（有机化学专业论文）功能荧光微球的制备及其对蛋白质的固定化.pdf

功能荧光微球的制备及其对蛋白质的固定化 蛋白质的固定化，特别是高通量药物筛选中受体蛋白的固定化是目前生物医 学领域的研究热点。固定化的载体材料特别是微球型载体的研究则是其中一个关 键性的内容。 采用改进的无皂乳液聚合法，制备了亚微米级到微米级的表面清洁化聚甲基 丙烯酸甲酯微球。其方法是在无皂乳液聚合体系里分别加入乙醇、n a c l 和甲苯。 结果表明，在不同的反应条件下，体系表现出不同的聚合行为，同时加入乙醇、 n a c l 和甲苯，对反应最有利，可以制备出接近微米级的单分散聚合物微球。 首次从产品收率与转化率的关系出发，考察了苯乙烯的分散聚合。结果表明， 不同的分散介质对聚合过程、反应转化率、产品实际收率以及微球的平均粒径和 粒径分布均有不同的影响。在此基础上，制备了1 l o g m 呈正态分布的聚合物微 球。 采用在苯乙烯分散聚合体系里加入功能单体的方法，制备了聚苯乙烯功能微 球。采用吸附法，制备了聚苯乙烯功能化荧光微球。所制备的荧光微球的化学性 能、物理性能、吸收及发射性能稳定，适合用做标记型蛋白质载体材料。 分别考察了不同条件下，聚苯乙烯功能荧光微球对血清蛋白以及胰蛋白酶的 固定化，对固定化胰蛋白酶的活性进行了研究。结果表明，在一定条件下，功能 微球对血清蛋白及胰蛋白酶均具有相应的稳定吸附量。固定化酶在温度稳定性、 p h 值稳定性、储存稳定性以及回收活性方面具有游离酶不可比拟的优越性。 从在载体表面位点占据度和蛋白质吸附的协同性出发，推导出蛋白质固定化 腊凇附馘濮躲船= 黑鳓膳劬 p = l n 击) 。从徽的 原理出发，解释了蛋白质吸附中的一些基本问题。 关键词：功能荧光微球，无皂乳液聚合，分散聚合，蛋白质固定化，等温模型 p r e p a r a t i o n o ff u n c t i o n a lf l u o r e s c e n t m i c r o s p h e r e sa n d t h e i r a p p l i c a t i o ni np r o t e i ni m m o b i l i z a t i o n w a n gd i q i a n g ( o r g a n i cc h e m i s t r y ) d i r e c t e db yp r o f e s s o rl i u b a i l i n g a b s t r a c t t h ei m m o b i l i z a t i o no fp r o t e i n s ，e s p e c i a l l yt h ei m m o b i l i z a t i o no fr e c e p t o r p r o t e i n sw h i c h v a l lb eu s e di nh i g ht h r o u g h - p u ts c r e e n i n go f d r u g s ，h a sr e c e i v e dg r e a t a t t e n t i o ni nr e c e n ty e a r s i nt h es t u a y o f p r o t e i ni m m o b i l i z a t i o n ，t h ec a r r i e r so f p r o t e i n ， i np a r t i c u l a r , m i c r o s p h e r e sw e r et h ec o r ec o n t e n t b yi n t r o d u c i n ge t h a n o l ，n a c la n d t o l u e n ei n t ot h em o d i f y i n gs o a p f r e ee m u l s i o n p o l y m e r i z a t i o no fm e t h y lm e t h a c r y l a t e ，r e s p e c t i v e l y , m i c r o s p h e m si n t h ed i a m e t e r r a n g e o fs u b - m i c r o nt om i c r o na n dw i t hc l e a rs u r f a c ew e r ep r e p a r e d t h e e x p e r i m e n t a l r e s u l t ss h o w e dt h a tt h e p o l y m e r i z a t i o np r e s e n t e d d i f f e r e n t c h a r a c t e r i s t i c su n d e rd i f f e r e n t p o l y m e r i z i n g c o n d i t i o n s t h ea d d i t i o no fe t h a n o l ，n a c l a n dt o l u e n ew a si nf a v o ro