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浮游植物群落组成荧光识别测定方法研究 浮游植物群落组成荧光识别测定方法研究 摘要 浮游植物分类识别和定量检测是赤潮监测技术的主要研究内容，活体荧光法 不仅能提供丰富的光谱信息，而且灵敏度和选择性高，不需要使用有机溶剂，因 而得到广泛应用。利用高斯分解法研究浮游植物荧光激发光谱和发射光谱的特 征，运用f i s h e r 判别分析法确定特征谱的有效性，在此基础上，利用非负最小二 乘法( n n l s ) 建立浮游植物群落组成识别测定技术，以实现浮游植物群落组成 的现场、实时、快速测定，对防治和减少赤潮灾害具有重要意义。 本文选择了1 2 种常见藻种，分属硅藻门、甲藻门、绿藻门和隐藻门，包括 我国东海常见的1 0 种赤潮藻以及一种绿藻和一种隐藻。在温度为2 0 ，三个光 照条件( 1 5 0 0 0 l x 、1 0 0 0 0 l x 、6 0 0 0 l x ) 下进行实验室培养，测定活体浮游植物 三维荧光光谱，运用高斯分解法研究了不同门类浮游植物的荧光光谱特征，在门 类水平上分别建立了基于浮游植物荧光激发光谱和发射光谱的群落组成识别技 术。通过实验结果的分析和讨论，主要得到如下结论： ( 1 ) 三维光谱中的瑞利散射严重掩盖了浮游植物的光谱信息，采用d e l a u n a y 三 角形内插值法能有效消除光谱中的散射干扰，去散射后，甲藻门除塔玛亚历山大 藻之外的其它三维光谱的相对标准偏差均在5 - - 6 之间，除盒形藻之外，硅藻 与绿藻、隐藻的相对标准偏差均小于5 。散射的去除有助于提高光谱的精密度， 凸显浮游植物荧光特征信息 ( 2 ) 在门类水平上建立活体叶绿素荧光激发光谱的群落组成识别技术。利用四 阶导数分析法分离激发光谱中的重叠荧光蜂，在3 5 0 - , 5 5 0 n m 内出现的六个极大 值，主要代表了活体藻液中的非色素荧光物质、叶绿素和类胡萝卜素等物质的荧 光峰；以导数分析为基础，在3 0 0 , - , 6 0 0 n m 范围内，对硅藻门、甲藻门、绿藻门 的荧光激发光谱分别设定1 1 个初始中心波长，对隐藻门设定1 2 个中心波长，作 高斯分解及多峰拟合。特征解析表明，同门类荧光激发光谱的高斯峰具有相似的 特征，而不同门类高斯峰特征具有显著差异。高斯参数中心波长u 和高斯峰高c 的相对标准偏差分别小于0 5 和2 5 ，半峰宽s 在3 5 0 - 5 5 0 n m 范围内相对标准 偏差小于5 ，具有较高的精密度和良好的重现性。利用相邻峰高比值法不仅可 以将硅藻和甲藻很好的分开，还可以对含叶绿素b 和含叶绿素c 的两大类浮游植 中国海洋大学硕士学位论文 物进行区分。以高斯分解得到的7 个特征波长点作为荧光激发光谱特征谱，利用 f i s h e r 判别技术对测试集作判别分析，结果在门类水平上，三个光照单藻测试集 的判别平均正确率达到9 6 0 6 0 0 ，两组不同浓度比组合的混合藻判别平均正确率 为8 2 2 9 ；利用n n l s 作识别测定研究，结果单藻识别正确率为9 2 7 1 ，混合 藻识别平均正确率为8 4 ，0 2 。表明以波长3 8 0 h m ，4 1 5 n m ，4 4 0 r i m 。4 6 5 n m ，4 9 5 r o l l ，5 3 0 h m ，5 6 0 r i m 构建的特征谱能够在门类上对不同浮游植物进行有效识别， 因而为进一步开发具有自主知识产权的浮游植物荧光自动分析仪提供技术支持。 ( 3 ) 建立单激发波长荧光发射光谱的群落组成测定技术。比较特征激发波长 为4 1 0 h m 、4 4 0 m n 、4 7 0 n t o 、5 0 0 r i m 和5 3 0 h m 下的不同门类浮游植物荧光发射 光谱，对差异最大的5 3 0 r i m 单激发波长荧光发射光谱进行门类水平上单藻测 试集的f i s h e r 判别分析，结果硅藻和甲藻无法区分，在将硅藻和甲藻视为同类 的基础上，单藻判别正确率达到9 4 ，6 8 in n l s 识别测定正确率达到8 5 4 2 ， 有效识别硅甲藻、绿藻、隐藻三大类浮游植物。5 3 0 h m 常被作为激光荧光雷达 的激发波长，因此单激发波长荧光发射光谱识别技术可以为常用激光荧光雷达 提供技术支撑。 ( 4 ) 在门类水平上建立多激发波长荧光发射光谱群落组成测定技术。以荧光激 发光谱的高斯特征波长4 4 0 r i m 、4 7 0 h m 、5 3 0 r i m 为激发波长构建多激发波长荧光 发射光谱，对构建的多激发波长荧光发射光谱作f i s h e r 判别分析，结果单藻判别 平均正确率为9 8 1 5 ，两组混合藻判别平均正确率为9 2 5 7 ；利用n n l s 对单 藻测试集和混合藻测试集分别作识别测定，其中单藻识别正确率为9 0 6 3 ；混 合藻识别平均正确率为8 9 5 3 。分析表明多激发波长荧光发射光谱群落组成测 定技术能对不同门类浮游植物进行有效识别，可以为各海洋监测基站现有仪器设 备提供技术支持。 综上所述，本文以活体浮游植物荧光光谱为研究对象，利用四阶导数法和高 斯分解法研究不同门类浮游檀物荧光光谱的特征。