（药物分析学专业论文）ict荧光探针与生物大分子相互作用的研究.pdf

摘要 摘要 第一章：本章简要概述了分子内电荷转移荧光的原理及研究现状、蛋白 质光谱探针的研究进展和d n a 光谱探针的研究进展。 第二章：利用吸收光谱和荧光光谱对化合物：4 一二甲氨基2 ，5 二羟基查 尔酮( d m a d h c ) 在不同极性介质中的光谱、光物理行为进行了研究， 并利用l i p p e r t m a t a g a 方程计算了该化合物基态和激发态偶极矩间的差 值。实验结果表明，溶剂极性使d m a d h c 的吸收光谱产生相对较小的 红移现象，而使其荧光光谱发生较大的红移，且基态和激发态间的偶极 矩差值u 较大，证明了该化合物具有典型的分子内电荷转移( i c t ) 的 特性。 第三章：本章采用紫外可见和荧光分光光度法研究了一种新型的分子内 电荷转移荧光探针1 酮2 ( 对二甲氨基苯亚甲基) 一四氢萘在不同极性有 机溶剂中的发光行为和光物理性质。随着溶剂极性的增加，吸收光谱出 现轻微红移，而荧光光谱出现显著的红移并伴随着荧光峰的半高宽变宽， 量子产率出现先增加后减小的趋势。用l i p p e r t m a t a g a 方程计算了该化 合物基态和激发态偶极矩间的差值。结果证明该化合物在激发态存在着 强烈的分子内电荷转移行为。 第四章：本文研究了新型的分子内电荷转移荧光探针4 - 二甲氨基2 ，5 一 二羟基察尔酮与人血清蛋白的相互作用。随着人血清蛋白含量的增加， 探针的荧光强度显著增大，荧光峰位置逐渐蓝移。同时，与蛋白的结合 也使得探针的吸收光谱发生红移，并出现一个明显的等吸收点。通过 s c a t c h a r d 方程得出探针和h s a 的结合常数和结合位点数，并计算了结 合反应过程的热力学参数，确定了探针和h s a 的主要作用方式，并且对 可能的结合位点进行了推测。此外，实验探讨了影响探针与人m 清蛋白 作用的条件，并建立了一种新型、简便的人血清蛋白的检测方法。对h s a 检出的线性范围为1 - - 9 5 1 s g m l ，检出限为0 5 “g m l 。应用本方法测定人 v i i c i 荧光探针与生物人分了棚土作用的研究 血浆中的血清蛋白，并用曙红探针法进行对比，结果令人满意。 第五章：本文研究了新型的分子内电荷转移荧光探针4 - 二甲氨基2 ，5 一二 羟基察尔酮( d m a d h c ) 与小牛胸腺d n a ( c t d n a ) 的相互作用。随 着c t d n a 含量的增加，探针的荧光强度锓著增大，荧光峰位置逐渐蓝移。 同时，与c t d n a 的结合也使得探针的吸收光谱发生红移，并出现一个明 显的等吸收点。通过阴离子猝灭、离子强度、荧光偏振和d n a 变性等实 验初步证明了探针与c t d n a 的作用模式为嵌插作用，由s c a t c h a r d 方程 估算了其结合位点数及结合常数，并建立了种新型、简便的c t d n a 的 检测方法。对c t d n a 检出的线性范围为6 9 8 1 0 - 7 2 4 1 1 0 m o l l ，榆 出限为1 8 0 1 0 一7m o l i ，。 关键词：分子内电荷转移；人血清白蛋白；小牛胸腺d n a ；查尔酮衍生 物 _ | 旦兰l 一 a b s t r a c t c h a p t e r1 ：t h ep r i n c i p l ea n dt h e d e v e l o p m e n to fi n t r a m o l e c u l a rc h a 曙e t r a n s f e rf l u o r e s c e n c ew e r ed e s c r i b e d r e c e n td e v e l o p m e n t so f t h eh s aa n d d n ai n t e r a c t i o n sw i t hs p e c t r o s c o p i cp r o b ew e r eb e e nr e v i e w e d c h a p t e r2 ：t h es p e c t r u ma n d p h o t o p h y s i c a lp r o p e r t i e so fan e w m t r a m o l e c u l a r c h a r g et r a n s f e r ( i c t ) p r o b e n a m e l y4 - d i m e t h y l a m i n o 一 2 , 5 - d i h y d r o x y c h a l c o n e ( d m a d h c ) w e r es t u d i e di nd i f 诧r e n ts o l v e n t sb v u s t a gs t e a d y s t a t ea b s o r p t i o na n de m i s s i o n s p e c t r o s c o p y w h e r e a st h 。 