（微生物学专业论文）纤维弧菌低温纤维素酶的分离纯化及性质探讨.pdf

原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独 立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不 包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研 究作出重要贡献的个人和集体，均已在本文中以明确方式标明。本声 明的法律责任由本人承担。 论文作者签名：雌 日 期；幽! 芏：研 关于学位论文使用授权的声明 本人完全了解山东大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学 校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论 文被查阅和借阅；本人授权山东大学可以将本学位论文的全部或部分 内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他手段保存 论文和汇编本学位论文。 ( 保密论文在解密后应遵守此规定) 论文作者签名：蝉导师签名：徇日期：一哟 山东大学璜士掌位论文 摘要 本论文从各地采集的腐殖质土样中分离得到多株纤维素降解细菌。其中菌株 2 3 8 的内切纤维素酶活力最高。且具有琼鼹液化和降解能力，在固体琼脂平板 上不形成明显的菌落通过1 6 sr 髓a 鉴定，该菌株属于纤维弧菌属纤维弧菌 2 3 - a 为中温菌，它既分泌胞外纤维素酶又产生胞内纤维素酶，其胞外纤维紊酶 组分中有低温纤维素酶，其最适反应温度为4 0 ，在0 1 3 时的残留酶活力为最适 反应温度的6 ；其最适反应p i i 为5 o ，属于酸性纤维素酶，在p h 4 - p h l 0 时稳 定性良好，能保持最高酶活力的的9 0 以上，具有很好的耐碱性结合其低温反 应特异性，可以预见其在低温洗涤业中具有广闻的应用前景低温纤维素酶粗酶 液经过c 卜f 猫tf l o w 层析分离，d f j 也- - f a s tf l o w 层析分离及制备电泳= 4 9 1 分离基本得到纯组分 本论文进一步研究了纤维弧蔼2 3 a 与羧康氏木霉s 3 8 对纤维素降解钓协同 作用，发现纤维弧菌2 3 一a 的内切酶组分与拟康氏木霉$ 3 8 的纤维素酶系对于纤 维素的降解存在着明显的协同作用，能有效的促进天然滤纸纤维素的彻底降解 这使我们对自然生境中纤维素的彻底降解有了更为深入的认识 本课题筛选到一株纤维弧菌，可分泌产生低温纤维素酶，目前尚未见纤维弧 菌低温纤维素酶的研究报道，因此本课题在纤维素酶的基础研究领域具有一定的 理论意义，并且本论文初步探讨了纤维弧菌2 3 - a 的内切酶组分与拟康氏木霉s 3 8 的纤维素酶系对纤维素降解的协同作用，这对于指导纤维素降解菌株的筛选及如 何进一步提高纤维素的降解效率均具有重要的意义 关键词：纤维素降解细菌纤维弧菌低温纤维素酶协同作用 坐至塑主竺垒堡苎 a b s t r a c t m a n yc c l l u l o l y t i cb a c m i ah a v eb e e ni s o l a t e df r o mh u m u ss a m p l e s a m o n gt h e m , t h es u a i n2 - 3 - ah a st h eh i g h e rc m c a s c x i v i t y , a n dt h i sm a i n 锄a l s o d e g r a d ea g 弧 b u tn ov i s i b l ec o l o n yc a nb e e nf o r m e do f ta g a rp l a t e s t i f f ss t r d m2 - 3 诅i sc e l l v i b r i o 艰姆1 6 sr r n a a n a l y s i s , t h es u a i n 艘一酷b o t hi a t t a c c l l u l a tc n d o - c e l l u l a s ea n d e x t r o l l u l a rr e d o - c e l l u l a r , t h ee x t r o l l u l a rc d l u l a 托c o l l t a i l l st h e c o l d - s d a p t 戡l 既l 刁r 蛳，a h h o u g ht h es t r a i ni sl y 删n 把s o p h i l i cb a c t e d l l m 1 ko p t i m a ll l 强c t i o n t c m l m a u o ft h i sc o l d - a d a p t e de n z y m ei s 柏i tc a n 砖b 缸a b o u t6 0 o fi t s h i g b e a 蒯嘶砒0 1 2 mo p t i m a l 崩崩p hi s5 o i tb e l o n g st ot h ea c i d c d l u l a s e t h ec o l d - a d a p t c d c e l l u l a s e c a n m a i n a b o u t 9 0 。