（植物学专业论文）蜂毒肽的抑菌作用及其基因表达研究.pdf

摘要 内容摘要：本文通过绘制抑菌曲线和牛津杯法，研究了蜂毒肽对金黄 色葡萄球菌、酵母菌g s l l 5 、番茄叶霉孢子等多种病原菌和基因工程菌 的抑杀作用及抑菌效力的影响因素。利用s d s 一聚内烯酰胺凝胶电泳、 细胞流式仪、透射电子显微镜和扫描电子显微镜等实验技术，从蛋白 质合成和表达、d n a 复制和细胞超微结构的角度系统分析了蜂毒肽的 抑杀菌机理。将蜂毒肽前体蛋白基因导入原核表达载体p e t - 4 2 a ( + ) 巾， 经p c r 、测序鉴定后转化至大肠杆菌b l 2 i ( d e 3 ) 中。 结果表明：蜂毒肽对多种病原菌和基因工程菌- n 具有强烈、速效的 抑杀作用，抑菌效果受p h 值、温度等因素的影响。经流式细胞仪分析， 蜂毒肽对菌体作用后，集中于i ( 或g 1 ) 期的细菌数量增加，进入r ( 或 s ) 期细菌数量减少，说明蜂毒肽的作用发生在i ( 或g 1 ) 期；而s d s p a g e 结果显示，药物作用后菌体蛋白谱带明显变浅，甚至消失，且这种作 用是速效的：通过电子显微镜观察到经蜂毒肽作用后，菌体细胞穿孔、 破裂或席卷式瓦解，细胞质外流，菌体裂解死亡。 蜂毒肽能透过细胞壁，作用于细胞膜，在膜上形成孔洞，使膜破 裂或席卷式瓦解，细胞内容物外泄死亡：进入细胞内。作用于蛋白质， 抑制蛋白质的合成与表达或降解细胞内原有的蛋白，使细胞内蛋白质 含量显著降低，细胞质固缩凝集；使d n a 复制受阻而能不通过细胞周 期的检盎点，滞留在d n a 复制期不能进入细胞分裂期，从而抑制细胞 的分裂，这条途径可能是由于蜂毒肽对蛋白质的作用引起的。综上， 蜂毒肽具有广谱、速效、高效的抑杀菌特性，口j 以克服当前生物农约 存在的不足，对温度的不敏感和抑菌作用的稳定性都体现出蜂毒肽作 为新型生物农药的开发潜力。 为了解决蜂毒肽的来源这一瓶颈问题，我们将蜂毒肽前体蚩白基 因和p e t _ 4 2 a ( + 1 载体重组后，导入大肠杆菌b l 2 1 ( d e 3 ) 中，在异丙基硫 代b d 半乳糖苷( i p t g ) 的诱导下，实现了蜂毒队前体蛋白与符胱甘肽 s 转移酶( g s t ) 的融合表达。 关键词：蜂毒肽；抑菌机理；基因表达 a b s t r a c t c o n t e n t ：t h ei n h i b i t i n ge f f e c ta n dp o s s i b l ee f f e c t i v ef a c t o r so fm e l i t t i n w e r ei n v e s t i g a t e do ns e v e r a lp a t h o g e n sa n de n g i n e e r e db a c t e r i a ，s u c ha s s t o p h y l o c o e c u sa u r e u s ，g s i l 5a n df u l v i af u l v a ，b ym e a n so fc y l i n d e r - p l a t eo ns e r i e sd i l u t i o n sa n dg r o w t hc u r v em o n i t o r i n g w ee x p l o r e dt h e m e c h a n i s m sb ye x a m i n i n gp r o t e i ne x p r e s s i o nl e v e l ，c e l lc y c l ea n dc e l l u l t r a s t r u c t u r a la l t e r a t i o n s ，u s i n gs d s p a g e ，f l o wc y t o m e t r ya n de l e c t r o n m i c r o s c o p y p r o m e l i t t i ng e e n w a si n s e r t e di n t o e x p r e s s i o n v e c t o r p e t 一4 2 a ( + ) a n dt r a n s f o r m e di n t oe c o l ib l 2 1 ( d e 3 ) a f t e ri d e n t i f i e db y p c ra n ds e q u e n c i n g t h ee x p e r i m e n t a lr e s u l t ss h o wt h a tt h ei n h i b i t o r ya c t i v i t yo fm e l i t t i nw a s i n s e n s i t i v et ot e m p e r a t u r ec h a n g ew i t h i nr o o mr a n g e ，w h i c hc o u l db e a p p l i e di ne a c hs e a s o n a t3 7 c ，b a c t e r i o s t a t i