并利用f i s h e r 判别技术亵 n n l s 建立了基于浮游植物荧光激发光谱和荧光发射光谱的浮游植物群落组成 门类水平上的识别测定技术，为实现浮游植物群落组成及赤潮的现场、实时、快 速检测提供了一种有效的途径。 关键词z 浮游植物l 荧光光谱；四阶导数；高斯分解l 特征谱；识别 n 浮游植物群落组成荧光识勇j 测定方法研究 s t u d yo nf l u o r e s c e n c es p e c t r af o ri d e n t i f y i n gp h y t o p l a n k t o n c o m m u n i t y a b s t r a c t c l a s s i f y i n ga n dq u a n t i f y i n gp h y t o p l a n k t o ni s a l li m p o r t a n tt a s k i nm a r i n e r e d - t i d em o n i t o r i n f t h ei nr i v ef l u o r e s c e n c em e t h o dc a np r o v i d ea b u n d a n t i n f o r m a t i o na n da v o i du s i n go r g a n i cs o l v e n t w i t hh i g hs e n s i t i v i t ya n ds e l e c t i v i t y ，i t h a sb e e nw i d e l yu s e di ns c i e n t i f i cr l 终e 础。i ti ss i g n i f i c a n tt of i n de f f e c t i v em e t h o d s t od e t e c tc o m p o n e n t so f p h y t o p l a n k t o nc o m m u n i t yf o rp r e v e n t i n gr e d - t i d ed i s a s t e r s t h i sp a p e ra i m st o s t u d y t h ec h a r a c t e r i s t i c so fp h y t o p l a n k t o nc h l o r o p h y l l f l u o r e s c e n c ee x c i t a t i o n s p e c t r u m a n de m i s s i o n s p e c t r u mb y m e a l 岱o f f o u r t h - d e r i v a t i v ea n a l y s i sa n dg a u s sd e c o m p o s i t i o n , t h e ne s t a b l i s hp h y t o p l a n k t o n c o m m u n i t yi d e n t i f y i n gt e c h n i q u ew i t hn o n - n e g a t i v el e a s ts q u a r e ( n n l s ) b a s e do n f i s h e ra n a l y s i s t w e l v ec o m m o na l g a es p e c i e sw h i c hb e l o n g st ob a c i l l a r i o p h y t a 、 p y r r o p h y t a 、c h l o r o p h y t aa n dc r y p t o p h y t aw e r ec h o s e na n dc u l t u r e du n d e rc e r t a i n t e m p e r a t u r e ( 2 0 e ) a n d t h r e e d i f f e r e n t i l l u m i n a t i o n i n t e n s i t i e s ( 1 5 0 0 0 l x 、1 0 0 0 0 l x 、 6 0 0 0 l x ) i nt h et w e l v es p e c i e s ，t e ni st y p i c a lr e d - t i d es p e c i e so f t h ee a s tc h i n as e a t h e i rt h r e ed i m e n s i o n a lf l u o r e s c e n c es p e c t r a ( e e m ) w e r em e a s u r e da n dt h em a i n r e s e a r c hw o r ki s 嬲f o l l o w s ： ( 1 ) t h ef l u o r e s c e n c ei n f o r m a t i o no fp h y t o p l a n 】c t o ni sa l w a y sc o v e r e du pb yt h e