, 4 0 f i 协h i m 器t a c t i v i t y w h e n p hv a r i e sf r o mp h 4 协p h i o s oi ti sw e l lt o l e r a n t - a l k a l e s c e n d u et oi t s l o w - t e m p e r a t u r er l 龇* t i o nc 3 a r a 帆t h ec e l l u l a s e so ft h i se e l l v i b r i o2 3 - am i g h th a v e w i d ei n d u s 姆a p p l i c a t i o n t h ee n z y m eh a sb e e np u r i f i e di nt h i ss t u d y 1 ks y r g b 蕊b e t w nc e l l v i b r i o2 - 3 aa n dz p s e u d o k o n i n g i i $ 3 8o nt h e d e g r a d a t i o no ft h e l l u l o s eh a sa l s ob e e ns t u d i e d a n dw ef o u n dt h a tt h e r ew a s o b v i o u ss y n c 哂蛐b e t w e 臼ae n d o - h u l a s e so fc e i l v i b r i o2 - 3 吨a n dc d l u l a s 酷o f t p s e u d o k o n i n g i is 3 8o nt h ed c 霉_ a d 砒i 锄o ff i l t e rp 薯啊：t k si s8g o o dw a yt o a e g r a , 蜥o nn a t r u a lc e l l u l o s e k e 即, , o r d ：e e l l u l o l y t i cb i c 吲ac e l h , i b r i o 渊a 出q ，t e dc c l l u l a 嚣s y n 盱g i s m 山东大学焉士学位论文 d n s c m c s d s t r i s 符号说明 二硝基水杨酸 羧甲基纤维素钠 十二烷基硫酸钠 三羟甲基氨基甲烷 山东大学硪士学位论文 研究背景 在二十一世纪，人类将面临着严重得资源匮乏的挑战，利用现代生物技术 开发生物质资源是解决未来资源问题的一条重要途径目前，世界正孕育着一场 用生物可再生资源代替化石资源的资源战略大转移的革命一个全球性的产业革 命正在朝着以碳水化合物为基础的经济方向发展，这是可持续发展的一个重要方 面 纤维素作为植物细胞壁的主要成分，占生物质资源总量的9 0 以上，是自 然界中最丰富的生物质资源。在其c - c 键和c - h 键中蕴藏着大量的能量，如果 能使用有效手段将植物残体转化为简单的糖类并用于进一步的发酵，纤维素将成 为最大量可用、低值和环境友好型的可再生性生物质能源( l y n d 矗a i ，1 9 9 9 , 2 0 0 2 ； h i m m e ! d n ，1 9 9 9 ) 在各种可再生能源中，生物质是独特的，它贮存的是太阳能，更是唯一的一 种可再生碳源陆地上主要的碳源贮存是森林中的木质纤维素类有机物( d e 蛐t g o r h a m ，1 9 粥) 绿色植物通过光合作用，将二氧化碳和水合成有机物质，这些有 机化合物再通过植物的自养呼吸和土壤微生物的异养呼吸等途径被转化为二氧 化碳和水，此即碳源的循环途径。理论上，在这个循环体系中二氧化碳的净摔放 为零。其中，微生物对纤维素的降解是自然界中主要的碳素循化途径之一( f 培i ； f a l k o 懈k i e t a l ，2 0 0 0 ) 因此，以取之不尽的木质纤维素为主要原料、开发清洁无污染的生物能源， 对防止环境污染，实现社会的可持续发展具有非常重要的意义。 f i & l1 1 埒伽睁i m 吨哪酣q ，o - m o l i - c 1 b i a m 吐喇蚰i o p o 坩c y c l ef o rs u s t a i n a b l et c d m o t o l 姻( r a 鲥j s k a sd 柚， 2 0 0 6 l 山东大学焉士学位论文 1 纤维素结构 纤维素作为植物细胞壁的主要成分，是自然界中最丰富的生物质资源，占生 物质资源总量的9 0 以上所有的纤维素都是由生物合成产生的，在自然生境 中，纤维素主要由植物利用光合作用合成，但也可由一些动物、藻类及细菌以非 光合作用的方式合成( e d 期d 1 9 9 8 ) 1 1 纤维素的超分子结构 纤维素的化学结构是由d - 吡喃葡萄糖环以c l 椅式构象通过d - 1 ，4 - 糖苷键 联结而成的线形高分子( z u g e n m a i e r ，2 0 0 