ca c t i v i t yo fm e l i t t i nb e g a n t od e c l i n ea f t e r5da n dd r o p p e dp r e c i p i t o u s l ya f t e r1 0d t h ei n h i b i t i o n c u r v es u g g e s t st h a tp a t h o g e n sw e n ti n t od e c l i n ep h a s ed i r e c t l yi n s t e a do f e n t e r i n gt h en o r m a ll o g a r i t h m i cp h a s e f r o mf l o wc y t o m e t r ya n a l y s i s ， a f t e rs e v e r a lh o u r st r e a t m e n tw i t hm e l i t t i n ，t h ep e r c e n t a g eo fc e l l si n p h a s ei ( o ri np h a s eo i ) i n c r e a s e d ，w h i l et h o s ei np h a s er ( o ri np h a s es ) d e c r e a s e d t h i si n d i c a t e st h a tm e l i t t i nd i s r u p t e dp h a s ei ( o rp h a s eg 1 ) r a t h e rt h a np h a s er ( o rp h a s es ) ，c a u s i n gm o s tc e l l st or e m a i ni np h a s ei ( o ri np h a s eg 1 ) m o s tp r o t e i ne x p r e s s i o ni np a t h o g e n sd e c l i n e dq u i c k l y w i t hm e l e t t i nt r e a t m e n t ，s o m eb a n d so ns d s p a g eg e l sa l m o s tv a n i s h e d e s p e c i a l l y t h e s er e s u l t ss u g g e s tt h a t m e l i t t i ni n h i b i t e dg e n ee x p r e s s i o n q u i c k l y ，b l o c k i n gc e l ld i v i s i o na f t e r4h e l e c t r o nm i c r o s c o p yr e v e a l e d t h a tm e l i t t i ni n t e r a c t e dw i t ha n dd i s r u p t e dt h ec y t o p l a s m i cm e m b r a n ea n d c a u s e dt h ed i s s o l u t i o no fp r o t o nm o t i v ef o r c ea n dl e a k a g eo fe s s e n t i a l m o l e c u l e s ，r e s u l t i n gi nc e l ld e a t h i ns u m m a r y ，i tw a sc o n f i r m e dt h a tt h r e ep a t h w a y sc o u l db ei n v o l v e di n i n h i b i t i o n ：m e l i t t i ni n t e g r a t e dw i t ht h ec e l lm e m b r a n ec a u s i n gc e l l b u r s t i n ga n dc y t o p l a s mr e l e a s e ，i n h i b i t e dt h es y n t h e s i so fp r o t e i n sa n d c a u s e dt h ec y t o p l a s mt oc o n d e n s e ，a n dd e l a y e dp a t h o g e n si np h a s ei ( o r p h a s eg 1 ) s ot h a tt h e yc o u l dn o tc o m p l e t et h ec e l lc y c l e t h e s e r e s u l t s s u g g e s tt h a tm e l i t t i nc o u l ds e r v ea sab r o a d s p e c t r u mb i o l o g i c a lp e s t i c i d e w i t hf a s