（植物学专业论文）拟南芥deg蛋白酶的胁迫响应分子机理研究.pdf

兰州大学硕士学位论文 缩写词( a b b r e v i a t i o nw o r d s ) 8 兰州大学硕士学位论文 原创性声明 本人郑重声明：本人所呈交的学位论文，是在导师的指导下独 立进行研究所取得的成果。学位论文中凡引用他人已经发表或未发 表的成果、数据、观点等，均己明确注明出处。除文中已经注明引 用的内容外，不包含任何其他个入或集体已经发表或撰写过的科研 成果。对本文的研究成果做出重要贡献的个人和集体，均已在文中 以明确方式标明。本声明的法律责任由本人承担。 论文作者签名：盏丛 日期：! ! 量! 苎：兰里 兰州大学硕士学位论文 关于学位论文使用授权的声明 本人在导师指导下所完成的论文及相关的职务作品，知识产权归属兰州大 学。本人完全了解兰州大学有关保存、使用学位论文的规定，同意学校保存或 向国家有关部门或机构送交论文的纸质版和电子版，允许论文被查阅和借阅； 本人授权兰州大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检 索，可以采用任何复制手段保存和汇编本学位论文。本人离校后发表、使用学 位论文或与该论文直接相关的学术论文或成果时，第一署名单位仍然为兰州大 学。 保密论文在解密后应遵守此规定。 论文作者签名：蕴施企导师签名： 3 兰州大学硕士学位论文 摘要 植物应对于复杂多变的自然环境形成了一系列复杂而精密的自我调节系统。 蛋白酶广泛地参与到了叶绿体的发生和维持过程中，在维护植物正常生长和逆 境生长过程中起着非常重要的作用。 对环境胁迫非常敏感是p s i i 的一个明确的特征，受环境胁迫破坏的主要目标 是反应中心的d 1 蛋白质。破坏的蛋白质被降解随后由新合成的蛋白质来替换。 引起蛋白降解的因素很多，包括环境的改变，多亚基复合体的不平衡，遗传的 突变，还有其共同作用因素的限制。 拟南芥叶绿体中的蛋白酶d e g 5 和d e g 8 协同作用参与p s i i 反应中，l , d i 蛋白 在c d l o o p 上的初级剪切，从而维持热胁迫条件下p s i i 的有效周转。为了研究拟 南芥叶绿体中d e g 5 和d e g 8 在其它环境胁迫条件下是否参与这些胁迫环境中d 1 蛋白的降解，我们用从s a l k 拟南芥突变体库中筛选到的t - d n a 插入突变体d e 9 5 和d e 9 8 以及它们的双突变体d e 9 5 d e 9 8 为材料，研究了它们对低温、干旱、盐、 渗透、氧化等一系列胁迫的响应，分析叶绿体中d e g 5 和d e g 8 以及p s i i 反应中心 d 1 蛋白的变化以及最大光化学效率f v 停m 的变化，进一步研究d e g 5 和d e g 8 在 拟南芥叶绿体p s i i 响应环境胁迫中的作用。 结果表明，在低温、干旱、盐、渗透、氧化等胁迫处理过程中，p s i i 的最大 光化学效率出现不同程度的降低。野生型较突变体稳定，单突变体较双突变体 稳定。野生型的d 1 蛋白含量在胁迫处理过程中的减少明显快于d e g 5 和d e g 8 缺 失的突变体。d e g 5 和d e g 8 蛋白酶在这些胁迫条件下参与破坏了的d 1 蛋白的降 解。 关键词拟南芥，p s i i ，d 1 蛋白，胁迫，d e g 蛋白酶 兰州大学硕士学位论文 a b s t r a c t p l a n t sf o r m e das e r i e so fc o m p l e xa n dr i g i ds e l fr e g u l a t i o ns y s t e mt oa n s w e rt h e c h a n g eo fe n v i r o n m e n tc o n d i t i o n s p r o t e o l y s i si si n v o l v e d i naw i d er a n g eo f p r o c e s s e sd u r i n gt h eb i o g e n e s i sa n dm a i n t e n a n c eo fc h l o r o p l a s t s i ti s av i t a l h o m e o s t a t i cf a c t o rt h a ti n f l u e n c e sm e t a b o l i cf u n c t i o n su n d e rb o t ho p t i m a la n d a d v e r s eg r o w t hc o n d i t i o n s p s i ii sv e r ys e n s i t i v et oe n v i r o n m e n t t h ep s i ir e a c t i o nc e n t e rd1p r o t e i nb e i n g t h em a i nt a r g e tf o re n v i r o n m e n ts t r e s si n d u c e dd a m a g ea m o n gp s i i p r o t e i n s d a m a g e dd 1 p r o t e i n s a r e d e g r a d e d a n ds u b s e q u e n t l y r e p l a c e d w i t h n e w l y s y n t h e s i z e dc o p i e s m a n yf a c t o r st r i g g e rt h ed e g r a d a t i o no fc h l o r o p l a s tp r o t e i n s ， i n c l u d i