 营养盐，投加高效菌剂现实可行。 关键词：石油烃；沉积物；微生物修复 t e c h n i c a lr e s e a r c ho f m i c r o o r g a n i s mi n - s i t ur e m e d i a t i o na b o u t t h eb o s o mm u d p o l l u t e db yt h e p e t r o l e u m a tj i a o z h o ub a y a b s t r a e t w i t l lt h ed e v e l o p m e n to f p e t r o l e u mi n d u s t r y , t h ep o l l u t i o nc a u s e db yw h i c hb e c o m e s m o r ea n dm o r es e r i o u s i ti sas e r i o u st h r e a tn o to n l yt ot h ee n v i r o n m e n tb u ta l s ot o t h eh e a l t ho fm a n k i n d t h e r e f o r e , p e o p l ep a ym o r ea n dm o r ea t t e n t i o n st ot h i s p r o b l e m i no r d e rt og e tr i do ft h ep o l l u t i o nf r o mt h ep e t r o l e u m , t h es c i e n t i s t sc a r d e d o a tal o to f s c i e n t i f i cr e s e a r c h e s n o wt h e ya r es t i l ll o o k i n gf o rt h es a f e ，e c o n o m i ca n d r e l i a b l et e c h n i q u e st os o l v et h i sp r o b l e m b i o r e m e d i a t i o nh a s p l a y e dag r e a t p e r f o r m a n c ea st h a tt ot h eh y d r o c a r b o nc o n t a m i n a t i o n t h i sp a p e rh a ss h o w nu pt h er e a d e r sm o r ed e t a i l e di n f o r m a t i o na b o u tt h e b i o d e g r a d a t i o nm e t h o d s i n c o n t r o l l i n gp e t r o l e u mp o l l a t i o n c o m p a r i n gv a r i o u s t r e a t m e n t s ，i ti sc o n s i d e r e dt oh a v em o r ea d v a n t a g e s t h ep a p e rh a sp r o p o s e dt h ew a y t h a tt os e p a r a t et h ef r e ed e g r a d i n gb a c t e r i u mt ot h ep e t r o l e u mf r o mt h ed e p o s i to ft h e o i lp o l l u t i o i l ，a n dd o n er e s e a r c ht od e g r a d a t i o n sp e r f o r m a n c e sa n dc o n d i t i o n st h a ta l e s m m b l ef o rt h eb a c t e r i u m t h r o u g hm i x i n gt h e mw eg e tt h ee f f e c t i v em i x e db a c t e r i a t od e g r a d et h ep e t r o l e u mh y d r o c a r b o n , a n dd os i m u l a t i o no fl a b o r a t o r yr e p a i r sa b o u t t h es e d i m e n tb o t t o mm u d t h er e p a i r e