t a c t i o na n dh i g h e f f i c i e n c y i no r d e rt os o l v et h ep r o b l e mo fl a c k i n gn a t u r a lr e s o u r c e ，t h ef u s i o n p r o t e i no fp r o m e l i t t i na n dg s tw a se x p r e s s e d i ne c o l iu n d e ri p t g i n d u c i n g k e yw o r d s ：m e l i t t i n ；b a c t e r i o s t a t i cm e c h a n i s m ；e x p r e s s i o n 学位论文独创性声明 本人承诺：所呈交的学位论文是本人在导师指导下所取得的研究成果。论 文中除特别加以标注和致谢的地方外，不包含他人和其他机构已经撰写或发表 过的研究成果，其他同志的研究成果对本人的启示和所提供的帮助，均已在论 文中做了明确的声明并表示谢意。 学位论文作者签名 勘多、与 日期： 学位论文版权的使用授权书 本学位论文作者完全了解辽宁师范大学有关保留、使用学位论文的规定， 及学校有权保留并向国家有关部门或机构送交复印件或磁盘，允许论文被查阅 和借阅。本文授权辽宁师范大学，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关 数据库并进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论 文。保密的学位论文在解密后使用本授权书。 学位论文作者签名 猫 指导教师签名 日期 r 蜂毒肽的抑菌作用及其基因表达研究 第一章综述 1 1 农药使用现状 据联合国粮农组织统计，如不使用农药，全世界每年平均因病、虫、 草害造成的损失约占农作物产量的3 7 ，其中虫害占1 4 ，病害占1 2 ， 草害占1 1 ，年损失高达1 2 6 0 亿美元，相当于中国农业总产值的一半。 我国是农业大国，世界第二大农药生产国，也是农药的出口大国，农 药产业的迅速发展，为农业生产提供了重要支持。但我国农药的总体 生产技术水平落后、农药生产和使用过程中环境污染严重等问题，制 约着农药行业的可持续发展，也对我国的食品安全和环境保护构成了 威胁。 在农业生产中，传统的化学农药以其见效快、效果稳定、价格低 廉等特点长期占据市场。但是，由于长期使用化学农药而产生的副作 用也逐渐暴露出来。该影响包括化学农药对环境介质( 主要包括对土 壤、水体和大气的污染影响) 、鸟类和昆虫种群、土壤以及农作物等 方面的作用【1 1 ，其中表现最突出的是农作物病虫害产生的耐药性和农 药残留引起的生态环境失衡。在世界范围内，农药的应用结构正在迅 速的发生改变。中国产业经济信息网讯：美国商业通讯公司( b c c ij 在最新发布的研究报告中指出，2 0 0 6 2 0 1 0 这5 年世界生物杀虫剂的 需求量将以每年9 9 的速度强劲增长。由2 0 0 5 年的6 7 亿美元增加 到2 0 1 0 年的1 0 亿美元。而同期传统化学合成杀虫剂需求将以年均 1 5 的速度递减。预计将从目前的2 6 0 亿美元降至2 0 1 0 年的2 4 2 亿美元。而我国也已颁布法规，对传统农药的使用加以控制，限制或 禁止含磷、硫、氯、氰基等高毒性的农药的使用。 1 2 生物农药的研究开发 目前，国际上没有统一的生物农药定义。我国对生物农药的性质 和范畴也有不同界定：中国农业百科全书一一农药卷称其为生物 源农药，即利用生物资源开发的农药，因此天敌昆虫、致病微生物、 生物信息物质以及氨基甲酸酯类、拟除虫菊酯类、沙蚕毒素类及烟碱 类杀虫剂均被纳入生物农药l2 1 。1 9 9 9 年，农药管理条例实施办法 蜂毒肽的抑菌作用及其基因表达研究 将用基因工程技术引入抗病、虫、草的外源基因改变基因组构成的转 基因作物以及有害生物的商业化天敌归类于农药，但没有明确其是 生物农药。 1 2 1 生物农药的分类 根据上述定义，生物农药应包括生物体农药和生物化学农药。生 物体农药指用来防治病、虫、草等有害生物的商品活体生物。生物化 学农药是指从生物体中分离出的、具有一定化学结构的、对有害生物 有控制作用的生物活性物质，该物质若可人工合成，则合成物结构 必须与天然物质完全相同( 但允许所含异构体在比例上的差异) 。生物 农药的种类较多，若按开发对象和来源分类，可用图l 表示。动物体 农药主要指商品化的天敌昆虫、捕食螨及采用物理或生物技术改造的 昆虫等。目前，仅转基因抗有害生物或抗除草剂的作物可称为植物体 农药。微生物体农药指用来防治有害生物的活体微生物。植物源生物 化学农药中，植物毒素指植物产生的对有害生物有毒杀及特异性作 用( 如对昆虫拒食、抑制生长发育、忌避、驱避、拒产卵等) 的物质， 如印楝素、烟碱等；植物内源激素，如乙烯、赤霉素、细胞分裂素、 脱落酸、芸薹素内酯等：植物源昆虫激素，如早熟素等；异株克生物 质，即植物产生的并释放到环境中能影响附近同种或异种植物生长 的物质；防卫素，如豌豆素等。