1 ：k l e m md & h e u b l e i n1 3 , 2 0 0 5 ) ；纤维 二糖是其重复单位( s j 扛o m ，1 9 9 3 ) 由于纤维素大分子之间，纤维素和水分子 之间，或者纤维素大分子内部都可以形成氢键( z u g e n m a i e r ，2 0 0 1 ：k l e m md h e u b l e i n1 3 , 2 0 0 5 ) ，从而形成了具有强大抗张能力的直链的稳定的超分子纤维 ( f i 9 2 ；i v l z t f l l e w s ，2 0 0 6 ) 天然纤维素有两种晶体状态：iq 和ib 其中id 在 藻类中占有很高比倒，ib 是高等植物的主要形式，二者具有相似的分子构成， 这两种晶态能够在热退火时相互转变( y a m a m o t o ，1 9 9 8 ) ，且能够在相同的微纤丝 中共存( i m i 矗s u g i y a m a , 1 9 9 8 ) 纤维素的聚合度非常大，纤维素在结构上可以分3 层( y ed a i y o n g ，2 0 0 5 ) ： ( 1 ) 单分子层，纤维素单分子即葡萄糖的高分子聚合物：( 2 ) 超分子层，自组装的结 晶的纤维素晶体；( 3 ) 原纤结构层，纤维素晶体和无定形纤维素分子组成的基元原 纤等迸一步自组装的各种更大的纤维结构以及在其中的各种孔径的微孔等。 纤维素的特点是易于结晶和形成原纤结构纤维素原纤( f i b r i l ) 是一种细 小、伸展的单元，这种单元构成纤维素的主体结构，并使长的分子链在某一方向上 聚集成束由于原纤聚集的大小不同，可以细分为基元原纤 ( e l e m e n t a r y f i b r i l ) 、微原纤( m i c r o f i b r i l ) 和大原纤( m a c r o f i b r i l ) 微原 纤由基元原纤所构成，尺寸比较固定。大原纤由多个微原纤构成，其大小随原料 来源或者加工条件不同而异纤维素基元原纤中纤维素分子在晶区中的捧列( 伸 直链或折叠链，平行捧列或反平行排列等) ，沿原纤的方向上晶区和非晶区间的聚 集联结 5 山东大学磺士学位论文 f 醵2 t h r e e 埘堋删h ) 曲叫弘r h 删岫嘲雌o f 岫l o 冀m 砒山o _ 矗a l ，加嘶i 1 2 纤维素的伴生成分 纤维素是不纯的多相固体，常常伴生着木质素，半纤维素、胶质、糖蛋白及 其它有机、无机的小分子物质，因此纤维素也被称为木质纤维素( e d 啪瞳d 1 9 9 8 ) 木质纤维素的降解速率远低于纯纤维索的降解，其中木索的存在是木质纤维索难 以降解的主要原因。木素产生的空间障碍阻止了酶与底物的结合对纤维素酶非 水解性的不可逆吸附，导致纤维素的可及性差，并影响了酶对底物的吸胀( m o 呻。y 1 9 9 8 ；n e l s o n & o l i v e r , 1 9 7 1 ) 应当注意的是，纤维索的结晶指数、可及性、聚合度及纤维素表面的粗糙程 度均是影响纤维素酶解速率的结构相关特性 2 纤维素酶 2 1 纤维素降解微生物的多样性 2 1 1 纤维分解真蕾( c e ll u l o l y t i cf u n g i ) 目前对纤维素降解微生物的研究主要集中于真菌。纤维素的降解能力遍布于 整个真菌界，分解纤维素的真菌包括子囊菌、半知菌、担子菌和一些低等的厌氧 真菌。真菌产生的纤维素酶一般在酸性或中性偏酸性条件下水解纤维素底物，且 其产生的纤维素酶多为胞外酶，便于研究的进行 2 1 2 纤维分解放线菌( c o ll u l o l y t i ca c t i n o m y e a s t e ) 对降解纤维素的放线菌研究相对较少，直到9 0 年代末期，才有相关文献报 道。土壤中很多放线菌都有分解纤维素的能力，能否分解滤纸己经作为放线菌分 类鉴定的一项指标其中对纤维素降解能力最强的是放线菌中的小单孢菌 ( t r u j i l l oe ta 1 。2 0 0 5 ) 近年来，从堆肥中分离出了多种高温单孢菌，如 6 山东大学礤士学位论文 弯曲高温单孢菌和褐色高温单孢菌具有分解天然纤维素的能力( t u n c e r b a l l ， 2 0 0 2 ；j a g t a p & r a o ，2 0 0 5 ) 大多数种类的抗生素是放线菌产生的，选育高产 抗生素菌株又能利用廉价而丰富的纤维素作为碳源，可谓一举两得 2 1 3 纤维分解细蕾( 钿l i u l o l y t i ab t e r i - ) 在自然界中存在着众多的降解纤维素的细菌，据其需氧特性分为两种不同的 生理类群：( 1 ) 好氧细菌，如纤维单胞菌属( c e i l u l o m o n a s ) 、纤维弧菌属( c e l l m b r i o ) 、 噬纤维菌属( c y 此, p h a g a ) 及好氧的滑动粘菌属等；( 2 ) 厌氧细菌，这类细菌多见 于腐植土中，如一些厌氧性的芽孢梭菌属( a 哪馓一) ；或者栖息于草食动物的 消化道、特别是反刍动物的瘤胃中( 硒嘲删c e u l i l o l y a cb a c t e r t a ) ，如产琥珀酸拟 杆菌( 蜘娩l 凇动加即螂) ，在瘤胃和厌氧消化中对纤维素等有机物的分解产 生葡萄糖后，吸收进细胞内进行丁酸类型发酵，产生多种有机酸和气体( 乙酸， 丁酸，甲烷，乙醇，h 2 ，c 0 2 和h 2 0 等) ( e s 劬m 螂t a t e ，2 0 0 1 ) 目前已经发现众 多的纤维素降解细菌( t a b l e l 。