（海洋生物学专业论文）海洋弧菌中五类溶血素基因分布及其生物学活性研究.pdf

独创声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含未获得 ( 篷；垫塑直基丝益墨缱型童盟的：奎拦亘窒2 或其他教育机构的学位或证书使 用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：互舞蚰嗣签字日期：w 审年占月多日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人 授权学校町以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用 影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。( 保密的学位论文在解密后 适用本授权书) 学位论文作者签名：二、；k 女司 导师签字： 签字日期：矽曰年月多日 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： i 回最哗 jl 签字日期吲年易月3 日 电话： 邮编 海洋弧菌中五类溶血素基因分布及其生物学活性研究 海洋弧菌中五类溶血素基因分布及其生物学活性研究 摘要 弧菌是海洋环境中最常见的细菌类群之一，广泛分布于近岸及河口海水、海 洋生物的体表和肠道中，是海水和许多海洋生物的正常或有益菌群的成员。研究 发现，许多海洋弧菌是养殖虾类和鱼类的重要病原菌。溶血素是病原弧菌中分布 最为广泛的毒素之一，能够导致红细胞膜的破裂并伴随着血红蛋白的释放。某 些细菌的溶血作用是由其产生的酶活性引起，如铜绿假单胞菌( p s e u d o m o n a s a e r u g i n o s a ) 的磷脂酶c 和美人鱼发光杆菌( p h o t o b a c t e r i u md a m s e l a e ) 的磷脂 酶d ，而另一些细菌的溶血素是通过在红细胞膜上的穿孔作用而产生溶血作用。 有时溶血素的穿孔作用不仅仅局限于红细胞，还可以作用于多种其它类型的细 胞，如肥大细胞和嗜中性粒细胞等，通过引起组织损伤而增加其毒性。 尽管弧菌属细菌产生的各种溶血素均具有溶血活性，但它们的核苷酸序列、 预测的氨基酸序列、活性以及作用机理却不尽相同。目前发现5 类有代表性的 溶血素家族，即副溶血弧菌( v i b r i op a r a h a e m o l y t i c u s ) 的热稳定性直接溶血素 ( t d h ) 、霍乱弧菌( 矿c h o l e r a e ) 的e lt o r 溶血素( h i y a ) 、副溶血弧菌的热不 稳定性溶血素( t l h ) 、副溶血弧菌的热稳定性溶血素( 6 - v p h ) 以及0 1 型霍 乱弧菌的一种溶血素( h l x ) 。 本研究使用的5 7 株海洋弧菌包括2 6 株弧菌标准菌株，另有2 0 株哈维氏弧菌， 1 1 株副溶血弧菌是从不同宿主和不同地理环境中分离得到的。从g e n b a n k 中获取 所有弧菌的5 类溶血素基因序列，分别用c l u s t a i w ( h t t p ：w w w e b i a e u l d c l u s t a l w ) 进行同缘比对。根据保守区域设计5 对引物，分别扩增t l h 、t d h 、h l y a 、6 - v p h 和h l x 溶血素基因片段。使用d i g 探针合成试剂盒，分别以哈维氏弧菌( 矿 h a r v e y i ) v i b6 4 5 、副溶血弧菌v i b6 1 1 、拟态弧菌( 矿m i m i c u s ) v i b2 9 8 和副溶 血弧菌v i b4 6 2 基因组d n a 为模板，p c r 合成地高辛标记的溶血素基因t l h 、 t d h 、h i y a 、6 v p h 和h l x 的部分序列，作为溶血素基因探针，检测这5 类溶 血素基因在5 7 株弧菌中的分布。结果显示，在5 7 株弧菌中，含有t d h 、n i y a 、 t l h 、6 v p h 和h l x 溶血素基因的菌株分别为2 株、2 株、4 9 株、3 株和3 0 株。分 析表明，t l h 溶血素基因广泛分布于弧菌中，尤其在哈维氏弧菌相关菌株( 包 括哈维氏弧菌、坎贝氏弧菌、溶藻胶弧菌、副溶血弧菌和飘浮弧菌) 和费氏弧 海洋弧菌中五类溶血素基因分布及其生物学活性研究 菌相关菌株( 包括费氏弧菌和火神弧菌) 中分布较广。h l x 溶血素基因在哈维 氏弧菌和副溶血弧菌中分布较多，在溶藻胶弧菌、辛辛那提弧菌、双氮养弧菌、 霍氏格里蒙菌中也有分布。t d h 、h l y a 及6 v p h 溶血素基因的阳性率均小于 6 ，表明t d h 、h i y a 及6 - v p h 溶血素基因在弧菌中分布较少。另外，3 株哈维 氏弧菌中分别含有2 个t l h 溶血素基因；一株霍氏格里蒙菌( g r i m o n t i a h o l l i s a e ) 和一株副溶血弧菌中分别含有2 个t d h 溶血素基因，可见双拷贝溶血素基因在弧 菌中并不罕见。 