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食品仪器分析 1、 色谱分析法导论 色谱法分类、特点；分类：(1)气相色谱：流动相为气体（称为载气）。按固定相的不同又分为：气固色谱和气液色谱；按色谱柱可分为：填充柱色谱和毛细管柱色谱；(2)液相色谱：流动相为液体（称为淋洗液）。按固定相的不同分为：液固色谱和液液色谱。（3）其他色谱方法薄层色谱和纸色谱：用于初步定性的色谱方法凝胶色谱法：测聚合物分子量分布超临界色谱: co2流动相高效毛细管电泳:九十年代快速发展、特别适合生物试样分析分离的高效分析仪器特点：（1）分离效率高：复杂混合物，有机同系物、异构体、手性异构体。（2）灵敏度高：可以检测出g.g-1(10-6)级甚至ng.g-1(10-9)级的物质量。（3）分析速度快：一般在几分钟或几十分钟内可以完成一个试样的分析。（4）应用范围广： 气相色谱：沸点低于400、结构稳定的各种有机或无机试样的分析。 液相色谱：高沸点、热不稳定、生物试样的分离分析。 色谱曲线图及有关术语；（一）组分分离 当流动相中样品混合物经过固定相时，就会与固定相发生作用，由于各组分在性质和结构上的差异，与固定相相互作用的类型、强弱也有差异，因此在同一推动力的作用下，不同组分在固定相滞留时间长短不同，从而按先后不同的次序从固定相中流出。（二）色谱流出曲线和色谱峰 由检测器输出的信号强度对时间作图，所得曲线称为色谱流出曲线。曲线上突起部分就是色谱峰。色谱流出曲线和色谱峰基线：在实验操作条件下，色谱柱后没有样品组分流出时的流出曲线称为基线，稳定的基线应该是一条水平直线。峰高：色谱峰顶点与基线之间的垂直距离，以（h）表示。（三）保留值 1.死时间tm 不被固定相吸附或溶解的物质进入色谱柱时，从进样到出现峰极大值所需的时间称为死时间，它正比于色谱柱的空隙体积，如下图。2. 保留时间tr 试样从进样到柱后出现峰极大点时所经过的时间，称为保留时间，如下图。 组分在色谱柱中的保留时间tr包含组分通过柱子的时间和组分在固定相中滞留的时间，所以tr实际上是组分在固定相中保留的总时间。3.调整保留时间tr 某组分的保留时间扣除死时间后，称为该组分的调整保留时间，即 tr= tr - tm 4分离度分离度是描述难分离物质对的实际分离程度。即柱效为多大时，相邻两组份能够被完全分离。难分离物质对的分离度大小受色谱过程中两种因素的综合影响：保留值之差色谱过程的热力学因素；区域宽度色谱过程的动力学因素。塔板理论；塔板理论的假设：(1) 在每一个平衡过程间隔内，平衡可以迅速达到；(2) 将载气看作成脉动（间歇）过程；(3) 试样沿色谱柱方向的扩散可忽略；(4) 每次分配的分配系数相同。当流动相中携带的混合物流经固定相时，其与固定相发生相互作用。由于混合物中各组分在性质和结构上的差异，与固定相之间产生的作用力的大小、强弱不同，随着流动相的移动，混合物在两相间经过反复多次的分配平衡，使得各组分被固定相保留的时间不同，从而按一定次序由固定相中流出。理论塔板数 n 定义为: 有效塔板数和有效塔板高度单位柱长的塔板数越多，表明柱效越高。用不同物质计算可得到不同的理论塔板数。组分在tm时间内不参与柱内分配。需引入有效塔板数和有效塔板高度：速率理论；1. 速率方程 h = a + b/u + cu h：理论塔板高度， u：载气的线速度(cm/s)减小a、b、c三项可提高柱效；存在着最佳流速；a涡流扩散项 a = 2dp dp：固定相的平均颗粒直径：固定相的填充不均匀因子固定相颗粒越小dp，填充的越均匀，a，h，柱效n。表现在涡流扩散所引起的色谱峰变宽现象减轻，色谱峰较窄。b/u 分子扩散项 b = 2 dg ：弯曲因子，填充柱色谱， 甲酰胺 乙腈 甲醇 乙醇 丙醇 丙酮二氧六环 四氢呋喃 甲乙酮 正丁醇 乙酸乙酯 乙醚 异丙醚 二氯甲烷氯仿溴乙烷苯四氯化碳二硫化碳环己烷己烷煤油(最小)主要分离类型与基本原理；1 液-固吸附色谱基本原理：组分在固定相上的吸附与解吸；适用于分离相对分子质量中等的油溶性试样，对具有官能团的化合物和异构体有较高选择性；2. 