（无机化学专业论文）修饰联吡啶金属配合物对dna的作用和断裂研究.pdf

中山大学博士论文修饰联吡啶一金属配合物对d n a 的作用和断裂研究 摘要 核酸酶是一种十分重要的金属酶，它具有摧毁外源d n a 、修复变异d n a 、 分解完成生理功能的蛋白质等功能。近年来对一些天然核酸酶的结构和催化机理 的研究发现，核酸酶的活性除了与活性中心金属离子及其配位的氨基酸残基有 关，还与多金属中心间的协同作用以及活性中心周围的功能氨基酸残基的辅助功 能有关。因此，本论文在本课题组前期研究的基础上，合成了一系列含多甲基铵 基、季钱基、腺嘌呤基的联吡啶基铜、锌配合物作人工核酸酶，系统地研究功能 基团的位置、空间位阻、氢键等因素对人工核酸酶活性影响，主要研究工作如下： 1 对5 ，5 4 ，4 二甲基2 ，2 联吡啶的甲基进行修饰，合成了一系列含多甲基铵 基的联吡啶衍生物l 1 l 4 ( l 1 = 5 ，5 ( m e 2 n h c h 2 ) 2 - b p y 】2 + ，l 2 = 【5 ，5 ( m e 3 n c h 2 ) 2 一 b p y 】2 + ，l 3 = 【4 ，4 ( m e 2 n h c h 2 ) 2 - b p y 】2 + ，l 4 = 【4 ，4 ( m e 3 n c h 2 ) 2 - b p y 】2 + ，b p y = 2 ，2 联 吡啶基) 以及它们的铜配合物，【c u ( l 卜4 ) 2 b r 】5 + ( 1 a “a ) 。测定了配合物l a 和4 a 的晶体机构，两个配合物中c u ( i i ) 均形成五配位的畸变三角双锥构型。通过热变 性实验和c d 光谱研究了这些配合物与小牛胸腺d n a ( c t d n a ) 之间的静电作 用模式。在未加任何还原剂的情况下，研究了这些配合物对p b r 3 2 2d n a 的水 解断裂能力和动力学过程，发现阳离子基团位于吡啶n 原子间位( 5 ，5 一) 的配合 物l a 和2 a 的核酸酶活性最高，是目前报道活性最高的人工核酸酶之一。当阳离 子基团位于毗啶n 原子对位时( 4 ，4 ) ，由于其诱导效应减弱，使得配合物3 a 和 4 a 活性降低。当阳离子基团位于吡啶n 原子邻位时，因配体不能与金属离子有 效配位而失去核酸酶活性。 2 合成了配体l 1 l 4 的锌配合物， z n ( l 1 4 ) 3 】8 + ( 1 b 4 b ) ，测定了配合物4 b 的晶体结构，z n ( i i ) 形成六配位的畸变八面体构型。通过电位滴定研究了配合物 在溶液中的物种分布。这些配合物与c t d n a 之间的静电作用通过紫外光谱滴 定和c d 光谱进行了研究。在近生理条件下，研究了这些配合物对p b r 3 2 2d n a 的水解断裂作用。结果显示，配合物l b 4 b 具有较高的核酸酶活性，尤其配合 物2 b 是活性最高的含锌人工核酸酶之一，作用机理类似于对应的c “i i ) 配合物。 对不同p h 值条件下配合物切割d n a 的研究表明它们在p h7 5 7 8 附近具有最 摘要 高的核酸酶活性。 3 对4 ，4 二甲基2 ，2 联吡啶上的甲基进行修饰，合成了一系列含不同链长 烷基季铵基的联吡啶衍生物l 5 l 8 作配体( l 5 = 【4 ，4 ( e t 3 n c h 2 ) 2 b p y 】“，l 6 = 【4 ，4 ( b u ) 3 n c h 2 ) 2 - b p y 】2 + ， l 7 = 4 ，4 ( c 6 h 1 3 ) 3 n c h 2 ) 2 - b p y 】“， l 8 = 4 ，4 ( ( 聍一c 8h 1 7 ) 3 nc h 2 ) 2 b p y 】2 + ) 。合成了配体l 5 和l 6 的锌配合物，【z n ( l 5 6 ) 3 】( c 1 0 4 ) 8 ( 5 b 和6 b ) ，通过电位滴定研究了5 b 和6 b 在溶液中的物种分布，通过紫外光谱滴定 和c d 光谱研究了它们与c t d n a 之间的静电作用。将两个配合物用于对p b r 3 2 2 d n a 水解断裂实验。发现含有较小阳离子基团的配合物5 b 能够有效地将超螺旋 型d n a 断裂成缺刻型，显示出较高的核酸酶活性。研究结果表明，阳离子基团 体积越小，其位阻效应越小，越有利于配合物与d n a 之间的相互作用，促进其 对底物d n a 的亲核进攻，从而增强其核酸酶活性。 4 合成了配体l 5 l 8 的铜配合物， c u ( l 5 8 ) 2 b r 】( c 1 0 4 ) 5 ( 5 a 8 a ) ，测定了配合 物5 a 的晶体结构，结果显示c u ( i i ) 形成畸变的三角双锥配位构型。通过紫外光谱 滴定研究了配合物与c t - d n a 之间的作用力；试验了这些配合物在水解条件下对 d n a 的断裂作用，结果显示这些配合物的核酸酶活性相对较低，尤其是含更长 烷基链的配合物7 a 和8 a 。但在还原剂的存在下，5 a 和6 a 能有效地氧化断裂p b r 3 2 2 d n a 。自由基淬灭实验表明h 2 0 2 和0 2 是导致d n a 断裂的活性氧物种。 5 对2 ，9 二甲基1 ，1 0 菲咯啉的甲基进行修饰在其上引入腺嘌呤基，合成了 2 ，9 二( 9 尽腺嘌呤基甲基) 一1 ，1 0 菲咯啉( l 9 ) ，并合成了其铜配合物9 a 和锌配合物 9 b 。