另外对鳗弧菌( 矿a n g u i l l a r u m ) v i b7 2 、河1 2 1 弧菌( 矿a e s t u a r i a n u s ) v i b 2 8 1 、 费氏弧菌( e f i s c h e r i ) v i b2 9 1 、河弧菌( e f l u v i a l i s ) v i b2 9 2 、坎贝氏弧菌( f c a m p b e l l i i ) v i b2 8 5 、飘浮弧菌( 矿n a t r i e g e n s ) v i b2 9 9 和哈维氏弧菌( 矿 h a r v e y i ) v i b6 4 7 的v h l c t l h 溶血素基因进行克隆并测序，其氨基酸序列与哈维氏 弧菌的v h h 溶血素和副溶血弧菌的t l h 溶血素氨基酸序列的相似性分别为 ( 6 7 9 9 ) 和( 6 9 - - - 9 1 ) 。 用鱼血平板和卵磷脂平板检测5 7 株弧菌的溶血活性和磷脂酶活性。结果表 明，在研究的5 7 株弧菌中，所有含有t l h 溶血素基因的弧菌均具有溶血活性； 除费氏弧菌、产气弧菌、火神弧菌和哈维氏弧菌v i b6 4 7 外，所有含有t l h 溶 血素基因的弧菌也都具有磷脂酶活性；并且大多数弧菌的溶血活性和磷脂酶活性 的强弱与t l h 溶血素基因杂交信号的强弱存在正相关性。多数溶血活性和磷脂 酶活性强的弧菌，其与t l h 溶血素基因探针的杂交信号也强，但也存在少数例 外情况，如美人鱼发光杆菌、弗尼斯弧菌、塔氏弧菌和哈维氏弧菌v i b6 4 9 ，其 溶血活性或磷脂酶活性较强，但杂交信号弱或无杂交信号。几乎所有无t l h 溶 血素基因杂交信号的菌株，都没有溶血活性和磷脂酶活性。具有两个t l h 溶血 素基因的3 株哈维氏弧菌，其溶血圈和磷脂酶活性的乳白色半透明圈的半径明显 大于其它菌株，说明具有两个拷贝溶血素基因的弧菌，其溶血活性和磷脂酶活性 均较强。因此，弧菌溶血活性和磷脂酶活性与t l h 溶血素基因具有显著相关性， 与另外四类溶血素基因的关系不密切。 为进一步研究v h h t l h 溶血素的性质，本研究以坎贝氏弧菌v i b 2 8 5 基因组 d n a 为模板扩增出溶血素基因砌的全序列，将r 胁克隆到大肠杆菌的表达载体 p e t - 2 4 d ( + ) ，构建出重组表达质粒p e t - 2 4 d ( + ) t l h 。将该表达质粒转化到大肠杆 2 海洋弧菌中五类溶m 素幕因分布及其生物学活件研究 菌的表达菌株b l 2 1 ( d e 3 ) ， ! 导到了重组菌b l 2 1 ( d e 3 ) p e t - 2 4 d ( + ) t l h ，t l h 在大 肠杆菌中得到了表达。在终浓度为1m m 的i p t g 诱导培养时，重组菌在血平 板上表现出溶血活性。 关键词：弧菌：溶血素：溶血素活性：磷脂酶活性 塑堂墨堕! 至耋塑生鲞苎塑坌塑墨基圭望兰重丝塑塞 d i s t r i b u t i o no ff i v ek i n d so fh a e m o l y s i ng e n e si nv i b r i o sa n d i t sc o r r e l a t i o nw i t hh a e m o l y t i ca n dp h o s p h o l i p a s ea c t i v i t i e s a b s t r a c t v i b r i o sa 托n o r m a li n h a b i t a n t si na q u a t i ce n v i r o n m e n t s ，b e i n gv e r yc o n l l n o l li n m a r i n ea n de s t u a r i n eh a b i t a t s m a n ys t u d i e sh a v er e p o r t e dt h a tv i b r i os p e c i e sa r e p a t h o g e n i ct om a r i l l es h r i m p sa n df i s h h a e m o l y s i n ，w h i c hi s a l le x o t o x i nt h a t a t t a c k sb l o o dc e l lm e m b r a n e sa n dc a u s e sc e l lr u p t u r e ，i sa r g u a b l yt h em o s t 丽d e l y d i s t r i b u t e dt o x i na m o n gp a t h o g e n i cv i b r i o s h a e m o l y s i sm a yr e s u l tf r o mt h e e n z y m a t i c a c t i v i t i e sd e m o n s t r a t e d b y s o m e s p e c i e s o fb a c t e d a , i n c l u d i n g p h o s p h o l i p