r a y l e i g hs c a t t e ri ne e m ，d d a u n a yt r i a n g u l a t i o ni n t e r p o l a t i o nw a su s e dt oc o r r e c t r a y l e i g h $ c a t t o r t h er s do f e e m w a sb e t w e e n5 6 f o rp y r r o p h y m e x c e p t a i ， a n dw a sl e s st h a n5 f o ro t h e rs p e c i e se x c e p to c t h ee l i m i n a t i o no fs c a t t e rw a s h e l p f u lt oi m p r o v es p e c t r u mp r e c i s i o n ( 2 ) nr i v ec h l o r o p h y l lf l u o r e s c e n c ee x c i t a t i o ns p e c t r ad i s c r i m i n a t i n gt e c h n i q u eo f p h y t o p l a n k t o nc o m m u n i t yo i ld i v i s i o nl e v e lw a se s t a b l i s h e d t h ef o u r t h - d e r i v a t i v e a n a l y s i sw a sp e r f o r m e do nf l u o r e s c e n c ee x c i t a t i o ns p e c t r at os e p a r a t eo v o r l a p p i n g f l u o r e s c e n c ep o a g s ，t h er e s u l t ss h o w e dt h e r ew e r es i xf l u o r e s c e n c ep e a k si nt h e f o m l h - d e r i v a t i v es p e c t r ab e t w e e n3 5 0 ma n d5 5 0 h m , w h i c hw e r er e p r e s e n t a t i v eo f m 中国海洋大学硕士学位论文 n o n - p h o t o s y n t h e t i cp i g m e n t s , c h l o r o p h y l l sa n dc a r o t e n o i d e sr e s p e c t i v e l y b a s e do n t h ep r e s e n c eo f p o s i t i o na n dn u m b 盯o f m a x i m a0 nt h ef o u r t h - d e r i v a t i v es p e c t r a ，1 1 i n i t i a lc e n t r a lw a v e l e n g t h sw e r es e tf o rb a c i l l a r i o p h y t a ，p y r r o p h y t a 、c h l o r o p h y t aa n d 1 2f o rc r y p t o p h y t ab e t w e e n3 0 0 n ma n d6 0 0 n m w i t ht h e s ew a v e l e n g t h sa sc e n t r e 。 o a u s s i a nd e c o m p o s i t i o na n d m u l t i - p e a kf i t t i n gw e r od o n et o t h es p e c t r a 1 1 他 c h a r a c t e r i s t i c so fg a u s ss p e c t r u m s u g g e s t e d t h a t s i g n i f i c a n td i f f e r e n c e sw o r e p r e s e n t e db e t w e e nd i f f e r e n td i v i s i o n sw h i l es i m i l a rc h a r a c t e r i s t i c sw c i of o u n di nt h e s a n l ed i v i s i o n t h er s do fo a u s s i a np a r a m e t e r sua n dcw e r ol e s st h a n0 5 a n d 2 5 r e s p e c t i v e l y ，a n dr s do fp a r a m e t e rsw a sl o w e rt h a n5 f o rg a u s sp e a k s b e