液-液分配色谱基本原理：组分在固定相和流动相上的分配；3. 离子交换色谱基本原理：组分在固定相上发生反复离子交换反应；组分与离子交换剂之间亲和力的大小与离子半径、电荷、存在形式等有关。亲和力大，保留时间长。4. 离子对色谱原理：将一种（或多种）与溶质离子电荷相反的离子（对离子或反离子）加到流动相中使其与溶质离子结合形成疏水性离子对化合物，使其能够在两相之间进行分配；5. 尺寸排斥色谱原理：按分子大小分离。小分子可以扩散到凝胶空隙，由其中通过，出峰最慢；中等分子只能通过部分凝胶空隙，中速通过；而大分子被排斥在外，出峰最快；溶剂分子小，故在最后出峰。6. 亲和色谱原理：利用生物大分子和固定相表面存在的某种特异性亲和力，进行选择性分离。液相色谱-质谱联用。色-质联用技术被广泛应用于复杂组分的分离与鉴定，其具有色谱的高分辨率和质谱的高灵敏度，是生物样品中药物与代谢物定性定量的有效工具。 质谱仪的基本部件有：离子源、滤质器、检测器三部分组成，它们被安放在真空总管道内。 接口：由gc出来的样品通过接口进入到质谱仪，接口是色质联用系统的关键。 接口作用：1.压力匹配质谱离子源的真空度在10-3pa，而gc色谱柱出口压力高达105pa，接口的作用就是要使两者压力匹配。2.组分浓缩从gc色谱柱流出的气体中有大量载气，接口的作用是排除载气，使被测物浓缩后进入离子源。 4、质谱分析法质谱分析原理：质谱分析依据：运动的带电离子在磁场中发生偏转,偏转半径与离子质量有关；质谱分析方法：是将样品转化为运动的带电气态离子，于磁场中按质荷比(m/z)大小分离并记录的分析方法。带电离子的运动理论：正离子在电场中受到电场力作用而加速()，其位能为ev，加速后的动能为：1/2*mv2=ev正离子进入磁场，运动方向与磁场垂直，离子受到洛仑兹力 f 作用：f=hev，m为碎片质量，为碎片速度，e为离子电荷，v为电压，h为磁场强度；洛仑兹力与离子偏转的向心力相等 当h、r、v三个参数中任两个保持不变而改变其中一个参数时，可得质谱图。现代质谱仪通常是保持v、r不变，通过扫描磁场来得到质谱图。仪器组成：真空系统：质谱仪中所有部分均要处高度真空的条件下(10-4-10-6torr或mmhg), 其作用是减少离子碰撞损失。真空度过低，将会引起：大量氧会烧坏离子源灯丝；引起其它分子离子反应，使质谱图复杂化；干扰离子源正常调节；用作加速离子的几千伏高压会引起放电。进样系统：液体入口，适用于低挥发度样品，对易分解样品，通常使用衍生法转化为稳定化合物后分析；气体入口，气态样品离子源电离室：将引入的样品转化成为碎片离子的装置。根据样品离子化方式和电离源能量高低，通常可将电离源分为：气相源，先蒸发再激发，适于沸点低于500oc、对热稳定的样品的离子化，包括电子轰击源、化学电离源、场致电离源、火花源等；解吸源，固态或液态样品不需要挥发而直接被转化为气相，适用于分子量高达105的非挥发性或热不稳定性样品的离子化，包括场解析源、快原子轰击源等。电子轰击源：采用高速（高能）电子束冲击样品，从而产生电子和分子离子m+，m+继续受到电子轰击而引起化学键的断裂或分子重排,瞬间产生多种离子。优点：使用最广泛，谱库最完整；电离效率高；结构简单，操作方便；缺点：因电离能量最高, 出现大量碎片峰,且很难得到分子离子峰.，不适合不稳定物质的检测。化学电离源：样品分子在承受电子轰击前，被一种反应气(通常是甲烷)稀释，稀释比例约为103:1，因此样品分子与电子的碰撞几率极小，所生成的样品分子离子主要由反应气分子组成。进入电离源的样品分子大部分与ch5+碰撞产生(m+1)+离子；小部分与c2h5+反应，生成(m-1)+离子。特点：电离能小，质谱峰数少，图谱简单；准分子离子峰(m+1)+大,可提供分子量这一重要信息。常用于有机和生物样品的分析。质量分离器：将不同碎片按质荷比m/z分开。