a s e co fp s e u d o m o n a sa e r u g i n o s aa n dp h o s p h o l i p a s edi n p h o t o b a c t e r i u md a m s e l a es s p d a m s e l a e h o w e v e r , m a n yo t h e rh a e m o l y s i u sa c tb y f o r m i n gp o r e si n t h ec y t o p l a s m i cm e m b r a n eo fe r y t h r o c y t e s i nm a n yc a s e s ，t h e p o r e f o r m i n ga c t i v i t yo fh a e m o l y s i ni sn o tr e s t r i c t e dt oe r y t h r o e y t e s ，b u te x t e n d st oa w i d e r a n g e o fo t h e rc e l l t y p e si n c l u d i n g m a s t c e l l s ，n e u t r o p h i l s ，a n d p o l y m o r p h o n u c l e a rc e l l s ，a n de n h a n c e sv i r u l e n c eb yc a u s i n g t i s s u ed a m a g e c u r r e n t l y ， f i v er e p r e s e n t a t i v eh a e m o l y s i nf a m i l i e sh a v eb e e nf o u n di nh b r i os p ，i n c l u d i n gt h e t d h ( t h e r m o s t a b l ed i r e c th a e m o l y s i n ) f a m i l yo f 矿p a r a h a e m o l y t i c u s ，t h eh i y a ( e l t o rh a e m o l y s i n ) f a m i l yo f 矿c h o l e r a e ，t h et l h ( t h e r m o l a b i l eh a e m o l y s i n ) f a m i l yo f 矿p a r a h a e m o l y t i c u s ，t h e5 - v p h ( t h e r m o s t a b l eh a e m o l y s i n ) f a m i l y o f 矿 p a r a h a e m o l y t i c u sa n dt h eh l xf a m i l yo f 矿c h o l e r a e0 1 e a c ht y p eo fh a e m o l y s i n g e n ew a sa l i g n e du s i n gc l u s t a l w ( h t t p ：w w w , e b i a c , u k c l u s t a l w ) ，a n df i v ep a i r so f p c r p r i m e r sw e r ed e s i g n e df r o mt h ec o n s e r v e dr e g i o no ft h eh a e m o l y s i ng e n e sa n d t h et l h ，t d h ，h i y a ，5 - v p ha n dh l xh a e m o l y s i ng e n ef r a c t i o n sw e r ea m p l i f i e d f i v ed i g 。l a b e l l e dh a e m o l y s i ng e n ep r o b e sw e r es y n t h e s i z e db yp c ra m p l i f i c a t i o n f r o mt o t a ld n ao f d i f f e r e n t1 4 b r i os t r a i n s a n dw e r eu s e dt od e t e c tt h ed i s t r i b u t i o n so f f i v eh a e m o l y s i ng e n e sa m o n g5 7l , q b r i os w a i n sb ys o u t h e r nb l o t t h er e s u l ts h o w e d t h a t2v i b r i os t r a i n sh a dt d hh a e m o l y s i ng e n e ，2s t r a i n sh a dh i y ah a e m o l y s i ng e n e ， 4 9s t r a i n sh a dt l hh a e m o l y s i ng e n e 。