a b 8 0 r p t i o ns p e c t r u mu n d e r g o e sm i n o rc h a n g ew i t hi n c r e a s i n gp o l a r i t yo ft h e s o j v e n t s ，t h ef l u o r e s c e n c es p e c t r u me x p e r i e n c e sad i s t i n c tb a t h o c h r o m i cs h i l t i nt h eb a n dp o s i t i o na n dt h ef l u o r e s c e n c e q u a n t u my i e l di n c r e a s e sr e a c h i n ga m a x i m u mb e f o r e d e c r e a s ew i t h i n c r e a s i n g t h es o l v e n t p o l a r i t y t h e m a g n i t u d eo fc h a n g ei nt h e d i p o l em o m e n tw a sc a l c u l a t e db a s e do nt h e l i p p e r t m a t a g ae q u a t i o n t h e s er e s u l t s g i v et h ee v i d e n c ea b o u tt h e i n t r a m o l e c u l a rc h a r g et r a n s f e r ( i c t ) c h a r a c t e ri nt h ee m i t t i n gs i n g l e ts t a t eo f t h i sc o m p o u n d c h a p t e r3 ：t h ep h o t o p h y s i c a l p r o p e r t i e so fan e wc o m p o u n d1 一k e t o 一2 一 ( p d i m e t h y l a m i n o b e n z a l ) 一t e t r o h y d r o n a p h t h a l e n ei nv a r i o u ss o l v e n t sa tr o o m t e m p e r a t u r e w e r ec h a r a c t e r i z e d b y t h e a b s o r p t i o n a n d s t e a d y s t a t e “u o r e s c e n c et e c h n i q u e t h eb a t h o c h r o m i cs h i f to nt h ee m i s s o ns p e c t r a ，t h e b r o a dh a l f w i d t ho ft h ef l u o r e s c e n c eb a n da n dt h ei n c r e a s ei nt h ee x c i t e ds t a t e d i p o l em o m e n to c c u r r e d t h e s eg a v et h ee v i d e n c ea b o u tt h ei n t r a m o l e c u l a r c h a r g et r a n s f e ro c t ) c h a r a c t e ri nt h ee m i t t i n gs i n g l e ts t a t eo ft h ec o m d o u n d c h a p t e r 4 ：4 d i m e t h y l a m i n o - 2 ，5 - d i h y d r o x y c h a l c o n e ( d m a d h c ) e x h i b i t e d d r a m a t i ce n h a n c e m e n to f f l u o r e s c e n c e i n t e n s i t yw i t h a c c o m p a n y i n g b l u e s h i f to ft h ee m i s s i o nm a x i m u mw h e nt h ec o n c e n t r a t i o no f h u m a ns e n m l a l b u m i n ( h s a ) w a si n c r e a s e d b i n d i n gt oh s aa l s oc a u s e dap r o g r e s s i v e i x i c t 荧光探针与生物人分予相互作用的研究 s h i f t i n a b s o r p t i o ns p e c t r u mo fd m a d h c ，a n dac l e a ri s o s b e s t i