t w e e n3 5 0a n d5 5 0 n m n a ts h o w e dh i 窖hp r e c i s i o na n dg o o dr e p r o d u c i b i l i t y u s i n g t h e i n t e n s i t y r a t i oo fn e i g h b o r i n gg a u s sp e a k sc o u l dn o t o n l yd i s t i n g u i s h b a c i l l a r i o p h y t aa n dp y r r o p h y t a ，b u ta l s od i s t i n g u i s hc h l o r o p h y l lba n dc h l o r o p h y l l c - c o n t a i n i n ga l g a e s e v e nr e p r e s e n t a t i v eg a u s s w a v e l e n g t h sw e r o u s e da s c h a r a c t e r i s t i cf l u o r e s c e n c ee x c i r a t i o n s p e c t r u m t h e nd i f f e r e n t i a t i o n a n d d i s c r i m i n a t i o nf o ra l g a et e s ta s s e m b l a g e sw o r es t u d i e d 谢mf i s h e rd i f f e r e n t i a t i o na n d n n l sd i s c r i m i n a t i o n a sar e s u l t ，o nt h el e v e lo f d i v i s i o n ，t h ed i f f e r e n t i a t i o na c c u r a c y f o rs i n g l ea l g a ea n dm i x e da l g a ew e r e9 6 0 6 a n d8 9 5 3 t h ed i s c r i m i n a t i o n a c c u r a c yf o rt h e m i s9 2 7 1 a n d 8 1 4 r e s p e c t i v e l y t h i ss h o w se f f e c t i v e d i f f e r e n t i a b i l i t ) ，o fp h y t o p l a n k t o nf l u o r e s c a n c e e x c i t a t i o ns p e c t r u mw h e nu s i n g 3 8 0 n m ，4 15 r i m ，4 4 0 r i m ，4 6 5 n m 4 9 5 n m ，5 3 0 r i m ，5 6 0 r i ma sc h a r a c t e r i s t i cw a v e l e n g t h s i tc a np r o v i d et e c h n i c a ls u s t e n t a t i o nf o ri n v e n t i o no fn e wa u t o a n a l y s i sf l u o r e s c e n c e a p p a r a t u s ( 3 ) s i n g l e - e x c i t a t i o nw a v e l e n g t hf l u o r e s c e n c ee m i s s i o ns p e c t r u md i s c r i m i n a t i n g t e c h n i q u eo fp h y t o p l a n k t o nc o m m u n i t yo nd i v i s i o nl e v e lw a s e s t a b l i s h e d t h e f l u o r e s c e n c ee m i s s i o ns p e c t r u mu n d e re x c i t a t i o nw a v e l e n g t h so f4 1 0 h m 、4 4 0 h m 、 4 7 0 h m 、5 0 0 h ma n d5 3 0 h mw e r ec o m p a r e d a m o n gf o u r d i v i s i o n s t h e s i n g l e - e x c i t a t i o nw a v e l e n g t hf l u o r e s c e n c ee m i s s i o ns p e c t r u ma t5 3 0 n mm o s td i s t i n c t a m o n gd i v i s i o n sw a sc h o s e n t o s t u d yb y f i s h e