（有机化学专业论文）大鼠肌肉素基因克隆、融合表达及多克隆抗体制备.pdf

大鼠肌肉素基因克隆、融合表达及多克隆抗体制各 英文缩写词 氨苄青霉素 肌肉素 心钠素 c 型利钠尿肽、 脑钠素 q 一葡萄糖苷酶抑制剂 餐后血糖 过氧化物酶激活型增殖体受体y2 胰一一十二指肠同源区蛋白质 磺酰脲受体l 葡萄糖转运蛋白 p p a r ，辅激活物l 核内因子。b i 。b 激酶 胰岛素受体底物 细胞因子传导信号抑制蛋白 美国糖尿病学会 空腹血糖 血糖 邻苯二胺 3 3 一二氨基联苯胺 脚脓脚呻肿枷隅眦孵哪嘲籼胍贼溺雠眦髓啪 大鼠肌肉素基因克隆、融台表达及多克隆抗体制备 摘要 肌肉素是肌细胞特异分泌的多肽蛋白质，参与机体糖代谢和脂代谢。肌肉素 作为一种自分泌和旁分泌因子在骨骼肌中起作用，其m r n a 几乎只在骨骼肌中表 达，并受营养条件和激素因子尤其是胰岛素的调控，在肥胖的患有胰岛素抵抗的 小鼠骨骼肌中，肌肉素的m r n a 表达水平相对于正常小鼠较高，而肌肉素蛋白能 抑制由胰岛素引起的葡萄糖吸收和糖原合成，由此推测肌肉素可能与糖尿病的发 生、发展有着密切联系。论文进行了原核表达并纯化肌肉素，制各肌肉索的多克 隆抗体，为深入了解删钟j 加基因的功能及其临床应用奠定基础。 本文从大鼠的骨骼肌中提取总r n a ，用r t p c 方法克隆到肌肉素的c d n a ，将 肌肉素基因片段插入含g s t 标签的融合表达载体p g e x - 5 x 一3 中，构建重组质粒 p g e x 一5 x 一3 一删占口j 如进行测序，测序结果与g e n e b a n k 中的进行同源性比对，d n a 序列的相似度为9 9 2 5 ，所编码的蛋白质的氨基酸序列相似度为1 0 0 将该重组质粒转化大肠杆菌b l 2 1 ( d e 3 ) ，并用i 盯g 诱导转化菌表达目的蛋 白，s d s p a g e 鉴定该转化菌表达了3 7 k d a ，并用免疫印迹分析证明该蛋白为 g s t m u s c l i n 重组蛋白。经表达形式分析证明，融合蛋白小部分可溶，用 g s h - s e p h a r o s er e s i n 进行纯化后，免疫日本大耳白兔制备多克隆抗体，利用问 接e l i s a 法和w e s t e r nb l o t 检测该重组蛋白能有效地诱导日本大耳白兔产生高 水平的特异性i g g ，抗血清效价可达1 ：3 2 0 0 0 左右，通过免疫前血清与免疫后 血清对比，用w e s t e r n 印迹检测抗体具有很好的特异性。这些结果表明该重组蛋 白免疫血清可用作检测肌肉素蛋白的特异性抗体。 关键词：肌肉素克隆原核表达多克隆抗体 大鼠肌随素基因克隆、融合表达及多克隆抗体制各 a b s t r a c t m u s c i i np r o t e i ni se x c l u s i v e l ys e c r e t e di i ln l y o c ”e ，i i l v o l v e di i lm eh o m e o s t a s i s o f 西u c o s ea i l dl i p i dm e t a l ) o l i s m ， a n dc o l l l df l m c t i o na s 姐a u t o 嘶n ea n dp 眦商n e f a c t o rms k e l e t a lm u s c l e s m u s c l i 工lm r n ai sa l m o s te x c l u s i v e l ye x p r e s s e di n s k e l e t a lm u s c l e s ，r e g u l a t e db yn u 砸t i o n a lc h a n g e sa n dh o 肋o n a lf a c t o r s ， e s p e c i a l l y i n s u l i n ，a i l da u g m e n t e di i lt 1 1 es k e l e 乜lm u s c l eo fo b e s e m s “n r e s i s t a n tm i c e m u s c l i np r o t e mc a i li n h i b i ti n s u l i n - s 缸1 m a t e d 百u c o s eu p t a k ea i l dg l y c o g e s y t l l e s i s i nm y o c ”e s t h eo b s e r v a t i o n ss u g g e s tt l l a tm u s c l i np r o t e i nc o u l db er e l a t e dt ot h e d e v e l o p m e n to fd i a b e t e sm e l l i t u s i no r d 盯t o 如r t h e rl 1 d e r s t 锄dm ep h y s i o l o g i c a l s i g n i 矗c