cp o i n t a p p e a r e d t h eb i n d i n gs i t en u m b e ra n db i n d i n gc o n s t a n tw a sc a l c u l a t e d t h e r m o d y n a m i cp a r a m e t e r s w e r eg i v e na n dp o s s i b l e b i n d i n g s i t ew a s s p e c u l a t e d t h eo p t i m u mc o n d i t i o n sf o rt h ed e t e r m i n a t i o no fh s a w e r ea l s o i n v e s t i g a t e d an e w ，f a s ta n ds i m p l es p e c t r o f l u o r i m e t r i cm e t h o df o r t h e d e t e r m i n a t i o no fh s aw a sd e v e l o p e d i nt h ed e t e c t i o no fh s ai ns a m p l e so f h u m a np l a s m a ，t h i sm e t h o dg a v ev a l u e sc l o s et ot h a to ft h ee r y t h r o s i nb m e t h o d c h a p t e r5 ：t h ei n t e r a c t i o no fan e wi n t r a m o l e c u l a rc h a r g et r a n s f e r ( i c t ) p r o b en a m e l y4 - d i m e t h y l a m i n o 一2 ，5 一d i h y d r o x y c h a l c o n e ( d m a d h c ) w i t h c a l ft h y m u sd n ah a sb e e ns t u d i e d c o m p a r e dt ot h es p e c t r a lc h a r a c t e r i s t i c s o f t h ef r e ef o l ni na q u e o u ss o l u t i o n ，t h ef l u o r e s c e n c eo f d m a d h ce n h a n c e d d r a m a t i c a l l ya c c o m p a n y i n gab l u e s h i f to ft h ee m i s s i o nm a x i m ai n t h e p r e s e n c eo fd n a t h ea b s o r p t i o na n df l u o r e s c e n c es p e c t r a ，s a l tc o n c e n t r a t i o n e f f e c t ，k iq u e n c h i n g ，f l u o r e s c e n c ep o l a r i z a t i o na n dd n ad e n a t u r a t i o n e x p e r i m e n t sw e r eg i v e n t h e s er e s u l t sg i v et h ee v i d e n c et h a td m a d h c m o l e c u l ei si n s e r t e di n t ot h eb a s e s t a c k i n gd o m a i no fd n ad o u b l eh e l i x t h e i n t r i n s i cb i n d i n gc o n s t a n ta n dt h eb i n d i n gs i t en u m b e rw e r ee s t i m a t e d t h e a n a l y t i c a lc h a r a c t e r i s t i c sw e r ea l s og i v e n k e y w o r d s ：i n t r a m o l e c u l a rc h a r g et r a n s f e r ；h u m a ns e r u ma l b u m i n c a l f t h 5 ，m i l sd n a ；c h a l c o n ed e r i v a t i v e x 第一章概论 第一章概论 1 1 分子内电荷转移荧光 1 1 1 分子内电荷转移荧光的原理 l i p p e r t 等川于2 0 世纪5 0 年代末在对极性溶剂中的二甲氨基苯甲氰( d m a b n ) 进行荧光研究时发现该化合物具有明显的双重荧光现象。