rd i f f e r e n t i a t i o na n dn n l s d i s c r i m i n a t i o n t h ec l a s s i f y i n gf i g u r es h o w e db a c i l l a r i o p h y ma n dp y r r o p h y t aw e r e o v e r l a p p e da n da l ls p e c i e sc a rs e p a r a t e di n t ot h r e ec l a s s e s w h e nb a c i l l a r i o p h y t aa n d 独创声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含未获得 ! 注! 翅超直基丝盂要挂型童盟趁：奎拦亘窒2 或其他教育机构的学位或证书使 用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示谢意。 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留，使用学位论文的规定，有权保留并 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人 授权学校可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用 影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。( 保密的学位论文在解密后 适用本授权书) 学位论文作者签名： 签字日期：b 0 年 于哆 0 其l o 日 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： 导师签字：j 芝险 签字同期：如矽年月多日 电话： 邮编 浮游植物群落组成荧光识别测定方法研究 0 引言 随着近海海域赤潮灾害的频发，以及发生范围和危害的增大，赤潮已成为我国政 府和相关部门极为关注的问题，快速检测海水中浮游植物组成和数量，不仅是预测、 预报赤潮发生的先决条件，也是掌握赤潮灾害的发生、发展和消亡规律，以及赤潮发 生海区浮游植物种群变动及其数量变化规律的重要环节，已成为我国海洋科学工作者 的当务之急。 本课题来源于8 6 3 国际合作项目i 匠海赤潮浮游植物荧光检测技术研究”和9 7 3 国家重点基础研究发展规划项目。荧光光谱分析最先用于现场浮游植物分类和数量测 量。传统的荧光分析( 激发光谱、发射光谱) 因其灵敏度高，可直接测量海水并快速 测量现场叶绿素。2 0 世纪9 0 年代德国b b e m o l d a n e n k e 公司制造的荧光计，能 够储存四类浮游植物( 蓝藻、绿藻、隐藻、褐藻( 硅藻和甲藻) ) 的特征激发荧光光 谱，通过直接测量海水即可对这四类浮游植物进行定性定量；b b e 技术在两个方面取 得了突破性成果，一是在门类的水平上测定浮游植物群落组成，即利用5 个激发波长 点的叶绿素荧光激发光谱，来实现对浮游植物群落组成的测定；二是b b e 采用发光 二极管作光源，避免了一般荧光分光光度计使用氙灯为光源而使得仪器结构复杂、耗 能大、需固定使用、灵敏度低等缺点，适应了现场、实时、快速监测的需要。但这些 技术都无法将我国近海海域最重要的两类浮游植物硅藻和甲藻进行分类识别监测。 基于国内外的研究成果，本文针对我国近海海域主要浮游植物类群( 硅藻、甲藻、 绿藻、隐藻) 的1 2 种常见藻和赤潮藻，通过四阶导数和高斯分解技术研究浮游植物 荧光光谱特征，提取特征谱，建立能够将硅藻和甲藻分类测定的浮游植物群落组成识 别测定技术，为课题进一步开发具有自主知识产权的浮游植物荧光自动分析仪提供技 术支持；基于浮游植物单激发荧光发射光谱和多激发荧光发射光谱，建立浮游植物群 落组成识别测定技术，为激光荧光雷达及各海洋监测基站现有仪器提供技术支撑。文 中应用了多种化学计量学技术，主要包括了四阶导数分析、高斯分解法、f i s h o r 判别 分析法和非负最小二乘法等。 由于个人水平有限，本文在该领域的研究尚存在一定的不完善之处，在此，真诚 希望各位专家、老师、同学对本文提出宝贵的意见和建议l 中国海洋大学硕士学位论文 1 文献综述 1 1 赤潮浮游植物检测技术研究进展 近年来受自然环境和人类活动的共同作用，我国近海海域赤潮频发，危害的程度 和范围日益扩大，在一定程度上制约了我国沿海地区海洋经济的发展，同时也对公众 健康造成了极大的危害。因此，如何准确地进行赤潮监测，以便及时采取有效的防治 措施，减少赤潮造成的损害，已成为海洋监测领域一项重要的研究内容。 目前，海洋赤潮检测主要是对于引发赤潮的浮游植物种类进行定性识别、鉴定及 细胞数量变化的分析和检测。现有的检测技术大都利用了浮游植物的不同细胞形态或 内含物( d l n a 、色素) 的特异性，对其进行种类识别和数量测定。其中色素以其特征 性显著而成为最理想的浮游植物标志物( 高洪峰等，1 9 9 7 ；姚鹏等，2 0 0 3 ) 。光学测 量技术和生物分析技术是化学工作者主要采用的研究方法之一，包括可见分光光度 法、荧光分析法、高效液相色谱法、显微镜技术、流式细胞技术等。