a n c eo fm l l s c l i np r o t e i na 1 1 d i t s c l i n j c a l 印p l i c a t i o n ，1 ep r o k a r y o t i c e x p r e s s i o n ，p u r i 丘c a t i o no f m u s c n na n dp r 印a r a t i o no f p 0 1 y c l o n a la 1 1 t i b o d yw e r ed o n e i n t l l i s p a p e r t 1 l eg e n e 矗a g m e n te n c o d i n gm u s c l i nw a s a m p l i f i e db yr t - p c r 矗d mt o t a lm 妊 o fr a ts k e l e t a ：im u s c l e ，a n dw a sc l o n e di n t o p r o k a r y o t i ce x p r c s s i o n v e c t o r p g e x 一5 x 一3 ， n ed n as e q u e n c eo fc l o n e dg e n e1 1 a d1 d i 仃e r e n c en u m 曲a to f 肼越渤i ng e n e b a 芏l k ，h 血i i et h ea m i n oa c i ds e q u e n c eo f p r o t e i nw a s 仕i es a m e 埘也 m u s c l i ni ng e n e b a n k e c 。，fb l 2 1w a st r 姐s f o m l e d 、i t hr c c o m b 砌p l a s m i dp g e x - 5 x 3 m l u s c l i n n et f a n s f o m l a l l tw a si n d u c e dt oe x p r e s s 1 er e c o m b i n a n tp r o t e i nb yi p t ga3 7 o a r e c o m b m p r o t e i i lw a si d e m i ：e i e di ns d s _ p a g ea n a l y s i s ，a n d6 l m l e rp r o v e db y w e s t e mb l o t n er e c o m b i 玎a n tp m t c 血c x i s t s 柳oe x p r e s s i o nf o n l l s ：s o l u b l ea 1 1 d i n s o l u b l e ，a n dt h es o l u b l ef o n n 啪sp 溉矗e db yg s h - s e p h 粕s er e s i n ， t h ep 涮f i e d r e c o m b m a tp r o t e i w a su s e dt o 抽i i n u l l i z cr a b b “t op r e p a r em ep 0 1 y c l o n a la n t i b o d y b ym e r e c te l i s aa n dw e s t e m b l o ta i l a l ) r s i sa n dc o m p a r l m g 也ep r e i i i l i m m es 洲n w i t h 缸t i s 黝， t h er e c o m b i n a n t p r o t e i nc o u l d 砌u c ee 伍c i c n t l yt i ”1 1 i 醢l e v e 王a n d s p e c i f i c 舭t i b o d yi g g ， m e 舭t i b o d yt i t e ri su pt o1 ：3 20 0 0 t h e s er e s u l t ss u g g e s t e d 廿1 a tt h er e c o m b i n a l l tp r o t e i na 1 1 t i s c o u l db eu s e dt od e t e c tt 1 1 em u s c l 王i la s “s s p e c i 蠡ca n 曲o d y k e y w o r d s ：m u s c l i nc 1 0 n e p m k a r y o t i ce x p r e s s i o np o l y c l o n a l 枷b o d y 4 大鼠肌肉素基因克隆、融合表达及多克隆抗体制各 刖吾 糖尿病是一种常见的内分泌代谢紊乱性疾病，是一组遗传和环境因素相互作 用而引起的临床综合征，以高血糖为其主要标志；其基本病理是各种原因造成胰 岛素相对或绝对缺乏，以及不同程度的胰岛素抵抗，引起糖、蛋白质、脂肪和继 发的水、电解质代谢紊乱，患病率日益增高。