ft h e p o l y m e r i z a t i o n ，a n da p p r o x i m a t e m i c r o n s i z e p o l y m e t h y lm e t h a c r y l a t em i c r o s p h e r e sw i t hm o n o d i s p e r s i o nc o u l db e o b t a i n e df r o m t h i sc o n d i t i o n u p t on o wi tw a st h ef i r s tt i m eo ft h ei n v e s t i g a t i o no ft h er e l a t i o n s h i pb e t w e e n t h ea c t u a la m o u n to f m i c r o s p h e r e sa n dt h ec o n v e r s i o no fs t y r e n ei n t h ed i s p e r s i o n p o l y m e r i z a t i o n t h er e s u l t si n d i c a t e dt h a td i f f e r e n tm e d i a h a dd i f f e r e n ti n f l u e n c eo n t h ep o l y m e r i z i n g p r o c e s s ，t h ec o n v e r s i o n ，t h ea c t u a ly i e l do fm i c r o s p h e r e s ，a sw e l l a s t h e a v e r a g e d i a m e t e ra n dd i s t r i b u t i o no fm i c r o s p h e r e s t h en o r m a ld i s t r i b u t i o n m i c r o s p h e r e si nt h ed i a m e t e rr a n g eo f 1 1 0g mw e r e p r e p a r e d w i t haw e l l e s t a b l i s h e d p r o c e d u r ea t t r i b u t e dt oo u r d e t a i l e dr e s e a r c ho nr e a c t i o nc o n d i t i o n s d i s p e r s i o np o l y m e r i z a t i o ni s a m e n a b l et o p r e p a r em o n o d i s p e r s em i c r o n - s i z e m i c r o s p h e r e sa c c o r d i n gt o t h ea b o v er e s e a r c h ，f u n c t i o n a lp o l y s t y r e n em i c r o s p h e r e s w e r ed e v e l o p e db ya d d i n gf u n c t i o n a lm o n o m e r st ot h er e a c t i o n s y s t e m u s i n g a d s o r b i n gm e t h o d ，t h e f l u o r e s c e n t m i c r o s p h e r e s w i t hs t a b l ec h e m i c a l p r o p e r t y , p h y s i c a lp r o p e r t y , a b s o r b i n gp r o p e r t ya n de x c i t i n gp r o p e r t yw e r ep r e p a r e d t h et a r g e t m i c r o s p h e r e s c o u l db eu s e da st h el a b e l e dm a t r i xf o r p r o t e i n i m m o b i l i z a t i o n w i t h p o l y s t y r e n e f u n c t i o n a lf l u o r e s c e n t m i c r o s p h e r e s a st h em a t r i x ，t h e i m m o b i l i z a t i o no fs c i u mp r o t e i na n dt r y p s i n ，a n dt h ea c t i v i t yo f i m m o b i l i z i n gt r y p s i n h a v eb e e ns t u d i e d t h er e s u l t