动物源生物化学农药指将昆虫产生的 激素、毒素、信息素或其他动物产生的毒素经提取或完全仿生合成加 工而成的农药，如昆虫保幼激素、性信息素、蜂毒肽等。av e r m e c t i n 、 d 内毒素、赤霉素等属于微生物源生物化学农药。 1 ，2 2 生物农药的特点 生物农药的出现和应用已有悠久的历史，但直到2 0 世纪3 0 年代之 后才有了一定的发展，从7 0 年代起，发展非常迅速。该类农药在长 期的研究和应用中所表现出的特点可初步归纳为以下几点： ( 1 ) 作用专一，活性较高 生物农药最显著的特点就是对病原菌的作用较为专一。在生物体 农药中，天敌昆虫、捕食螨常为寡食性或专性寄生；昆虫病原真菌、 细菌、线虫、病毒、微孢子虫等均是从感病昆虫中分离出来，经人工 繁殖再作用于该种昆虫；植物体农药更是有针对性地对某一种特定功 2 蜂毒肽的抑菌作用及其基因表达研究 能基因进行定向重组或改造。生物化学农药的专一性也较强，如昆虫 性信息素只对同种昆虫有效。另外，生物农药特别是生物化学农药对 有害生物的活性较高1 4 】。 生物农药 生物体农药 0 r g a n i s m p e s t i c i d e s 动物体农药天敌昆虫、捕食螨，转基因昆虫等 z o i c p c s t i c i d c sn a t u r a le n e m yi n s e c t sa n dm i t e s ，t a n s g e n i c i n s e c t s ，e t e 植物体农药转基因作物 b o t a n i c a lp e s t i c i d e st r a n s s e n i cp l a n t s 微生物体农药真菌、细菌、病毒、线虫、徽孢子虫等 m i c r o b i a lp e s t i c i d e s f u n g i ，b a c t e r i a ，v i r u s ，n e m a t o d e m i c f o s p o r i d a n ，e t c r 黜龇貅药篡篡：卫瓤锄舰蝴瓤 j b o t a n i c b i o c h e m i c a l 。；。，。t 。o 。x c i n n , 。n s l a i n n t s h c c o i r m h 。o f n m e p h y t o a l e x i n , p h y t o g 。n c ， 生物化学农爿i 动物源生物化学农药昆虫信息素、昆虫激素、毒素等 b 。h 。m 。3 1 iz 。1 。b 。h 。m 。8 1p 。5 。i d 。8 p h 。m 。“。，“5 。“。m 。“。， i 。4 i m 3 l 。1 i “，。 p e s t i c i d e s l 微生物源生物化学农药抗生素、毒素类等 lm i c r o b i a lb i o c h e m i c a lp e s t i c i d e s a n t i b i o t i c ，t o x i n ，c t c 图注：引自文献【3 】 ( 2 ) 对环境较安全 生物农药均是天然存在的活体生物或化合物，故在环境中会自然 代谢，参与能量与物质循环。施用于环境中或作物上，不易产生残留， 不会引起生物富集现象。如a v e r m e i t i n 对光不稳定，会逐渐被氧化。 在强日光下半衰期小于1 0 h 15 1 。 ( 3 ) 对非靶标生物相对安全 因生物体农药作用目标较为单一，若不考虑生态因素，其对非靶标 3 蜂毒肽的抑菌作用及其基因表达研究 生物几乎无影响。生物化学农药活性较高，用量较少，而且对害虫多 为胃毒作用，因此也是相对安全的。研究表明，印楝素对黑肩盲蝽、 菲岛长体茧蜂、智力小植绥螨等多种天敌安全：对蜜蜂、蚯蚓等有益 生物安全：对大白鼠、虹鳟等低毒，无致畸作用 6 1 。 ( 4 ) 利用途径多，开发前景广泛 天敌类动物体农药可以人工繁育，也可以引种释放。微生物类生 物农药可以直接利用，也可以经基因重组后利用。生物化学类农药不 但可直接利用或经人工合成后利用，也可以采用生物工程技术来定 向培养，或采用基因重组技术转化为植物体农药。 ( 5 ) 作用机理不同于常规农药，不易产生抗药性 生物杀虫剂大多是神经毒素，作用机理一般均都较为复杂。如印楝 素作为拒食剂，可作用于昆虫下颚须上的抑食细胞，而作为生长调 节剂则作用于脑神经肽【7 】：b t 所产生的内毒素作用于昆虫中肠上的特 异性受体，属于消化道毒剂1 8j ；昆虫性信息素作用于昆虫触角上的化 学感受器。天然产物和已商品化的人工合成除草剂之l 、日j 很少存在共同 的分子靶标部位，而且天然产物靶标中几乎没有与商品除草剂共有 的作用部位【9 ，”j 。 ( 6 ) 种类繁多，研发的选择余地大 生物农药的开发思路是在了解自然界中植物、昆虫、微生物彼此 之间及各类群之内的相互关系的基础上，充分利用连接这种关系的 信息系统来研发的。凡对农业有害生物有控制作用的均有可能通过多 种途径被开发为生物农药。随着人类环保意识的增强及农业可持续发 展战略的实施，生物农药作为类高效、安全的农药，必将具有广阔 的发展前景。 1 2 3 生物农药在我国的发展现状及存在问题 中国自2 0 世纪5 0 年代开始研究开发生物农药，已有多年历史。