3s t r a i n sh a d6 - v p hh a e m o l y s i ng e n ea n d3 0 s t r a i n sh a dh l xh a e m o l y s i ng e n e f r o mt h e s er e s u l t s ，i ts e e m st h a tt h et l h 4 海洋弧菌中五类溶血素基因分布及其生物学活性研究 h a e m o l y s i ng e n ew a sw i d e l yd i s t r i b u t e di nd i f f e r e n th b r i os p e c i e s ，a n dt h ep o s i t i v e r a t i ow a sa sh i g i la s8 5 9 6 h l xh a e m o l y s i ng e n ew a sw i d e l yd i s t r i b u t e da m o n g 矿 h a r v e y i ，i f p a r a h a e m o l y t i c u sa n d w a sa l s od e t e c t e d i n 矿a l g i n o l y t i c u s 矿 c i n c i n a t i e n s i s ，ed i a z o t r o p h i c u s ，g r i m o n t i ah o l l 西a ea n dt h ep o s i t i v er a t i oi s5 2 6 3 h o w e v e r t h ep o s i t i v er a t i o so f t d h ，h i y aa n d6 一v p hh a e m o l y s i ng e n e sw e r el e s s t h a n6 m o r e o v e r , t h r e es t r a i n so f 矿h a r v e y ih a dd u p l i c a t e dt hg e n e s o n es t r a i no f g r i m o n t i ah o l l 话a ea n do n es t r a i no fi f p a r a h a e m o l y a c u sh a dd u p l i c a t e dt d hg e n e s i ts e e m st h a td u p l i c a t i o no f h a e m o l y s i ng e n e si nv i b r i o si sn o tr a r e t os u p p o r tt h i sc o n c l u s i o n ，t h ev h h t l hh o m o l o g u cg e n e si n a n g u i l l a r u mv i b 7 2 ，矿a e s l u a r i a n u sv i b2 8 1 ，形加曲折v i b2 9 1 ，e f l u r i a l i sv i b2 9 2 ，矿c a m p b e l l i i v i b2 8 5 ，n a t r i e g e n sv i b2 9 9a n d 矿h a r v e y iv i b6 4 7w e r ec l o n e da n d s e q u e n c e d a n dt h ed e d u c e da m i n oa c i ds e q u e n c e ss h o w e dh i g hd e g r e eo fi d e n t i t i e st ov h h ( 6 7 - 9 9 ) a n dt l hh a e m o l y s i n ( 6 9 - 9 1 ) 5 7i s o l a t e so fv i b r i o sw e r ei n o c u l a t e do nt h ef i s hb l o o da g a rp l a t ea n de g gy o l k p l a t e sr e s p e c t i v e l y , a n dh a e m o l y t i ca n dp h o s p h o l i p a s ea c t i v i t i e sw c i ed e t e r m i n e db y t h ea p p e a r a n c eo fal y r i cz o b ea n do p a l e s c e n c ea r o u n dt h eb a c t e r i a lg r o w t h i tw a s f o u n dt h a ta l lt h ev i b f i o ss t r a i n s 谢t ht l h h a e m o l y s i ng e n eh a dh a e m o l y t i ca c t i v i t i e s e x c e p te f i s c h e r i , 矿g a z o g e n e s ，el o g e ia n d 矿h a r v e y v i b6 4 7 。