a l b e r t , 1 9 9 0 来源于腐殖质的纤维素降解细菌大部分具有分解几丁质的能力产生不同的 酶系统降解纤维素和几丁质。在自然环境中，利用几丁质作为氮源可以看作是纤 维索降解微生物的能力( 血删mr e g u m 2 0 0 0 纤维弧菌为纤维素降解细菌，最早为w m 咎a d 囱，于1 9 2 9 年分离纯化革 兰氏阴性、好氧细菌，轻微弯曲的杆状，具有极生或侧生鞭毛，其中鞭毛的存在 有利于细菌的吸附作用，这是纤维弧菌能从根部土壤中分离出来的优势所在。能 够以氧化的方式利用葡萄糖，且能水解纤维素及其它多糖复合物纤维弧菌能够 在以纤维二糖、纤维胡精和纤维素为碳源的培养基上旺盛生长，但在以葡萄糖为 碳源的培养基上不能够很好的生长d n a 分子的的o + c 摩尔百分比为5 0 1 4 0 。 7 耋茎董茎量墓耋耋霎耋耋霎耋茎蓁霎重量耋霎量萋量霎 耋茎茎詈量耋耋耋茎茎萋茎萋蓁耋羹耋耋耋萋耋蓁霎 耋茎茎霎萋霎霎萋耋耋萎董萋霎量霎耋耋耋耋霎霎耋董 山东大学磺士学位论文 目前对纤维弧菌的研究主要集中在以下几个方面：其一是b 葡聚糖苷酶， c e l l v i b r i om i x t 埘的内切1 ，3 ( 眵p - m 葡聚糖苷酶基因已于1 9 9 3 年进行克隆重组 与表达0 - i a n ys a k e l l a r i s 。1 9 9 3 ) ；c e l l v i b r i og i l v u s 的b - 葡聚糖苷酶基因已于1 9 9 4 年进行测序( y u t a k ak 锄h i w a g i ，1 9 9 4 ) ；j o n g - d e o gk i l n 等人研究了其o 葡聚糖苷 酶d 末端的五个氨基酸残基在蛋白质折叠与稳定性方面的重要作用( j o n g - d e o g k i m , 1 9 9 8 ) 1k i y o s h ih a y a s h i 将c e i l v i b r i og i 栅的b - 葡聚糖苷酶c 末端结构域 基因序列进行d n a 出咖i 唱重组，从而改善酶特性( 魁y o s h ih a y a s h i , 2 0 0 1 ) 纤维弧菌c e l i v i b r i og i 懈的b - 葡聚糖苷酶与t h e r m o t o g am a r i t i m a 的嗜热b 葡 聚糖苷酶均属于葡萄糖苷水解酶第三家族，将二者基因进行d n as h u f f l i n g 重 组，来产生新的葡聚糖苷酶，从而加强其转糖基化作用( j o n g - d e o gg i m , 2 0 0 2 ) 其二是纤维二糖磷酸化酶，a i m i nl i u 等人于1 9 9 8 年对纤维弧菌c e l l l , i b r i og i l v u s 纤维二糖磷酸化酶基因进行了克隆、测序与表达( a i m i nl 沁1 9 9 8 ) 其三是纤维 素酶，c e l i v i b r i om i x l l l 墨纤维素酶c e l a 其基因已被测序克隆，并进行了表达 c e l a 属于第五家族的内切葡聚糖苷酶，其含有c b d 结构域，只具有一条多肽链 和单一催化结构域这暗示着能够产生专一性作用于非结晶纤维素的酶类，具有 较广泛的底物范围，c e l a 具有典型的内切葡聚糖苷酶的活动模式，但不能降解 结晶纤维素。c e l a 还具有高热稳定性及蛋白酶的抗性( ps v o g e t ，1 9 9 7 ) 但 是未见有关纤维弧菌低温纤维素酶的研究 2 2 纤维素酶的组成及研究 2 2 1 纤维素冀的组成 纤维素酶是一个多组分的复杂体系，主要包括：内切争l 葡萄糖苷酶 ( e n d o - p - 1 以l u c a n a s e s , e c 3 2 1 4 ) ，简称为内切酶( 来自真菌简称e g ，来自细菌的简称 c e n ) ；外切争l 葡萄糖苷酶( e x o - 争1 , 4 - g l u c a n a s e s , e c 3 2 l 9 1 ) ，简称为外切酶，又 称为纤维二糖水解酶( c e l l o b i o h y d r o l a s e s ，来自真菌的简称c b h ，来自细菌的简称c 既) ； 争葡萄糖苷酶( 争l 蚓岫m 嬲，e c 3 2 i 2 1 ) ，又称为纤维二糖酶( c c l l o b i 神c b 或阳；) 。 其中内切酶作用于纤维素分子内部的非结晶区，随机水解b - l ，4 - 糖苷键，将 长链纤维素分子截断，产生大量的不同长度的纤维素短链，快速降低纤维素底物 聚合度( d p ) ，但其还原糖的增加却比较缓慢( b 6 9 l l i n e t a l ，1 9 9 4 ；w o o d & m c c r a e , 1 9 7 8 ) 。