通过热变性实验、紫外光谱滴定和c d 光谱来研究这两个配合物与c t d n a 之间的作用力。结果显示，两个配合物都能够选择性地结合在a t 富集的d n a 小 沟。研究了配合物9 a 在还原剂的存在下，对p b r 3 2 2d n a 的氧化还原断裂作用。 结果显示，在还原剂的存在下，配合物9 a 能有效地断裂d n a 。自由基淬灭实验 表明h 2 0 2 、0 2 一和1 0 2 均参与了对d n a 的切割，其中h 2 0 2 是主要的活性氧物种。 6 通过循环伏安法研究了配合物5 a 8 a 的电化学性质，发现带正电荷的季铵 基能够提高配合物的氧化还原半波电位。测定了这些配合物的s o d 活性，结果显 示这些配合物具有较高的s o d 活性，尤其是含有适当长度烷基链季铵基的配合物 6 a 和7 a 的活性更高。 关键词：人工核酸酶，2 ，2 联毗啶衍生物，铜配合物，锌配合物，s o d 模拟物 t h es t u d yo nb i n d i n ga n dc l e a v a g ep r o p e r t i e so fm o d i f i e db i p y r i d i n e m e t a ic o m p i e x e s t o w a r d sd n a t h es t u d yo nb i n d i n ga n dc l e a v a g ep r o p e r t i e so f m o d i f i e db i p y r i d i n e m e t a ic o m p l e x e st o w a r d sd n a m 句o r ：i n o 曙a n i cc h e m i s t 叫 n a m e ：j i h u il i s u p e r v i s o r ：p r o z o n g - w a nm a o a b s t r a c t n u c l e a s ei sav e 巧i m p o r t a n tm e t a l l o e n z y m e i tp l a y sa ne s s e n t i a lr o l ei np r o t e c t i n g o 玛a i l i s m sb yd e s t r o y i n ge x t r i n s i cd n a ，r e p a i r i n gm u t a n td n a a i l dd e c o m p o s i n g u s e l e s sp r o t e i n s r e c e n ts t u d i e so nt h es t r u c t u r e sa n dc a t a l ”i cm e c h a n i s m so fs o m e n a n 】r a i 肌c l e a s e sr e v e a l e dt h a tt h ea c t i v i t i e so fn u c l e a s e sr e l yo nn o to i l l yt h et ) ，p e so f m e t a li o n sa n dt h ec o o r d i n a t e da m i n oa c i dr e s i d u e si na c t i v es i t e s ，b u ta l s ot h e c o o p e r a t i v i t yb e t 、v e e nm e t a l i o n si na c t i v es i t e sa n dt h ea s s i s t a i l te f f e c to f 凡n c t i o n a l 锄i n 0a c i dr e s i d u e s 狮u n dt h ea c t i v es i t e s t h e r e f o r e ，o nt h eb a s i so fo u rp r e v i o u s s t u d y ， as e r i e so fc o o p e ra n dz i n cc o m p i e x e so fb i p y r i d y ll i g 趾d sc o n t l i n i n g m u l t i m e t h y l a m m o i l i 啪g r o u p s ，t e t r a a l k y i 籼o n i 啪g r o u p sa n da d e n y lg r o u p sh a v e b e e ns y n t h e s i z e da sa n i f i c i a ln u c l e a s e s t h ep r e s e n tt h e s i sa i ma tas y s t e m i c i n v e s t i g a t i o ni nt h ee f f e c to fs o m ef a c t o rs u c ha st h ep o s i t i o no fa m c t i o n a lg r o u p s ， s t e r i ch i n d r a n