de f f e c t i v ec o n d i t i o n sa l ei n v e s t i g a t e dt h r o u e # i n o c u l a t i n gw i t hm i x e dp h a r m a c e u t i c a lo ff u n g u sh i g h - e f f i c i e n t l y , a d d i n gt h es a l to f n u t r i t i o na n ds u r f a e t a n t w h i c hc a l lo f f e rt h ee x p e r i m e n tf o u n d a t i o nf o rt h er e p a i rt o t h ep e t r o l e u mh y d r o c a r b o no f t h eb o t t o mm u do nt h es p o t t h ek e yr e s u l t so f t h ep a p e rc a nb ec o n c l u d e da sf o l l o w s ： ( i ) o i l d e g r a d a t i o nb a c t e r i u mi ss e p a r a t e df r o mt h es e d i m e n tb o t t o mm u do f q i n g d a ol o u m o u n t a i nr i v e re s t u a r y t h eb a c t e r i u mw h i c hh a st h ea b i l i t yt od e g r a d e t h ep e t r o l e u mh y d r o c a r b o ni sc o n c e n t r a t e do nt h eb i o l o g i c a lc o n s t a n tt e m p e r a t u r e t a b l eu s i n gt h ec r u d eo i lo fs h e n g l io i lf i e l da st h es i n g l ec a r b o ns o b r c e t h e ne l e v e n o i l - d e g r a d a t i o nb a c t e r i aw i t hc o l o n yd i f f e r e n c ea f eg o tt h r o u g hr e p e a t i n gp l a t e l i n e a t i o ns e p a r a t i o n , w h e r ef i v ep r e d o m i n a n ts t r a i n sa r es e l e c t e dw h i c hh a v et h e h i g h e rd e g r a d a t i o na b i l i t yt h a tc o u l db eu pt ob y4 0 f o rl 叽p e t r o l e u mc u l t u r e m e d i u m ( 2 ) a c c o r d i n gt ot h eg e n e r a lc l a s s i f i e dm e t h o d , c a r r i e do nt h em o r p h o l o g y o b s e r v a t i o na n dt h ep h y s i o l o g i c a lb i o c h e m i s t r yc h a r a c t e r i s t i cr e s e a r c ht ot h el s l l s 4 ， a n dt h r o u g h1 6 s r d n as e q u e n c ea n dp c rt e c h n o l o g yt oa n a l y z e t h er e s u l t sa g e b e l o w ： l s lb e l o n gt og o r d o n i ab r o n c h i a l i , l s 2b e l o n gt ot h a l a s s o s p i r an i t r o r e d u c e n s , l s 3b e l o n gt om a r i n o b a c t e , l s 4b e l o n gt op s e u d o a l t e r o m o n a sg a n g h w