ss h o w e dt h a ti nc e r t a i nc o n d i t i o n s ，t h ep r o t e i n sc o u l db e s t a b l yi m m o b i l i z e do n t ot h ef u n c t i o n a lm i c r o s p h e r e s ，a n dt h ei m m o b i l i z e de n z y m e w a s s u p e r i o r t o t h ef r e e o n z y l n e i n t e m p e r a t u r e r e s i s t a n c e ，p h - r e s i s t a n c e ， t i m e r e s i s t a n c ea n dm a i n t a i n e da c t i v i t y 觚i s o m e 衄m a d s o r p t i o n m o 捌w 舔d e a u c e d a s 卜i 篙籍o r i n k + 灿【p 1 = h ( 一与) ，b a s e d 。n m e h 0 1 d i n gd e g r e e o fs u r f a e 。a c t i v e8 岫a n dm 。 c o o p e r a t i o no fp r o t e i ni m m o b i l i z a t i o n ，a n ds o m ef u n d a m e n t a lq u e s t i o n si np r o t e i n a d s o r p t i o n w e r e e x p l a i n e da c c o r d i n g t ot h ep r i n c i p l eo f c h a n g ei ne n t r o p y k e y w o r d s ：f u n c t i o n a l f l u o r e s c e n tm i c r o s p h e r e s ；s o a p f r e ee m u l s i o np o l y m e r i z a t i o n ； d i s p e r s i o np o l y m e r i z a t i o n ；i m m o b i l i z a t i o no f p r o t e i n ；i s o t h e r m a l m o d e l 引言 引言 随着科技的发展和社会的迸步，人类越来越注重对自身的关注。这推动了生 命科学的不断发展，并扩大了与其他学科的融合与交叉。生物医学材料的研究是 其中一个非常重要的内容，它涵盖了生物科学、医学科学、材料科学、数学、化 学以及物理学等领域。可以毫不夸张的说，生物医学材料的研究水平，在一定程 度上代表着一个国家或地区在国际科技领域的地位。 在生物医学材料研究领域中，高分子试剂一直是一个令人关注的内容。例如， 它可以用做药物释放的载体材料、用做生物活性物质的筛选材料、用做组织工程 的基质材料，甚至还可以直接用做药物。 蛋白质的固定化，特别是高通量药物筛选中受体蛋白的固定化则是目前生物 医学领域的又一研究热点。高通量药物筛选法是一种高效、微量、快速、简便的 体外筛选法，是药物化学、合成化学、组合化学发展的产物。它带来了现代药物 学的进步，具有传统的动物模型筛选法无可比拟的优势。国外发展起来的高通量 筛选模型，每天可筛选多达5 万个化合物。西方发达国家已采用这种方法开发新 药，并目益受到人们的关注和重视。随着国际药物研究形式的发展和我国加入 w t o ，开发有自主知识产权的新药已迫在眉睫。但由于筛选的模型基本上都是 动物模型，因而未能形成规模，在我国还没有高通量的药物筛选。我国天然产物 资源丰富，面对天然药物越来越受到世界重视的趋势，应用高效的药物筛选方法， 从海洋生物、中药材植物资源中开发出具有自主知识产权的新药，这对我国新药 的开发以及经济的发展将产生巨大的推动作用。 高通量药物筛选法得以实旌，有赖于2 0 世纪9 0 年代初期发展起来的邻近闪烁 分析法以及其他一系列类似的亲和结合方法。这类检测法因无须分离结合和游离 的标记物，从而使自动化操作成为可能。而其成功应用的关键则是荧光微球的制 备。荧光微球可与受体、酶、抗体、基因等靶点相连接，这些靶点可与特定的标 记物结合，从而将标记物产生的能量传递给荧光微球，激发出荧光，进行检测。 而未结合的标记物由于与微球的距离较远，不能使荧光微球发光。因而可在一个 体系中完成全部的反应过程，实现自动化操作。 因此，通过对载体材料的制各和其与生物活性物质的相互作用进行深入细致 功能荧光微球的制备及其对蛋白质的固定化 的研究，并将所取得的研究成果应用于药物筛选，并结合组合化学、药物化学、 数学以及计算机科学等学科，相信我国在本世纪一定能实现高通量药物筛选的目 标。 作为一个应用基础性的研究，本论文的目的在于从载体材料的制备方法出 发，探讨载体材料制备过程中的一些关键性因素，并对其制备机理进行解释，对 所制备的功能化载体材料进行应用性能上的考察，从而建立起一条可行的载体微 球研究路径，以期对其在蛋白质的固定化尤其是在高通量药物筛选方面有初步的 指导意义。 