c e ，h y d r o g e nb o n d i n g ，p ho fs o l u t i o ne t co nt h ea c t i v i t i e so fa r t i f i c i a l n u c l e a s e s f o l l o w i n gr e s e a r c h 、v o r kh a v eb e e nf i n i s h e d ： 1 b ym o d i f y i n gt h em e t h y l so f5 ，5 4 ，4 - d i m e t h y l - 2 ，2 b i p y r i d i n e ，a s e r i e so f 2 ，2 t - b i p y r i d i n ed e r i v a t i v e sc o n t a i n i n gm u l t i m e t h y l a m m o n i u mg r o u p s ，l 1 一l 4 ( l 1 = 5 ，5 ( m e 2 n h c h 2 ) 2 - b p y 】2 + ，l 2 = 5 ，5 ( m e 3 n c h 2 ) 2 - b p y 】2 + ，l 3 = 【4 ，4 一( m e 2 n h c h 2 ) 2 - b p y 】2 + ，l 4 = 【4 ，4 ( m e 3 n c h 2 ) 2 - b p y 】2 + ，b p y = 2 ，2 - b i p y r i d y l ) a n d t h e i rc u ( i i ) c o m p l e x e s ，【c u ( l 1 - 4 ) 2 b r 】5 + ( 1 a 4 a ) h a v eb e e ns y n t h e s i z e da n d c h a r a c t e r i z e d o ft h e s e a b s t r a c t c o m p l e x e s ， l aa 1 1 d4 aw e r es t m c t u r a l l yc h a r a c t e r i z e d ，a n db o t hc o o r d i n a t i o n c o n f i g u r a t i o n so fc u ( i i ) i o n sc a nb ed e s c r i b e da sd i s t o r r t e dt r i g o n a lb i p y r 锄i d t h e o u t s i d ee l e c t r o s t a t i ci n t e 托屺t i o nm o d eb e t w e e nt h e s ec o m p i e x e sa n dc a l ft h y m u sd n a ( c t d n a ) w 2 l se v a l u a t e db yt h e m a l - d e n a t u r a t i o ne x p e r i m e n t sa n dc ds p e c t r o s c o p y i nt h ea b s e n c eo fa n yr e d u c i n gr e a g e n t s ，t h ec l e a v a g eo fp l a s m i dp b r 3 2 2d n ab y t h e s ec o m p l e x e sw a si n v e s t i g a t e da n dt h eh y d r o l y s i sk i n e t i c so fd n aw a ss t u d i e d t h er e s u l t si n d i c a t et h a tc o m p l e x e slaa n d2 aw h o s ec a t i o n i cg r o u p sl o c a t ea tt h e m e t a p o s i t i o n s ( 5 ，5 - ) o fn a t o m si nb i p y r i d y lp o s s e s s1 1 i g h e s tn u c l e a s ea c t i v i t y b e i n g t w oo ft h em o s ta c t i v ea r t i f i c i a ln u c l e a s e s w h e nc a t i o n i cg r o u p sl o c a t ea tt h e p a r a - p o s i t i o n s ( 4 ，4 一) ，t h e i ri n d u c t i v ee f r e c td e c r e a s e ，w h i c hr e s u l t si nt h ed e c r e a s eo f n u c i e a s ea c t i v i t i e so fc o m p l e x e s3 aa n d4 a w h e nc a t i o n i cg r o u p sl o c a t ea tt h e o n h o p o s i t i o n s ，t h