通常，内切纤维素酶的活性仅限于羧甲基纤维素和磷酸或碱膨胀纤维素 9 山东大学颈士学位论文 等无定型纤维素，极少数分离的内切酶也具有降解结晶纤维素的能力( w o o d m c c r a e , 1 9 7 $ ) 传统观点认为c b h 从纤维素葡聚塘链的非还原性末端开始水解释放纤维二 糖，近来的研究显示，t r i c h o d e r m ar e e s i 的c b hi 和c b h1 1 分别从相反的链末 端水解纤维素( t e c f i , 1 9 9 7 ) 其主要产物是纤维二糖，但纤维素水解过程中也有 少量的葡萄糖和低聚糖释放。纤维二糖水解酶对结晶纤维素和无定型纤维素具有 广泛的特异性，但对羧甲基纤维素等纤维素替代品则无活性在些真菌的培养 液中常常含有大量的纤维二糖水解酶蛋白，t r e e s e i 分泌的纤维= 糖水解酶蛋白 约占细胞外蛋白的9 0 ( e n a de t m ，l 鲫1 ) ，可见其在纤维素水解中的重要作用 p 葡萄糖苷酶主要水解纤维二糖和纤维低聚糖，产生葡萄糖或者从可溶性纤 维寡糖的非还原末端移去糖残基。 微生物采取不同方式来组合这些酶以达到最好的水解效果如：丝状真菌和 放线菌通过菌丝的延长穿透纤维素，产生游离纤维素酶，并分泌到细胞外，称之 为非复合( n o n c o m p l e x e d ) 酶系统，如好氧丝状真菌h c h o d e n n nr e e x i 和h u m c o a i n s o l e m 产生的酶系相反，细菌产生复合( c 啪p l e 勰d ) 纤维素酶系统另外，还存 在多个结构域的纤维素酶系统，主要来自于厌氧嗜热的细菌 2 2 2 细菌纤维素酶的分子结构和功能 t i l b e u r g 等( t i l b e u r g ，1 9 8 6 ) 用木瓜蛋白酶限制酶切t r i c h o d e r 越r e e s e i 的c b h1 分子得到两个具有独立活性的结构域：一个是具有催化功能的催化域 ( c a t a l y t i cd o m a i n ，c d ) ，另一个是具有结合纤维索功能的纤维素结合( 吸附) 域( c e l l u l o s eb i n d i n gd o m a i n ，c b d ) 之后使用类似的方法在多种细菌和真菌 的纤维素酶中均发现类似的结构。目前，人们普遍认为纤维素酶分子由c d 和c 叻 及连结二者的肽链( 1 i n k e r ) 构成，c b d 在纤维素酶中位于氨基端或羧基端，它 通过一段高度糖基化的连接桥( 1 i n k e r ) 与催化区相连( f 唔3 ；h a 山m g ie ta i ，2 0 0 3 ) 山东大学硬士学位论文 酌量3 & 岫m 删i 越唪kd h m a yo f 缸 m o 出i i 一岫i 协d i _ oo f0 d h 函瞄f r o md i f f m m t 础y s y i h y d r o t m a f m t l y ( b 掣口矗吐，2 0 0 1 ) 纤维素酶三维结构的研究为内切酶和外切酶底物的特异性作出了合理的解 释：内切酶的活性位点位于一个开放的沟槽( c l e f t ) 中，它可与纤维素链的任何 部位结合并切断纤维素链；外切酶的活性位点位于一个长l o o p 所形成的孔道 ( t u n n e l ) 里面，这些孔道结构只能与纤维素单链结合( 其中c b 还原端首先进 入孔道，c 咖非还原端首先进入孔道) ，然后通过孔道内基团对纤维索单链分 予的输运，在催化位点处切断糖苷键，释放纤维二糖，这种结合同时保证了单链 不再与纤维素晶面结合，形成纤维素结晶。 c b d 普遍存在于大部分好氧和厌氧细菌以及真菌产生的纤维素酶中，也存在 于一些半纤维素酶中，纤维素酶中c b d 对酶的催化活力是非必需的，但它们具有调 节酶对可溶性和非可溶性底物专一性活力的作用( 王春卉，1 9 9 7 ) ，且对结晶纤 维素的高效降解起着关键作用c b d 的功能就是将酶分子连结到纤维素上c 叻 连结到纤维素上的机制相当复杂，不同酶的c b d 结合纤维素的机制是不相同的。根 据c b d 氨基酸序列的相似性，c b d 主要可分为5 个家族( t o m m e ，1 9 9 5 ) ，细菌的c 叻 大概有6 3 2 4 0 氨基酸残基，而真菌的c b d 只有3 0 4 0 个氨基酸残基c b d 的用机 制目前仍未完全清楚，一种观点认为它有助于增加催化结构域在固体纤维素表面 的浓度，另一种观点则认为它能促使单链纤维素分子从结晶纤维素中释放，以便 催化结构域能接近它( l i n d e r ，1 9 9 7 ) 细菌纤维素酶的连接桥富含p h o 、t l l r ，c b d 与c d 的夹角为1 3 5 。，并且两 个酶切位点可将c 即与连接桥分别切去由于纤维素全酶分子成蝌蚪状，其连接 桥高度糖基化且具有较强柔韧性，故很难得到结晶这一段肽链对蛋白酶非常敏 感，这是因为它易暴露于水相，所以为了防止被蛋白酶水解，这一段肽链常常被 山东大学硕士学位论文 o - g l y c o s i l a t e d 糖基化，l i n k e r 区虽然不直接参与催化反应，却赋予了纤维素 全酶分子以柔性。