质量分析器类型：磁分析器（用一个扇形磁场进行质量分析的质谱仪）、飞行时间、四极杆、离子阱、离子回旋共振等。离子检测器：记录仪电离源（上面有）质量分析器：质谱图：横坐标是m/e，纵坐标是相对丰度。相对丰度：原始质谱图上最强的离子峰为基峰，定为100%。其它离子峰以此基峰的相对百分值表示。离子峰：包括分子离子峰、碎片离子峰、同位素离子峰、重排离子峰、亚稳离子峰和多电子离子峰等。分子离子峰，分子受电子撞击后，失去一个电子而生成带正电荷的离子，分子离子峰m/e数值, 相当于该化合物的相对分子质量，且位于质谱图的右端，因为m/e最大；碎片离子峰，在高能量电子源轰击情况下，分子离子处于激发状态，原子间的一些键进一步断裂，产生质量数较低的碎片，是获取分子结构相关信息的重要依据；亚稳离子峰，离子离开电离室到达收集器之前的过程中，发生分解而形成低质量的离子所产生的峰（子离子与中性碎片）；重排离子峰，两个或两个以上键的断裂中，某些原子或基团从一个位置转移到另一个位置生成的离子，转移基团多为氢原子；多电荷离子峰，非常稳定的分子，可能失去两个或两个以上的电子，在的位置上出现多电荷峰。5、 核磁共振波谱法核磁矩：原子核是带正电荷的粒子，和电子一样有自旋现象，因而具有自旋角动量以及相应的自旋量子数。由于原子核是具有一定质量的带正电的粒子，故在自旋时会产生核磁矩。核磁矩和角动量p都是矢量，它们的方向相互平行，且磁矩与角动量成正比，即：=p式中：为磁旋比（magnetogyricratio), radt1s1，即核磁矩与核的自旋角动量的比值，不同的核具有不同旋磁比，它是磁核的一个特征值；为磁矩，用核磁子表示，1核磁子单位等于5.051027jt1；p为角动量。p为角动量，其值是量子化的，可用自旋量子数表示：式中：h为普郎克常数（6.631034js）；i为自旋量子数，与原子的质量数及原子序数有关。自旋量子数：当i=0时，p=0，原子核没有磁矩，没有自旋现象；当i0时，p0，原子核磁矩不为零，有自旋现象。 i=1/2的原子核在自旋过程中核外电子云呈均匀的球型分布，见图3.1（a）核磁共振谱线较窄，最适宜核磁共振检测，是nmr主要的研究对象。i1/2的原子核，自旋过程中电荷在核表面非均匀分布。（原子核的自旋形状）有机化合物的基本元素1h、13c、15n、19f、31p等都有核磁共振信号，且自旋量子数均为1/2，核磁共振信号相对简单，已广泛用于有机化合物的结构测定。最为常用的是1h,结构简单,且所有有机化合物中都有1h存在。自旋取向数：按照量子力学理论，自旋核在外加磁场中的自旋取向数不是任意的，可按下式计算：自旋取向数m= 2i1以1h 核为例，因i =1/2，故在外加磁场中，自旋取向数=2（1/2）1=2，即有两个且自旋相反的两个取向，其中一个取向磁矩与外加磁场b0一致；另一取向，磁矩与外加磁场b0相反。两种取向与外加磁场间的夹角经计算分别为54024（1）及125036（2）。见图：核磁共振及共振条件：(1)核磁共振 已知核从低能级自旋态向高能态跃迁时，需要一定能量，通常，这个能量可由照射体系用的电磁辐射来供给。如果用一频率为射的电磁波照射磁场中的1h核时，电磁波的能量为： e射 = h v射当电磁波的频率与该核的回旋频率回相等时，电磁波的能量就会被吸收，核的自旋取向就会由低能态跃迁到高能态，即发生核磁共振。此外e射=e，所以发生核磁共振的条件是：或可见射频频率与磁场强度b0是成正比的，在进行核磁共振实验时，所用磁场强度越高，发生核磁共振所需的射频频率越高。（2）共振条件(1) 核有自旋(磁性核)(2) 外磁场,能级裂分;(3) 射频辐射照射频率与外磁场的比值 2b0 = h v 化学位移：n0 = g / (2p ) （1- s ）h0 由于屏蔽作用的存在，氢核产生共振需要更大的外磁场强度（相对于裸露的氢核），来抵消屏蔽影响。 在有机化合物中，各种氢核周围的电子云密度不同（结构中不同位置）共振频率有差异，即引起共振吸收峰的位移，这种现象称为化学位移,用d(delta)表示。