第一章功能微球及其与蛋白质相互作用研究进展 第一章功能微球及其与蛋白质相互作用研究进展 1 1 大粒径、单分散聚合物微球的制备方法研究进展 1 1 】聚合物微球的特征及其应用前景 所谓微球，是指直径在o 0 1 l o i t m 范围内具有球形外观的微小粒子f 】1 。一般 来说，聚合物微球具有如下一些特征2 】： 1 体积小，因而可以迅速的响应刺激，可以用做标记物和标准物； 2 比表面积大，因此可以提供足够的场所供吸附、解吸附、化学反应、以及 对光进行散射等等； 3 高扩散性和运动性，其分散体具有较低的粘度。从宏观上其可以通过重力 场、电场等产生运动，微观上可以通过布朗运动产生运动，从而不断更新与分散 介质的相互作用界面： 4 在一定条件下具有相应的分散稳定性； 5 相对均匀的粒径及形态分布； 6 多样化的制备方法及用途。 由于具有以上的特征，使功能性聚合物微球在标准计量、情报信息、分析化 学、医学免疫及生物化学方面具有广阔的应用前景p j 。因此，多功能、高性能聚 合物微球的合成及应用已经成为国内外学者致力的一个研究热点，并取得了长足 的进步。 1 1 2 聚台物微球的基本制备方法 聚合物微球的制备包括两条基本路线，如图1 1 t 2 】所示。路线1 是单体经非均 相聚合直接制备得到聚合物微球。路线2 是单体聚合成高聚物后，或者天然的高 分子材料经过些加工方法( 大部分是物理方法) 而得到聚合物微球，主要包括乳 液固化成型法，凝聚成型法，溶剂蒸发成型法，或溶剂抽提成型法等【4 “。对于 制备具有均匀粒径及表面形态的功能聚合物微球，路线1 具有相当大的优势。而 对于用于药物释放的载体微球的制备，路线2 具有天然的好处，因为大部分药物 释放载体材料均选用天然高分子材料。本论文所注目的焦点是乙烯基单体经非均 相聚合得到聚合物微球以及其表面改性引进功能基团的方法，即路线1 所示的方 功能荧光微球的制备及其对蛋白质的固定化 法。 f i g u r e1 1p r e p a r i n g r o u t i n e o f p o l y m e r m i c r o s p h e r e s 图1 2 1 2 1 是乙烯基单体经非均相聚合得到聚合物或对其进一步处理得到新微 球的方法。大致上分为两类，一类是非均相聚合直接得到聚合物微球，包括乳液 聚合法，无皂乳液聚合法，沉淀聚合法，悬浮聚合法以及分散聚合法。另一类是 在已有微球的基础上，进行进一步的处理，得到新的聚合物微球，主要有种子溶 胀聚合法等，此类方法的一个最大的优点就是可以形成明显的核- 壳结构，或者 是得到单分散的大粒径微球。但是，由于制备方法繁琐耗时，产率低，影响了其 应用前景。图1 2 还展示了不同制备方法所得到的聚合物微球的粒径范围。由图 中我们可以看到，乳液聚合的适用范围是纳米到亚微米级范围，无皂乳液聚合适 用于亚微米级接近微米级的范围，分散聚合则可制备从亚微米到微米级范围内的 聚合物微球，悬浮聚合制备的微球其粒径最大，从几微米到几百微米，而沉淀聚 合得到的微球，其粒径范围最广，可以从纳米级到几十微米。种子聚合则适用于 制备几微米到几十微米范围内具有单一分布的功能化聚合物微球。尽管沉淀聚 合、悬浮聚合所制备的聚合物微球具有粒径较大的优点，但是因为其产物粒径分 布不均匀，因此般不用做制备聚合物微球试剂。 第一章功能微球及其与蛋白质相互作用研究进展 d i a m e t e r ( u m ) p o l y m e r i z a t i o n 厂0 1 l 一1 r l i - - l o o l 、 l - f i g u r e1 2p a r t i c l e f o r m i n gp o l y m e r i z a t i o na n d r e s u l t e d p a r t i c l ed i a m e t e r 1 1 3 单分散大粒径聚合物微球制备研究进展 自1 9 5 5 年美国里海大学乳液聚合物研究所v a n d e r h o f f 和b r o d f o r d 教授成功 合成单分散聚合物微球以来f 6 l ，单分散、大粒径聚合物微球的制备方法至今已经 取得了很大的进展。目前，制备单分散大粒径的方法主要包括分散聚合法和种子 聚合法。 分散聚合法是7 0 年代初发展起来的一种聚合方法，此种方法的提出，为聚合 物微球的合成开辟了一个全新的领域。因为具有简便易行、产物性能好的优点， 3 0 年来，分散聚合法得到了充分的发展。初期分散聚合法的研究，主要集中在单 一品种单体的聚合方面，着重探讨聚合反应的条件，如单体、引发剂、稳定荆和 分散介质，然后逐渐过渡到多种单体的共聚制备功能聚合物微球。在研究聚合条 件的同时，关于分散聚合机理的研究也在同步进行，并取得了巨大的成就，t s e n g ， l o k ，l u ，p r o c h a z k a 以及p a i n e 等人 7 1 2 1 做出了开创性的贡献。在聚合物成核方面， 功自荧光微球的制各及其对蛋白质的固定化 目前所公认的成核机理有两种，即f l q t s e n g 等人提出的齐聚物沉淀机理，和由l o k 等人提出的接枝共聚物聚结机理【7 。