el i g a j l d s c a n tb ec o o r d i n a t e dw i t hm e t a li o n st 0f o 眦m e t a l c o m p l e x e s ，n o tt om e n t i o nn u c l e a s ea c t i v i t y 2 z n ( i i ) c o m p l e x e so fa b o v em e n t i o n e dl i g a n d s ，【z n ( l 1 4 ) 3 】8 + ( 1 b 4 b ) h a v eb e e n p r e p a r e da n dc h a r a c t e r i z e d ，o fw h i c hc o m p l e x4 bh a sb e e ns t n l c t u r a l l yc h a r a c t e r i z e d ， a n dt h ec o o r d i n a t i o nc o n f i g u r a t i o no fz n ( i i ) i o nc a nb ed e s c r i b e da sad i s t o r r t e d c e n t r o s y 删m e t r i co c t a l l e d r o n s p e c i e sd i s t m u t i o ni na q u e o u ss o l u t i o no fc o m p l e x 、v a s d e t e 加“n e db yp o t e m i o m e t e r i ct i t r a t i o n t h eo u t s i d ee l e c t r o s t a t i ci n t e r a c t i o nb e t w e e n t h e s ec o m p l e x e sa j l dc t - d n aw a l sc o n f i 肌e db yu va n dc ds p e c t r o s c o p i e s t h e s e c o m p l e x e sw e r ea p p i i e dt ot h ec l e a v a g eo fp b r 3 2 2d n a u n d e rn e a u rp h y s i o l o g i c a l c o n d i t i o n st oa s s e s st h e i rn u c i e a s ea c t i v i t i e s t h er e s u l t ss h o wt h a tt h e s ec o m p l e x e s p o s s e s sq u i t eh i g hn u c l e a s ea c t i v i t i e s ，e s p e c i a l l yc o m p l e x2 bi so n eo f t h em o s ta c t i v e z i n c - b a s e da r t i f i c i a ln u c l e a s e s 7 r h es t u d yo nt i l ep h d e p e n d e n tn u c l e a s ea c t i v i t i e so f t h e s ec o m p l e x e si n d i c a t e st h e ye x h i b i th i g h e s tn u c l e a s e sa c t i v i t i e sa tp h7 5 7 8 3 b ym o d i 矽i n gt h em e t h y l so f4 ，4 一d i m e t h y l 一2 ，2 - b i p y r i d i n e ，as e r i e so fb i p y r i d i n e d e r i v a t i v e sc o n t a i n i n gt e t r a a l k y l a m m o n i u m 掣o u p sw i t ha l k y lc h a i n so fv 撕e dl e n g t h ， l 5 l 8 ( l 5 = 4 ，4 ( e t 3 n c h 2 ) 2 b p y 】2 + ，l 6 = 【4 ，4 ( ( ，z b u ) 3 n c h 2 ) 2 b p y 】2 + ，l 7 = 5 ，5 一 ( ( ，z c 6 h 1 3 ) 3 n c h 2 ) 2 b p y 】2 + 甜l dl 8 =【5 ，5 ( c 8 h 1 7 ) 3 n c h 2 ) - 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d n a w a se x p l o r e db yu v s p e c t r o p h o t o m e t r i ct i t r i a t i o n t h ec l e a v a g eo fd n ac a t a l y z e db yt h e s ec o m p l e x