a 1 1t h eo t h e rv i b r i o s t r a i n st h a th a dt l hh a e m o l y s i ng e n ea l s oh a d p h o s p h o l i p a s ea c t i v i t i e s m o s tv i b r i o s t r a i n st h a th a ds t r o n gh a e m o l y t i ca n dp h o s p h o l i p a s ea c t i v i t i e sa l s oh a ds t r o n g h y b r i d i z a t i o ns i g n a l sf o rt l hh a e m o l y s i ng e n e h o w e v e r , t h e r ea r ea l s os o m e e x c e p t i o n s ，e g p h o t o b a c t e r i u md a m s e l a es u b s p d a m s e l a e ，l , f f u r n i s s i i , 矿t u b i a s h i i a n d 矿h a r v e y iv i b6 4 9 ，w h i c hh a v es t r o n gh a c m o l y t i co rp h o s p h o l i p a s ea c t i v i t i e s h a v ew e a ko rn oh y b r i d i z a t i o ns i g n a l s a l m o s ta l lt h ev i b f i os t r a i n sw h i c hh a dn o h y b r i d i z a t i o ns i g n a l sf o rt l hh a e m o l y s i ng e n eh a dn oh a c r n o l y t i co rp h o s p h o l i p a s e a c t i v i t i e s t h eh a e m o l y t i co rp h o s p h o l i p a s ea c t i v i t i e si nt h e3r h a r v e y ii s o l a t e s w h i c hh a dd u p l i c a t e dt l hh a e m o l y s i ng e n e sw e r es t r o n g e rt h a nt h o s ei no t h e r s s t r d i n s t h i ss u g g e f l st h a tt h eh a e m o l y t i co rp h o s p h o l i p a s ea c t i v i t i e so f h a r v e w e r ea l s o c o r r e l a t e dw i t l lt h ed u p l i c a t i o no ft l hh a e m o l y s i ng e n e s f r o mt h e s e r e s u l t s ，i tw a sc o n c l u d e dt h a th a e m o l y t i ca n dp h o s p h o l i p a s ea c t i v i t i e so fh b r i o 5 海洋弧菌中五类溶血素基因分布及其生物学活件研究 s p e c i e sw e r ec l o s e l yc o r r e l a t e dw i t ht h ed i s t r i b u t i o no f t l hh a e m o l y s i ng e n e ，b u t n o t w i t ho t h e r4t y p e so f h a e m o l y s i ng e n e s t of u r t h e rs t u d yt h ev h h t l h h a e m o l y s i ng e n e t h ec h r o m o s o m a ld n ao f 矿 c a m p b e l l i iv i b2 8 5w a su s e da st e m p l a t et oa m p l i f yt h ew h o l ev h h t l hh a e m o l y s i n g e n e t h ep c rp r o d u c tw a sc l o n e di n t op e t - 2 4 d ( + ) v e c t o rf o l l o w i n gl h e m a n u f a c