据w h o1 9 9 7 年报告，全球己确诊 1 3 5 亿人，预测2 0 2 5 年增至2 9 9 亿，增长最快的是在发展中国家如非洲，亚 洲和南美而在发达国家，糖尿病的流行已达到6 “3 ，更惊人的是在肥胖的白人 青少年中达到4 而其中2 5 的人具有异常的葡萄糖耐受。9 0 的糖尿病人患有 i i 型糖尿病。1 。糖尿病及其并发症不仅威胁人类健康和生命安全，降低生活质 量，而且带来沉重的经济负担。较严重的糖尿病并发症大多是由于动脉粥样化形 成导致心血管疾病发生，i i 型糖尿病人忠心血管疾病的病率是非糖尿病人的2 4 倍跚。 1 糖尿病新的诊断 1 9 9 7 年a d a 在分析和总结了全世界多个地区和国家资料基础上，鉴于 f b g 7 om m o l l 与b g2h n 1 衄o l 几在预防患病率和并发症上有良好的敏 感性和一致性，因而建议将f b g 由7 8 珊0 1 l - 1 改为7 0 唧o l l ，b g2h 1 1 1 硼o l l 不变，作为诊断标准铷旧。 燕犀痢糖耐量低减( 1 盯) 空履血耱受拯( i f 空膜或服持后2 小时空腹或服锗后2 小时空膜或服格后2 小 年新 ? o ( l 女竹n 1 2 0 0 )61 t 儿o ) 及 叫磅断标准 厦 1 1 1 ( 2 0 0 ) 1 蚺5 年w i o儿l ( 2 0 0 ) 78 ( 1 4 0 )78 h o ) 7b ( 1 4 0 ) 暂行标准臣 u 1 ( 2 帅) 诊断糖尿病和其他类型高血糖的数据 静脉血浆葡萄糖珊0 1 l ( m g d 1 ) 2 高血糖的病理生理学 胰岛素是控制血糖浓度的主要激素，机体中血糖浓度的稳定是由胰岛素的作 用和分泌相互协调来维持的旧。正常的胰腺b 细胞能够随着胰岛素的生理作用进 行调整，例如，胰岛素作用降低时，机体会增加p 细胞的功能作为补偿，与此同 7 大鼠肌肉素基因克隆、融合表达及多克隆抗体制各 时，空腹的血糖浓度会逐渐增加，随着时问的推进，由于葡萄糖毒性引起b 细胞 功能障碍。 2 1 胰岛素抗性 胰岛素抗性是由于胰岛素的生物学功能减弱抑制骨骼肌中葡萄糖的吸收和 肝脏中内源性葡萄糖的生成而产生的m 。然而在空腹状态下，肌肉只吸收小部分 的葡萄糖，而内源性葡萄糖的生成导致所有的葡萄糖进入血中嘲嘲。在糖尿病初 期和中期阶段，血中胰岛素过多会加快i i 型糖尿病或空腹血糖受损病人的内源性 葡萄糖的生成，因此，肝细胞胰岛素抗性是i i 型糖尿病人高血糖的主要驱动力。 2 2 肥胖 很多机制表明胰岛素抵抗和肥胖密切相关，脂肪细胞分泌的各种激素、细胞 因子和代谢能量物质如自由脂肪酸能调控胰岛素的生理作用。在内脏或皮下脂肪 中贮存的甘油三酸酯使脂肪细胞能够抵抗胰岛素抑制的脂解作用，因此必然使自 由脂肪酸和甘油含量增加，而脂肪酸和甘油又进一步调控胰岛素的生理作用加剧 骨骼肌和肝脏的胰岛素抵抗m “1 。 3 细胞机制 胰岛素结合、激活细胞膜上的受体后通过一系列下游信号通路将胰岛素信 号往下游传递，最终达到提高葡萄糖运输、细胞分化和调节酶活性等生物功能o ”。 胰岛素受体属于配体激活的受体酪氨酸激酶超家族成员，因此受体下游的许多信 号通路都被不同的受体酪氨酸激酶所利用，即所谓的信号串联，只是利用幅度不 同。 3 1 胰岛素受体底物蛋白的磷酸化与去磷酸化 在胰岛素抵抗状态下，以下几种分子机制很可能参与阻碍胰岛素信号的传 递：酪氨酸磷酸酶使受体和受体底物的酪氨酸侧链去磷酸化，及在丝氨酸和苏氨 酸残基上发生磷酸化“”，磷酸酪氨酸磷酸酶1 b 在胰岛素信号的负调控中起着重 要作用“”。而胰岛素受体底物的丝氨酸和苏氨酸残基磷酸化降低胰岛素受体底物 作为底物能力，并抑制胰岛素受体底物偶联到下游效应系统。许多胰岛素受体底 物丝氨酸激酶已被识别，其中包括有丝分裂活化蛋白激酶，c j u nn - 端激酶，蛋 白激酶c 和磷脂酰肌醇激酶等等“”。胰岛素受体的内在化和细胞膜上受体的缺失 及胰岛素受体底物的降解也可以产生胰岛素信号传递的负调控“。细胞因子信号 抑制子家族蛋白也可以通过蛋白酶体遍在化路径参与胰岛素受体底物的降解“”。 3 2 脂肪细胞的分泌产物和炎症的作用 自由脂肪酸和炎症因子达到一定浓度后能严重影响胰岛素信号级联反应 “”“”。自由脂肪酸能抑制骨骼肌中胰岛素刺激的葡萄糖代谢，刺激肝脏的糖异生 作用。儿“1 ，且通过增加胞内二酰甘油含量，而二酰甘油能活化炎症激酶抑制剂。 大鼠肌肉素基因克隆、融合表达及多克隆抗体制各 b 激酶和c j u nn 一端激酶，并增加胰岛素受体底物1 的丝氨酸苏氨酸的磷酸化， 降低胰岛素受体底物1 ( i r s l ) 下游信号传递，最终活化细胞内激酶包括蛋白激 酶c 的同功酶啪“捌。而肿瘤坏死因子a 能提高脂肪细胞的脂解作用，进一步 增加自由脂肪酸含量，以产生对胰岛素信号通路负调控作用嘲。促炎症反应因子 白细胞介素6 则通过增加s 0 c s 蛋白表达量抑制胰岛素信号传递脚“2 ”。 3 3 核内因子。b ( n f 。b ) 和i k k 活性 最近研究发现胰岛素抵抗和经典的炎症信号通路有着紧密的联系。核内因 子。b ( n f 。b ) 在静息状态下通过结合抑制子i 。