e su n d e rh y d r o i ”i cc o n d i t i o n sw a l s t e s t e d ，a n dt h er e s u l ti n d i c a t em ed n ac l e a v a g ea c t i v i t i e so ft h e s ec o m p l e x e s ， e s p e c i a l l yc o m p l e x e s7 a 锄d 8 aw m c hc o n t a i nl o n g e ra l k y lc h a i n s ，a r es o m e w h a tl o w h o w e v e r i nm ep r e s e n c eo fr e d u c i n gr e a g e n t s ，c o m p l e x e s5 aa n d6 ac a ne f f e c t i v e l y c l e a v ep b r 3 2 2d n a1 ，妇o x i d a t i v ep a m t h em e c h a n i s mo fd n ac l e a v a g eb yt h e s e c o m p l e x e sw a ss t u d i e db yu s i n gi n h i b i t i n gr e a g e n t s ，a n dt h er e s u l t si n d i c a t et h a th 2 0 2 a n d1 0 2a r et h er e a c t i v eo x y g e ns p e c i e st oi n d u c ed n ac l e a v a g e 5 b ym o d i f y i n gt h em e t h y l so f2 ，9 一d i m e t h y l 一1 ，lo - p h e n a n m r o l i n ea n di n t r o d u c i n g a d e n y l s ，2 ，9 d i a d e n y l m e m y l 1 ，l0 p h e n a n t h r o l i n e ( l 9 ) h a s b e e ns y n t h e s i z e d 锄d c h 甜a c t e r i z e d ，a i l di t sc u ( i i ) c o m p l e x 【c u l 9 ( h 2 0 ) 3 】( c 1 0 4 ) 2 ( 9 a ) 2 l r l dz n ( i i ) c o m p l e x z n l 9 ( h 2 0 ) 4 】( c 1 0 4 ) 2 ( 9 b ) h a v e b e e n p r e p a r e d 1 k i n t e m c t i o nb e t w e e nb o t h c o m p l e x e s 锄dc t d n aw a s 咖d i e db yt h e m a l - d e n a t u r a t i o ne x p e r i m e n t s ，c d s p e c t r o s c o p y 锄du vs p e c t r o p h o t o m e t r i ct i 慨i o n r e s u l t si n d i c a t eb o t hc o m p l e x e s c a ns e l e c t i v e l yb i r l dt 0a t - r i c hr e g i o ni nm i r l o rg r o o v eo fd n a i nt i l ep r e s e n c eo f r e d u c i n gr e a g e n t s ，t h eo x i d a t i v ec l e a v a g eo fp b r 3 2 2d n ab yc o m p l e x9 aw a s i n v e s t i g a t e d r e s u l t ss h o w t h a ti i lt h ep r e s e n c eo fr e i i u c i n gr e a g e n t s ，c o m p l e x9 ac a u l e f f c c t i v e l yc l e a v ed n a n l er e s u l to fr a d i c a l ss c a v e n g i n ge x p e r i m e n ti n d i c a t et t l a t ab s t r a c t h 2 0 2 ，0 2 一a n d l0 2 p a r t i c i p a t ei nt h ec l e a v a g eo fd n a ，a n dh 2 0 2i st h em a i nr e a c t i v e o x y g e ns p e c l e s 6 e l e c t r o c h e m i s t 巧 o fc u ( i i ) c o m p l e x e s5 a 8 a w a ss t u d i e d