经仔细研究发现：在短波 长处的b 带有正常的光谱特征，而长波处的a 带则有异常的光谱行为，一个突出的 表现是该带的发射强度具有强烈的温度依赖性，即随着温度的升高，荧光强度会随 之升高，这和正常的发光现象恰恰相反。因为一般在正常情况下，温度升高会引起 分子热运动加强，导致能量耗失而使荧光减弱，因此荧光随温度而升高的现象显然 不是一种正常的行为。随后的研究表明系列电子给体受体对位取代苯，如对二甲氨 基苯甲酸( 酯) 、对二甲氨基苯甲醛( 酮) 等均具有类似的发光特性。1 9 7 9 年波兰化 学家g r a b o w s k i 等及以后德国的r e t t i g 等对上述化合物作了进一步研究，提出了下列 的看法： ( 1 ) 由于强烈的电荷转移可导致分子内二甲氨基的扭曲松弛。即使原来共轭的电 荷转移结构体系，变成二甲氨基和氰基苯平面相互正交垂直的电子转移结构。 ( 2 ) 这是因强烈的电荷转移而引起电荷分离，即发生了电子转移。为保持这一分 离的结果，于是就出现了扭曲的分子内电荷转移体系。 ( 3 ) 这一现象可称之为体系的自去偶现象。 ( 4 ) 由于电子转移的发生可引起分子内荧光的白猝灭。但由于分子运动可引起上 述垂直_ i _ 三交平面离开正交，于是在强烈的分子运动时，两个正交平面的电子云会离 开“结点”使各自的电子云发生部分重叠，于是就出现了“反常的”温度效应。 上述结果表明，在发光化合物中引入推、拉电子取代基，可以增强分子内的电 荷转移和分子的极化能力，它在一定程度上有利于增大发光强度。但过强的电荷转 移将导致电子转移的发生，并随之发生上述n 体系的自去偶，引起荧光的自猝灭， 显然这对化合物的发光是不利的。 稳态和时间分辨荧光光谱学研究揭示，双重荧光产生自直接激发形成的局部激 发态和分子内电荷转移( i c t ) 激发态( 2 1 。同时实验还表明，发生i c t 时伴随着分子 构型的变化。但关于i c t 态的分子构型尚无定论。目前有三种主要模型【3 1 ，即扭曲 的i c t 模型，平面i c t 模型和重杂化i c t 模型。 1 1 2 分子内电荷转移荧光传感和分子识别 c t 荧光探针与生物大分于相皿作用的研究 i c t 双重荧光传感和分子识别是基于i c t 光物理的两个主要特性：( 1 ) i c t 态涉 及电荷分离，其偶极矩显著高于基态。因而，i c t 态的形成与发光对介质环境极为敏 感。( 2 ) 激发态i c t 光物理过程受制于分子中电子给体和受体的电子得失能力。因 此，分析物种可籍由改变i c t 荧光体的得失电子能力和介质微环境性质而被传感或 识别。由于i c t 态的发光性质，传感和识别过程可由i c t 荧光指明，这是i c t 双重 荧光传感和分子识别的独特性。 c o l l i n s 等1 6 】将i c t 荧光体的电子受体苯甲氰基团连接到氮杂冠醚环中，构成分 子内电荷转移体系。因冠醚对金属离子尺寸有识别作用，当z n ”、c u ”、c d ”等金属 离子与等冠醚键合时，氮原子上的电荷密度减小，给电子能力下降，导致从氮原子 向苯甲氰基团的分子内电荷转移程度受阻，因而1 c t 光物理和双重荧光改变而被传 感，从而实现对z n ”、c u 2 + 、c d 2 + 等金属离子的传感和识别。k n u t 等7 1 把一系列的查 尔酮衍生物同氮杂冠醚连接，研究了该传感分子对h g ”、z n 2 + 、a g + 离子的荧光传感 能力，并通过实验验证了该传感分子的i c t 行为，给出了荧光传感识别的机理。 u e n o 等【8 j j 哿i c t 荧光体连接于环糊精的端口，在水溶液中i c t 荧光团处于非极 性的环糊精空腔中。识别物种存在时因与i c t 荧光基团竞争环糊精空腔，使i c t 荧 光基团被挤到极性的水相中，i c t 荧光基团经历强烈的微环境极性变化，后者可由 i c t 荧光明确指示。该传感体系体现了i c t 荧光对介质极性的依赖性与刚性环糊精 空腔对分子识别能力的巧妙组合。研究表明，i c t 荧光体与环糊精的包合物具有类似 的传感识别能力 9 】。在水溶液中的i c t 研究发现，有机溶剂中微量水即可显著改变 对二甲氨基苯甲酸酯的i c t 荧光。这是由于在有机溶剂中高极性的水分子i c t 念的 优先溶剂化效应。掘此建立了有机溶剂中微量水的i c t 荧光传感检测方法i 】。 由于i c t 态的偶极矩远高于基态，其发光对外电场强度的变化具有灵敏的响应。 江云宝等i “l 提出以离子型胶束为电场中介体，建立基于上述响应的i c t 荧光传感新 模式。传感物种通过与胶束作用导致胶束水界面电场强度变化，从而改变增溶于胶 束中的荧光体的i c t 荧光。该传感体系适于离子和中性分子，并且可通过向胶束中 引入“识别”因子而提高传感的选择性。 在非质子有机溶剂如氯仿中，i c t 荧光体对二甲氨基苯甲酸通过氢键与取代苯甲 酸结合后，l e 态的电荷转移弛豫通道由i c t 扩展为i c t 和p t e t ，导致i c t 荧光变 化而被传感。吴芳英等设计合成了i c t 荧光体对二甲氨基苯甲酰肼( d m a b h ) ， 研究了d m a b h 与阴离子h s 0 4 、c 1 0 4 一、n 0 3 和b r 等结合后的光物理性质，并通过 与d m a b h 的阴离子识别行为比较，解释了主体分子与阴离子的作用机理。 