研究表明，两个区域功能的有效发挥需要二者有足够的空间距 离，l i n k e r 在某种程度上控制了两结构域之间的几何构象，催化过程中长的 l i n k e r 具有一定的柔性，能够保证两结构域在纤维表面的运动一致( b a y e r ， 2 0 0 1 ) 2 2 3 纤维素冀分子的多型性 通过对纤维素酶的研究发现，多型性的存在是普遍现象，这也是在经历了漫 长的进化过程后，各纤维素酶产生菌株对天然纤维索复杂结构的适应多型性有 深广的含义，表现在多个方面 ( 1 ) 酶系组成的多型性：不同的纤维素降解微生物具有不同的纤维素降解酶 系，其内、外切酶的含量、种类比例和活性大小都有很大的差别一个完整的纤 维素酶系，通常含有作用方式不同而又能相互协同催化水解纤维素的三类酶。并 且，在每一类纤维素酶中，不同酶系往往会有多个在结构，功能和活性上不同的 组分，每一组分又可能由不同的亚组分组成这种现象就是纤维素酶的多型性 同一种微生物也可能因不同的地区来源和不同的培养条件而使得纤维素酶的成 分有很大的差别，这也是多型性的表现之一。 ( 2 ) 酶蛋白结构形式的多型性：一般真菌产生的外分泌纤维素酶往往是单 体蛋白分子，但是也发现有复合体的存在而在厌氧真菌和细菌中，纤维素酶系 往往是以复合体的形式存在的，具有不同活性的多组分蛋白分子聚合成一个多酶 复合体。另一方面，真菌产生的外分泌纤维素酶往往是糖蛋白糖基化在糖苷酶 中是一个普遍的现象，这能增强酶蛋白对蛋白水解酶的抗性。不同纤维素酶组分 由于糖基化氨基酸、糖链聚合度或分枝程度的不同，而表现出多种形式 ( 3 ) 理化性质上表现的多型性：从理化性质上看，不同的纤维素酶组分具有 不同的分子量、等电点和酶学活性。 另外，纤维素酶还具有结构的多型性和催化机理的多型性 造成纤维素酶多型性的原因是多方面的，可能有：( 1 ) 结构基因的不同， 是造成纤维素酶多型性的最根本原因；( 2 ) 翻译后修饰与加工，是纤维素酶多 型性的直接原因：( 3 ) 表观的多型性，这种多型性并不是由于酶分子结构的变 化造成的，而是因为酶分子与其它酶组分或效应物结合形成复合体 山东大学磺士学位论文 3 细菌纤维素降解酶系统的作用机理 研究纤维素酶降解系统所呈现出的困难不同于一般的酶学研究，天然底物是 不可溶的。包括结晶区与非结晶区，且底物的结构在反应的过程中会发生变化 而且所涉及的酶系统包含了几种不同的组分，每一组分又具有多样性。一些 组分可以作为独立的实体存在于培养液中，或结合于纤维素上，或结合在细胞表 面。或者这些单个的组分可能组成一个多酶复合体，吸附于细胞表面、纤维素， 或者作为游离的复合体存在于培养液中而且，在一种培养条件下所展现出的特 点不用于其它培养条件下的特点，或者在培养条件下呈现出巨大的变化上述的 这些变化与不确定性使纤维素酶的研究更加困难 3 1 吸豫纤冁与皇 维素酶产生之同钓关系 许多的纤维素降解细菌吸附到纤维素或半纤维素材料上才能降解纤维素，因 此有学者设想这种吸附是纤维素酶的生产及底物的科用所必需的。细菌的这种吸 附作用受到一系列因素的影响，不仅包括细菌细胞及其表面的成分，而且还包括 环境的因素例如培养基的离子组成、温度和p h 值。纤维素降解细菌对其纤维素 底物的吸附是否是其纤维素降解能力的产生及保持所必需的，具有很大的争议 目前可以肯定的是细菌与纤维素底物的结合不是纤维素酶合成诱导的先决条件 ( 舢b e n ，1 9 9 1 ) 。 3 2 纤维素多奠复合体喝鼙小体 许多纤维素降解细菌的纤维素酶以多酶复合体的形式存在，被称为纤维小 体纤维小体众多的亚组分是由许多功能域组成的，表现出c 骶髂e 活力，功能 域彼此褶互作用，且与纤维底物相互作用。其中的一个亚组分不具有c l 眈$ e 活 力，但包含了一个独特的新的非催化脚手架多肽，从而有选择性的将各种纤维素 酶亚单位组成多酶复合体，保持多酶复合体的完整性，而且调节多酶符合体与纤 维素的吸附作用。多酶复合体能够更加彻底、更加有效的降解纤维素纤维素降 解细菌通过两种不同的方式进行纤维素的降解：其一是利用多酶复合体的形式水 解纤维素，其二是以游离酶的形式水解纤维素( m b e r t 1 9 9 1 ) 4 低温酶 4 1 低温微生物 在生态圈中，有8 0 常年平均温度在5 或5 以下，因此低温微生物广泛 山东大学硕士学位论文 分布在自然界中低温微生物可分为二类：耐冷微生物( p s y c l u o t o e r a n t 和嗜冷 微生物( p s y c h r o p h i l e s ) 前者是指能在3 5 生长，最高生长温度在2 0 以上，最适生长温度可超过1 5 的一类微生物；后者是指能在0 或0 以下 生长，最适生长温度低于1 5 ，最高生长温度低于2 0 的一类微生物( 辛明秀， 1 9 9 8 ；朱非，7 0 0 2 ) 目前已经发现的耐冷微生物如下( 陈秀兰，2 0 0 3 ) ： t a b i e 2t h ef o u n d e dp s y c h r o p h i l m ( g e n u s ) p s e t m o m o n a sv i b r i oa c b z e t o b a c t e