8 】。随着分散聚合方法的逐渐成熟和聚合机理 的逐步完善，分散聚合已不仅仅局限于单一品种聚合物微球的制备，而是向多功 能、多形态、多品种发展，如今，以该方法为基础，已经成功地开发出交联结构 功能微球f 1 3 】，中空多孔微球1 1 4 】，核壳结构功能微球1 6 1 ，磁性微球18 1 ，热敏 微球1 1 7 等新型品种应用于许多领域，特别是生物医学领域。 除了分散聚合外，还有一类制备单分散大粒径聚合物微球的有效方法，可统 称为种子溶胀法。所谓种子溶胀法，就是先用无皂乳液聚合、分散聚合或雾化法 等方法制成小粒径单分散聚合物微球，然后以此为种子用单体进行溶胀，使颗粒 长大，再引发聚合的方法。到目前为止，已经发展出常规溶胀法，逐步溶胀法， 活性溶胀法以及动力学溶胀法等。 常规种子溶胀法即是将聚合物种子在分散体系中直接用一定量的单体溶胀 一定时间，然后进行聚合，得到聚合物微球。如o k u b o 等人【1 9 2 0 1 在0 。c 下用s t 氯甲基苯乙烯或s t d v b 单体混合物，溶胀预先用分散聚合制备的2 微米单分散 聚苯乙烯微球，2 4 小时后进行聚合反应，得到了3 微米的单分散微球。 逐步溶胀法 2 1 1 是指把种子颗粒进行多次溶胀，多次聚合最终制备聚合物微球 的方法。根据m o r t o n 2 2 1 分散颗粒热力学方程，可以计算出种子颗粒被单体溶胀 后体积将增大2 倍，粒径将增大l 。4 倍。反复溶胀、反复聚合即可得到大粒径微 球。从理论上讲，小粒子增长速率大干大粒子，经过一连串溶胀聚合步骤以后， 粒径分布应当变窄。但实际上若控制不好，每一步都有可能产生新的小颗粒，故 很难得到单分散微球。另外，由于所需时间较长，造成颗粒聚并，使体系稳定性 变差，粒径分布变宽【2 ”。 7 0 年代末，u g e l s t a d 等人 2 3 - 2 5 1 发明了一种制备大粒径、单分散聚合物微球 的新方法，即活性溶胀法( 或二次溶胀法) 。用这种方法可以制各粒径为1 - 1 0 0 9 m ， 分散系数小于2 的聚合物微球。这种方法主要采取两个步骤，首先，向种子分 散体中引入一种齐聚物o 或一种低分子化合物y ，这样可以使颗粒溶胀度提高 1 0 0 0 倍。接着，把经第一步溶胀的种子分散体系用单体和油溶性引发剂进行溶 胀，待达到溶胀平衡后，升温进行聚合反应，即可得到大粒径单分散聚合物微球。 9 0 年代，日本的o k u b o 教授 2 6 - 2 现又提出一种新的溶胀聚合法，即动力学溶 第一章功能微球及其与蛋白质相互作用研究进展 胀法。这种方法不需要加入溶胀剂，而是直接用单体和引发剂对种子一步溶胀即 可完成，可显著提高效率。其操作方法是，先用分散聚合法制备出单分散种子分 散体系，再向该分散体系中加入单体、引发剂、稳定剂及某种溶剂，然后慢慢加 入水，使单体在介质中的溶解度降低，以改变单体在颗粒和介质问的分配系数， 使更多的单体进入聚合物颗粒，溶胀成约4 倍直径的单分散颗粒，进行聚合，最 后可以得到约3 倍直径的单分散、大粒径聚合物微球。 1 2 聚合物微球的应用 1 2 1 聚合物微球在生物医学领域的应用 聚合物微球研究的飞速发展，是与其在生物医学领域的巨大应用密不可分 的。图1 3 ( 本图大部分来源于文献【2 ) 列出了不同粒径大小的聚合物微球在生物 医学领域的应用以及自然界存在的相应尺度的天然物质。 b i o c o m p o u n ds i z e ( u m ) u s eo fm i c r o s p h e r e s p r o t e i n v i r u s b a c t e r i u m c e j j l i 匪 l e a s s a y i ：= = ? ” f i g u r e1 3b i o m e d i c a la p p l i c a t i o n so f p o l y m e r m i c r o s p h e r e s m ， d o c ； ， - 4 一 一 一 一 一 功能荧光微球的制各及其对蛋白质的固定化 1 ) 生物分离 生物大分子如蛋白质、核酸、糖等都具有自己独特的理化性能，可以根据其 独特的理化性能在水溶液中对其进行分离与浓缩。微米级以上的凝胶粒子是最常 用的分离和浓缩试剂，凝胶渗透色谱便是一个最成功的例证。通过疏水缔合作用、 静电相互作用，亚微米级聚合物微球也可用于蛋白质的提纯【3 0 】。 热敏型凝胶微球是另一类虽白质浓缩与分离的有效试剂。通过其在不同温度 下的形态转变，可以从蛋白质混合体系中提纯和浓缩某种目标蛋白质p 1 ，3 2 j 。 亲和分离是一类广泛应用于核酸、蛋白质和糖类分离的方法。通过在载体微 球上共价结合上亲和配体，再将此亲和载体微球装填在色谱柱内，混合物在通过 色谱柱时，由于特异性亲和作用，目标分离物被固定在柱内，继而通过洗涤分离， 就可实现对产物的分离与纯化。如龚波林等人以单分散交联聚甲基丙烯酸环氧丙 酯树脂为亲和载体，对伴刀豆球蛋白- a 进行纯化，得到了很好的效果3 3 1 。 除了以上所提及的方法，如今又研究出一些新的方法，以磁性微球分离最具 代表性【3 4 1 。