e n s i s ( 3 ) w ec u l t u r et h el s i - l s 5w i t h1 0 m g ld i e s e lo i l a sc u l t u r em e d i u mv i a s h a k i n g ，m o n i t o rt h eb a c t e r i u mg r o w t hq u a n t i t ya tf i x e dt i m et og e tt h eg r o w t hc n r v e o ft h eb a c t e r i a , a n dt h e nm a k es u l et h a tt h ec u l t u r et i m eo ft h ef i r s tc l a s ss e e da r e a b o u t3 0h o u r s w ec u l t u r et h el s l l s 5v i as h a k i n g 、撕t hp e t r o l e u mc u l t u r em e d i u m , a n df m dt h a tn i - 1 4 n 0 3i st h em o s ta v a i l a b l en i t r o g e ns o u r c e ，m i x t u r eo fk 2 h p 0 4a n d k h e p 0 4i st h em o s ta v a i l a b l ep h o s p h o r u ss o u r c ea n dt h ec o n d i g ng r o v c f l ac o n d i t i o ni s t e m p e r a t u r eb e i n g3 0 。c ，i n i t i a lp hb e i n g7 5 ，t h es h a k i n gr a t eo ft h ec u l t u r ef l a s k s b e i n g1 8 0r r a i n , t h ec o n c e n t r a t i o no f n a c lb e i n g2 ( 4 ) g r o u p i n gt h el s l - l s 5b yt w o ，t h r e e ，f o u ra n df i v e ，s h a k i n gt oc u l t u r et h e m a t3 0 c ，1 8 0r m i n , t h es t u d ys h o w s t h a t t h e m i x t u r e o f l s l 、l s 2 、l s 3 、l s 4 h a s t h e h i g h e s tp e t r o l e u md e g r a d a t i o ne f f i c i e n c yw h i c hi su pt ob y6 8 8 ( 5 ) i nt h el a b o r a t o r ys i m u l a t i o nr e p a i r sa b o u tt h es e d i m e n tb o t t o mm u d , p e t r o l e u md e g r a d a t i o ne f f i c i e n c yi nt h ec o m p a r i s o ni sb y3 6 1 w h i c hi sb y6 2 6 6 w i t hr h a m n o l i p i db i n - s u r f a c t a n t ，w h i c hi sb y6 9 9 2 谢mo r g a n i cn 、p ，w h i c hi sb y 6 4 7 9 w i t ht h eh i g h l ye f f e c t i v em i x e db a c t e r i a a n dw h i c hi sb y7 9 0 1 w i t l ln o t o n l yi n o r g a n i cn 、pb u ta l s om i x e d b a c t e r i a t h es t e p sw et a k ec a ni m p r o v et h er e p a i re f f i c i e n c yo ft h ep e t r o l e u mp o l l u t i o n , s oi ti sf e a s i b l er e p a i ro nt h es p o tu s i n gb i o - s u r f a c t a n t , a d d i n gn u t r i t i o ns a l to rp u t t i n g i nh i g h l ye f f e c t i v em i x e db a c t e r i a k e yw o r d s ：p e t r o l e u mh y d r o c a r b o no n ；s e d i m e n t ；m i c r o o r g a n i s mr e p a i r 独创声明 本人卢明所节交的学位论文是本人在导师指导f 进行的研究i ：作及取得的研究成果。