r 彳e r o m o m s c h r o m o b a c t e r i u mf l a v o b a c t e r i t ms e r r a a ay e m i n a 细菌 a n n o u n c e r o 哆聊h 酩晒嘞州庙明袖口嘶b 删 c e l l u l o m o n ml a c t o b a c i l l 埘b r o c h o t h r 虹& n 别执口m l i s t e r i ab a c i l l u sc l o s t r i d i u mo 惋叫| 昭口 蓝细菌 n o s t o c 硅藻 f r a l l a r i a 绿藻c h l a y d o m o n a sr a 曲i d o n 镰ac h l o r o m o n a $ c y l j n d r o c y s t i s c a n d i 出t o r a l o p mc r y p t o c o c c u sr h o d o t o r a i at o r a l o p s y s 酵母 h a n s e n i a s p o r a ss a c c h a r o m y c e s 马舢l c p t o m i t mm u c o rr h i z o p m p e n i c i l l i u m 丝状真菌 a l t e r n a r i aa 副她即lk e r a t i n o m y c e s 病毒 b a c t e r i o p h a g e so f p s e “d o m o n a s 低温微生物能在低温环境下生存是由于其酶能在低温下有效地发挥催化作 用近来，低温酶的研究广泛开展，主要集中在耐冷机制和生物工程应用方面已 有二十多种低温酶得到了纯化或克隆表达其中大部份低温酶是从南极和北极以 及海水中的低温菌中分离获得的( t a b l e 3 ) t 曲l e 3c o l d - a d a p t e d e n z y m ew h i c hp r o d u c e db y 胂f k o p 蜥l a 低温酶低温酶 丙氨酸脱氢酶b 一内酰胺酶 乙醇脱氢酶3 一异丙基苹果酸脱氢酶 a 一淀粉酶景- 酸脱氢酵 天冬氨酸氨甲酰基转移酶腊肪酶 蛋白酶苹果酸脱氢酶 几丁质酶n - 口一乙酰基鸟氨酸酶 d n a 连接酶果胶酶 柠檬酸合成酶磷酸甘油酸激酶 脐- 2 枯草杆菌蛋白酶 e f - 七 丙糖磷酸盐异构酶 弹性蛋白酶木聚糖酶 1 4 山东大学焉士学位论文 4 2 低温酶 低温酶是指能在低温下具有高的催化效率，即与相应的中温酶相比，在低温 及室温时具有较高的且特异性的催化效率因此将低温酶与中温酶区分开来的关 键是：低温酶在低温下具有较高的催化效率由于所研究的低温酶数量有限，将 低温酶定义为：在o c 3 0 范围内比相应的中温酶具有更高的催化效率，且相对 不稳定( c h a r l e sg e r d a y , 1 9 9 t ) 4 2 1 低温琦的结构特点 不同的低温酶，具有不同的提高蛋白构象柔顺性的结构特征低温酶一般通过分 子内相互作用的减弱、与溶剂相互作用的增强来提高酶活性位点及邻近区域。或 整个蛋白结构的柔顺性低温酶分子结构一般具有如下一些特征： 4 2 i 1 与蛋白构象稳定性有关的分子内静电弱相互作用减小 盐桥的数量 蛋白表面的离子数量与蛋白的稳定性有很好的对应关系( w a l k e r , 1 9 9 0 ) 。低 温酶含有的盐桥的数量比嗜热酶要少得多，这与其热不稳定性是一致的盐桥数 量的差异主要是由于谷氮酸或天冬氨酰残基替代原来的氨基酸 氢键结合作用 氢键作用力在稳定折叠状态的蛋白质时起主要支配作用( c x - * i g h t o n , 1 9 9 1 ) 目 前对低温酶的氢键结合作用尚没有进行详细的研究。但发现南极一些低温酶中可 形成极性氢键的氨基酸残基( 如丝氨酸、苏氮酸、天冬酰胺及谷氨酰胺) 总数量 减少。而氢键的缺乏，可导致靠近蛋白催化残基的2 个1 3 一桶状域( b a r r e l d o m a i n s ) 之间，以及c _ 末端螺旋与n 一末端域之间的连接松散( f e l l e r ，1 9 9 7 ) 芳香族侧链的相互作用 相对于氢键作用力而言，芳香族侧链之问由酪氨酸、苯丙氨酸及色氨酸的芳 香环形成的弱极性相互作用在热力学上更具重要性，但数量较少在低温酶中广 泛存在着芳香族侧链之间的相互作用，从而反映了其在维持构象时的重要功能。 相反，在低温d 一淀粉酶中，氨基一、氧一及硫一与芳香族侧链之间的相互作用要低 得多( f e l l e r , 1 9 9 7 ) a 一螺旋中电荷与偶极的相互作用 在a 一螺旋中由于多肽结合的两极性，以及这些微极距的平行排列，所以其 山东大学爱士学位论文 宏观的偶极是n 端带有0 5 单位的正电荷，c 带有0 5 8 位的负电荷。如果氨基酸侧 链所带的净电荷与a 一螺旋第一或最后一个拐角处偶极的局部电荷相反，则能够 稳定螺旋构象，反之则破坏二级结构。