微生 物农药在中国的研究起步较早，从2 0 世纪5 0 年代开始b t 杀虫剂的研究， 但由于总体发展不平衡，制约了中国生物农药整体水平的提高。近1 0 年来，中国在生物农药的菌种引进、资源筛选评价、新产品开发、生 产工艺、产品质量检测及工业化生产等方面，都取得了长足的发展。 苏云金杆菌、阿维菌素、白僵菌、绿僵菌在中国己广泛推广和应用， 4 蜂毒肽的抑菌作用及其基因表达研究 药效良好。木霉菌开发取得成功，已获得注册，应用于防治蔬菜灰霉病。 2 0 0 4 年我国登记的生物农药活性成分品种为1 4 0 种，占我国农药总有 效成分品种的1 5 ；产品4 1 1 个，占注册登记农药产品的8 ；年产量 1 2 1 3 万吨制剂，约占农药总产量的1 2 ；年产值约3 亿美元，占农 药总产值的1 0 左右，使用面积约4 亿多亩次。目前，每年新研制成 功和登记注册的生物农药品种以4 的速度递增。2 0 0 5 年，我国各类 生物农药的总需求量达到1 4 5 万吨，总销售量额约为8 1 0 亿元。中国 b t 杀虫剂只占市场份额的2 ，棉铃虫病毒杀虫剂占0 2 ，农用抗生 素占9 ，植物源农药占0 5 。 由于使用生物农药较化学农药成本高、见效慢、抗菌谱窄、品种 单一，且一方面农民还没有形成环境保护的意识；另一方面，防治同 种虫害的生物农药的价格多数情况下比化学农药要高，而生产出来的 “绿色”农产品在市场上又没有明显的价格优势，大大抑制了农民购 买使用生物农药的积极性。这些问题直接或间接的影响到生物农药在 中国产业化的推进速度。 1 2 4 生物农药的发展前景 由于新的化学农药筛选成功率愈来愈低，对新药性能的要求愈来 愈高。与生物农药相比，化学农药的开发周期3 倍于生物农药，开发 费用4 0 倍于生物农药，注册费则是生物农药的1 0 0 倍。更重要的是， 多年以来化学农药的副作用问题一直无法解决，而且在我国绿色食品 生产标准中已明确规定，a a 级绿色食品生产要使用b t 、农抗1 2 0 、井 冈霉素等生物农药。北京、上海、山东、广州、福建等省市都已制定 了无公害生产条例，明确规定蔬菜生产中禁止使用剧毒农药和部分高 毒农药。在今后几年中，占我国农药使用量7 0 左右的5 种剧毒化学 农药将退出市场，取而代之的是低毒生物农药。针对中国入世，发达 国家纷纷调整提高了产品进口的技术门槛，农产品受到的影响首当其 冲。欧盟于2 0 0 3 年1 2 月3 1 日起正式禁止3 2 0 种农药在欧盟销售，其中 涉及我国产农药达6 0 多个品种，其中杀虫剂3 1 种，其它为杀菌剂和除 草剂等，此类农药在我国的生产量和使用范围已具有一定规模。因此， 生物农药的研制已成为当务之急，其研发将有效地实现农产品的优质 安全生产，提升农产品的经济附加值，扩大我国农副产品外销市场， 5 蜂毒肽的抑菌作用及其基冈表达研究 推进绿色农业产业的发展。 生物农药来源广，研究领域宽泛，而我国在生物农药科研方面投 入的资金与国外各大农药公司相比要少得多。因此，我国的生物农药 研究和开发要根据现有基础和优势有针对性地发展，微生物体及寄生 类天敌昆虫应作为生物体农药的主要开发对象。 1 3 抗菌肽综述 2 0 0 0 年，n a t u r e 杂志发表了一篇题为“多细胞生物的抗菌肽”的 综述，系统论述了抗菌肽领域新的研究进展及其应用前景。抗菌肽是 生物体内经诱导产生的一种具有生物活性的小分子多肽，生物体在不 断进化过程中产生的一种防御武器，是生物先天性免疫的重要组成成 分i l ”。1 9 7 2 年，瑞典科学家b o m a n 等从惜古比天蚕( h y a t o p h o r ac e c r o p i a ) 蛹中诱导分离出具有免疫功能的抗菌肽，被称为天蚕素( c e c r o p i n ) 1 1 2 1 。 随着人们研究的不断深入，相继在其他昆虫、哺乳动物、两栖动物以 及植物中分离到了多种类型的抗菌肽。 1 3 1 抗菌肽的分类 抗菌肽数量巨大，一级结构极其多样。通常从来源和二级结构的 角度对抗菌肽进行分类。 1 3 1 1 按来源分类 ( 1 ) 植物源抗菌肽1 1 3 j 植物生长常会受到微生物侵袭，在长期进化过程中形成了一套天 然防御体系。植物对微生物的防御一直是植物病理学研究的热点，病 菌危害是世界范围内农作物减产的重要原因。目前研究表明，植物虽 然没有哺乳动物那样特异的免疫系统，但非特异性的天然免疫体系却 十分惊人。不同类型的具抗菌肽作用的物质( 如过氧化氢酶裂解酶) 、 次生代谢物质以及抗菌蛋白( 如病员相关蛋白、p r 蛋白) 和防卫素等 在植物中广泛存在。 其中硫堇是最先在禾本科植物种子中发现的碱性小肽。研究发现， 硫堇广泛存在于单子叶和双子叶植物中，在植物的种子、叶片和根部 也得到了多种硫堇蛋白，不同植物中该蛋白存在同源性。之后，又在 6 蜂毒肽的抑菌作用及其基因表达研究 植物中发现了防卫素、脂转移蛋白、橡胶素类抗菌肽等植物源抗菌肽。 受到病原菌感染的植物能诱导植物防卫素基因表达，抑制多种细菌真 菌的生长，植物防卫素基因的表达呈现严格的器官特异性。 ( 2 ) 动物源抗菌肽 在自然界中存在大量能够产生毒素用以防卫或捕食的动物，主要 包括昆虫中的蚕类、蝇类、蜂类、蝎类、蜘蛛类等，水生动物中的螺 类、水母类、贝类和一些有毒鱼类，两栖动物中的蟾蜍类，爬行动物 中的蛇类等。 