a.化学位移的表示方法a. 位移的标准没有完全裸露的氢核，没有绝对的标准。 相对标准：四甲基硅烷si(ch3)4 （tms）（内标） 位移常数 dtms=0b. 为什么用tms作为基准? ( 1 ) 12个氢处于完全相同的化学环境，只产生一个尖峰； （2）屏蔽最大，位移最大，人为地把它的d定为0 （3）化学惰性；易溶于有机溶剂；沸点低，易回收。b. 影响化学位移的因素c. 化学位移表示方法 因为化学位移数值很小，质子的化学位移只有所用磁场的百万分之几，所以要准确测定其绝对值比较困难。实际工作中，由于磁场强度无法精确测定，故常将待测氢核共振峰所在磁场b0(sample)与某标准物氢核共振峰所在磁场b0(ref) 进行比较，把这个相对距离叫做化学位移，并以表示： 屏蔽效应：理想化的、裸露的氢核, 满足共振条件： n0 = g h0 / (2p ) 产生单一的吸收峰； 实际上，氢核受周围不断运动着的电子影响。在外磁场作用下，运动着的电子产生相对于外磁场方向的感应磁场，起到屏蔽作用，使氢核实际受到的外磁场作用减小： h=（1- s ）h0 s：屏蔽常数。 s 越大，屏蔽效应越大。 n0 = g / (2p ) （1- s ）h0 核周围的电子对核的这种作用，叫做屏蔽作用，各种质子在分子内的环境不完全相同，所以电子云的分布情况也不一样，因此，不同质子会受到不同强度的感应磁场的作用，即不同程度的屏蔽作用，那么，核真正受到的磁场强度为h= b0(1- ) (为屏蔽常数）。因此共振频率与磁场强度之间有如下关系： 从上式看出，如果将射频固定而改变磁场强度时，不同环境的质子（即具有不同屏蔽参数的质子）会一个接一个地产生共振。不同类型氢核因所处的化学环境不同，共振峰将出现在磁场的不同区域。 这种由于分子中各组质子所处的化学环境不同，而在不同的磁场产生共振吸收的现象称为化学位移。自旋核在h0中的感生磁场 在外磁场作用下这些电子可产生诱导电子流，从而产生一个诱导磁场，该磁场方向和外加磁场方向恰好相反。这样使氢核受到外加磁场的影响要比实际外加磁场强度小，这种效应叫屏蔽效应。 原子核感受到的磁场强度：因此，在有屏蔽效应时，要发生核磁共振就必须使外加磁场强度h外加磁场略有增加以抵消感生的磁场强度。 n+1规律：一组化学等价（化学位移值相同）的质子，若其相邻碳原子上有n个质子，则其分裂峰数目为n+1。各峰的高度比与二项展开式(a+b)n的各项系数比一致。6、 紫外-可见分光光度法 1.电子能级分子吸收光谱的产生对应三种能级：电子能级、振动能级和转动能级能量: 电子能量ee 、振动能量ev 、转动能量er 而且: e v r 分子能量: eee+ev+er（1）电子能级: 电子的跃迁能约为1-20 ev，比分子振动能级差要大几十倍，所吸收光的波长约为12.5 - 0.06mm，主要在真空紫外到可见光区，对应形成的光谱，称为电子光谱或紫外、可见吸收光谱2.振动能级和转动能级振动能级:分子的振动能级差一般在0.05 - 1 ev，需吸收波长约为25 -1.25mm的红外光才能产生跃迁。在分子振动时同时有分子的转动运动。这样，分子振动产生的吸收光谱中，包括转动光谱，故常称为振-转光谱。转动能级:转动能级间的能量差r：0.005 0.050ev，产生此能级的跃迁，需吸收波长约为250-25mm的远红外光,吸收光谱位于远红外区。形成的光谱称为远红外光谱或分子转动光谱；3.电子跃迁类型，生色团生色团: 分子中能吸收紫外光或可见光的结构系统叫做生色团或色基。象c=c、c=o、cc等都是生色团。4.助色团有些原子或基团，本身不能吸收波长大于200nm的光波，但它与一定的基团相连时，则可使该基团所产生的吸收峰向长波长方向移动。并使吸收强度增加，这样的原子或基团叫做助色团。 特点：助色团一般是带有p电子(非键电子对)的基团。例如： 5.