b 处于非活性状态，旦i 。b 激 酶( i i ( i ( ) 磷酸化i x b ，n f * b 被释放转移到细胞核中影响参与炎症效应的各种基 因的转录。而高剂量的水杨酸酯能改善由糖尿病和肥胖症引起的高血糖和胰岛素 抵抗是因为水杨酸酯能抑制i k k 活性啪瑚m “。通过提高i r s l 的酪氨酸磷酸化和 下游信号的活化，i k kb 敲除实验显示由自由脂肪酸引起的骨骼肌胰岛素抵抗能 回复到正常状态，这些结果表明i k k 也许可以成为治疗胰岛素抵抗的新靶位点 托】 3 4 线粒体代谢 在内脏中贮存的脂肪，甘油三酸酯累积表明i i 型糖尿病人线粒体脂肪氧化能 力有所缺失，该病人的肌细胞氧化能力受损和线粒体数含量减少嘲。p p a r ，辅激 活物1 ( p g c l ) 是线粒体脂肪酸氧化和a t p 合成基因的转录因子，在青年，瘦子 和父母是i i 型糖尿病的后代中，p p a r ，辅激活物1 含量降低表明线粒体氧化磷酸 化缺陷可能导致细胞脂肪的堆积1 。基因表达研究也显示p g c l 和相关基因产物 的表达量降低能影响胰岛索抵抗和型糖尿病患者的线粒体功能。”m 1 。 3 5 正常的胰岛素分泌 g l u t 2 被葡萄糖激酶磷酸化后，能将葡萄糖运输至胰腺被b 细胞快速吸收， 而g l u t 2 的磷酸化是b 细胞糖代谢的限速步骤。在b 细胞内，葡萄糖进一步降解 产生丙酮酸，丙酮酸再进入线粒体进行能量代谢产生a t p ，a t p 是胰岛素释放所 必需的能量物质，但也参与细胞膜的去极化，a d p a t p 的比值活化磺酰脲受体1 ( s u r l ) 蛋白，接着导致k + 通道的关闭，进而改变膜电位和打开c - 通道，激发 胰岛素的释放嘲。 3 6 葡萄糖毒性 9 大鼠肌肉素基因克隆、融合表达及多克隆抗体制备 葡萄糖毒性是由于高血糖能降低胰岛素的分泌而产生的一个概念，这也表明 随着血糖浓度的增加，对细胞组分的损害逐渐加深。小。事实上，胰岛索分泌的 损伤是大多数糖尿病人致病的原因，大约十年左右会发展为严重的胰岛素缺陷 侧。在b 细胞中，葡萄糖氧化代谢常会伴随着氧自由基的生成，而氧自由基又可 被催化酶和超氧化物歧化酶去除。b 细胞除含有少量的上述两种酶外，还有起 氧化还原调控作用的谷胱甘肽过氧化物酶o ”。高血糖在b 细胞中代谢产生大量的 氧自由基，对细胞组分进行破坏。胰岛素基因启动子的活性调控予一胰十二指肠 同源异形盒( p d 卜1 ) 的缺失是导致b 细胞功能异常的主要机制”。此外，氧自 由基能提高诱导e 细胞程序性死亡的n fkb 的活性。 3 7 脂毒性 糖尿病和非糖尿病人脂肪细胞的脂解作用提高了自由脂肪酸的浓度。有急性 研究表明脂肪酸提高胰岛素的分泌，但在2 4 小时后又抑制胰岛素的分泌。在葡 萄糖存在下，b 细胞中脂肪酸的氧化被抑制且长链乙酰辅酶进行累积啪1 ，推测该 现象的机制是正常的胰岛素分泌过程的一部分。然而长链乙酰辅酶a 通过打开b 细胞的k 通道也能降低胰岛素的分泌。第二个机制可能是增加非偶联蛋白2 的表 达，非偶联蛋白2 导致a t p 合成减少，进而引起胰岛素分泌不足。第三个机制可 能通过脂肪酸或甘油三酸酯诱导的神经酰胺合成或氧化亚氮的生成参与细胞 的程序性死亡* “，。 3 8 胰岛淀粉样蛋白 胰岛淀粉样蛋白由胰岛淀粉样肽组成，也称作胰淀素，胰淀素是胰岛b 细胞 的一种正常分泌产物，与胰岛素共同贮存在b 细胞的分泌颗粒中，二者在葡萄糖 及非糖促分泌剂的刺激下以一定比例( 摩尔比为1 ：1 0 0 ) 相伴释放到胰岛b 细 胞外“。胰岛淀粉样肽的生理学作用还不清楚，可能抑制胰岛素的行为、分泌和 胰高血糖素的分泌。有报道指出体积小的聚集物对细胞是有毒性的”1 ，很可能和 最终胰岛淀粉样蛋白的生成量有关。胰岛淀粉样蛋白并不存在所有的i i 型糖尿病 人体内1 。 在糖尿病初期，胰岛素的需求量增大，尤其是在高浓度的自由脂肪酸条件下 会导致胰岛淀粉样多肽聚集旧。也有报道i i 型糖尿病患者的嫡系亲属含胰岛淀粉 样肽量很少，而淀粉样蛋白在患有胰岛素抵抗的中年病人体内并未观察副m 3 。 因此胰岛淀粉样多肽在l i 型糖尿病患者体内的生理作用仍有待进一步研究。 4 高血糖的治疗 1 0 大鼠肌肉素基因克隆、融合表达及多克隆抗体制各 在治疗型糖尿病的方法上，首要考虑的是防止病人发生长期的并发症，胰 岛素抵抗是i i 型糖尿病发生的主要因素。因此首选的治疗方法是改善组织对胰岛 素的敏感性，这常常需要生活方式的改变，如适度的锻炼和减肥能明显降低受损 的葡萄糖耐受转化为糖尿病的危险性，也能改善代谢综合症引起的心血管风险参 数删。 4 1 噻唑霉素 能提高胰岛素敏感性主要是噻唑霉素类药物，这些药物不仅降低血糖，而且 增强血管功能，改善i i 型糖尿病的血脂障碍和炎症环境“”。噻唑霉素主要活化脂 肪组织的p p a ry 受体及调控脂肪代谢和脂肪分布，能降低血清中2 0 一4 0 的自由 脂肪酸，自由脂肪酸含量降低不但可以改善胰岛素的作用，而且通过降低脂毒性 增强昼细胞的功能，各种实验显示，噻唑霉素能增加6 细胞的功能达6 0 。