b yc y c l i c v o l t a m m e t r y ，a j l dt h er e s u i t si n d i c a t et h a tt h ei n t r o c l u c t i o no ft e t r a a i k y l a m m o n i u m g r o u p si n e r e a s e st h er e d o xp o t e n t i a l so ft h e s ec o m p l e x e s s o d - l i k ea c t i v i t i e so fa l l m i m i c sw e r ee x 锄i n e d t h er e s u l t ss h o wt h a ta l l c o m p l e x e s ，e s p e c i a l l ym i m i c s c o n t a i n i n gt r i 。胛- b u t y l 锄m o n i u m a n dt r i 一”- h e x y l 锄m o n i u m g r o u p s( 6 aa n d7 a ) e x h i b i tq u i t eh i 曲s o d - l i k ea c t i v i t i e s k e yw o r d s ：a n i f i c i a ln u c l e a s e s ，2 ，2 - b i p y r i d i n ed e r i v a t i v e s ，c o p p e rc o m p i e x e s ，z i n c c o m p l e x e s ，s o dm i m i c s 原创性声明 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独 立进行研究工作的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包 含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究 做出重要贡献的个人和集体，均己在文中以明确方式标明。本人完全 意识到本声明的法律责任由本人承担。 学位敝作者签名：勃乏身争 日期：2 0 0 8 年5 月1 9 日l 学位论文使用授权声明 学位论文使用授权声明 本人完全了解中山大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学 校有权保留学位论文并向国家主管部门或其指定机构送交论文的电 子版和纸质版，有权将学位论文用于非赢利目的的少量复制并允许论 文进入学校图书馆、院系资料室被查阅，有权将学位论文的内容编入 有关数据库进行检索，可以采用复印、缩印或其他方法保存学位论文。 导师签名：獭 日期：2 口揖珀弓p 日 汲砑、i 、 协日 叶彳侈 轮 月 套 一 彰 年 如 沧 也 位 期 学 日 知识产权保护声明 知识产权保护声明 本人郑重声明：我所提交答辩的学位论文，是本人在导师指导下 完成的成果，该成果属于中山大学化学与化学工程学院，受国家知识 产权法保护。在学期间与毕业后以任何形式公开发表论文或申请专 利，均需由导师作为通讯联系人，未经导师的书面许可，本人不得以 任何方式，以任何其它单位作全部和局部署名公布学位论文成果。本 人完全意识到本声明的法律责任由本人承担。 学位论文作者签名：专传涸 日期：2 0 0 8 年5 月1 9 日 l l l 第一章前言 1 1 引言 第一章前言 核酸是重要的遗传物质，分为脱氧核糖核酸( d n a ) 和核糖核酸( r n a ) 两 类。为了完整地保存其遗传特性并维持蛋白质的特定功能，大自然选择了十分稳 定的磷酸双酯键来连接核酸中的核苷以及肽键来连接蛋白质中的氨基酸。双链 d n a 中的磷酸双酯键极其稳定，其在中性条件、2 5 下自发水解的半衰期大约 为1 3 0 o o o 年【l 】。r n a 中的磷酸双酯键和蛋白质中的肽键在相同条件下的半衰 期也在数年以上。 磷酸双酯键和肽键的稳定性也带来了问题。例如，外来d n a 和蛋白质一旦 被识别，将很难被摧毁，这可能会影响生物体的生理功能甚至引起病变；将使对 发生变异的原始d n a 的修复变得困难；信使r n a ( m r n a ) 在完成对蛋白质的 编码后必须被分解，以免不必要地重复合成蛋白质：最后，蛋白质在完成其功能 不再必需时，也要降解成相应的氨基酸【2 】。所有这些生命过程，必须在生理条件 下完成。为了完成这些艰难的任务，自然界发展了多种天然核酸酶( 如限制性核 酸内切酶，拓扑异构酶) ，它们能显著地催化d n a 的水解，使其水解速率提高 1 0 1 2 1 0 1 7 倍【3 】，从而使对生命研究十分重要的d n a 操作成为可能。 虽然已有多种天然核酸酶应用于实验室研究【4 】，但由于天然核酸酶结构复 杂、稳定性差、序列选择性差、反应条件苛刻，加上来源少、提取纯化过程复杂 使得其价格昂贵，从而大大限制了对它们的研究和应用。因此，设计和合成高活 性、稳定性好、具有序列选择性的小分子人工核酸酶并模拟其对d n a 的水解催 化作用，不仅为研究生命体系中的化学过程提供了理论基础，而且对多种疾病的 诊断、治疗及治疗性药物的开发提供了现实可能性。 