红移和蓝移长移和短移 (红移和蓝移)长移:某些有机化合物因反应引入含有非键电子对的基团（助色团）使吸收峰向长波长移动的现象称为长移或红移，这些基团称为向红基团；短移:使吸收峰向短波长移动的现象称为短移或蓝移，引起蓝移效应的基团称为向蓝基团。6.紫外可见光度计仪器组成1)光源 对光源基本要求：足够光强、稳定、连续辐射且强度随波长变化小。 钨及碘钨灯：340-2500 nm，多用在可见光区； 氢灯和氘灯：160-375nm，多用在紫外区。2) 单色器单色器由色散元件和狭缝组成，常用的色散元件有棱镜和光栅两类。单色器作用：获得半宽度5-10nm的单色光。3)吸收池(样品池)(cell，container)：吸收池放置各种类型的吸收池（比色皿）和相应的池架附件。吸收池主要有石英池和玻璃池两种。在紫外区须采用石英比色皿，可见区一般用石英比色皿和玻璃池比色皿。4)检测器利用光电效应将透过吸收池的光信号变成可测的电信号，常用的有硒光电池、光电管或光电倍增管。5)结果显示记录系统 检流计、数字显示、微机进行仪器自动控制和结果处理.7. 分光光度计的类型单波长单光束721、722、752型等,简单，价廉，适于在给定波长处测量吸光度或透光度，一般不能作全波段光谱扫描，要求光源和检测器具有很高的稳定性单波长双光束国产730、uv-240型等,自动记录，快速全波段扫描。可消除光源不稳定、检测器灵敏度变化等因素的影响，特别适合于结构分析。仪器复杂，价格较高。双波长将不同波长的两束单色光(1、2) 快速交替通过同一吸收池而后到达检测器。产生交流信号。无需参比池。 a a2 a1 (2 1)b c两波长处测得的吸光度差值a与待测组分浓度成正比。1和2分别表示待测组分在1和2处的摩尔吸光系数。7、红外吸收光谱法1.偶极矩红外吸收光谱主要研究在振动中有偶极矩变化的化合物,除了单原子和同核原子如he,ne,o2和h2等之外，几乎所有的有机化合物在红外区均有吸收。红外吸收光谱产生的条件1.辐射光子具有的能量与产生振动跃迁所需的能量相等；2.分子振动时，必须伴随有瞬时偶极矩的变化. 对称分子：没有偶极矩，辐射不能引起共振，无红外活性。如：n2、o2、cl2 等。非对称分子：有偶极矩，红外活性。偶极矩是表示极性分子极性大小的一个量。由于是极性分子，电荷分布不均，正电荷集中在一块，负电荷集中在一块，正、负电荷中心间的距离 r 和电荷中心所带电量 q 的乘积叫偶极矩。 = rq. 2.红外光谱图 3.分子振动红外光谱法简介（ir)基于物质对红外区域辐射的选择性吸收引起分子振动能级和转动能级的跃迁而进行分析的方法,主要用于有机化合物的成分和结构分析.红外光区的划分:近红外光区（0.75 -2.5m ）中红外光区（2.5 -25m ）远红外光区（25 - 1000m 红外光谱在可见光和微波光区之间，波长范围为 0.75-1000 um，一般说的红外光谱指中红外区的红外 光谱2.5-25um (4000 - 400 cm-1)4.基团频率区按照吸收的特征,可将红外光谱分为4000-1500cm-1和1500-600cm-1两个区域,分别称为基团频率区和指纹区。在红外吸收光谱中, 通常把这种能代表基团存在,并有高强度的吸收带称为基团频率,其所在的位置称为特征吸收峰。基团频率区:主要包括x-h、双键和叁键的伸缩振动.基团频率常用于鉴定有机化合物官能团区或特征区 ,因此,基团频率区又称官能团区或特征区。5.指纹区指纹区:主要包括c-x键的伸缩振动和c-h键的弯曲振动.当分子结构稍有不同时,该区的吸收就有明显的改变,类似于人的指纹。6.电子效应1）电子效应 包括诱导效应、共轭效应和中介效应，它们都是由于化学键的电子分布不均匀引起的。内部因素 （i）诱导效应（i效应）。由于取代基具有不同 的电负性，通过静电诱导作用，引起分子中电子分布的变化，从而改变了键力常数，使基团的特征频率发生位移。 7.试样的处理和制备。 制备样品的要求 试样纯度98%,单一组分 试样中不应含游离水 试样浓度和测试厚度适当 气体试样的制备 使用