a 水生动物抗菌肽 水生动物尤其是海洋动物毒素作为新型药物开发对象是目前研究 的热点之一。在数千种有毒的海洋生物中，迄今研究过的仅占极少数。 这些海洋生物毒素中有不少结构特异、毒性强烈，药理作用与已知的 陆地天然产物相差悬殊，因此成为许多药物研发的关注热点。据报道， 许多水生动物抗菌肽除具有毒性外，尚具有抗菌性、抗病毒性、抗癌 性，溶血性及扩瞳等生物活性，这些水生动物毒素即使不能做为药物 直接利用，也能用作药理学试剂或者应用在其他药物的合成和改良两 方面【1 4 】。 目前水生动物抗菌肽作为农药直接开发研究的工作还很少，更多 的仍集中在其分子作用机理和基因转化的研究，特别是不同抗菌肽作 用于神经系统离子通道以及离子通道受体的影响等i ”j 。 b 两栖、爬行类动物抗菌肽 两栖、爬行类动物抗菌肽主要包括蛇毒抗菌肽和蟾毒抗菌肽。 蟾毒是蟾蜍科动物皮肤腺的分泌物。蛙皮素( m a g a i n i n s ) 是人们首 先从蛙皮中分离得到的抗菌肽，后来在蛙胃中也有发现。极低浓度蛙 皮素就能杀死革兰氏阳性和阴性细菌、真菌及原生动物。现在已知的 两栖类皮肤肽可分为血管紧张素样肽( a n g i o t e n s i n 1 i k ep e p t i d e s ) 、 铃蟾肽类( b o m b e s i n 1 i k ep e p t i d e s ) 、舒缓激肽样多肽( b r a d y k i n i n 1 i k e p e p t i d e s ) 等1 4 个家族类型i ”】。 作为目前为止研究最多的一种毒素，蛇毒内也存在多种活性多肽， 已分离出的一个1 3 个氨基酸( i n k a i a a l a k k l l ) 小肽，其对革兰氏阴 性和阳性菌均具有极强的杀菌能力1 1 ”。 7 蜂毒肽的抑菌作用及其基因表达研究 c 昆虫抗菌肽 昆虫在动物界中数量最多，分布最广，并且有高度的适应能力和 防御机制。昆虫免疫防御体系中，没有抗体、补体的参与，主要是由 一系列抗菌肽发挥作用。大多数昆虫抗菌肽是由脂肪体合成后释放入 血淋巴中，但也有少数是在特定区域表达。昆虫还能根据不同的病原 菌产生不同的抗菌肽，例如果蝇在感染昆虫病原真菌时，产生只对真 菌起抑杀作用的抗菌肽( d r o s o m y c i n ) 1 8 , 1 9 l 。昆虫抗菌肽种类繁多， 主要包括蚕类抗菌肽、蝇类抗菌肽、蝎毒活性肽、蜘蛛毒抗菌肽和蜂 毒抗菌肽。 自从1 9 7 2 年瑞典微生物学家首次从美洲天蚕的蛹中分离到分子量 4 k d 的抗菌多肽c e e r o p i n 后1 2 0 1 ，现在已从包括家蚕1 2 ”、柞蚕、麻蝇【2 2 l 等许多昆虫及高等动物中得到抗菌肽。多数分子量在3 0 0 0 至4 0 0 0 d 之 间，由3 0 至4 0 个氨基酸组成，具有热稳定性、广谱抗菌的特点。家蚕 抗菌肽对革兰氏阴性及阳性细胞均有较强的杀灭作用，对宫颈癌、人 髓白细胞病等一些肿瘤细胞体外共培养具有杀伤作用，而且可以抑 制肝炎病毒的d n a 复制。柞蚕中提取的抗菌肽d 对鼠造血细胞的生 长、功能与分化均能产生一定作用1 2 3j 。 蝎毒为传统药材全蝎的主要活性物质，是一种毒性仅次于蛇毒的 生物毒素，其主要活性成分是毒性蛋白( 即蝎毒素s c o r p i o nv e n o m ) 和 酶。该毒性肽是由6 0 至7 0 个氨基酸构成的单链神经活性肽。具有抗炎、 抗肿瘤、抗癫痫、镇痛、纤溶、抑制心律及改变血液流变性的作用1 2 “。 蜘蛛毒液是一种含多种成分的复杂混合物，组成蜘蛛毒液的主要 成分有多肽神经毒、蛋白质神经毒素、酶、核酸、游离氨基酸等i ”】。 目前已鉴定的蜘蛛毒素多为神经毒性多肽，分子量在3 k d 至t j 8 k d 之问， 能与细胞膜上的各种离子通道相作用【2 “。有一些蜘蛛毒性肽也表现出 抑菌 2 7 - 2 9 l 、凝集【3 0 】等作用，还可破坏心肌和骨骼肌【3 1j 以及改变血管 的通透性1 3 2 l 。 人们已从家蝇血淋巴分离到多种活性抗菌肽，它们的分子量在 4 8 6k d ，由5 1 1 1 1 个氨基酸组成。家蝇抗菌肽对细菌、真菌、肿瘤癌 细胞和病毒等具有生物活性，可通过针刺、带菌针刺、超声波、放射 性射线、高频电磁场和生理盐水等方法诱导增量产生，能耐极端的温 8 蜂毒肽的抑菌作用及其基因表达研究 度和p h 值的溶液，在高浓度盐溶液中也很稳定1 3 3 1 。 d 哺乳动物抗菌肽 目前，在哺乳动物中发现的抗菌肽主要存在于中性粒细胞、黏膜和 皮肤等1 3 引，有防御素( d e f e n s i n s ) 和c a t h e l i c i d i n s 两类1 3 引。哺乳动物防 御素具有保守的6 个半胱氨酸，能形成3 个稳定的二硫键( 这是区别于 其他抗菌肽的主要特征之一) ，具有十分广泛的抗菌谱，除抗细菌、 真菌、病毒外，还对支原体、衣原体、螺旋体及一些活性细胞r 如肿 瘤细胞) 有较强的杀灭作用1 3 6 1 。防御素是研究最多也最清楚的抗菌肽， 已从不同的物种中分离得到8 0 多种a 、b 和0 防御素。