n gc h a n g e si ne n v i r o n m e n t a lc o n d i t i o n s ，i m b a l a n c e si nt h es t o i c h i o m e t r yo f m u l t i s u b u n i tc o m p l e x e s ，g e n e t i cm u t a t i o n s ，a n dl i m i t a t i o n si nt h ea v a i l a b i l i t yo f c o f a c t o r s i na r a b i d o p s i st h a l i a n a ，d e g 5a n dd e g 8h a v eas y n e r g i s t i cf u n c t i o ni nt h ep r i m a r y c l e a v a g eo ft h ec dl o o po f t h ep s i ir e a c t i o nc e n t e rp r o t e i nd1 ，t h u s ，t h e yr e m a i nt h e e f f i c i e n tt u r n o v e ro fp s i i i nt h ei n t e r e s to fs t u d yt h ei nv i v of u n c t i o no fd e g 5 ， d e g 8a n dd1i na r a b i d o p s i st h a l i a n ai no t h e ra d v e r s eg r o w t hc o n d i t i o n s ，w eo b t a i n e d a r a b i d o p s i sl i n e sf r o mt h es a l kc o l l e c t i o n si nw h i c ht - d n aw a si n s e r t e di n t o d e 9 5a n dd e 9 8 ，a n dw eg o tt h ed e 9 5 d e 9 8d o u b l em u t a n t b o t hw i l dt y p e ( c 0 1 ) a n d m u t a n t sw e r et r e a t e di nt oa n a l y z et h ec h a n g eo fd 1 p r o t e i na n dc h l o r o p h y l la f l u o r e s c e n c e ，s t u d yt h ef u n c t i o no fd e g 5a n dd e g 8i nt h e s ee n v i r o n m e n ts t r e s s e s o u rr e s u l ti n d i c a t e dt h a tw h e nt r e a t e dw i t hc o l ds t r e s s ，d r o u g h ts t r e s s ，s a l ts t r e s s ， o x i d a t es t r e s sa n do s m o t i cs t r e s s ，t h ef v f mr e d u c e db o t hi nw i l dt y p ea n dt h em u t a n t l a c ko fd e g 5a n dd e g 8p r o t e a s e ，a n di nw i l dt y p ea r es l o w e rt h a ns i n g l ed e g 5o r d e g 8m u t a n t ，i ns i n g l ed e gm u t a n ta r es l o w e rt h a nd o u b l em u t a n td e 9 5 d e 9 8 t h e d 1p r o t e i ni nw i l dt y p er e d u c e df a s t e rt h a nt h a ti nm u t a n tl a c ko fd e g 5a n dd e g 8 d e g 5a n dd e g 8p r o t e a s ea l s op a r t i c i p a t ei nr e d u c i n gd1p r o t e i ni nt h e s ea d v e r s e g r o w t hc o n d i t i o n s k e yw o r d s ：a r a b i d o p s i st h a l i a n a , p s i i ，dip r o t e i n ，e n v i r o n m e n ts t r e s s ，d e gp r o t e a s e 7 兰州大学硕士学位论文 第一章研究背景 光合作用是地球上唯一大规模将太阳能转化为化学能，同时利用c 0 2 和h 2 0 合成富能的有机化合物，并释放氧气的过程。光合作用不仅仅是农作物产量的 物质基础，也是其他生物能量和氧气的主要来源。在人们的日常生活中，光合 作用还关系到人类共同面临的粮食、能源、资源、环境等等重大问题。因此， 光合作用被称为地球上最重要的化学反应。 随着模式植物拟南芥的基因组测序完成，光合作用的机理研究进入了一个 崭新的时代。大量的蛋白质组、结构基因组信息也为研究光合作用过程及其调 控机理提供了新的机遇( l e i s t e r ，2 0 0 3 ) 。采用分子生物学和遗传学的技术和手 段，结合已有的基因组信息，使得在基因组水平进行光和基因功能的全面分析 成为可能。