这种相互作用在低温丙糖异构酶中尤为重 要( f e l l e r , 1 9 w ) 4 乏1 2 精氨酸的含量 精氨酸胍基集团的电荷共振效应不仅使精氨酸有形成盐桥的可能性 ( m r a b e t ，1 9 9 2 ) ，而且还成倍增加了与主链羰基氧之问的氢键( b o r d e r s ，1 9 9 4 ) ， 从而有利于酶蛋白的稳定性。通过序列的统计学发现：嗜热酶的精氨酸含量及精 氨酸精氨酸+ 赖氨酸的比例要比中温酶高；相反，低温酶例如。一淀粉酶、b 一 内酰胺酶及脂肪酶的精氨酸含量又比其同源的中温酶相对较低。 4 2 - 1 3 脯氨酸残基数量的减少 带有二面角的脯氨酸的存在严重削弱了n - c 键的旋转，进而降低了蛋白非折 叠状态的熵在低温酶中，脯氨酸残基通常被删除，或者被小氨基酸( 主要是丙 氨酸) 所取代这些取代或删除一般发生在l o o p 脯氨酸残基环内或拐角处，从而 有利于蛋白质多肽链的柔韧性。 4 2 1 4 聋白功能域附近甘氨酸残基的堆积 与中温酶相比，低温酶的甘氨酸含量与其它蛋白相比没有太大差异，但在功 能区会有甘氨酸残基的堆叠在低温枯草杆菌蛋白酶c a 2 + 连接部位、低温脂酶 及。一淀粉酶活性位点等功能区附近，都发现了甘氨酸残基的异常堆积有人提出， 酶催化残基周围是否存在甘氨酸堆积现象，可作为判别低温酶的一项指标小分 子甘氨酸的存在，减小了酶活性位点入口处的空间位阻，而且由于甘氨酸无侧链， 可以提供绝大多数其它氨基酸没有的双面角( d i h e d r a la n g l e ) ，这些都有利于酶 活性位点及整个蛋白结构的柔顺性并为其提供了一个有利的能量环境。这一特征 与低温酶的高活力及热不稳定性密切相关( d a v a i l ，1 9 9 4 ) 4 2 1 5 琉水作用下降 在蛋白质核心内由疏水侧链聚集成簇所形成的疏水核，是维持蛋白折叠构象 稳定性的主要驱动力。蛋白内部非极性表面相互作用时吸收热量，从而温度的升 高有利有利于稳定蛋白结构在低温a 一淀粉酶中，形成疏水作用簇的8 4 个氨基 酸残基有2 5 个发生替换，其中8 0 的替换伴随着疏水作用力的急剧下降，同时蛋 山东大学磺士学位论文 自主链的柔韧性增加了7 2 例如来源低温微生物p i m m o b i l i s 的8 一内酰胺酶由 于a 一螺旋上发生氨基酸的取代，也导致疏水作用力降低。 4 2 1 6 离子结合能力的降低 嗜热蛋白的稳定性是通过解离结合钙离子实现的，这涉及到高度的亲和力或 者是多余的钙结合位点而低温酶的离子结合常数要比相应的中温酶低得多在 低温a 一淀粉酶中，其钙离子结合区域与猪a 一淀粉酶是相同的，因此前者离子结 合常数的降低是由于在结合位点附近蛋白构象疏松造成的。离子结合位点或其附 近氨基酸的替换也是离子结合力降低的主要原因 4 2 1 7 溶剂相互作用及表面亲水性升高 有利于提高溶剂相互作用的蛋白表面氨基酸残基电荷的增多，可以增强蛋白 表面的亲水性并减小蛋白外层的紧密度，提高蛋白结构的柔顺性( f e l l e r , 1 9 9 7 ) 南极细菌枯草杆菌蛋白酶分子的二级环状结构中，带负电荷的天冬氮酸残基数量 增多，从而使蛋白具有一个舍1 1 个额外天冬氨酸残基、高亲水性的表面，蛋白与 溶剂的相互作用得到明显提高( n 咄，1 9 9 7 ；d a v a i l ，1 9 9 4 ) 2 1 8 具有独特性质的环状结构的插入删除 嗜冷菌t a 4 1 枯草杆菌蛋白酶具有4 个伸展的表面环状结构，这有助于减小 蛋白分子表面的紧凑度而在低温a 一淀粉酶的环状结构中有氨基酸删除现象发 生。 4 2 1 9 蛋白质折叠 低温酶需要低温来实现酶分子的正确折叠( f e l l e r ，1 9 9 9 ) 蛋白的正确折 叠对于酶分子的适冷性可能具有关键作用：原先一些被认为是低温酶的表征性结 构特征，在非低温型酶中也有发现；来自低温、常温环境中鱼类的乳酸脱氢酶， 虽然具有完全相同的氨基酸序列，但却具有不同的热力学特性对一些低温酶三 维结构分子模型的研究发现，酶分子构象微妙的变化可以直接影响到蛋白结构的 柔顺性和稳定性( f e h e r ，1 9 9 9 ) 松散的n _ 和c - 末端、域之间以及亚基之问相 互作用的减弱，都可能降低低温酶分子结构的热稳定性 4 2 2 适应策略 一般认为，低温酶内部结构高度的柔韧性是其在低温下主要的适应策略，结 构柔韧性的增加能够降低反应的活化能，从而能够更有效的与底物接触 山东大拳酮士学位论文 ( g e o r l e t t e 2 0 0 4 ) 分子内部柔韧性的增加是通过减少或降低分子内的相互作用来 实现的，与此同时也导致酶蛋白热稳定性的降低( s d a m i c o , 2 0 0 3 ) 。通过对尿嘧 啶d n a 糖营酶的分子柔韧性及催化特性之间关系的研究表明：冷适应性仅与蛋白 特定区域柔韧性的增加有关，而与蛋白质整体柔韧性无关( m i y a z a k i ，2 0 0 0 ； g e o r l e t t e ，2 0 0 4 ) o 低温酶不同于中温及嗜热同源蛋白之处仅是有限的结构差异或者是少数几 个氨基酸的替代功能域氨基酸的替代和扩大溶剂与亲水表面的相互作用能够增 加结构的柔韧性( g e o r l e t t e ，2 0 0 4 ) 。而且静电自由能在低温酶