牛的b 防御素是 d i a m o n d 等首次在气管黏膜上皮细胞中发现的短肽，命名为t a p ，后 来又在粒性白细胞中发现了1 3 种与t a p 序列高度同源的b 防御素。在 牛的舌、气管、牙槽巨噬细胞及小肠细胞中还发现了另9 6 2 种防御素 l a p 和e b d 。猪的防御素p b d 1m r n a 广泛分布于胸腺、脾、肝脏、 肾、淋巴结、膀胱、脑、睾丸、肌肉、皮肤、骨髓及心脏等多种器官 的组织细胞中，在猪舌中防御素的含量最多可达2 0 1 0 0 m g l 。此外， 在鼠、羊、鸡和火鸡中也有大量的b 防御素分布【3 7 1 。 ( 3 ) 微生物抗茵肽 微生物来源的抗菌肽也是抗菌肽家族中的重要部分，包括环形肽、 糖肽和脂肽，例如短杆菌肽、杆菌肽、多粘菌素抗菌肽，有些已进入 i l l 期i 临床实验1 3 8 l 。一些由真菌产生的抗菌肽，如哌珀霉素类 ( p e p t a i b 0 1 ) 抗菌肽，主要由木霉属土壤真菌产生【3 9 】。 1 3 1 2 按照所含氨基酸类型分类 可大致分为4 类：c e c r o p i n ( 抗菌肽) 类、富含p r o 残基的m a g a i n i n ( 蛙皮素) 类、富含g l y 残基的m e l i t t i n ( 蜂毒肽) 类和富含c y s 残基的 d e f e n s i n ( 防御素) 类| 3 9 1 。 1 3 1 3 按照二级结构分类 ( 1 ) a 螺旋结构的肽 4 0 1 存在两性的a 螺旋结构类。此类抗菌肽不含半胱氨酸，不形成分 子内二硫键，n 末端区域富含亲水性碱性氨基酸残基，如赖氨酸和精 氨酸，所带正电荷有利于与细菌膜上的酸性磷脂头负电荷作用而吸附 到细菌膜上；c 末端含较多的疏水性氨基酸残基，疏水性的尾部有利 9 蜂毒肽的抑菌作用及其基因表达研究 于抗菌肽插入细菌膜的双层脂质膜中。分子的两端各形成一个双亲性 a 螺旋，两个a 螺旋之间有甘氨酸和脯氨酸形成的铰链区。常见的有 天蚕素( c e c r o p i n ) 和爪蟾抗菌肽( m a g a i n i n ) 。 ( 2 ) 伸展性螺旋结构类 该类抗菌肽不含半胱氨酸，但富含脯氨酸和( 或) 精氨酸或色氨酸等 由1 5 - 3 4 个氨基酸残基构成，在两性分子内部形成分子内的a 螺旋。 研究表明昆虫防御素与哺乳动物防御素二硫键的连接方式以及三维 空间构型是截然不同的，因而昆虫防御素与哺乳动物防御素不具有同 源性。后来又从麻蝇( s a r c o p h a g ap e r e g r i n a ) 、埃及伊蚊( a e d e sa e g y p t i ) 、 按蚊( a n o p h e l e sg a m b i a e l 、果蝇、人的腮腺及牛中性粒细胞等分离到 防御素家族成员n ”。 ( 3 ) b 折叠型 此类抗菌肽在分子内有2 - 6 个二硫键的抗菌肽类，分子量约为4 - 6 k d ， 可分为a 型和b 型两种。a 防御素已从人的中性粒细胞、兔的巨噬细 胞、鼠和人的小肠p a n e t h 细胞中分离到1 4 ，一般含有2 9 3 4 个氨基酸残 基，分子内形成的1 3 一片层结构、二硫键、赫键及每个单体中残基问的 疏水作用保证了二聚体空间结构的稳定性。1 3 防御素广泛存在于不 同的上皮组织中，可能参与上皮和粘膜的抗感染防御1 4 2 - 4 4 l 。 ( 4 ) 环链结构类 该类抗菌肽在c 2 末端有一个分子内二硫键，在c 末端形成一个环 链结构，而n 末端为线状结构。如青蛙皮肤细胞产生的b r e v i n i n s 和 b a c t e n e c i n 属于此类。而牛中性粒细胞分泌的b a c t e n e c i n 是在分子的中 部形成一个环链，两端有一个或两个游离的残基【4 副。这一类抗菌肽有 较强的抗菌活性。 1 4 蜂毒肽综述 蜂毒( b e ev e n o m ) 是工蜂遇攻击时通过螫针排出的一种具有芳香 气味的透明毒液，存在于工蜂毒腺内。祖国医学应用蜂毒治疗风湿、 类风湿性关节炎、肩周炎等疾病已有悠久的历史，获得良好的疗效。 蜂毒呈酸性反应，是具有高度生物学活性和药理学活性的复杂混合 1 0 蜂毒肽的抑菌作用及其基因表达研究 物，主要以肽类为主，其中包括蜂毒溶血肽( m e l i t t i n ) 、活性酶、生 物胺、蜂毒肥大细胞脱粒肽等1 0 余种活性肽，此外还含有透明质酸酶、 蜂毒磷脂酶a 2 及组胺等5 0 多种酶类物质。其中蜂毒肽约占蜂毒干重的 5 0 ，是蜂毒中主要发挥作用的成分1 4 6 】，具有高度的药理作用和生物 学活性。蜂毒肽可以通过多途径影响细胞的信号传导系统，并可诱导 细胞凋亡，具抗菌、抗病毒、抗炎、抗关节炎、抗辐射等方面的作用 4 7 , 4 8 l ，近十年来发现尚有抗肿瘤【4 9 】及抗人免疫缺陷病毒h i v 作用【5 0 1 。 1 4 1 蜂毒肽的结构 蜂毒肽是由2 6 个氨基酸组成的小分子肽，具有不对称的线性结构。 兼性结构由第1 位至第2 0 位的疏水基团和第2 1 至第2 6 位的亲水基团组 成。 1 4 1 1 一级结构 1 9 6 7 年h a b e r m a n m 等首先从蜂毒中分离出由2 6 个氨基酸组成的蜂 毒肽，并分析了氨基酸序列，证明其结构中无二硫键。