然而 因噻唑霉素使脂肪细胞扩增和甘油三酸脂贮存，临床上噻唑霉素主要的副作用是 增加患者体重和患动脉粥样硬化的危险m 1 。 4 2 二甲双胍 自1 9 9 4 年美国批准使用临床二甲双胍以来，二甲双胍在全世界已得到广泛 应用，但确切的作用机制还不清楚。二甲双胍主要生理效应是降低肝脏的葡萄糖 异生作用，及空腹状态下的高血糖。二甲双胍另一个效应是提高胰岛素对肌肉 组织的敏感性，可能是由于二甲双胍降低自由脂肪酸的含量姗“刚。二甲双胍因各 种原因可以作为治疗型糖尿病的首选药物，通过改变胰岛素的敏感性，能降低 患心血管疾病的危险“”。而二甲双胍的主要副作用是胃肠的不耐受性，主要是由 服用量和吸收速率引起1 。 4 3q 一葡萄糖酶抑制剂 1 9 9 6 年，阿卡波糖和米格列醇推向市场，这两类药影响p p g 含量且和寡糖 竞争小肠上皮细胞的a 葡萄糖酶，进而抑制寡糖与a 葡萄糖酶结合。因此，当进 食后，该类药物能推迟碳水化台物的吸收，也不引起低血糖和降低体重。然而因 影响p p g 含量使a g i 效果显著低于其他试剂，且常发生肠胃气胀、腹部疼痛和腹 泻，因此在美国这些药品并不常用。 4 4 外源胰岛素 在缺乏胰岛素的情况下，噻唑霉素和二甲双胍并不能有效地发挥作用，因此 补给外源胰岛素可以增强噻唑霉素和二甲双胍的临床效果，而且能有效地减弱尤 大鼠肌肉素基因克隆、融合表达及多克隆抗体制各 其是在维管结构中炎症的发生过程。因此，为降低i i 型糖尿病的血糖浓度，可 以注射胰岛素并辅于口服胰岛素敏感类药。然而胰岛素和噻唑霉素联合使用会增 加水肿和心率衰竭的危险性，这在大多数欧洲国家已不允许联合使用了髓。 5 糖尿病的预防 通过早期治疗和预防糖尿病来减低糖尿病带来的负担是至关重要的。许多研 究表明进行规律性的饮食和运动及降糖药物的应用可以推迟或预防糖尿病，所用 药物有二甲双胍，阿卡波糖或噻唑霉素瑚1 。 6 肌肉素的研究概况 分子生物学和分子遗传学的飞速进展，使人们已开始从分子水平去研究、认 识疾病。糖尿病的发生除环境因素外，一些基因在发病中起重要作用。最近，日 本学者眦t o s h in i s h i z a w a 等从小鼠骨骼肌中获得一特异性分泌因子，该分泌 因子命名为肌肉素，肌肉素能作为一种自分泌和旁分泌因子在骨骼肌中起作用， 其m r n a 几乎只在骨骼肌中表达，并受营养条件和激素因子尤其是胰岛素的调控， 在肥胖的胰岛素抵抗小鼠骨骼肌中肌肉素的m r n a 表达水平相对于正常小鼠较 高，而f l a g 标记的肌肉素蛋自能抑制由胰岛素引起的葡萄糖吸收和糖原合成。 由此推测，肌肉素很可能参与机体糖代谢，且与糖尿病的发生、发展具有一定联 系。 骨髂肌参与糖代谢和脂代谢的内稳态平衡，它和脂肪组织特异性分泌脂肪因 子一样能特异性分泌生物活性因子嘲”1 即肌肉素。肌肉素由1 3 0 个氨基酸组成， 含有n 端3 0 个氨基酸信号肽序列，分子量为1 l k d a ，和人的序列同源性为7 5 9 ， 大鼠和小鼠之间的序列同源性为9 0 2 ：在肌肉素的c 端含有一个与利钠肽嘲1 ( a n p 、b n p 和c n p ) 高度同源的1 7 个氨基酸序列即推断的丝氨酸蛋白酶切割位点 ( k k k r ) ，这表明肌肉素和利钠肽一样，在i ( i ( k r 位点切割，但与利钠肽不同的是 这1 7 个氨基酸不是在两个半胱氨酸残基之间，因此不具有与利钠肽一样经折叠 产生尿钠排泄活性。 经研究，从哺乳动物细胞培养液中纯化的肌肉素的大小为1 5 2 0 k d a ，而从 大肠杆菌中提取的肌肉素大小为1 1 k d a ，可推测肌肉素蛋白在哺乳动物细胞内会 被修饰，而用切割o - 糖基化位点的神经氨酸苷酶未产生小片段，表明肌肉素的 修饰不是糖基化而有可能是其他修饰形式如脂肪酸化“”或酰胺化“”等，这些修饰 是蛋白活性的主要调控因素”2 】“”。 肌肉素作为内分泌因子进入血液还未确定，b r u n i n gp fa j 报道肌肉特 异性的胰岛素受体缺陷小鼠患有脂肪增生、体重增大，这些表明胰岛素介导的降 低脂肪含量的肌肉分泌因子的生成。有学者指出由腺病毒介导表达的肌肉素蛋自 大鼠肌肉素基因克隆、融合表达及多克隆抗体制各 在血清中能明显降低小鼠的脂肪含量，推测肌肉索可能是连接骨骼肌与脂肪的一 个信号分子，即接收胰岛素调控信息，控制脂肪含量。可以推测肌肉素蛋自传送 重要信号给骨骼肌或其他组织。因此建立有效、可信的方法检测肌肉素蛋白水平 将有助于了解肌肉素的生理学意义。 本研究采用r t - p c r 方法从大鼠骨骼肌中获得删s c j 咖c d n a ，并采用分子克 隆技术使该基因片段在大肠杆菌b l 2 1 内表达，获得了一融合蛋白，再免疫日本 大耳白兔制备了肌肉素融合蛋白多克隆抗体，为进一步研究肌肉素的作用位点及 其与糖尿病的发生、发展机理奠定基础。 1 3 大鼠肌肉素基因克隆、融合表达及多克隆抗体制备 第一部分大鼠肌肉素基因的克隆与表达 肌肉素是肌细胞特异分泌的多肽蛋白质，参与机体糖代谢和脂代谢，与糖 尿病的发生、发展有着密切联系。本文中，通过r t p c r 方法从大鼠骨骼肌中克 隆到肌肉素c d n a ，构建表达载体p g e x 一5 x 一3 一叫s c l i n ，并在b l 2 1 大肠杆菌中成 功表达了融合蛋白g s t m u s c l i n ，且对表达条件进行了优化。