第一章概论 1 2 蛋白质光谱探针的研究进展 1 2 1 引言 蛋白质是生物体内最重要的物质之一，是生命的物质基础。催化生物体内几乎 一切化学反应的酶，调节物质代谢的许多激素，以及人和动物体内防御疾病，抵抗 外界病原入侵的抗体等都是蛋白质或多肽。有关蛋白质的各类研究，是当前生命科 学、化学、药学及临床医学中所共同感兴趣的课题。其中，特别是对蛋白质大分子 与药物小分子之间相互作用的研究，例如，建立蛋白药物结合的体外模型，了解蛋 白质结构与功能的关系，为生命科学研究提供有用的信息和数据，而且有助于认以 药物药效作用的药理机制，为药物分子的设计与筛选及新药的开发提供有益的启发 与重要指导。 血清蛋白是血浆中含量最丰富的载体蛋白，它能与体内许多内源性物质及许多 药物小分子作用，而药物进入人体后，总要通过血浆的贮存与运输，达到受体部位， 进而发生药理作用。在蛋白质与药物等小分子化合物相互作用的研究中，白蛋白是 目前研究得最为广泛的一种蛋白质h 4 - ) 6 j 。人血清白蛋白( h m n a ns e r u ma l b u m i n ，简 称h s a ) 是人血浆中最丰富的蛋白质，约占血浆总蛋白的6 0 左右。它内含5 8 5 个氨 基酸，分子量为6 6 ，0 0 0 6 9 ，0 0 0 ，等电点47 4 9 。作为最重要的药物小分子结合蛋白， 近年来，h s a 成为这一领域的研究热点。h s a 分子包括三个结构上相似的功能域： 域i ( 残基1 - 1 9 7 ) 、域i i ( 残基】8 9 3 8 5 ) 和域i i i ( 残基3 8 1 5 8 5 ) ，每个功能域又 包括两个相似的螺旋结构的亚域( s u b d o m a i na 和s u b d o m a i nb ) ，六个亚域聚集在 一起，形成了一个不刘称的心型分子。其结构如下图所示： 图1h s a 分子的结构示意图 i c 1 1 荧光探针与生物火分了午h 互作用的研究 1 2 - 2 蛋白质与小分子光谱探针作用的研究方法 所谓蛋白质光谱探针，就是能与蛋白质发生相互作用的无机离子、有机小分子 或络合物，这些物质与蛋白质结合生成超分子复合物之后，体系的光谱性质发生变 化，从而可以提供蛋白质浓度或结构方面的信息。光谱探针法作为最常用的分析蛋 白质构象的方法又可分为吸收光谱法、荧光光谱法、共振拉曼光谱法和圆二色谱光 谱法等。多年来，国内的研究工作者对此做出了大量的研究工作。 1 2 2 1 吸收光谱法 一些小分子配体与蛋白质结合后其分子结构发生了一定的变化，相应的出现了 吸收峰位移或谱峰宽度的变化，据此可研究蛋白质与小分子间的结合强弱和结合机 理，因而紫外一可见吸收光谱法是这一研究领域中最方便，最常用的一种技术。测定 蛋白质含量常用的吸光光度法包括双缩脲法、l o w r y 法以及基于蛋白质与染料结合 的光度法等。 双缩脲法的基本原理是利用双缩脲反应使蛋白质和小分子配体生成具有特定吸 收的络合物，从而实现对蛋白质的定性定量分析。但双缩脲并非蛋白质的特效反应。 所以，必须在测定前先使蛋白完全沉淀，除去干扰物质，才能得到较准确的结果。 梁宏等7 】用紫外可见光谱的方法研究了c o ( i i ) 离子与h s a 的相互作用。当c o ( i i ) 离子与蛋白作用时，有一个从最初形成的弱复合物a 到最终形成强复合物b 的转换 过程。利用不同时间的紫外光潜的变化，粱宏等做出了相关的解释。双缩脲法优点 是对自、红蛋白产生颜色反应相近，干扰物质少，不受温度的影响。但通常其灵敏 度低，且操作复杂，很难用于自动化仪器分析。 l o w r y 法是定量测定蛋白质的另一种常用方法。反应产物的最大吸收峰位于 7 5 0 r i m 处，方法线性范围较宽，检出限较低，但存在着显色所需时间长，灵敏度低， 稳定性差等缺点。1 9 8 6 年l a r s o n ”报道利用温和还原剂二硫苏糖醇( d t t ) 加快f o 】i n 试 剂还原速度，缩短了分析周期，提高了测定的灵敏度。d t t 法的原理是：f o l i n 试剂 在碱性条件下极刁；稳定，四元复合物蛋白质钼一钨f o l i n 试剂的形成可能对结合的 f o l i n 试剂起着一种暂时的缓冲保护作用。当反应体系中加入d t t 时，可促使四元复 合物中结合的f o l i n 试剂进一步充分还原，从而使反应迅速完成，提高了反应的灵敏 度。1 9 8 8 年康建1 1 9 1 对该法进行了改进，改进后的l o w r y 蛋白质测定法已被广泛应用， 但存在d t t 价格昂贵的问题。石磊【2 0 1 利用连二亚硫酸钠( 保险粉) 代替d t t ，实现了蛋 白质含量快速、灵敏、廉价的测定。 蛋白质与染料结合的方法是目静应用最广泛的分析方法。蛋白质的基本化学结 第一章概论 构单元为氨基酸，当溶液p h d , 于蛋白质等电点时，蛋白质肽链上的碱性氨基酸上的 氮原子因质子化而为阳离子，因而含有磺酸基等阴离子的染料或染料母体为负离子 的金属络合染料就可以通过静电引力和分子间范德华力与蛋白质结合f 2 1 1 ，从而实现 对白蛋白的定量测定。