中山大学博士论文修饰联吡啶一金属配合物对d n a 的作用和断裂研究 1 2 一些天然核酸酶的结构及催化机理 核酸酶通常具有多金属催化位点，最常采用的金属离子是m 矿+ 、z n 2 + 、m n 2 + 、 c a ”和f e 2 十。然而要弄清这些核酸酶所采用的金属种类、金属详细的配位环境以 及它们的催化机理是很困难的【5j 。许多这样的蛋白质，其实并不是真正的金属蛋 白。换句话说，它们只是以一种较弱的结合力与金属离子键合，在特定条件下可 以分离出其中的金属离子。许多有关核酸酶的催化机理，通常是通过晶体结构分 析、考察p h 的变化和金属种类对酶活性的影响来推断的。即使能够得到某些核 酸酶的晶体结构，也不能确定用于结构分析的晶体中观察到的金属配位环境与原 始的配位状态一致，也不能断定观察到的键合金属离子是不是催化活性的口j 。 研究得最多的天然核酸酶是两种金属磷酸酯酶，即碱性磷酸酯酶( a l k a l i n e p h o s p h a t a s e ，a p ) 【6 7 1 和紫色酸性磷酸酯酶( p u r p l ea c i dp h o s p h a t a s e s ，p a p s ) 【8 9 】，它 们能够催化磷酸单酯的水解。人们对这两类酶在生理上的重要程度还所知甚少， 所知道的是它们都是利用双金属活性中心来催化磷酸酯的水解，下面对其结构和 催化机理进行介绍。 1 2 1 碱性磷酸酯酶 这种酶因在p h8 0 时活性最高而得名，其结构己获表征【7 1 ，如图1 1 所示。 它是一种同型二聚体，每个单元含有两个z n 2 + 和一个m 9 2 + ，其中两个z n 2 + 是活性 图l 一1 碱性磷酸酯酶( p d b i d ：1 a l k ) 的结构和活性中心的配位构型 f i g 1 1s t r u c t u f ea n da c t i v es i t eo fa i k a l i n ep h o s p h a t a s e ( p d b i d ：la l k ) 2 髫碓!，遂瓣 第一章前言 活性位点，而m g h 对活性贡献很小，其主要的作用是稳定酶的结构。两个z n 2 + 之间的距离是3 9a ，其中z n l 与分别来自两个天冬氨酸( a s p 5 i ，a s p 3 6 9 ) 的各一 个氧原子，一个组氨酸( h i s 3 7 0 ) 的氮原子，一个丝氨酸( s e r l 0 2 ) 的氧原子以及一 个水分子配位；z i l 2 与分别来自两个组氨酸( h i s 3 3 l ，h i s 4 1 2 ) 的氮原子、一个天冬 氨酸( a s p 3 2 7 ) 的两个氧原子以及一个水分子配位，都形成五配位的几何构型。 k i m 和w y c k o f 曜出了碱性磷酸酯酶催化磷酸酯的水解机理【7 】，是一个两步 的亲核取代过程，其间形成一个磷酸酶中间体：其中一个z n 2 + 活化与之靠近的丝 氨酸s e r l 0 2 ，使其进攻磷酸单酯；另一个z n 2 + 活化一个水分子把磷酸基从丝氨酸 残基上取代下来。在每一步中，两个z n 2 + 都是协同作用，其中一个活化亲核试剂， 另一个稳定离去基团上的负电荷，两个z n 2 + 还起到固定底物使其保持合适的构型 以及通过静电作用稳定五价膦过渡态的作用。上述机理简示于图1 2 。 h 葛婴 瑚 ：竣以眨 1 t 碜5 3 7 0 科影瑚 h 2 0 图l 2 碱性磷酸酯酶催化磷酸单酯水解的两步亲核取代机理示意图 f i g 。l 一2t h et 、 ，o - s t e pn u c l e o p h i l i cd i s p i a c e m e n tm e c h a n i s mf o rt h eh y d r o l y s i so f p h o s p h o m o n o e s t e rc 删y z e db ya p 3 中山大学博士论文修饰联吡啶一金属配合物对d n a 的作用和断裂研究 这种机理是建立在大量的实验基础之上的，包括催化行为对p h 和金属种类 依赖性研究【6 1 、晶体结构分析【7 1 以及核磁共振( n m r ) 研究【10 1 ，后者证实了底物 与两个z n 2 + 之间的作用。碱性磷酸酯酶是迄今为止研究最为透彻的金属磷酸水解 酶，它的催化机理常被作为同类金属酶催化机理的范例。 1 2 2 紫色酸性磷酸酯酶 紫色酸性磷酸酯酶也具有双金属金属催化位点，其中一个是三价的f e ”，另 一个是二价金属离子，通常是z n 2 + 或f e 2 + ，两个金属位点协同作用，催化磷酸酯 的水解【5 】。两个金属离子通过来自天冬氨酸的一个氧原子和一个羟基( 据光谱研 究结果推测) 桥联起来：每个金属离子都保留一个敞开的配位点，这个配位点据 推测被溶剂水分子占据f l 。这种酶在酸性条件下具有最佳催化活性，这是由于铁 配位的水分子在此条件下去质子，生成具有催化活性的亲核进攻试洲晓1 。另一个 二价金属离子的作用被认为是在其它关键活性点处氨基酸残基的协助下，稳定过 渡态的电荷【1 3 】。酸性磷酸酯酶催化磷酸单酯水解的机理及其过渡态如图1 3 所 示。 陆捷耸售蜘研石姐o ，、t 、哆p i 川i i 仅 h i s 如弋、 胁除售晰 ，童t o r 图1 3 紫色酸性磷酸酯酶催化磷酸单酯水