在最优化的表达条 件下，融合蛋白的表达量达到了1 4 2 。 1 材料和方法 1 1 材料 1 1 1 质粒和菌株 p g e x 一5 x 一3 d h 5d 及b l 2 1 菌 1 1 2 大鼠 1 1 3 工具酶和主要试剂 t r i z 0 1 试剂 a m v 第一链c d n a 合成试剂盒 t a qd n a 聚合酶 d n t p i x t u r e m g c l ? l i g a t i o ns 0 1 u t i o ni 限制性内切酶 b a c t ot r y p t o n b a c t oy e a s t e x r a c t 酚：氯仿 u n i q 1 0 柱式d n a 胶回收试剂盒 a n t i g s tm o u s em o n o c l o n a la n t i b o d y g o a ta n t im o u s ei g g h r p 1 4 本实验室保存 王筱兰老师馈赠 江西医学院 mdb 1 0 1 n c 上海生工 b m i 公司 t a k a r a 公司 t a k a r a 公司 t a k a r a 公司 t a k a r a 公司 o x o i d 公司 o x o i d 公司 上海生工 上海生工 北京普利莱公司 北京中杉公司 大鼠肌肉素基因克隆、融合表达及多克隆抗体弗4 备 d a b l b 液体培养基：( p h 7 0 ) 胰蛋白胨 酵母提取物 氯化钠 l b 固体培养基：( p h 7 o ) 胰蛋白胨 酵母提取物 氯化钠 琼脂 主要溶液； 溶液i ： 葡萄糖 t r i s c 1 ( p h 8 0 ) e d t a ( p h 8 o ) 溶液i i ： n a 0 h s d s 溶液： 5 m o l 1 乙酸钾 冰乙酸 水 t e 缓冲液( p 1 8 o ) t r i s c 1 ( p h 8 o ) e d t a c 8 c l 。溶液 c a c l 2 包涵体纯化所需溶液： 溶液l ： t r i s c 1( p h 8 0 ) 1s 博士德公司 1 0g 1 5g 1 1 0g l 1 0g l 5g l l og l 1 5g 1 5 0 衄0 1 l 2 5 姗o l l 1 0 岫0 1 1 o 。2m 0 1 1 1 6 0m l 1 1 5m 1 2 8 5m l 1 0 唧o l 1 li f l f n 0 1 l o 1 咖o l l l o 帅o l 1 大鼠肌肉素基因克隆、融合表达及多克隆抗体制备 e i a t r i t o nx 一1 0 0 溶液2 ： t r i s c 1( p h 8 0 ) e d t a n a c l 溶液3 t r i s c l ( p h 8 o ) e d t a u r e a 溶液4 t r i s c l ( p h 8 0 ) e d t a u r e a 溶液5 t r i s c 1 ( p h 8 0 ) e d t a u r e a 溶液6 t r i s c l( p h 8 o ) e d t a u r e a 溶液7 t r i s c 1( p h 8 o ) e d t a u r e a 常用的电泳缓冲液： 1 0 xt r i s 一硼酸( t b e ) t r i s 碱 硼酸 1 6 1 衄o l l 0 5 1 0 咖0 1 1 l 姗o l l lm 0 1 1 1 0m m o l l 1h 吼o l l o 5 m 0 1 1 1 0 珊o l 1 li t 【1 0 1 l 1m o l l 1 0 m o l 1 lm m 0 1 1 1 5m 0 1 1 1 0i 砌o l l li 珊o l 1 2m 0 1 1 1 0f 砌o l l 1 硼o l l 8 m 0 1 l 1 0 8g 1 5 5g l 奎塾坚堕墨苎里塞堕：壁垒室垄墨查塞堕垫竺型鱼 0 5m 0 1 1e d t a 4 0m l 5xt r i s 一甘氨酸 t r i s 碱 1 5 1g l 甘氨酸 9 4g l 1 0 s d s 5 0m 】 s d s p a g e 所需溶液： 1 5 的分离胶( 1 0 皿1 ) 水 3 0 丙烯酰胺溶液 1 5m o l lt r i s ( p h 8 8 ) l o s d s 1 0 过硫酸铵 t e m e d 5 的积层胶( 3m 1 ) 水 3 0 丙烯酰胺溶液 1 0 m o l lt r i s ( p h 8 8 ) 1 0 s d s 1 0 过硫酸铵 t e m e d 1 x s d s 凝胶加样缓冲液： t r i s c l ( p h 6 8 ) d t t s d s 溴酚蓝 甘油 蛋白印迹分析 转移缓冲液： 甘氨酸 t r i sb a s e 1 7 2 3m l 5 om l 2 5m 1 0 1m 1 o 1m l 0 0 0 4 m 1 2 1m l 0 5 m l o 3 8m l o 0 3m 1 0 0 3m l o 0 0 3m 1 5 0 彻0 1 l 1 0 0 眦o l l 2 0 1 1 0 3 9 姗0 1 l 4 8 咖0 1 l 大鼠肌肉索基因克隆、融合表达及多克隆抗体制各 s d s 甲醇 封闭缓冲液 o 0 3 7 2 0 ( v v ) 含5 脱脂奶粉的p b s 缓冲液 p b s 在8 0 0 毫升蒸馏水溶解8g n a c l ，o 2g k c l ，1 4 4gn a m p 吼，0 2 4g k h z p 0 4 ， 用h c l 调节溶液的p h 值至7 4 ，加水定容 至1 l ，高压蒸汽灭菌2 0 分钟，保存至室温。 