目前常用于蛋白质的测定的染料大致有：n ) 三苯甲烷类染料： 溴酚蓝 2 2 3 是一种研究较早、性能优良的探针试剂。该试剂与蛋白质的反应在p h = 3 2 左右进行，在6 0 0 n m 钡, u 量吸光度。澳甲酚绿【2 3 1 也是性能优良的试剂，结合反应在 p h = 4 2 左右进行，在6 2 8 n m 测量吸光度。这2 种试剂在临床分析中已广泛应用。1 9 7 6 年，b r a d f o r d 提出用考马斯亮蓝g 2 2 5 0 分析蛋白质的方法【2 4 1 。在酸性条件下，浅红色 的考马斯亮蓝( k m a x 为4 5 5 n m ) 与蛋白质反应生成深蓝色复合物( k m a x 为5 9 5 n m ) ，线性 范围为1 2 0u # m e 。该法的灵敏度高于劳罩法、溴酚蓝法和溴甲酚绿法，成为灵敏 度最高的染料探针分析方法。( 2 ) 偶氮类染料：除上述三苯甲烷类染料外，偶氮染料 也有了广泛应用。w a n g l e ；1 2 5 1 对偶氮染料对磺基苯偶氮变色酸( s p a d n s ) 在酸性环境 中与蛋白质的相互作用分别用分光光度法和瑞利散射发法进行了研究，线性范嘲为 0 1 2 5 1 4 9l ag m l ，对5 opg m l 的b s a 一染料体系，标准偏差为3 9 4 ，该方法可用 于人血浆蛋白的测定，氨基酸、金属离子及其他干扰物对测定结果几乎无影n 虮胡 庆红等利用变色酸2 b 2 6 1 和变色酸2 c 2 7 1 等一系列变色酸单偶氮染料与蛋白质反应形 成复合物使染料褪色，可用于测定多种蛋白质。( 3 ) 金属络合染料：借助金属络合 染料进行蛋白质检测的分光光度法近年发展很快，该法灵敏度高，稳定性好，线性 范围宽，干扰离子少，简单快速。w a t a n a b e 等【2 8 j 报道蛋白质的加入可导致邻苯三酚 红一钼络合体系吸收波长的改变，且吸光度与蛋白质加入量一定范围内呈线性关系， 据此可实现对蛋白质的测定。 1 2 2 2 荧光光谱法 荧光法是蛋白质研究中的常用分子光谱法。蛋白质含有色氨酸、酪氨酸和苯丙 氨酸残基，故在紫外光区有吸收，并且在3 4 0 3 5 0 n m 有荧光发射，因此可以用蛋白 质本身的荧光光谱进行定量或定性分析。但对微量分析而言，蛋白质的内源光谱在 灵敏度方面常常不能满足需要。为此，人们发展了各种光谱探针的分析方法。 在蛋白质的定量分析中，蛋白质与小分子探针结合后，引起溶液荧光强度的增 强或猝灭，并且在一定浓度范围内和蛋白质的浓度成正比，据此可建立蛋白质的定 量分析方法。俞英等【2 9 】研究了在酸性溶液中b s a 与酸性品红的结合反应，认为两者 主要是通过静电引力而结合，结合反应符合p l s a v e n t o 提出的相分配模型，并探讨了 实验条件对结合反应的表观结合常数k c 、结合数n 、s a n d e l l 灵敏指数的影响，建立 c t 荧光探针与生物大分子相互作用的研究 了b s a 的酸性品红测定方法。宋功武等口o l 研究了曙红与b s a 作用的荧光光谱，曙 红荧光光谱发生显著的变化，5 4 0 n m 的荧光猝灭，其猝灭程度与b s a 浓度成正比， 据此建立了测定b s a 的荧光分析方法。刘立明等口i j 以罗丹明b 单体和二聚体平衡转 化为基础，提出了罗丹明b 自聚平衡体系测定蛋白质方法。罗月明b 在阴离子表面 活性剂的作用下自聚成二聚体，体系荧光降低，但是蛋白质加入后体系荧光增强。 该法灵敏度高，简便、快速、选择性好。 在蛋白质分子构象研究中，传统的荧光分析方法一般是通过药物对蛋白质内源 荧光的猝灭机制，结合用于描述小分子生物大分子相互作用的s e a t c h a r d 模型【弛1 及 f 6 r s t e r 能量转移理论，从而确定小分子在蛋白质上的结合部位及分子问的结合常数 和距离。例如，朱铿等先后研究了铁( i i i ) 一铬天青s 、甲基橙、酸性铬蓝k 等多 种染料与b s a 的反应机理和结合常数。王艳等【3 4 1 在磷酸缓冲体系中研究了尼古丁对 b s a 的作用，证明二者形成了1 ：1 型络合物，根据b s a 对尼古丁的高选择性结合， 提出了白蛋白在去毒过程中的独特作用。谭亮等f3 5 】用荧光法研究了硫脲嘧啶对牛血 清白蛋白荧光猝灭的影响，发现其相互作用符合动态猝灭机理，求算出硫脲嘧啶与 牛血清白蛋白色氨酸残基之间距离和结合反应的热力学函数，并建立了牛血清白蛋 白的分析方法。 除了常用的荧光分析方法，近年来还出现了一些新的基于荧光光谱的新方法。 如同步荧光光谱法和三维荧光光谱法。同步荧光技术是在同时扫描激发和发射波长 的情况下来获得荧光光谱图。与普通的荧光技术相比，同步荧光技术有许多优点。 蛋白质的同步荧光光谱已被用来判断蛋白质的构象变化。由a x = 1 5 n m 所得到的同步 荧光仅显示蛋白质酪氨酸残基的光谱特征，保持a ) 。= 6 0 n m 作出的同步荧光光谱仅表 现出色氨酸的荧光。b u r s t e n 口6 】认为色氨酸的最大发射波长与其所处的环境有关，随 其所处环境的疏水性逐渐降低其最大发射波长红移，故由发射波长的改变可判断蛋 白质的构象变化。