其中显微镜技术 是海洋浮游植物种类鉴别和数量测定的基础，通过研究细胞形态可直接进行赤潮生物 的种类判别和丰度统计，但是必须依靠人工操作，工作量大，且对专业技术和经验要 求较高，在计数速度和准确性方面也受到很大的限制；流式细胞分析( 晁敏等，2 0 0 3 ： 焦念志等，1 9 9 9 ) 是将样品细胞悬浮于液体中，并在流动过程中逐个经过测量区进行 快速测量，该方法可直接测量海水样品，同时进行定性和定量测定，且速度快，但是 专用流动细胞仪价格昂贵，操作复杂，不能满足海洋现场调查与监测特别是连续检测 的需要。目前国内常用的分析技术主要有吸光法、荧光法和高效液相色谱法等，其中 吸收光谱法和荧光光谱法是主要的光谱分析技术。 吸光光度法是最早用于分析浮游植物叶绿素( r i c h a r dfa e ta 1 ，1 9 5 2 ) 和其它色 素组分( y e n t s c hcs ，1 9 6 2 ；b i d i g a r er re ta l 。，1 9 8 9 ) 的方法，特点是原理简单、 操作简便、能满足一般的测定要求。国内测定叶绿素含量的标准方法即是采用吸光光 度法，随着化学计量学的发展，国内外学者开始采用数学方法与吸收光谱法结合来检 测浮游植物。h o e p f f i l e r n ( 1 9 9 3 ) 等运用非线性回归和高斯分解法研究了北大西洋海 域浮游植物的吸收光谱，并建立由总颗粒物吸收光谱测定浮游植物主要色素的方法； j o h n s e ngo ( 1 9 9 4 ) 等通过逐步判别分析法研究了赤潮浮游植物的活体吸收光谱，并 根据辅助叶绿素对有毒藻种进行了分类。国内研究者李继刚等( 2 0 0 0 ) 分析了厦门海 域的藻种吸收谱线，提出了辨别赤潮藻与悬浮物的方法和途径；王磊( 2 0 0 5 ) 等对浮 浮游植物群落组成荧光识别谢定方法研究 游植物体外吸收光谱特征进行了初步研究，运用遍历非负最小二乘法，可以将硅藻和 甲藻分开目前已有不少有关应用吸收光谱法识别海洋浮游植物的报道，但由于受灵 敏度的限制，该方法一般需要浓缩或萃取浮游植物色素等前处理，因此主要限制在实 验室的应用。 相比较而言，荧光光谱法具有更高的灵敏度，并且选择性好、干扰小，因而被广 泛使用。早在2 0 世纪6 0 年代，荧光法即被用于浮游植物的时绿素及降解产物的分析 ( y e n t s c hcs ，1 9 6 3 ；l o r e n z e n ，1 9 6 6 ) 8 0 年代y e n t s c hcs ( 1 9 8 5 ) 开始利用荧光 光谱鉴定浮游植物种类，操作简便，并且能够实现快速检测芬兰学者s e p p a e l a e 等 ( 1 9 9 8 ) 根据一定激发波长下辅助色素的特征峰荧光强度，实现了对浮游植物门类的 快速化学分类。国内也有不少学者运用荧光法对浮游植物色素及赤潮藻的分类进行了 研究。朱明远( 1 9 9 4 ) 等以湛江叉鞭金藻和四乳突扁藻为材料，比较了普通荧光分析 法和同步荧光分析法测定c h l a 、c h l b 、c h l e 的适用性。贺俊芳等( 2 0 0 1 ) 采用扫描成 像荧光光谱技术对外周天线l h c 的荧光光谱特性进行了研究，采用高斯组分光谱解 析的方法，解析出l h c i i 的荧光发射有七个谱带，并认为其中6 5 8 n m 的发射谱由c h l b 分子所发射，其余的发射谱则由c h l a 分子发射。吕洪刚等( 2 0 0 5 ) 采用三维荧光技术 分析了栅藻( 绿藻) ，微囊藻( 蓝藻) 和小环藻( 硅藻) 的色素组成，建立了叶绿素 浓度与藻密度的荧光强度矩阵方程。张前前( 2 0 0 4 ) 等利用主成分判别分析法对浮游 植物活体三维荧光光谱分类判别进行了研究，结果对于试验的6 个藻种有较强的区分 能力；并进一步研究了荧光光谱的特征提取方法( 2 0 0 5 ) ，表明对去除散射干扰后的 三维光谱进行奇异值分解，得到的相应于激发光谱的第一主成分具有区分藻种的能 力，可作为三维光谱的特征光谱。金海龙( 2 0 0 5 ) 等利用导数荧光光谱识别活体海藻， 根据二阶导数极小值的特点可将含叶绿素a 、叶绿素b 的海藻进行区分。荧光法具有与 吸光法完全不同的原理，其获得的指纹信息可作为物质的特征信息，并可基本消除黄 色物质等的影响，因而能较为准确的获得有用信息，但它与吸收光谱法一样都容易产 生色素谱带的重叠现象，因此需借助数学方法对光谱进行处理。 高效液相色谱法是一种新型的分离技术，主要利用分析化学方法对浮游植物进行 定性和定量分析，具有分离性能高、分离速度快和灵敏度高等特点自1 9 7 5 年高效 液相色谱法( h p l c ) 首次用于分离色素以来，其作为色素分析的有效手段已得到普 遍接受。由m a e k e y 等人开发的c h e m t a x 程序( 1 9 9 6 ) 是现有的比较适合处理h p l c 数据的软件。但色谱法对色素的分离度要求较高。且需要昂贵的实验设备，样品的后 中国海洋大学硕士学位论文 续处理工作量大，因而在现场的连续测定中受到了限制，总体来说，国内在该领域还 处于起步阶段。 