t u r e si n s t r u c t i o n t h er e c o m b i n a n tp l a s m i d c o n t a i n i n g t h ei n s e r to f e x p e c t e ds i z ew a st r a n s f e r e di n t oec o l ie x p r e s ss t r a i nb l 2 1 ( d e 3 ) w h e ni n d u c e d b yi p t g ( 1r a m ) ，t h er e c o m b i n a n ts t r a i nh a dh a e m o l y t i ea c t i v i t y k e yw o r d s ：v i b r i o ；h a e m o l y s i ng e n e ；h a e m o l y t i ca c t i v i t y ；p h o s p h o l i p a s ea c t i v i t y 6 海洋弧菌中五类溶帆素基因分布及其生物学活性研究 1 前言 1 1 我国海水养殖鱼类病害研究概况 我国的水产养殖产量居世界之首，改革开放后我国的水产业发展非常迅速， 水产品产量咀平均每年1 5 0 万吨左右的速度增长，据f a o 统计2 0 0 2 年全国水产品 产量增加到3 6 5 9 多万吨，占世界总产量的7 1 2 和产值的5 4 ，7 。近年来随着育 苗技术的提高，我国海水养殖的面积也不断扩大，产量不断上升，到2 0 0 2 年海 水养殖产量约1 1 3 2 万吨，海水养殖占养殖产量的3 0 以1 - 1 3 1 。 随着海水鱼类养殖的不断扩大，养殖品种、养殖面积及密度日益增加，海水 鱼类养殖已成为继对虾养殖之后的另一经济增长点。但由于局部养殖密度过大、 人工投饵、种质退化、环境污染等因素的影响，鱼类病害频繁发生，对海水鱼类 规模化养殖和发展造成了巨大的威胁，为此，海水养殖鱼类病害的研究已日益成 为人们关注的焦点【2 j 。 1 2 鱼病病原体 鱼类病原种类很多，包括病毒、细菌、真菌、藻类、原虫、蠕虫和甲壳动物 等( 表1 1 ) 。 表1 1 病原体及其感染鱼类 t a b l e1 - 1p a t h o g e n sa n di t si n f e c t e df i s h 海洋弧菌中五类溶血奈基因分布及其生物学活性研究 真鲷球形病毒( p a g r o s o m u sm a j o rs p h e r e o v i r u sp m s v ) ；真鲷杆状病毒( p a g r o s o m u sm a j o r b a c u l o v i r u sp m b ；牙鲆弹状病毒( h i r a m er h a b d o v i r u sn r v ) 1 3 海洋弧菌 在引起鱼类发病的众多病害中，细菌性病害占据首位。海洋细菌泛指能在海 洋环境中生存和繁殖的细菌，包括好盐性和非好盐性两大类，其中只有前者原栖 于海洋，属于真正的海洋细菌。b e r g e y sm a n u a lo f s y s t e m a t i cb a c t e r i o l o g y 第一 版1 1 5 1 ，将异养、好盐性海洋细菌中具发酵葡萄糖等醣类能力的兼性厌氧 ( f a c u l t a t i v e l ya n a e r o b i c ) 的革兰氏阴性杆菌，都归类于弧菌科( v i b r i o n a c e a e ) 弧菌 属( v i b r i o ) 或发光杆菌属( p h o t o b a c t e r i u m ) 。这类习称为海洋弧菌( m a r i n ev i b f i o s ) 或弧菌( v i b r i o s ) 的弧菌科海洋细菌，大多具运动性且氧化酶阳性。它们几乎都能 1 2 海洋弧菌中五类溶i i i l 紊草因分布及其生物学活忭研究 在t c b s ( t h i o s u l f a t e - c i tr a t e b i l es a l t s u c r o s e ) 选择性培养基上生长。随着新种的 陆续发现，海洋弧菌有效种己从二十年前的孤菌属和发光杆菌属两个属所含的二 十余种，增加为目前的肠弧菌属( e n t e r o v i b r i o ) 、格里蒙菌属( g r i m o n t i a ) 、 发光杆菌属、盐弧菌属( s a l i n o v i b r i o ) 和弧茵属等五个属所含的共约八十种 1 3 1 海洋弧菌的分布与重要性 海洋弧菌广泛分布于各类内湾( i n l e t ) 、沿岸和外洋( p e l a g i c ) 水域，而且 数量相当丰富。它们通常占沿岸和外洋海水中可培养异养细菌总菌数的l o 5 0 。s i n a i d u 和t s l l l c 锄o t o 【8 5 1 的研究显示，各种海洋弧菌在海水中分布，大多不 受地理区域限制，却有依深度而生境分离( h a b i t a ts e g r e g a t i o n ) 的倾向。