当它位于疏水介质中k 。= 3 3 i n m ，部分暴露于水相中k 。= 3 4 1 n m ， 完全暴露于水相中k 。= 3 4 1 n m 。若色氨酸的最大发射波长改变，说明蛋白质的构象 发生了改变。三维荧光光谱法是由激发波长( y 轴) 一发射波长( x 轴) 一荧光强度一( z 轴) 三维坐标所表征的矩阵光谱，通常具有较高的选择性。例如，鄢远等 3 7 1 人曾将三维 荧光光谱法用于测定溶液状态下蛋白质的构象，结果表明这是一种研究蛋白质分子 构象的有效方法，能直观地观察t r p 残基在蛋白质分子的微环境中及其在不同条件 下的构象变化。 1 2 2 3 共振光散射法 第一章概论 共振光散射( r r s ) 是新近发展起来的光谱技术，近几年中此技术广泛应用于 蛋白质、核酸和金属离子的测定中。有机染料是最常用的光散射探针，由于蛋白质 多肽链上各部分的非极性侧链在酸性条件下带正电荷，强烈吸引带负电荷的有机染 料与之结合，因此在蛋白质表面形成一个有机染料的覆盖层，这种以蛋白质为支撑 核心的大的染料聚集体远大于染料自身聚集体的体积，因此两者结合后，光散刺的 强度急剧增加，并与加入的蛋白质浓度成正比。据此，可进行蛋白质的分析测定。 铬天青s 可以与血清白蛋白在p h 3 5 左右的柠檬酸n a o h 介质中生成超分子化合物， 产生最大散射波长为3 7 0 r i m 的光散射信号，基于这一现象可以测定低至o 0 2 9 9 m l 的血清白蛋白，方法的灵敏度高于考马斯亮蓝法5 0 倍。李树伟等【3 9 j 研究了金属指 示剂铬黑t ( e b t ) 作为共振光散射探针测定蛋白质的分析方法。实验表明，在p h = 4 1 0 的b r i t t o n r o b i n s o n 缓冲溶液条件下，铬黑t 与蛋白质结合后有强烈的共振光散射作 用。在 = 3 7 5 n m 处，光散射强度最大且与蛋白质的浓度成f 比，据此建立了一种测 定蛋白质的新方法。用于这类研究的探针还有酸性偶氮染料变色酸2 r 4 0 】和焦尔茶酚 紫等。 1 2 2 4 圆二色谱( c d ) 光谱法 圆二色光谱法主要是利用了一些分子的圆二色性即有光学活性介质的分子对 左、右圆偏振光的吸收不同，且吸收差随波长而变化的性质。圆二色谱( c d ) 对溶 液中蛋白质的立体结构变化高度灵敏，并且能检测其立体化学结构的微小变化。因 此，c d 光谱技术在人血清白蛋白的研究领域得到越来越广泛的应用。例如：利用 h s a 的远紫外c d 光谱( 2 0 8 2 2 2 n m ) 处的负波峰的增减，可估计蛋白的一螺旋含 量的变化【4 2 1 ；而其近紫外光谱的变化，则主要与芳香族氨基酸和二硫键有关。如s h e n 等【4 3 】曾研究了a g o ) h s a 体系的c d 光谱变化，结果表明：在二者的结合过程中， 在远紫外区域，光谱变化很小，这说明h s a 的二级n 螺旋结构变化很小；而在近紫 外区域，光谱持续递减，这说明结合过程中，a 譬十诱使芳香族氨基酸和_ 二硫键微环境 的扰动。l i l i a n n a 等【4 4 】用c d 光谱技术研究了h i n d ( r u l n d 2 c 1 4 ) 与人血清的结合反 应。结果表明蛋白的构型发生了变化，螺旋的稳定性下降并伴随有结合区域局部的 微扰出现。再结合相对荧光强度的减少这一现象l i l i a n n a 等得出该微扰发生在t r p 残 基附近，而这一现象与作者通过试验观察到的包括t a r o 在内的华法令( w a r f a r i n ) 结合 区域的稳定状态下降现象相一致。 1 2 3 蛋白质与探针分子相互作用的研究内容 1 2 3 1 确定蛋白质与探针的作用类型 c t 荧光探针。j 生物火分予相互作用的研究 当蛋白质与小分子探针相互作用时，蛋白质自身发荧光的生色团，如色氨酸、 酪氨酸、苯丙氨酸发出的荧光会发生猝灭现象。导致猝灭的行为有两种：一种是动 态猝灭，另一种是静态猝灭。动态猝灭指小分子与蛋白质的激发态分子之间发生的 相互作用过程，如能量转移过程或电子转移过程；静态猝灭指小分子和蛋白质在基 态时发生配合反应而导致的荧光猝灭现象h ”。区分动态猝灭与静态猝灭可以通过以 下几个方面来确定： ( 1 ) 温度的影响 动念猝灭过程依赖于分子扩散运动。由于温度升高而导致扩散运动加快，增大 了扩散系数，从而增大双分子猝灭常数；然而，温度升高可能引起静态猝灭形成的 基态配合物的稳定性下降，从而碱小静态猝灭的程度。根据s t e r n v o l m e r 方程 f o f2i + k q 吒 e 2i + k 。，剐 ( 1 ) 随着温度的升高，动态猝灭速率常数或s t e m v o l m e r 猝灭常数将增大，而静态猝 灭基态配合物的形成常数将减小。 ( 2 ) 吸收光谱的变化 由于动态猝灭只影响到荧光分子的激发态，因而并不改变荧光物质的吸收光潜； 而静态猝灭中基态配合物的生成往往会引起荧光物质吸收光谱的改变。 ( 3 ) 荧光寿命的测量 对于静态猝灭，猝灭剂的存在并不改变荧光分子激发态的寿命，“f 1 。而动念 猝灭，猝灭剂的存在使荧光寿命缩短，z o z = f o f 。