荧光技术在浮游植物检测领域具有广阔的应用前景，根据浮游植物荧光发射原理 探讨荧光光谱法识别浮游植物的方法，有望建立现场实时的活体浮游植物荧光检测技 术，这对赤潮的在线监测具有重要的意义。 1 2 四阶导数法在光谱分析中的应用 在实际测定中，光谱技术的灵敏度和准确度往往会受到谱带重叠的影响，而导数 分析技术在解决谱带重叠和消除背景干扰等问题上具有良好的效果，它已被证明是一 种提高荧光分析选择性的有效手段。导数光谱法是在紫外光谱法的基础上发展起来的 一种新的分析方法，从1 9 7 4 年开始被用于荧光分析。其基本原理如同紫外吸收光谱 吸光度( a ) 对波长九的函数图类似，是吸收光谱关于波长的微分系数( 等) 对波长 ( 九) 的函数图，对于荧光光谱来说，即是荧光强度随波长变化率对波长的曲线。 通过记录荧光强度对波长的一阶导数或更高阶导数，便获得相应的导数荧光光 谱。原始光谱( 又称零阶光谱) 按一定的波长间隔( 五) 测得变化率( 了d 石a ) 对应 于波长而得到疗阶导数光谱。其中奇数阶导数曲线的零点对应于零阶曲线的峰值，而 极大值和极小值则对应于零阶曲线的拐点；偶数阶导数曲线的极值对应于零阶曲线的 峰值，而零点则对应于零阶曲线的拐点响应值筹与吸光度( a ) 一样，遵循朗伯 一比耳定律，且具有加和性。因此，对于多元组分体系，在某一波长下测得的响应值 笔手为多种组分导数值的加和，即一阶、二阶一阶导数值皆与浓度成正比随 着导数阶数的增加，谱带变得尖锐，带宽变窄，分辨率提高，通过响应值券可分辨 重叠的吸收曲线。导数光谱的特点在于灵敏度高，可减小光谱干扰，增强特征光谱精 细结构的分辨能力，因而在分辨多组分混合物的谱带重叠、增强肩峰的清晰度及消除 散射方面有重要的作用。 国内有关导数光谱法分离重叠谱带的研究多集中于一阶导数光谱法( 梁李广等， 1 9 9 2 ；周雪梅等，1 9 9 6 ；张娇燕等，1 9 9 9 ) 和二阶导数光谱法( 左晖等，1 9 9 7 , 马俊 4 浮游植物群落组成荧光识别测定方法研究 玲，2 0 0 0 ；丁建华，2 0 0 4 年) ，且在药物分析和医学检验领域应用较为广泛( 王绪明 等，2 0 0 0 ) 。如乙酰色氨酸酰胺的二阶导数荧光光谱被用来考察蛋白质中色氨酸环境 的变化，减少了酪氨酸的光谱干扰和散射光的影响，使得光谱变化特征更突出，从而 有利于揭示蛋白质结构特性( m o z o - v i l l a r i a s ae a 1 ，2 0 0 2 ) 。 因导数光谱法具有简便快速，灵敏准确的特点，有国外学者将其应用于浮游植物 吸收光谱来分析浮游植物色素及群落结构的组成d a v i dem i l l i e ( 1 9 9 7 ) 等用四阶导 数分解吸收光谱的方法，分析了赤潮甲藻中光合色素的吸收特征，能识别含有不同特 征色素的短裸甲藻。金海龙等( 2 0 0 5 ) 将二阶导数光谱法用于研究活体浮游植物发射 光谱，分离含不同叶绿素的浮游植物。与常用的二阶导数法相比，四阶导数法( 吴庆 生，1 9 9 5 ；1 9 9 7 l 刘魁等，2 0 0 3 ；楼永明，2 0 0 3 ) 对混合物的重叠峰有更高的分离 度和灵敏度，在提高检测灵敏度，改善分辨率和加强抗干扰力等方面有其独特的优点， 将其作为分离浮游植物荧光光谱重叠谱带的方法，可较为准确地获得色素荧光峰的特 征波长。 1 3 高斯分解法在光谱分析中的应用 通过高斯分解法可提取浮游植物荧光光谱的特征信息，突出不同门类浮游植物之 间的光谱差异。高斯分解法是用若干个高斯函数逼近某种物质的光谱，以获取高斯函 数族的个数、中心波长位置、高度和半峰宽来表述某种物质的特征，进而用这些特征 来辨别多元组分或混合物的光谱，以达到对混合物组分定性和定量的目的。 与高阶导数光谱法相同，高斯分解法也有坚实的物理基础。由光谱理论可知，元 素的原予或离子被激发时会发出一定波长的光，但任何谱线都不是严格的单色光，而 是在某一波长范围内，强度按一定规律分布，即谱线展宽。谱线展宽分为均匀展宽和 不均匀展宽，前者呈洛仑兹( l o r e n t z i l m ) 分布，后者里高斯( g a u s $ i a n ) 分布，其解 析式分别如下； 儿= c 【l + ( x - $ ：u ) 2 1 ( 洛仑兹) ；c e x p 【一l n 2 垒；芷】 ( 高斯) 式中c 为峰高( 强度) ，“为中心波长，$ 为半峰宽度。 浮游植物色素分子在能量的传递过程中产生很强的偶联作用，加之色素分子本身 中国海洋大学硕士学位论文 吸收波长接近，因而不可避免地造成光谱谱线的重叠。为了消除谱带的重叠，获取浮 游植物色素准确的定性及定量信息，国外学者做出了诸多尝试和研究。2 0 世纪初， l o r e n t zh a 提出一套光学性质的经典理论，鄄洛仑兹模型，他把电子和离子看成是电 磁场中简单的谐振子，这个模型曾被用于浮游植物吸收光谱的分解( b r i c a u de ta 1 ， 1 9 8 6 ) ，但是该模型无法解释重叠吸收峰之间的影响和光合色素分子之间强烈的振动 交互作用。此后，t o y o z a w a 提出当谐振子之间存在很强的相互作用时，吸收峰趋向于 g a u s s i a n 形状；当这种作用很弱时，则趋向于l o r e n t z i a n 形状。就浮游植物光谱而言， 高斯模型是较为合适的解析方法。 