此外，浅 水层海洋弧菌大多生长较快，普遍具有降解酪蛋n ( c a s e i n ) 、几丁质( c h i t i n ) 、d n a 、 秦皮甲素( e s c u l i n ) 、明胶( g e l 撕n ) 、淀粉( s t a r c h ) 等高分子量有机物的能力。楣对 来说，深水层海洋弧菌一般生长较慢，大多不能降解这些高分子量有机物。海洋 弧菌也广泛分布于沉积物和各种海洋生物中。已有研究显示，珊瑚、鱼虾、软体 动物、海草、海绵和浮游动物等海洋生物体表或体内常生存着高密度的海洋弧菌。 海洋弧菌具有丰富多样的生理生化机能，对海洋生物和海洋生态系可能会产生重 要影响，如致病、发光、固氮及降解几丁质和琼脂等复杂多糖类的能力。 1 3 2 病原性海洋弧菌 已知可能感染鱼类或人类，造成病害的病原性海洋弧菌，不下二十种。其中 能感染人类引起疾病者超过十种，但以霍乱弧菌( v i b r i oc h o l e r a e ) 、副溶血弧 菌( 矿p a r a h a e m o l y t i c u s ) 和刨伤弧菌( 矿v u l n i f i c u s ) 三者最重要，且为一般人所 熟知。 霍乱是通过水和食物传播的严重消化道疾病，经常发生于饮水和卫生条件不 良的发展中国家。根据世界卫生组织年报，在2 0 0 0 至2 0 0 2 年问，全球至少有一万 人死于霍乱，其中9 6 发生于非洲。在2 0 0 3 至2 0 0 4 年间，单是非洲就发生至少一 万五千件霍乱感染的实例。美国疾病控制预防中心所管辖的一个弧菌监测系统， 在2 0 0 0 年问报告了2 9 6 件弧菌感染病例；大多数病原菌株( 2 6 8 株) 是从患者粪便、 伤口和血液中分离得到，其中被鉴定为副溶血弧菌、创伤弧菌和霍乱弧菌的依序 为1 3 7 、6 4 和2 7 株。病人中死于创伤弧菌感染者最多，共有2 2 人。美国疾控中心 的另一份报告指出，大多数感染实例发生于夏季月份，起因于病人食用鱼、虾和 海洋弧菌中五类溶血素基因分布及其生物学活性研究 牡蛎。霍乱弧菌在环境中的作用似乎并不重要，然而一旦经由受污染的食物和饮 水进入人体，附着在人体肠道上皮组织，则会分泌一种称为霍乱毒素( c h o l e r a t o x i n ，c t ) 的内毒素，这种内毒素可引起病人发生严重的水样腹泻，甚至死亡。 副溶血弧菌可产生的t d h ( t h e r m o s t a b l ed i r e c th e m o l y s i n ) 或t r h ( t d h r e l a t e dh e m o l y s i n ) 两类溶血素，引起感染病人罹患胃肠炎，出现下痢、反胃、呕 吐、腹绞痛、头痛和轻度发烧等现象。 创伤弧菌是唯一易于经由外伤感染人体的海洋弧菌，感染伤口会起水泡、红 肿发炎、甚至形成蜂窝组织炎，严重者甚至会引发致死性败血症。荚膜多糖 ( c a p s u l a r p o l y s a e c h a r i d e ，c p s ) 是创伤弧菌的主要毒力因子，与感染者体内出现的 发炎症状有关。 霍氏格里蒙菌( g r i m o n t i ah o l l i s a e ) 、美人鱼发光杆菌美人鱼亚种 ( p h o t o b a c t e r i u md a m s e l a es u b s p d a m s e l a e ) 、溶藻胶弧菌( 矿a l g i n o l y t i c u a ) 、 河弧菌( 1 4 f u r n 捌) 、弗尼斯弧菌( m f u r n i s s i i ) 、哈维氏弧菌( h a r v e y i ) 、 辛辛那提弧菌( 矿c i n c i n a t i e n s i s ) ，拟态弧菌( m i m i c u s ) 等海洋弧菌是不太重 要的人类病原菌，这些菌种感染的病例都属散发性且不太常见。 有些海洋弧菌是水产养殖动物的致病菌，已发现的水产养殖鱼类的病原弧菌 有( 表1 2 ) ：鳗弧菌( 矿a n g u i l l a r u m ) 、哈维氏弧菌、副溶血弧菌、溶藻胶弧 茵、费氏弧菌( 矿f i s c h e r i ) 、河弧菌、创伤弧菌、美人鱼发光杆菌美人鱼亚种、 拟态弧菌、坎贝氏弧菌( 矿c a m p b e l l i i ) 、霍氏格里蒙菌、弗尼斯弧菌、河口弧 菌( 1 4 a e s t u a r i a n u s ) 、飘浮弧菌( 矿n a t r i e g e n s ) 、火神弧菌( 矿l o g e i ) 、辛 辛那提弧菌和解蛋白弧菌( 矿p r o t e o l y t i c u s ) 等。 表1 - 2 已报道的鱼类病原弧菌 t a b l e 】一2f i s hp a t h o g e n so f t h eg e n u sh b r i o 4 海洋弧苗中五类溶血素基因分布及其生物学活性研究 1 3 3 发光性海洋弧菌 已知的海洋发光细菌有费氏弧菌、哈维氏弧菌、火神弧菌、鱼发光杆菌 ( p h o t o b a c t e r i u ml e i o g n a t h i ) 和明亮发光杆菌( p jp h o s p h o r e u m ) 等五种海洋弧 菌，及s h e w a n e l l ah a n e d a i 和s h e w a n e l l aw o o d y i 两种非海洋弧茵。