这是区分静态猝灭与动态猝灭最确 切的方法。 1 2 3 2 结合常数与结合位点数的计算 s c a t c h a r d 曾将小分子配体与生物大分子的结合看作是配体在大分子特定部位的 结合，在此基础上推导了溶液平衡处理的理论公式，利用公式作图可以求出不同类 型结合的结合常数和结合位点数，它是最常用的方法之。蛋白质内源荧光很强， 杨频等 4 6 1 提出了一种利用药物对蛋白质荧光的静态猝灭来求结合常数的方法。该方 法比较简便，可靠。 1 2 3 3 荧光给体一受体间距离的求取 根据f o r s t e r 型偶极偶极无辐射能量转移机理【4 7 , 4 8 ，转移效率与给体一受体间距 离r 及临界能量转移距离r n 有关，给体与受体问能量转移效率e 为 e 2 r 0 “( r o 。+ r 6 ) ( 2 ) 其中r n 是转移效率为5 0 时的临界距离 r 第一帝 | ：论 r 。6 = 8 8 1 0 2 5 ( k 2o n 。j ) ( 3 ) 式中k 。是偶极空间的取向因子，n 为介质的折射指数，为给体的光量子率，j 为给 体的荧光发射光谱与受体的吸收光谱间的重叠积分 j = f ( ) e ( ) 4 f ( ) ( 4 ) 式中f ( ”为荧光给体在波长 处的荧光强度，e ( 殉为受体在波长 处的摩尔吸收系 数，能量转移效率可由下式给出 e = l f f 。( 5 ) 其中f 和f 分别为能量接受体存在和不存在时的能量给予体的荧光发射强度。 根据( 2 ) 式和( 5 ) 式可算出r 。和r 。 1 2 3 4 探针与蛋白质问作用力的确定 小分子与蛋白质之间的作用力包括氢键作用力、范德华力、静电作用和疏水作 用。从热力学的角度来说，a h 0 并且船 o 表明是疏水作用：j v 0 并且螂 0 表明是静电作用”1 。由于在结合 反应过程中，温度的变化可以忽略不计，反应的焓变可以认为是常数。由下面的方 程 i n _ k 2 ：( 丢一当) 掣 ( 6 ) 女l 、一 疋。r 、+ g = a h t a s ( 7 ) a g = 一r t i n k ( 8 ) 可求算出小分子同蛋白质发生相互作用时的热力学参数h 和s ，从而确定它们之 间的作用力。 1 2 3 5 荧光猝灭常数的测定 当猝灭剂与生物大分子结合且靠近其荧光发色团时，猝灭剂使得生物分予自身 荧光猝灭。根据s t e m v o l m e r 方程： f o f 1 + k q l o 0 _ 1 + k s v e ( 9 ) f 。为未加入猝灭剂时荧光物质的荧光强度，f 为猝灭剂浓度等于 o 】时荧光物质的荧 光强度，k q 为双分子猝灭过程的速率常数，一。为没有猝灭剂存在下荧光分子的平 均寿命。k s 。为s t e r n v o l m e r 猝灭常数，是双分子猝灭常数与单分子衰变速率常数的 比率。对于静态猝灭，k s 。是基态配合物的形成常数。 1 3d n a 光谱探针的研究进展 9 i c t 荧光探针，生物人分了相互作用的研究 1 3 1 引言 脱氧核糖核酸( d e o x y 舶o n u c l e i ca c i d ，d n a ) 是重要的生命物质，是遗传信息的载 体。有关d n a 的研究是揭示生物遗传奥秘的基础，因此对它的研究在生命科学中具 有重要意义。1 9 5 3 年w a t s o n 和c r i c k 5 1 】提出d n a 的双螺旋结构模式，从分子水平 上阐述了生命遗传信息通过d n a 的半保留复制机理，从此生物学进入分子生物学的 新时代。有关生物基本遗传物质d n a 的研究也就成为分子生物学和生物化学的重要 课题。 d n a 的研究通常包括：对生物样品中d n a 的含量进行测定，确定d n a 结构和 碱基对序列，研究环境中污染物质对d n a 损伤机理，对p c r 产物进行检测，以及 研究各种小分子和金属配合物与d n a 相互作用等许多方面。小分子与d n a 的相互 作用是研究新型药物分子设计的基础【5 2 1 ，通过对一些小分子与d n a 作用的研究，可 发现其基本的作用模式和机理。小分子与d n a 相互作用的模式，特别是插入作用诱 导了d n a 的一些生理和物化性质的改变，在d n a 的识别、分离及分析中有很大的 应用潜力。 1 3 2 小分子与d n a 的作用模式 通过对d n a 上大沟、小沟等小分子识别位点的研究，科学家们发现药物、金属 配合物和染料等小的探针分子与d n a 的相互作用模式主要有三种：非共价结合、共 价结合和剪切作用5 3 1 。 1 3 2 1 非共价结合 小分子化合物与d n a 的非共价结合主要包括静电结合( e l e c t r o s t a t i cb i n d i n g ) 、 沟槽结合( g r o o v e b i n d i n g ) 和嵌插结合( i n t e r c a l a t i v e b i n d i n g ) ，见下图： 静电作州沟区作用 嵌入作用 图2d n a 与小分子探针非共价结合的三种形式 星零室藿髫量墓 第一章栅睦 ( 1 ) 静电结合，带正电荷的小分子与核酸中带负电荷的磷酸酯骨架之