磁性微球结合上目标分离物后，在磁场作用下，很容易被分离。因此， 该方法是一种极具潜力的分离方法。 2 ) 免疫检测及亲和诊断 抗体一抗原反应是生物体内最重要的生物免疫反应，通过此反应，可以使肌体 免受外来侵袭的损害。所以，抗体一抗原反应的检测是生物医学领域的一个非常 重要的内容。在聚合物微球上负载上抗体，用于对抗原的特异性结合，就可对其 进行检测。其检测方法也是多种多样，既可以对复合物分离之后进行测定，也可 以用标记的办法直接对复合物进行检测。如h a r m a 等人以时间荧光分辨的方法 在微球表面进行多元免疫检测，得到了良好的结果【3 5 1 。 如果抗原一抗体结合反应引起载体材料体积的明显改变，则可通过此种方法测 定反应的程度。这就是所谓亲和乳胶诊断的原理 矧。亲和乳胶诊断是最快速、最 简便易行的免疫检测方法，因此，具有广泛的前景。 实际上，亲和乳胶微球并不仅仅局限于抗原抗体的检测，只要符合图1 4 2 】 所示的情形，就可使用亲和测定的方法进行检测。后文中将要述及的高通量药物 的筛选方法，也是基于此原理。 第一章功能微球及其与蛋白质相互作用研究进展 区一 a f f i n i t yi a t e xp a r t i c l e s a p p l i c a t i o n b i o a s s a y d i a g n o s i s b i o m o l e c u l a rs e p a r a t i o n c e l ll a b e l t a r g e t i n g c e l ia c t i v a t i o n c e l ls e p a r a t i o n f i g u r e1 , 4p o s s i b l ea f f i n i t yl a t t i c e s 3 ) 血液检测 心脏的血液输出以及局部的血液流动关系到氧的输送与吸收问题，因此，对 其进行检测具有很大的必要性。可以使用放射标记的聚合物微球进行检测。由于 安全性因素，后来又发展出彩色标记、荧光标记、磁性标记等无放射性的标记与 检测方法。如s c h l e n s a k 等人采用荧光微球，研究了动脉灌注法在心脏分流手术 中的影响，认为此方法并不能有效的抑制肺部的局部缺血问题【3 7 】。 尽管血管的栓塞在绝大多数时候都是有害的，但其也可以被加以利用。例如， 可以利用其减少手术中血液的流失量，提高安全系数。聚合物微球在此方面也得 到了有效的应用i 3 8 o 噬菌作用是血液细胞( 包括巨噬细胞、白细胞等) 为了保护肌体免受外来侵害 产生的又一种生物反应。通过噬菌细胞对荧光标记的聚合物微球的吞噬作用，可 功能荧光徽球的制各及其对蛋白质的固定化 以对此反应进行检测3 9 1 。这种方法对药物在血液中的控制释放具有相当大的意 义。 4 ) 药物释放体系2 1 聚合物微球在药物释放方面有着非常重要的应用。此方面的研究文献可以说 是数不胜数。最近几年，纳米聚合物微球在药物控制释放和定向释放方面的应用 取得了突飞猛进的发展，相信在不久的未来，该研究就可以为人类的健康做出巨 大的贡献。 1 2 2 聚合物微球在其他领域的应用【2 3 1 1 ) 化学功能 聚合物微球在分析化学中可做为高效液相色谱填料，适当粒径的单分散微球 可大大提高分离效果及检测精度，并可改善流动性。在化学工业中大粒径、单分 散并具有多孔结构的聚合物微球可用做催化剂载体，其催化活性高，副反应少， 反复利用率和选择性高，并且易于回收。还可用作高效离子交换树脂。 2 ) 光学和光电功能 单分散、大粒径聚合物微球可用作标准计量的基准物，可用作电镜、光学显 微镜及c o u l t e r 粒径测定仪等仪器的标准粒子，可用于胶体体系和聚合物乳液的 研究以及半透膜孔径的测定，还可在电子工业检测仪器中作标准物质。另外，电 子印刷的照相材料和光电摄影调色剂也使用单分散、大粒径微球。单分散、大粒 径微球的另一个重要应用是作为液晶片之间的间隙保持剂，可准确控制和保持液 晶片之间的距离，大大提高了液晶显示的清晰度。 3 ) 流变学功能 聚合物微球可以用于流体的粘度控制。表面离子化聚合物微球在电场里具有 电泳行为，可用于涂料的电沉降刷涂，还可用于自身性能的研究。聚合物微球还 可用作电流变流体，在新型开关、离合器以及调节器制各方面有广阔的应用前景。 1 3 荧光微球的制备及其应用 聚合物微球除了其本身所固有的比表面积大、吸附性强、凝集作用大和表面 反应能力强等特性以外，人们还根据不同的用途而赋予其各种性状，如生物特异 第一章功能微球及其与蛋白质相互作用研究进展 结合性、中空多孔性、磁性等。其中，荧光微球以其稳定的形态结构及稳定而高 效的发光效率，在许多领域尤其是生物医学领域有很重要的应用。该领域的研究 在国外已经得到了很好的发展，但国内有关荧光微球的报道仅见于有限的专利 4 0 4 3 1 。 1 3 1 荧光微球的定义及分类 荧光微球是指直径在纳米级至微米级范围内，负载有荧光物质，受外界能量 刺激能激发出荧光的固体微粒。其外形可为任意形状，典型外形为球形。荧光微 球的载体多为有机或无机聚合物材料。它具有相对稳定的形态结构以及发光行 为。受外界条件如溶剂、热、电、磁等的影响比纯粹的荧光化合物小。