据 我所知，除了文中特别加以标注羊致榭的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的 研究成果，也不包含未获得 i 适! 垫监直基地霞墨控捌岜明趁! 奎 拦互窒2 或其他教育机构的学位或证1 5 使h 过的材料。与我一同i ：作的同忠对本研究所做的 任何贡献均己在论文中作了明确的说明井表示谢意。 学位论文作者签名：阱卜瞩 签字日期：卅年6 月譬日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使川学位论文的规定，有权保留并向国家有天 部j 或机构送交论文的复印什平磁 j c ，允许论文被布阅和借阅。本人授权学校可以将学位论 文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索可以采墙影印、缩印或扫描笛复伟手段保存、 汇编学忙论文。( 保密的学何论文在解密后适川本授权1 5 ) 学能论文作者签名：阿l ，卜愧 签字日删： 川年6 月? 日 学位论文作者毕业后左向： i ：作单住： 通讯地址： 翮擗可 签字日期：9 7 年月? 日 电话 邮编 胶州湾石油污染底泥的模拟微生物原位修复技术研究 1 文献综述， 1 1 石油污染的现状 当今石油工业飞速发展，在石油勘探与开发，储运与炼制过程中，常会有石 油外溢或排放，造成严重的海洋环境污染。石油烃作为一种全球性的环境污染物， 因其分布广、稳定性强、生物富集率高、致癌性强，而对环境和人类健康构成极 大的威胁，已引起各国环境科学家的极大关注。 1 1 1 石油的组成 石油属于可燃矿物质，是地球在其形成的不同历史时期，由植物或动物等有 机物残骸生成，由于生成条件不同，其物理化学性质存在很大差异。石油中含有 数百种化合物，主要由烷烃、环烷烃及芳香烃组成，约占石油含量的5 0 8 0 ，简称石油烃，其余为非烃类含氮、硫及氧等元素的有机化合物。 一般石油中，烷烃占总油量的2 0 ，其中一半是直链烃( 石蜡烃) ，一半是 支链烃，直链烃的碳数范围从c 1 c 柏，中国高蜡原油中检出c 6 0 ，支链烃中最 重要的是异戊二烯类化合物，以姥鲛烷( c 1 9 ) 和植烷( 1 2 2 0 ) 为代表，支链烷烃 无毒，可被多数微生物降解，但分支越多越难被降解( 李丽等，2 0 0 1 ；李习武等， 2 0 0 2 ) 。环烷烃约占总油量的5 0 ，其中大部分是环戊烷和环己烷，还有很重要 的少量组分为甾烷、萜烷类，环烷烃浓度高，油品粘度大，环烷烃是润滑油的主 要成分，微生物难降解环烷烃( 袁红莉，2 0 0 3 ) 。芳香烃不超过总油量的2 0 ， 有单环芳烃( 如苯、甲苯、二甲苯) ，还有双环芳烃( 主要是萘) 、三环芳烃( 如 蒽和菲) 和三环以上的多环芳烃( 如苯并芘、苯并葸) ，芳香烃对生物毒性大， 特别是多环芳烃，难以生物降解( 李习武等，2 0 0 2 1 陈国华，2 0 0 2 ) 。 1 1 2 海洋石油污染的来源 海洋水体油污染是目前世界性的严重的海洋污染，主要集中在河口、港湾近 海水域、海上运油航线和海上油田周围。进入海洋水体的油类主要来自：经河流 或直接向海洋注入各种含油废水；海洋石油勘探开发中的泄漏和采油废水的排 放；船舶压舱水、机舱水和洗舱水。船舶航行中因事故造成海上溢油，特别是油 轮溢油事故可造成非常严重的污染。逸放大气中的石油烃的沉降及海底油自然溢 油等，都可造成不同程度的油污染。目前经各种途径进入海洋的石油烃每年越 中国海洋大学硕士学位论文 6 0 0 万吨1 0 0 0 万吨，排入中国沿海的石油烃每年约l o 万吨( 史鄂候，1 9 8 8 ) 。 据统计日本沿岸海域油污染事故占海洋污染事件总数的8 3 ，美国沿岸海域每 年发生的l 万起污染事故中，约3 4 是石油污染，可见油类是当今海洋水体中最 重要的污染物。表1 1 列出了全球各类污染源石油烃入海估算量( 万邦和，1 9 8 6 ： 格拉赫s a ，1 9 8 7 ) 。 