蜂毒肽相对分 子量为2 8 4 9 ，氨基酸的排列顺序为： n h 2 一g l y - i l e g l y a l a v a l l e u l y s v a l - l e u t h r - t h r g l y l e u p r o a l a - l e u i l e - s e r t r p i l e l y s a r g l y s - a r g g l n g l n - c o o h 在通常情况下，c 末端有4 个氨基酸残基携带正电荷，n 末端2 个 氨基酸残基携带正电荷，整个分子带6 个正电荷。分子的三个赖氨酸 和两个精氨酸使蜂毒肽成为具有强碱性的兼性分子。 1 4 1 2 二级结构 蜂毒肽的二级结构为a 螺旋结构，分别为自n 末端1 1 0 个氨基酸残 基形成的a 螺旋结构和1 3 2 0 氨基酸残基形成的a 螺旋结构。 1 4 1 3 三级结构 。 1 9 8 0 年a n d e r s o n 等观察了蜂毒肽的三级结构，表明其空问结构可 分为4 个区域：自n 末端1 1 0 氨基酸形成的a 螺旋结构，1 1 - 1 2 氨基酸 以1 2 0 角连接2 个螺旋的绞链结构，1 3 2 0 氨基酸形成的a 螺旋结构以及 邻近c 末端的2 1 2 6 氨基酸所在的正电荷区域。这样的4 个单体通过疏 水基相连( 5 。在中性水溶液中，蜂毒肽作为单体是以随机的卷曲结构 蜂毒肽的抑菌作用及其基冈表达研究 存在的，而随着p h 值以及离子强度的增高，4 个单体自我交联，形成a 螺旋的四聚体结构 5 2 , 5 3 】。而2 个a 螺旋结构间的夹角会由于不同溶液 中蜂毒肽维持的形态不同而有所改变1 5 4 , 5 5 1 。蜂毒肽的n 末端起前2 0 个氨基酸残基主要是疏水的，c 末端的6 个氨基酸残基主要是亲水的。 这种双亲性( a m p h i p h i l i c ) 是膜结合肽和膜蛋白跨膜螺旋的特征，所以 这个特性决定了蜂毒肽既可以溶于水中又可以与膜自然结合 5 6 , 5 7 1 ，进 而溶解细胞。 1 4 1 4 构效关系 据报道1 9 6 8 年就已发现蜂毒肽具有广谱抗菌作用。但对其结构与 抗菌及溶血作用之问关系的研究近些年才有报道。蜂毒肽两种手性异 构体的溶血和抗菌作用相当，不需要手性识别【5 1 1 。研究表明，将1 4 位的脯氨酸残基换成丙氨酸，可使蜂毒肽的1 2 0 。旋光角消失，溶血 作用增加2 5 倍，降低形成电压依赖性通道的稳定性，证明溶血与通 道的形成不相关1 5 引。删掉蜂毒肽的1 1 1 5 位，2 1 2 6 位的单个氨基酸得 到蜂毒肽的类似物对溶血作用没有影响，单独删掉6 位亮氨酸、7 位赖 氨酸、8 位缬氨酸、9 位亮氨酸、1 3 位亮氨酸、1 6 位亮氨酸、1 7 位异亮 氨酸和1 9 位色氨酸得到蜂毒肽的类似物的溶血活性下降很大( 去掉弯 曲区的氨基酸则不影响溶血作用) 、兼性程度也降低，同时抗菌作用 也略有下降，提示兼性结构对溶血作用尤为重要1 58 1 。不论对1 9 位色氨 酸进行化学修饰或以亮氨酸取代，都使得蜂毒肽的生物学活性大为降 低1 5 9 j ，证明1 9 位色氨酸对蜂毒肽的生物学活性至关重要。7 位的赖氨 酸在维持蜂毒肽的a 螺旋结构中起重要作用 6 0 1 。蜂毒肽的非对映异构 体螺旋性很低，不具溶血性，但有抗菌作用 5 7 , 6 1 1 。各种类似物的抗菌 效力表明，抗菌作用对兼性结构的需要程度与溶血作用相比较弱1 5 1 1 。 构效关系的研究提示我们，可以通过对蜂毒肽氨基酸序列做出修 饰，提高我们需要的特定功能，减弱多重功能的不利影响。 1 4 2 蜂毒肽的功能 1 4 2 ，1 蜂毒肽的药理作用及临床应用 ( 1 ) 抗茵抗病毒作用 蜂毒肽对2 0 余种革兰阳性和阴性细菌的生长繁殖有抑制作用，尤 其是蜂毒肽可以抗对青霉素具有耐药性的金黄色葡萄球菌【6 2 】，这在细 1 2 蜂毒肽的抑菌作用及其基因表达研究 菌对现存抗生素耐药性日渐增强的今天，引起了人们的特别注意。蜂 毒肽还能增强磺胺类和青霉素类药物的抗菌效力。蜂毒肽对多种真 菌、病毒也具有毒性。 ( 2 ) 对神经系统的作用 蜂毒肽可作用于神经系统，其对n 乙酰胆碱受体有选择性阻滞作 用，使中枢神经系统突触内兴奋传导阻滞，并表现出中枢性烟碱型胆 碱受体阻滞作用；蜂毒肽还能抑制周围神经冲动传导1 6 3 】，有明显的 镇痛作用和调节神经系统紧张度的作用【6 4 1 。 ( 3 ) 对心血管和血液系统的作用 蜂毒肽有明显的降血压作用，其作用过程类似于组胺，是通过扩张 血管实现的，蜂毒肽还对心肌具有正性频率和负性肌力作用。蜂毒肽 具有溶血、抗凝血和降低血栓素的作用。 ( 4 ) 抗炎镇痛作用 蜂毒肽是迄今为止人类所知的抗炎活性最强的物质之一，其抗炎 活性是氢化可的松( h y d r o c o r t i s 0 1 ) 的1 0 0 倍。它具有类激素样的作 用，但无激素的不良反应1 6 6 j 。蜂毒肽对前列腺素合成酶的抑制作用是 吲哚美辛的7 0 倍1 6 7 ，镇痛强度为吗啡的4 0 ，镇痛持续时间较长，但 无水杨酸类对消化道的刺激和淄体类的免疫抑制作用。 (