目前，仅有少数文献报道高斯分解法研究浮游植物光谱h o e p f f n e rn 与 s a t h y e n d r a n a t hs ( 1 9 9 1 ) 用高斯分解法对三种单藻及它们的混合物吸收光谱进行了研 究，以对单藻光谱设定的1 1 个初始中心波长，和混合藻光谱设定的1 3 个中心波长， 分解得到凡耱主要光合色素相对应的吸收光谱，并用计算得蜀的吸收系数重构光谱， 结果与原始光谱相当接近，同时发现高斯曲线的峰高与被测样品中的4 类色素浓度里 线性相关。1 9 9 3 年，这两位学者又证明通过高娠分解法得到的吸收光谱以及吸收系数 可以确定天然浮游植物中主要光合色素的浓度。a g u i r r e - g 6 m e zr ( 2 0 0 1 ) 等结合导数 光谱法和g a u s s i a n - l o r e n t z i a n 曲线法，对吸收光谱进行分解及拟合，将重叠的色素吸 收峰分开，利用高斯峰对光合色素定性，从而达到鉴别浮游植物色素的目的。可见， 国外应用高斯分解法研究浮游植物主要集中于对吸收光谱的研究，而关于浮游植物荧 光光谱的高斯分解研究甚少。 1 4 导数光谱法与高斯分解法的结合 高斯函数族是一系列具有固定特征参量的高斯函数组合，具有良好的逼近性能。 用高斯函数族来逼近浮游植物的荧光光谱，实际上就是一种利用荧光光谱来反演其色 素分布的方法。为了取得较好的逼近( 拟合) 效果，必须先对光谱的高斯函数族确定 合适的初始参数，主要包括高斯函数族个数n ，中心波长位置“，半峰宽度j 。强度c 等。其中高斯函数个数、中心波长位置可通过对光谱求微分，即导数光谱法获得，其 余两个参量半峰宽度j ，强度c 按最小二乘原则拟合得到。获得导数光谱的方法很多， 常用的有光学方法、电子微分法、数值微分法、波长谲戳技术等( 许金钩等，2 0 0 6 ) 借助m a t l a b 平台可用数值微分法对光谱求导，即将谱线数据以数值形式表达，使 用计算规进行原始数据的平滑、平均和微分等数值处理。然后输出导数信号， 浮游植物群落组成荧光识别测定方法研究 a g i ：m r e - g 6 m e zr ( 2 0 0 1 ) 等即利用四阶导数法获得硅藻等吸收光谱的一系列初始中心 波长后，采用高斯函数和洛仑兹函数组合的方法，对原始光谱进行分解及拟合。李建 东等( 2 0 0 4 ) 根据血清荧光二阶导数光谱极小值的数量和位置对原光谱进行多峰高斯 拟合，并使用特定高斯曲线峰值的比为参量将健康血清与病变血清分开。殷光中等 ( 2 0 0 4 ) 应用荧光光谱解析法研究胃肿瘤组织中的荧光组成变化，以负二阶导数光谱 最大值位置所对应的波长作为高斯函数的初始中心波长，采用一组高斯函数作为基函 数进行荧光光谱拟合，对离体正常和肿瘤胃组织荧光光谱进行解析。 导数光谱法为鉴别光谱中的特征峰提供了数学基础，并且能有效分离重叠谱带， 凸显肩峰，将其与高斯分解法结合研究浮游植物荧光光谱特征，可减小中心波长选择 的盲目性，因而更具有实际的意义。 1 5 本文的研究内容及意义 本文以我国近海常见的1 2 种常见浮游植物为研究对象，运用四阶导数法和高斯分 解法解析不同门类浮游植物叶绿素荧光激发光谱特征，并在此基础上建立活体浮游植 物的荧光光谱群落组成测定技术。本文的主要研究内容为； ( 1 ) 浮游植物三维荧光光谱的测量及数据的预处理，包括散射的去除，叶绿素荧光 激发光谱的提取，并讨论叶绿素荧光产生机理和光合色素的荧光光谱特征。 ( 2 ) 建立活体浮游植物叶绿素荧光激发光谱的群落组成识别技术。运用四阶导数分 析提取叶绿素荧光激发光谱特征波长，对不同门类荧光激发光谱作高斯分解及多峰拟 合，考察不同门类高斯峰的特征差异，并根据特征解析提取浮游植物特征荧光激发光 谱，利用f i s h c r 势j 别分析技术对所提取特征谱的有效性进行分析，并利用非负最小二 乘法建立浮游植物群落组成识别测定技术。 ( 3 ) 根据荧光激发光谱高斯峰特征分析，建立活体浮游植物单激发和多激发波长荧 光发射光谱的群落组成测定技术。根据实际需求，考察不同激发波长下，浮游植物荧 光发射光谱的差异性，分别基于单激发和多激发波长荧光发射光谱，建立荧光发射光 谱的f i s h e r 势 别分析技术和n n l s 识别测定技术。 研究不同门类浮游植物的荧光光谱特征，根据实际需要，建立不同门类水平上活 体浮游植物荧光光谱群落组成测定技术，对进一步完善我国近海海域赤潮浮游植物的 海洋监测基站荧光监测技术，具有重要的意义。 7 中国海洋大学硕士学位论文 2 实验部分 2 1 仪器和材科 2 1 1 仪器 ( 1 ) h i t a c h if 4 5 0 0 荧光分光光度计，i c m 石英比色池 ( 2 ) s h i m a d z uu v - 2 5 5 0 紫外可见分光光度计 ( 3 ) g x z - 3 1 0 0 型光照培养箱 ( 4 ) l d z x - 4 0 b i 型立式自动电热压力蒸汽灭菌器 ( 5 ) b b e ( a l g a ea n a l y s i s ) ( 6 ) o l y m p u sb h - 2 光学显微镜 ( 7 ) 常规数字照度计( c u s t o md i g t a ll xm e t e r ) ( 8 )