表1 1 全球各类污染源石油烃入海估算量( m r a ) t a b l e1 - 1g r o s so f e s t i m a t et ot h es e ao f p e t r o l e u mh y d r o c a r b o no ne a r t h 1 1 3 石油烃在海洋环境中的分布及形态 1 1 3 1 分布： 海洋中污染石油的浓度分布极不均匀，地理和水文因素起主要作用。一般情 况，大部分石油发现在码头附近，靠近大的口岸，其中多数是处于河口港湾中。 因此，石油主要集中在河口港湾和大陆架水域中，而不是在开阔的海洋中。水的 停滞时间影响石油的分布。例如，波罗的海和地中海海水的停滞时间约为4 0 年， 而爱尔兰海水的停滞时间只有1 年左右。我国渤海海水交换性能差，而黄海、东 2 胶州i 毒石油污染底泥的模拟微生物原位修复技术研究 海海水较好性能较好。 1 1 3 2 存在形态： 石油进入水体后，以5 种形态存在，( 1 ) 悬浮油：在水体中油珠颗粒较大， 一般大于1 5 t t m ，以连续相的油膜漂浮于水面；( 2 ) 分散油：粒径大于l g m 的微 小油珠悬浮分散于水相中，不稳定；( 3 ) 乳化油：由于表面活性剂的存在，油在 水体中呈乳状液，形成o w 型乳化微粒，粒径小于l t t m ，表面常常覆盖一层带 负电荷的双电层，体系比较稳定，不易上浮水面；( 4 ) 溶解油：油在水中的溶解 度很小，一部分油以分子状态或化学方式分散于水体中形成油一水均相体系，非 常稳定，一般低于5 1 5 m g l ；( 5 ) 油一固体物：水体中的油吸附在水中的固体 悬浮物的表面上，形成油一固体物( 也称附着油) 。油膜是石油输入海洋的初始 状态，然后一边蒸发一边扩散溶解，分散油，乳化油和溶解油分散在水体中，剩 下的油一固体物根据其密度大小可以浮于水体或沉于水底沉积物( 沈德中， 2 0 0 2 ) 。 1 1 4 石油在海洋中的迁移转化 石油进入海洋环境后，受风、海浪、洋流、光照、气温、水温和生物活动等 因素的影响，水体中油类物质的数量、化学组成，物理性质及化学性质都随着时 闻不断地发生变化。低分子量的引起这些变化的过程是蒸发、光化学氧化、溶解， 乳化、颗粒物质的吸附沉降和生物降解等。这些迁移、转化作用的大致比例及所 经历的时问如表1 2 所示( 王连生，1 9 9 4 ) 。 表1 - 2 石油在海洋中的迁移转化 t a b l e1 - 2t r a n s f o r ma n da s e i o t i o no f o i li nt h es e a 1 1 5 石油污染的危害 1 1 5 1 石油对生物的危害 石油对水生生物的毒性可分两类，一类是大量石油造成的急性中毒；另一类 是长期低浓度石油的毒性效应。石油在水体中的毒性效应大多来自水溶性大的低 3 中国海洋大学硕士学位论文 分子量的正烷烃和单环芳烃。油类在水体中以浮油、溶解油、乳化油、附着油等 形式存在。水面油膜厚度大于l p m 时，就可隔绝空气与水体间的气体交换，同时 氧化l m g 石油需消耗3 4 m g 氧气，这会导致水体溶解氧下降，导致浮游生物的 死亡。沉积于水底的石油烃厌氧分解产生硫化氢等毒物，会使底栖生物死亡。 油类中芳香烃类毒物可使水生生物致畸和致癌( 郭楚玲等，2 0 0 0 ) 。 石油污染物对生物的危害主要是影响其正常的生长，对其成长、发育造成一 定的危害，甚至导致生物的死亡或灭绝。例如，石油污染物通过鱼鳃进入鱼体内， 影响其呼吸功能，并影响鱼卵、幼鱼及鱼类生存的生态系统，鸟类体表黏上溢油， 使其丧失飞行功能，摄入体内可使肝、肺、肾等器官发生损害并减少白细胞数日， 造成鸟类死亡( 盂蒙强，2 0 0 0 ) 。石油对浮游植物的光合成速度有明显的影响， 一般妨害藻类的生长。据报道，近5 0 年来因石油污染己有1 0 0 0 多种海生生物灭 绝，海洋生物己减少了4 0 ( 周文敏，1 9 9 0 ) 。 1 1 5 1 石油对人体的危害 暴露在环境中的石油，其低沸点组分很快挥发，人体直接摄取各种石油蒸馏 物可发生各种中毒症状，受到影响的器官有肺、胃肠、肾、中枢神经系统和造血 系统。苯是极少数能够致癌的烃类之一，苯的急性中毒是从呼吸道吸入产生，在 与低至4 4 m g l 的浓度慢性接触时，即可得白血病和破坏免疫系统。多环芳烃是 石油中毒性最大的成分，具有强的疏水性和化学稳定性，对海洋鱼类以及底栖生物 并最终对人类造成严重威胁( c a r m a nk r ，e ta l ，1 9 9 5 ) 。研究表明，蛤、贻贝、 虾、多毛类以及鱼类对多环芳烃有很强的生物累积效应，最终可能通过食物链进 入人体，危害人体健康。 1 2 石油烃的微生物降解 鉴于石油污染的严重危害，世界各国开发出了一系列石油污染治理的技术 包括物理、化学、生物等方法( p a w l & e d w a r d ，1 9 9 1 ) 。