t s ( p h 7 5 ) n a c l1 5 0 册0 1 l t r i s c l5 0 m m 0 1 l 1 1 6 主要仪器 台式高速冷冻离心机 p c rs y s t e m 水平凝胶电泳仪 垂直凝胶电泳槽 凝胶成像系统 恒温振荡器 隔水式恒温水浴培养箱 1 2 方法 k e n d r og e r a n y 杭州博日科技有限公司 北京市六一仪器厂 湖南天能 u d l a n d ， usa 常州围华电器有限公司 上海新苗医疗器械制造有限公司 1 2 1 目的基因引物的设计与合成 根据g e n b a n k 发表的肌肉素c d n a 序列，利用引物设计软件0 1 i g o6 分别 设计m u s c l i n 组件的上、下游引物，引物由上海生物工程有限公司合成，在上 游引物5 ，端加入b a j ni 酶切位点和保护碱基a t ，下游引物57 端加入s a li 酶 切位点和保护碱基t a g c a t c c 上游引物：5 a t g g a t c ca ga t gc t gg a ct g ga g at t g 3 下游引物：5 t a g c a t c c g t c g a ct c ag c ct c tt g g 从ct g ga g 3 。 大鼠肌肉素基因克隆、融合表达及多克隆抗体制各 1 2 2 大鼠肌肉组织总r n a 的提取 1 )取5 0 毫克肌肉组织加入玻璃研磨器中，再加入1m l 豫i z 0 1 试剂， 不断研磨至肌肉破碎，转入一1 5 l 离心管中，室温放置5 分钟。 2 ) 加入2 0 0 p l 氯仿，剧烈悬摇2 0 秒，室温放置5 分钟。 3 ) 于4 ，1 2o o og 离心1 5 分钟， 4 ) 取出无色水相，转入另一离心管中，加入l l 乙醇，混匀后室温置 1 5 分钟，于4 ，1 2 0 0 0 9 离心1 0 分钟。 5 ) 用7 5 的乙醇洗涤管底沉淀，自然干燥后溶解于5 0 m 用d e p c 处理的 水中。取5 皿用1 的琼脂糖凝胶电泳分析其完整性及测定其0 d 。o d 。 以确定总r n a 的浓度和完整性。 1 2 3 目的蛋白基因的扩增与鉴定 1 )将合成的引物稀释成2 0 岫o l 几，以提取的总r n a 为模板，按r t 试 剂盒使用说明书进行总体积1 0p l 的反转录反应。 2 )以r t 反应产物为模板，以特异性合成引物进行p c r 反应，条件为： 9 4 2m i n ；i 三i 己；。 s s c r c ，e s 5 5 3 0s 3 5c y c l e 8 7 2 1m i nj 3 ) 1 琼脂糖凝胶电泳对p c r 产物进行鉴定，切下目的d n a 凝胶带，按 d n a 胶回收试剂盒说明从凝胶中回收纯化目的d n a 。 。 1 2 4 目的d n a 和p g e x 一5 x 一3 的双酶切 1 )用5 0 “l 体系酶切 1 0 xkb u f f e r d n a h ：o b 鲫hi 5 蛆 l 3 4 扯l l l 2 ) 3 0 保温3 小时后，加入等体积的酚：氯仿，振荡1 5 秒，于4 1 2 0 0 0 9 离心3 分钟； 3 ) 取上清置一新管中，再加入等体积的氯仿，振荡1 5 秒，于4 1 2 0 0 0 9 1 9 大鼠肌肉素基因克隆、融合表达及多克隆抗体制各 离心3 分钟； 4 ) 取上清，加入2 倍体积的无水乙醇，混匀置一2 0 3 0 分钟，于4 1 2 0 0 0 9 离心1 5 分钟，弃上清； 5 ) 用适量的7 0 乙醇洗涤沉淀，上下翻转，弃上清 6 ) 将管置室温自然凉干 7 ) 于管中加 1 0 xhb u f f e r5 蛆 h 20 4 4 址1 s a lil p l 8 ) 3 7 温育3 小时 9 ) 跑1 的琼脂糖凝胶电泳，切下酶切产物的凝胶带 1 0 ) 按胶回收试剂盒使用说明回收目的d n a 片段，并定量。 1 2 5 大肠杆菌感受态细胞的制备 1 )取冻存的菌种于l b 平板上划线，3 7 恒温培养过夜 2 )次日挑取生长良好的单菌落接种5 毫升液体培养基中，3 7 2 0 0 r p m 振荡培养过夜。 3 )取o 5 毫升活化后的菌液接入5 0 毫升l b 液体培养基中，3 7 2 0 0 r p m 振荡培养至o d 。