另外，海洋弧菌 中的霍乱弧菌、地中海弧菌、东方弧菌( 矿o r i e n t a l i s ) 、灿烂弧菌( 矿s p l e n d i d u s ) 、 杀鲑弧菌( 矿s a l m o n i c i d a ) 和创伤弧菌等种的少数分离株，也有的被检测出具发 光能力1 1 9 , 2 9 5 4 , 8 0 j 。 海洋发光细菌依其生态位( e c o l o g i c a ln i c h e ) ，可分为浮游、附存f 含附着、寄 生、腐生) 、共生等类型 4 8 , 5 1 , 5 8 , 6 1 】。然而同一种发光细菌可能有多个生态位，亦 即不同生态位并非截然分立，而是互有关联1 2 5 舯舯】。例如，寄生于南极虾等甲壳类 和一些外洋中深层的鱼体表发光细菌，往往于宿主死后迅速生长，继而出现明显 发光现象；这些寄生性发光细菌的发光现象，易于导致宿主被掠食性鱼类捕食， 藉此进入鱼的肠道生长繁衍，成为宿主肠道内共生细菌。 浮游型海洋发光细菌以哈维氏弧菌、费氏弧菌、鱼发光杆菌三种海洋弧菌最 为常见。o m d o r f f 和c o l w e l l 从马尾藻海水深1 6 0 3 2 0k m 海水分离出8 3 株发光细 菌，其中6 0 以上属于哈维氏弧菌，其余几乎都是费氏弧菌或鱼发光杆菌。加州 沿岸表层水所含发光细菌中，哈维氏弧菌和费氏弧菌合占9 9 以上；夏季时哈维 氏弧菌占6 0 到7 0 ，但冬季时此种几乎完全消失，剩下的几乎全部是费氏弧菌 7 1 1 。c a c c a m o 等1 挣1 对意大利西西里东北方第勒尼安海( t y r r h e n i a ns e a ) 沿岸水的 1 5 株发光细菌分离株，进行了表型和分子测试。结果显示，分离株虽可区分为四 类表型或三类基因型，但都属于哈维氏弧菌。除了广泛分布于沿岸水域，哈维氏 海洋弧菌中五类溶血素基因分布及其生物学活性研究 弧菌常出现于海水养殖池，一旦其感染池中鱼虾，往往给养殖场带来严重的亏损； 该菌也能通过海鲜类食品和污染饮水，成为人的病原菌。 费氏弧菌、鱼发光杆菌和明亮发光杆菌三种发光性海洋弧菌，常与海洋中特 定鱼类及头足类形成紧密共生关系。它们密集生存于宿主发光器官内，藉此获得 比较安全而不缺乏营养的环境。宿主则可藉助共生细菌发光，获得惊吓、驱退捕 食者，诱捕饵料生物及呼朋引伴、求偶等效益。三种内共生发光细菌在浮游、体 表附存或肠道内共生状态下也都能生存繁衍，因此一般认为，发光器官与外界有 相通管道，这些菌由此进出发光器官。有证据显示，鱼类和头足类发光器官的内 共生发光细菌，并非得自亲代传承，而是子代于成长过程中从周遭海水中获得的 嗍。明亮发光杆菌可被用作检测水中毒物污染的指示生物1 5 2 咀7 0 ，竭，因为该菌的 发光强度对毒性物质相当敏感；环境中毒物浓度与该菌发光强度呈线性相关，毒 物浓度愈高，该菌的发光强度愈弱【6 ”。 1 3 4 多糖分解性海洋弧菌 沿岸环境富含琼脂、几丁质等复杂多糖类，这些难分解性物质，只能由特定 海洋细菌的水解作用才得能以再生为其它海洋生物可以利用的碳源。琼脂主要来 自红藻，因此琼脂分解菌常见于沿岸环境，在陆上和淡水环境则很少见。海洋弧 菌已知种中，只有食琼脂弧菌( v i b r i oa g a r i v o r a n s ) 具琼脂分解能力1 5 6 j 。有人亦 曾分离出兼具固氮和琼脂水解性的未知种海洋弧菌，其中有些分离株能利用琼脂 作为唯一碳源，进行厌气性固氮生长1 7 4 , 7 s , 7 9 , 8 4 1 。海洋弧菌中到底含有多少个能水 解琼脂的未知种，尚需进一步探讨。 几丁质是由n 一乙酰葡萄糖胺( n a c e t y l g l u - c o s a r a i n e ) 构成的聚合物，此聚合 物是昆虫和甲壳类动物外骨胳及真菌细胞壁的主要成份，因此几丁质分解细菌遍 布海洋和陆地土壤。海洋弧菌可能是海洋生态系中最重要的几丁质分解细菌；以 b e r g e y sm a n u a lo f s y s t e m a t i cb a c t e r i o l o g y 第一版录载的二十种弧菌属细菌为例， 其中只有三种缺乏几丁质水解能力1 1 4 1 。 1 3 5 固氮性海洋弧菌 氮是海洋初级生产者的主要限制因子之一，因为海洋普遍缺乏可为浮游植物 和大型海藻等初级生产者摄取利用的无机化合物态氮源，包括硝酸盐和氨盐。海 洋固氮生物包括自养性和异养性细菌，能将空气中氮分子还原转化成氨态氮，故 海洋弧菌中五类溶帆素摹囡分布及其生物学活件研究 而可能是海洋环境中无机化合态氮源的重要提供者。已知具固氮能力的海洋弧菌 只有双氮养弧菌和飘浮弧菌两种：前者除了分布于海水，也常见于海胆消化道。 另外的研究显示，至少还有其它三、四种尚未被命名的固氮性海洋弧菌，广泛分 布于河口、沿岸水域和沉积物，一些海洋无脊椎动物的体表或体内，以及海草根 部周围。研究显示，固氮性海洋弧菌可能是海洋生态系中数目最多、分布最广的 异养性固氮生物1 7 4 j 5 ，7 9 】。 1 3 6 病原弧菌的致病因子镕血素 已有的