其中，利用生物技术处理 石油污染物，具有安全、经济、高效、无二次污染、操作简单等优点，己成为一 种经济效益和环境效益俱佳的、解决复杂环境污染问题的最有效的手段。 1 2 1 降解石油的微生物 国外在2 0 世纪4 0 年代就开展了细菌降解油污的研究( 李永琪等，1 9 9 1 ) ，我国 这方面的研究始于2 0 世纪7 0 年代末期( 丁明宇等，2 0 0 0 ；丁美丽等，1 9 7 9 ；陈碧 4 胶州湾石油污染底泥的模拟微生物原位修复技术研究 娥，2 0 0 0 ；史君贤，1 9 9 1 ) 。研究表明。在海洋中存在着大量能够降解石油的微 生物，它们的种类组成和土壤、淡水中降解石油微生物有很大不同。据报道能够 降解海洋石油污染物的微生物有2 0 0 多种，分属于7 0 个属，其中细菌4 0 个属( 张士 璀，1 9 9 7 ) 。 海洋中最主要的石油烃降解细菌属有：无色杆菌属( a c h r o m o b a c t e r ) 、不动杆 菌属口c i n e t o b a c t e r ) 、产碱杆菌属( a l c a l i g e n e s ) 、节杆菌属( a r c h r o b a c t e r ) 、芽孢杆 菌属( b a c i l l u s ) 、黄杆菌属( f l a v o b a c t e r i u m ) 、棒杆菌属( c o r y n e f o r m s ) 、微杆菌属 ( m i c r o b a c t e r i u m ) 、微球菌属( m i c r o c o c c u s ) 、假单孢菌属( p e s u d o m o n a s ) 以及放线菌 属( a c t i n o m y c e t e s ) 、诺卡氏菌属( n o c a r d i a ) 。在大多海洋环境中，上述这些细菌是 主要降解菌，在真菌中，金色担子菌属口u r e o b a s i d i u m ) 、假丝酵母属( c a n d i d a ) 、 红酵母属( r h o d o t o r u l a ) 和掷抱酵母属( s p o r o b o l o m y c e s ) 是最普通的海洋石油烃降 解菌。c o r o l l o s p o r a 、d e n d r y p h i e l l a 、l u l w o r t h i a 、v a r i c o s p o r i n a 以及一些丝状真 菌如曲霉属( a s p e r g i l l u s ) 、毛霉属( m u c o r ) 、镰刀霉属( f u s a r i u m ) 和青霉属 ( p e n i c i l i u m ) 也应被归入海洋降解菌中( a t l a s ，1 9 8 1 ；李丽，2 0 0 1 ；韩如呖，2 0 0 2 ) 。 1 2 2 微生物对石油烃的摄取模式 石油烃的憎水性是限制其被微生物降解的主要因素，因为烃类物质必须同微 生物接触，并通过细胞壁才能被位于细胞膜内的烃降解酶所分解( 华兆哲等， 1 9 9 8 ) 。对于不同的微生物，烃类进入细胞的途径亦不同。一般认为，微生物在 摄取石油烃时主要采取以下三种方式： ( 1 ) 微生物细胞摄取溶解在水相中的烃类。这种微生物利用方式，被称为“单一 扩散一溶解烷烃的摄取”模型。该模型只适用于水溶性芳香烃和气态烷烃，不适 于长链烷烃，后者在水中溶解度太小，不足以维持微生物的生长。 ( 2 ) 微生物细胞与比其大得多的油滴直接接触进而进行摄取。“与大油滴直接接 触”模型认为，微生物细胞与比其大得多的以非水相形式存在的液滴相接触，假 设基质的摄取是在接触点通过扩散或主动运输进行的，其中底物对细胞接触表面 积的有效性是微生物生长的限制因素。 ( 3 ) 微生物细胞与比其小得多的假溶、拟溶或被包裹的烃类颗粒作用，进而进 行摄取。这种“微滴接触”模型是微生物细胞在非水溶性底物的诱导下分泌生物表 面活性剂，将底物乳化成小液滴，形成烷烃一表面活性剂胶束，可使微生物有效 中国海洋大学硕士学位论文 地利用烷烃生长。研究表明，烷烃液滴的界面面积与微生物的比生长速率之间相 关，即烷烃液滴直径越小，界面面积越大，比生长速率越大( s e k e l s k y & s h r e v e ， 1 9 9 9 ) 。 1 2 3 影响石油烃生物降解的因素 在自然环境中，石油烃类降解与否以及快慢与其所处的环境密切相关。国内 外许多学者在影响石油生物降解速率的主要因素即烃类的组成与状态、烃类降解 微生物、温度、营养盐及p h 值等方面进行了深入而细致的研究( 陈碧娥等，2 0 0 1 ； 林风翱等，1 9 9 7 ) 。也有学者从微生物的生理生化特性和生物能学的观点探讨碳 氢化合物的降解，并着重探讨影响其生物降解速率的环境因子与生物因子。 