为o 4 一o 6 4 ) 菌液冰浴1 0 分钟后，于4 4 0 0 0r m i n 离心1 0 分钟，弃上清， 收获细胞 5 )用l o 毫升预冷的c a c l ：溶液悬浮细胞，冰浴中置2 0 分钟后，于4 4 0 0 0 r m i n 离心1 0 分钟，弃上清，收获细胞 6 )用2 毫升预冷的c a c l 。溶液( 含l o 甘油) 悬浮细胞，然后分装成o 2 毫升一份先予4 贮存1 2 2 4 小时，再置一8 0 储存。 1 2 6 质粒d n a 的转化 1 ) 从一8 0 取出感觉态细胞，于冰上融化，轻弹混匀 2 ) 取5 雌质粒加入感受态细胞中，轻弹混匀后置冰浴中3 0 分钟 3 ) 取出置4 2 水浴热激9 0 秒 4 ) 再置冰浴中3 5 分钟 5 ) 于管中加8 0 0 “ll b 培养基，3 7 振荡培养4 5 分钟 6 )取2 0 0 叮培养物涂布于l b ( 含氨苄青霉素6 0 瞻m 1 ) 上，待菌液充 分吸收后倒置平板置3 7 ，于培养箱中过夜培养 大鼠肌肉索基因克隆、融合表达及多克隆抗体制备 1 2 7 质粒d n a 的提取 1 ) 将过夜培养的菌液取1 5 毫升加入e p 管中，1 2o o o g 离心2 分 钟，弃上清 2 ) 将菌体悬浮于1 0 0 m 预冷的溶液i 中 3 ) 加2 0 0 “1 新配制的溶液，上下颠倒，直至变清亮 4 ) 加1 5 0 肛l 预冷的溶液，振荡混匀至产生白色絮状沉淀 5 ) 1 20 0 0 9 离心1 5 分钟，取上清 6 ) 加入r n a 酶，3 7 水浴保温3 0 分钟 7 ) 加入等体积的酚：氯仿，振荡后， 1 2o o o g 离心3 分钟，取上清 8 ) 加入等体积的氯仿， 振荡后， 1 2o o o g 离心3 分钟，取上清 9 ) 加入2 倍体积的无水乙醇。摇匀后一2 0 置3 0 分钟 1 0 ) 1 20 0 0 9 离心1 0 分钟，弃上清 1 1 ) 室温自然干燥后用3 0 1 t e 溶解，置一2 0 1 2 8 重组原核表达载体的构建 将回收的目的片段和载体酶切大片段以l ：3 的摩尔比混合，置4 5 水浴5 分钟，将二者用t a k a r a 公司的l i g a t i o ns o l u t i o ni 在1 6 连接3 0m i n ，连 接产物转入用c a c l ：致敏的d h 5a 菌株中，提取转化质粒，经p c r 与测序鉴定连 接方向正确后再将质粒转化b l z l 菌株。 1 2 9 重组蛋白的表达与鉴定 1 2 9 1 诱导表达 将含p g e x - 5 x 一3 一m u s c l i n 的b l 2 1 菌株接种子含有a m p 的培养基中，3 7 振 荡培养，当菌液浓度在o d 跚达到o 4 1 5 时，取出l m l 菌液作对照，然后加入i p t g 至终浓度1 j i 】i n o l l ，继续诱导培养3 小时。 1 2 9 2 目的蛋白的s d s p a g e 电泳 取诱导后的培养液1m 1 于1 2 0 0 0g 离心2 分钟，弃上清，沉淀菌体加1 0 0u l l x s d s 加样缓冲液，振荡混匀后沸水浴加热5m i n ，在1 5 的s d s p a g e 凝胶中 电泳，然后将胶用考马斯亮蓝染色3 0 分钟，用脱色液洗脱后观察表达结果。 1 2 9 3 目的蛋白的免疫印迹分析 1 ) 将诱导表达的重组菌按常规方法进行s d s _ p a g e 电泳，并将凝胶上的蛋 白带用电转移法转至硝酸纤维素膜上。 2 i 大鼠肌肉素基因克隆、融合表达及多克隆抗体制备 2 ) 3 ) 4 ) 5 ) 6 ) 用含5 脱脂奶粉的p b s 缓冲液封闭膜2 小时，然后将稀释1 0 0 0 倍的 a n t i - g s t 鼠源单抗与膜在室温下孵育1 小时。 用p b s 漂洗膜3 次，每次1 0 分钟。 用ts 洗膜10 分钟后， 最后将稀释5 0 0 0 倍的辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠i g g 与膜在室温下 作用l 小时，再用t s 漂洗膜3 次，每次1 0 分钟， 用溶解于0 0 1 m 0 1 lt r i s c 1 的d a b 和h ：o ：对膜上酶标记物显色。 1 2 1 0 分析表达蛋白的存在形式 1 )将诱导表达的5 0 m 1 菌液以5 0 0 0 9 在4 离心1 5 分钟，加入5 m l5 0 j i 】m t r i s c 1 溶解沉淀并加l m l1 的t r i o nx l o o 混匀。 2 )用超声破碎仪处理菌液共2 0 分钟，1 0 s 破碎2 0 s 间歇，共2 0 次。然 后在4 以1 20 0 0 9 离心1 5 分钟，收集上清和沉淀进行s d s p a g e 电 泳，分析蛋白存在状态。 1 2 1 1p g e x 一5 x 一3 一m u s c i ；n 在原核细胞中表达条件的最优化 1 2 11 1 p g e x 一5 x 一3 _ m u s cl ln 在原核细胞中表达条件的优化 1 ) 将含p g e x 一5 x _ 3 一m u s c l i n 的b l 2 l 菌株接种到