根据载体 及荧光物质的不同，荧光微球可分为两类：1 ) 无机有机荧光微球；2 ) 有机有机 荧光微球。 1 ) 无机有机荧光微球 此类荧光微球可分为两种，一是以无机材料为载体，而荧光物质为有机化合 物。典型的无机载体为硅胶。如m a k a r o v a 4 4 肄以中空的硅胶“纳米微泡”包覆 荧光素异硫氰酸酯( f i t c ) ，获得了纳米荧光探针。t r a u 与b a t t e r s b y _ 4 5 1 则报道了以 硅胶为载体的荧光微球在药物及基因的高通量筛选中的应用。 二是以有机高分子为载体，荧光物质为无机物。b a r b 盯a - g l l i l l 锄l 4 6 1 将带有活 性基团的聚合物微球与带有活性基团( 如氨基酸、羧酸等) 的无机荧光纳米晶体( 半 导体微晶或金属氧化物掺杂微晶) 结合，制备了聚合物荧光微球，直径从零点几 微米到几百微米不等，可用于多对象的混合检测，其荧光强度高于传统的荧光微 球。 2 ) 有机有机荧光微球 此类荧光微球的载体是合成或天然高分子材料，其负载的荧光物质是有机 物。r e m b a u m 4 7 1 以带可自由基聚合官能团的荧光物质( 结构为f ，a b o ，其中f 为发色基，o 为双键，a ，b 为可相互缩合的官能团) 与带活性官能团( 如一o h 、 c o o h 、- n h 2 、c n ) 的丙烯酸类单体进行水相悬浮聚合，并用交联剂交联得到 高光量子、高稳定性且生物相容的聚合物荧光微球。其平均直径为1 7 微米。将 其标记细胞膜，可探测膜上受体的性质、数量及分布情况。h a u g l a n d a s , 4 9 等在其 功自 荧光微球的制各及其对蛋白质的固定化 专利中报道了一类有机有机荧光微球的制备及应用。此类荧光微球用未标记的 大分子微球在荧光物质的有机溶液中染色而得，而荧光物质是多种荧光染料的混 合物，其发射峰和激发峰可依次叠加，造成染料系列中的能量转移，从而增大整 个荧光微球的s t o k e s 转移，使检测更加准确灵敏。在所得到的荧光微球外部敷 涂功能基，可与生物活性基团结合，从而能与被检测物结合并对其进行检测。其 优点是可对目标物进行多个或单个标记与检测。 1 3 2 荧光微球的制备方法 1 ) 吸附法( 染色法) 此种方法多用于有机有机荧光微球的制备。有机荧光材料一般为非水溶性的 物质，将其溶解在丙酮、酒精等水溶性的有机溶剂中，再与载体的水分散体系混 合，荧光材料即会析出并被吸附到载体上。如图1 5 所示。许多文献【4 1 3 报道了 用此种方法制备荧光微球的详细过程。 o + f l u o p o l y m e rs p h e r e f l u os p h e l e f i g u r e1 5p r e p a r a t i o no f f l u o r e s c e n tm i c r o s p h e r e sb yd y i n g m e t h o d 2 ) 包覆法 通过此种方法，可以制备无机有机荧光微球及有机有机荧光微球。其基本 原理是将荧光材料均匀分散在介质中，利用聚合反应、微胶囊化方法或分子自组 装方法制各出荧光微球。制备出的荧光微球几乎都具有明显的核壳结构。包覆 法有两种形式，如图1 6 所示。其中a 表示荧光材料包在载体内部，b 则恰好相 反，表示荧光材料包覆在载体外部。 、 8 + p o l y m e r o r m o n o m e r u f l u of l u os p h e r e b o 一o p o l y m e rs p h e r ef l u o s p h e r e f i g u r e1 6p r e p a r a t i o n o ff l u o r e s c e n t m i c r o s p h e r e sb ye n c a p s u l a t i n g m e t h o d 1 2 功能荧光微球的制各及其对蛋白质的固定化 f l u os p h e r e f i g u r e1 8p r e p a r a t i o no ff l u o r e s c e n tm i c r o s p h e r e sb yc o - p o l y m e r i z a t i o n gm e t h o d 上述四种方法皆为单一性制备方法，实际上，很多情况下是将上述诸方法结 合用以制备荧光微球。z h a n g 5 s 等将染色法和共聚法共用制各了一类颇具特色的 荧光微球。其中至少含有一个球形( 球壳形) 荧光物质区域，其截面表现为与球同 心的环形或圆盘，如果含有两种以上的荧光物质，两光环边界不产生弥散，通过 光谱特征或光强很容易进行甄别与测定。其方法是先用染色法获得核层浅层染色 的微球，然后利用种子聚合法与可聚合荧光单体或非荧光单体共聚获得多层荧光 微球，最后将微球进行浅表染色获得多荧光区域的荧光微球。 i 3 3 荧光微球的应用 1 1 一般应用 荧光微球有很多重要的应用。如用来对物质及生物体进行标记、检测及筛选， 用作标准物，用来标定光学仪器等。 z h a n g 【5 8 1 等制备的荧光微球可用作组合分析的标记物，示踪粒子，以及用于 光学仪器，特别是共焦显微仪的校正。