1 2 3 1 石油的理化性质 许多学者对各成分的微生物降解率进行了研究( h i g a s h i h a r at ，e ta l ，1 9 9 5 ) ， 认为饱和烃的降解率最高，其次是低分子量的芳香族烃类化合物，高分子量的芳 香族烃类化合物、树脂和沥青质则极难降解。不同烃类化合物的降解率一般模式 是：正烷烃 分枝烷烃 低分子量芳香烃 多环芳烃。 由于多环芳烃性质稳定，单纯靠自然微生物降解很慢。研究表明，两环和三 环多环芳烃( 苯、菲、葸、芴等) 在环境中存在的时间较短，能将多环芳烃作为唯 一碳源的微生物就能矿化这些化合物，目前已分离到的有假单胞菌属、黄杆菌属、 诺卡氏菌属、弧菌属、解环菌属、分枝杆菌属等( b o u c h e zm ，1 9 9 5 ) 。而四环、 多环高分子量的多环芳烃则难以降解。一般来说，随着多环芳烃苯环数的增加， 辛醇一水分配系数增大，其降解速率越来越低。 1 2 3 2 微生物种类 石油降解微生物的种类和数量对海洋中石油烃的降解有明显影响。不同微生 物种类对石油烃的降解能力差别较大，同一菌株对石油烃不同组分的利用能力也 有较大的差别，一般情况下，混合培养的微生物对石油烃的降解比纯培养快。石 油污染能够诱导降解石油的微生物种群的生长，未受到石油污染地区的石油降解 菌不n o 1 。但在受污染地区的石油降解菌的比例和数量明显上升，污染程度 越重细菌数量越多，说明石油污染能够使石油降解菌发生富集。 1 2 3 3 电子受体 研究表明，好氧环境和厌氧环境微生物都能降解石油烃，只是降解途径和降 6 胶州湾石油污染底泥的模拟微生物原位修复技术研究 解效率不同而已。在好氧环境中，0 2 可直接作为电子受体，而在厌氧环境中， 以n 0 3 n 0 2 、s 0 4 2 等含氧酸根以及s 、f e 、m n 等元素氧化态作为电子受体( h e a d l m ，e ta l ，1 9 9 9 ) 。在一般情况下，微生物降解多环芳烃多需要氧气的参与，为改 善好氧状况，可采用生物通气或建立藻、菌共生系统等生物修复方法。对于厌氧 环境，也可添加n 0 3 。、s o ? 。等含氧酸盐类电子受体( 马文漪等，1 9 9 8 ) 。 1 2 3 4 营养盐状况 环境中营养盐的缺乏对微生物的生长和种群的维持都是重要的限制因素。在 实验室和现场进行的很多研究表明，添加营养对溢油的生物降解有显著的促进作 用( o hy s ，e ta l ，2 0 0 1 ) 。为了彻底降解和加快净化速度，生物修复中常添加氨 和磷酸盐来调节c ：n ：p 比例。但水溶性的氮、磷营养盐易被冲刷掉，效果不好 ( b r a g gjr ，e ta l ，1 9 9 4 ) ，还会造成富营养化，促进藻类生长繁殖。为克服这 些缺点，目前国际上已研制出多种含n 、p 的亲油性肥料和包水性肥料，并已成 功地应用于溢油事故的处理( l e a t h yjg c o l w e l l ，1 9 9 0 ：p r i t c h a r d ，e ta l ，1 9 9 1 ) 。 但是，有研究表明，添加氮只在一定浓度范围内会明显促进石油烃的降解，超过 这一浓度对石油烃的降解速率影响不大( o u d o t ，e ta l ，1 9 9 8 ；v e n o s a ，e ta l ，1 9 9 6 ) 。 1 2 3 5 温度 温度以两种方一式影响油的生物降解效率：一是温度直接影响烃类降解菌的 生长和繁殖以及微生物的种群构成；二是温度影响油的物理状态和油的化学组 成。在一定范围内提高温度，可促进原油中一些对细菌有害的烃类的挥发，也增 加原油的乳化程度，从而提高烃的代谢速率。但石油烃的降解速率并不总是随温 度的升高而增大。高温下，烃对膜的毒性也增大，从而抑制烃类的降解能力：在 低温时，油粘度增加，有毒的短链烷烃挥发性下降，生物降解启动滞后( l e a h y & c o l w e l l ，1 9 9 0 ) 。对于好氧菌来说最佳的石油降解温度一般在1 5 3 0 。c 之间。但 也有一些研究表明石油烃的降解可在极端的温度条件下进行。 1 2 3 6p h 值和盐度 石油烃类的微生物降解一般处于中性值，极端的p n 值环境不利于微生物的 生长( 陈燕等，2 0 0 3 ) 。当营养盐及温度不是限制因子时，石油烃的生物降解率 随盐度的增大而减小。k a s t n e r 等( 1 9 9 8 ) 发现盐度的增大会抑制土著微生物及接种 的外源微生物对多环芳烃的降解。然而，目前也发现一些耐盐或嗜盐烃类降解菌 7 中国海洋大学硕士学位论文 ( b r u n s & b e r t h e c o r t i ，1 9 9 9 ) 。 1 3 近海石油污染的生物修复 1 3 1 生物修复技术的特点 所谓的生物修复是指利用生物特别是微生物来催化降解环境污染物，减小或 最终消除环境污染的受控或自发过程，生物修复是在微生物降解基础上发展起来 的新兴的环保技术。具有投资小，操作简单，不易产生二次污染等优点，特别是 多环芳烃较彻底的处理方法( h i c k s ，1 9 9 3 ) 。从二十世纪七十年代起，世界各国 陆续开始石油烃的生物降解的研究及其污染环境的生物修复技术的研究，经过三 十多年的发展，生物修复技术得到很大发展并已在现场获得使用，利用生物修复 技术已成为一种经济效益和环境效益俱佳的解决石油污染土壤或水体的有效手 段( a l b e r td v e n o s a ，e ta l ，1 9 9 6 ；a l h a s k s m g c ，da l ，1 9 9 8 ：d e l p h i n em a s s i a s ， 2 0 0 3 ) 。表1 3 概括了生物修复与常规修复方法相比较的优缺点( 沈德中，2 0 0 2 ) 。 表1 3 生物修复的优、缺点 t a b l e1 - 3a d v a n t a g ea n dd i s a d v a n t a g eo f b i o l o g i cr e n o v a t i o n 优点缺点 可在现场进行 使位点的破坏达到最小 减少运输费用，消除运输隐患 永久性消除污染 费用低 可和其他处理技术结合使用 有些污染物不易或根本不能被生物降解 有些污染物的降解产物毒性和迁移性增强 地点特异性强 工程前期投入高 需要增加微生物监测项目 1 3 2 生物修复的类型 目前，在土壤、沉积物和地下水的生物修复中，根据人工干预的情况分为自 然生物修复与人工生物修复，人工生物修复又分为原位生物修复( i ns i t u b i o r e m e d i a t i o n ) 和易位生物修复( 及s t u b i o r e m e d i a t i o n ) 两种( 沈德中，2 0 0 2 ) 。 所谓原位生物修复是指对受污染的介质( 沉积物、土壤、水体) 不作搬运或输送而 在原位污染地进行的生物修复处理。其修复过程主要依赖于被污染地自身微生物 的自然降解能力和人为创造的合适降解条件。易位生物修复是指将被污染介质 8 胶州湾石油污染底泥的模拟微生物原位修复技术研究 ( 沉积物、土壤、水体) 搬动或输送到它处进行的生物修复处理。但这里的搬动和 输送是低限度的、而且更强调人为控制和创造更加优化的降解环境。表1 4 对人 工生物修复的分类、技术形式、适用范围及特点作了描述与比较( 沈德中，2 0 0 2 ) 。 表l - 4 人工生物修复分类、技术形式、适用范围及特点 t a b l ei - 4s o k t c c l m i c a lf o r m a t , a p p l i c a b i l i t yr a n g ea n dc h a r a c t e r o f m a n p o w e rb i o l o g i cr e n o v a t i o n 9 中国海洋大学硕士学位论文 1 3 3 污染环境对生物修复的敏感度 由于受污染环境不同的理化状况对生物修复的敏感程度并不相同。例如，油 污染海滩是否适合采用生物修复，还应考察其对生物修复是否敏感。通常情况下， 与敏感度相关的因素主要有：海岸线对波浪及潮汐能的暴露或掩蔽程度、海岸线 的坡度、溢油品种及数量、海滩的生物相等，常用的海岸线敏感性指标( m e a t u s a j ， 1 9 9 7 ) 参见表1 5 。 表1 5 海岸线的敏感性指标 t a b l e ! - 5s e n s i t i v ee x p o n e n t i a lo f c o a s t l i n e 从表1 5 中可以看出，受潮汐、海浪影响小，坡度小，沉积物底质疏松适宜 生物特别是微生物生长的海岸线地带对生物修复敏感，易于进行生物修复。 1 3 4 强化石油污染生物修复的基本措施 石油的自然生物降解过程速度较慢，可采取多种措施强化这一过程，常用的 技术包括：添加能高效降解石油污染物的微生物；提供微生物生长繁殖所需的条 件( 提供0 2 或其他电子受体，施加营养) ；投加表面活性剂促进微生物对石油烃的 利用。 1 3 4 1 接种微生物 石油污染的生物修复主要依靠微生物对石油烃的生物降解作用来实现。用于 生物修复的微生物有土著微生物、外来微生物和基因工程菌。土著微生物降解污 1 0 胶媸湾石油污染底泥的模拟微生物原位格复技术研究 染物的潜力巨大，但生长速度慢，代谢活性低；受污染物的影响，土著菌的数量 有时会急剧下降。此时，添加外来的、能降解污染物的高效菌，能够催化生物修 复的限制步骤( 张景来，2 0 0 2 ) 。因此，筛选一些降解石油烃的高效菌种是生 物修复的必然要求。 污染区域需要大量的接种微生物并