他们还制备了用二毗咯甲基二氟化硼衍生 物标记的荧光微球。可应用于荧光光学仪器的校准，作为示踪物，或应用于生物 分子的标记与分析。具有比其它染料标记的微球更好的荧光特征，发光强度大、 发光稳定、光谱齐且光谱性质不受载体及环境的影响【5 。 d e v e c i 与e g g i n t o n t 5 9 1 认为，荧光微球可以取代辐射性微球对小型哺乳动物进 行精确的局部血流检测，从而避免放射性危险、降低成本并且不损失检测的灵敏 度。 荧光微球还在细胞流式记数测定方面有很重要的应用，如用做测定的标准物 1 5 5 以及用来标定细胞流式记数仪鲫。 另外，荧光微球在免疫检测中亦有重要应用 5 6 6 ”。 2 1 在高通量药物筛选中的应用 1 4 第一章功能徽球及其与蛋白质相互作用研究进展 所谓高通量药物筛选( h t s ) f 6 2 1 ，是使用机器人和自动化系统，从大量的样本 中鉴别出对确定的分子靶标有相互作用的少量活性化合物的一种现代药物筛选 技术。它是利用已有的化合物进行筛选，是一种大规模、高效率、高灵敏度的筛 选方法【6 ”1 邻近闪烁分析( s p a ) l “i 的发展促进了h t s 的开发与发展。其基本原理是通过 亲和结合，将放射配基结合到带有受体的闪烁球体( 荧光微球) 上，从而产生光子， 避免了放射配体标记分析中的游离配基与结合配基的分离过程，使得放射配基分 析可以以全自动化的方式进行【6 卯。使荧光微球表面带上能与被检测物结合的受体 蛋白，并对被检测物进行放射标记，当将两种物体混合，能与微球结合的被检测 物的放射能激发荧光物质产生荧光，而不能与微球结合的被检测物，由于距离较 远，其放射能在水中湮灭，不能激发荧光，从而可以对其进行不分离产物的检测， 减少成本及放射性危斟5 0 1 。s 队方法的基本原理如图1 9 所示。尽管目前高通量药 物筛选的方法已经不仅限于s p a 方法f 6 9 j ，但其基本原理仍然基于外部能量刺激 荧光微球产生荧光，从而对其进行检测，由此可见荧光微球在药物的高通量筛选 中的重要地位。 习r e c e p t o r 、r a d i o l a b e l e dl i g a n d 口oo l e a d c o m p o u n d f i g u r e1 9p r i n c i p l eo fs p at e c h n o l o g y 在h t s 中，既可以使用无机有机荧光微球，如t r a u 与b a t t e r s b y t 4 5 1 报道的 以硅胶为载体的荧光微球在药物及基因的高通量筛选中的应用；又可以使用有机 功能荧光微球的制各及其对蛋白质的固定化 有机荧光微球进行筛选，d e s m a r a i s 7 0 l 等在其专利中使用有机有机荧光微球来检 测磷酸酶和蛋白酶即为一例。 尽管荧光微球具有很广泛的用途，但目前国内在此方面的研究却极少。因此， 当务之急是迅速建立起在此领域的研究体系，通过对荧光微球的制备方法的研 究，扩展荧光微球的品种，通过对载体与荧光物质的相互作用的研究，制备出更 稳定及具有更高量子效率和光谱范围的荧光微球，以扩大其应用范围和深入其应 用程度。针对我国天然药物资源的优势以及高通量药物筛选正处于起步阶段的现 状7 ”，荧光微球的研究及其在高通量药物筛选中的应用在我国更具有重要的意 义。 1 4 功能聚合物微球与蛋白质的相互作用及蛋白质的固定化 如前所述，功能聚合物微球在生物医学领域有非常重要的应用，但在大多数 情况下，都需要将生物活性物质固定在功能聚合物微球上，并尽可能保留其生物 活性，因此，此方面的研究具有重要价值。 作为研究模型，蛋白质与功能聚合物微球的相互作用即有其理论意义，又有 其实际应用上的意义。图1 1 0 给出了功能聚合物微球与蛋白质相互作用的方式 【7 2 】。蛋白质是由氨基酸共价组成的，其结构中包含疏水的碳核和亲水的氨基酸残 基，以及少量的其它亲水基团如羟基、巯基等，是一类典型的两亲聚合物。功能 聚合物微球与蛋白质的相互作用既包括疏水部分的相互作用，也包括亲水部分的 相互作用。总体来说，主要分为四种情况：1 ) 亲水基团之间的氢键结合，包括 羧基与羧基、羧基与羟基、羧基与胺基、羟基与胺基等的相互作用，这种结合是 蛋白质固定化的一个非常重要的依据；2 ) 疏水相互作用，主要是指微球疏水本 体与蛋白质疏水内核之间依靠范德华力建立起来的一类相互作用，尽管范德华力 与氢键和共价键相比相差几个数量级，然而由于相互作用位点的数量巨大，因此 此类相互作用仍然是两者之间最主要的相互作用之一，并由此而引起学术界对其 与其余几种相互作用孰轻孰重的争议7 2 娟j ；3 ) 静电相互作用，指微球上具有带 电离子，在某种p h 条件下，能与蛋白质上带相反电荷的离子形成类似离子对的 一类相互作用，此类作用有时会收到巨大的效果 5 6 ，7 7 1 ；4 ) 共价结合，蛋白质在 其末端和肽链中带有许多可反应基团，如胺基，因此，可以利用醛基与其反应形 第一章功能微球及其与蛋白质相互作用研究进展 成席夫碱，产生共价结合。与前面几种相互作用相比，此种相互作用对蛋白质的 吸附量大，吸附稳定，因此，得到许多研究者的青睐。 b u f e r f i g u