光系统相关的突变体是光和功能基因研究中的重要材料。采用t d n a 插入或r n a i 导致特定基因k n o c k - o u t 或者k n o c k d o w n 的突变体库，高荧 光筛选光合相关的突变体。通过正向遗传学研究可以找到产生突变形状的基因。 借助已有分子生物学技术，从转录、翻译、翻译后组装等不同水平上进行基因 功能刻画，采用生化手段进一步研究这些蛋白质有助于揭示突变体的生理生化 及遗传机制，从而为光合类囊体膜复合物调控和基因表达分子机理研究提供依 据。 植物的生长总是处于复杂多变的自然环境中，应对于外界条件的变化，高 等植物形成了一系列复杂而精密的自我调节系统。已有的实验发现拟南芥叶绿 体中的d e g 蛋白酶d e g 5 和d e g 8 在热胁迫下的p s i i 的修复循环中，对于d 1 蛋白的有效周转及保护保护免受热胁迫的破坏中是非常重要的。 1 叶绿体结构 叶绿体是真核光合生物特有的细胞器，是真核生物进行光合作用的唯一场 所。叶绿体是由叶绿体被膜、基质和类囊体三部分组成( 图1 1 ) 叶绿体被膜( c h l o r o p l a s te n v e l o p e ) 叶绿体被膜由两层单位膜组成，两膜间 距5 l o n m 。被膜上无叶绿素，它的主要功能是控制物质的进出，维持光合作 用的微环境。外膜( o u t e rm e m b m n e ) 为非选择性膜，分子量小于1 0 0 0 0 的物质如 9 兰州i 大学硕上学位论文 蔗糖、核酸、无机盐等能自由通过。内膜( i n n e rm e m b r a n e ) 为选择透性膜，c 0 2 、 0 2 、h 2 0 可自f ： ；i 通过；p i 、磷酸丙糖、双羧酸、甘氨酸等需经膜上的运转器 ( t r a n s l o c a t o r ) 才能通过；蔗糖、c 5 、c 7 糖的二磷酸酯、n a d p + 、p p i 等物质则不 能通过。 土 雌绿传 韶篷氍撂。麓f 鬈 的星c ：= 【”霉胡。 嘤 二渔霉舞 f “善茹若器曩 。鹈瑟蕊君蒜蓐蕊f = i 。穗。 。一 。麓蚴巷誊削黼删t 罄扩强镩崔 ，。、 娉黢 墓乒 篓粒类囊件 茎差羹薹雹f b lr日1，亡j疆i 图1 - 1 叶绿体的结构示意图 a 叶绿体的结构模式；b 类囊体片层堆叠模式 基质及内含物被膜以内的基础物质称为基质( s t r o m a ) ，基质以水为主体，内 含多种离子、低分子的有机物，以及多种可溶性蛋白质等。基质是进行碳同化 的场所，它含有还原c 0 2 与合成淀粉的全部酶系，其中1 ，5 二磷酸核酮糖羧化 酶i d n 氧酶( r i b u l o s e l ，5 b i s p h o s p h a t ec a r b o x y l a s e o x y g e n a s e ，r u b i s c o ) 占基质总蛋白 的一半以上。此外，基质中含有氨基酸、蛋白质、d n a 、r n a 、脂类( 糖脂、磷 脂、硫脂) 、四吡咯( 叶绿素类、细胞色素类) 和萜类( 类胡萝卜素、叶醇) 等物质及 其合成和降解的酶类，还含有还原亚硝酸盐和硫酸盐的酶类以及参与这些反应 的底物与产物，因而在基质中能进行多种多样复杂的生化反应。 基质巾有淀粉粒( s t a r c hg r a i n ) 与质体小球( p l a s t o g l o b u l u s ) ，它们分别是淀粉和 脂类的贮藏库。将照光的叶片研磨成匀浆离心，沉淀在离心管底部的白色颗粒 就是叶绿体中的淀粉粒。质体小球又称脂质球或亲锇颗粒，在叶片衰老时叶绿 体中的膜系统会解体，此时叶绿体中的质体小球也随之增多增大。 类囊体( t h y l a k o i d ) 类囊体是由单层膜围起的扁平小囊，膜厚度5 7 n m ，囊 1 0 兰州大学硕一i ：学位论文 腔( 1 u m e n ) 空间为1 0 r i m 左右，片层伸展的方向为叶绿体的长轴方向。类囊体分 为二类：一类是基质类囊体( s t r o m at h y l a k o i d ) ，又称基质片层( s t r o m al a m e l l a ) ，伸 展存基质中彼此不重叠；另一类是基粒类囊体( g r a n at h l y l a k o i d ) ，或称基粒片层 ( g r a n al a m e l l a ) ，可自身或与基质类囊体重叠( g r a n u m ) 。片层与片层互相接触的部 分称为堆叠区( a p p e s s e dr e g i o n ) ，其他部位则为非堆叠 又( n o n a p p r e s s e dr e g i o n ) 。 1 1 类囊体膜上的蛋白复合体 熟 盯p e m t h a s e j 。 一 i 7一 。：0i l 。+ 400一 一： _ ，t ，f 图1 - 2 类囊体超分予蛋白复合体在膜上的分布示意图( l e i s t e r ，2 0 0 3 ) 光合作用过程中光能的吸收和转换在叶绿体类囊体膜系统中进行，它是光和 过程中基本的光合膜系统，包含有捕获光能并将光能转化为化学能所必需的四 类跨膜蛋白复合体，即p s i i ，p s i ，c y t b 矿和a t p 合酶( l e i s t e r ，2 0 0 3 ) 。图1 2 显示了定位于类囊体膜上的这四类跨膜复合物的有序分布。首先p s i i 利用吸收 的光能裂解( 氧化) 水产生氧气和h + ，从水中提取电子，电子通过醌库和c y t b 6 f 复合物被传递至p c ( 质体蓝素，一个小的可溶性铜蛋白) 。而p s i 吸收的光能 则诱导电子从膜内侧( 囊腔侧，l u m e n ) 的p c 传递到相对一侧( 基质侧，s t r o m a ) 的铁氧还蛋白。在电子传递过程中，形成产生于光能转换的高能化合物。 高等植物的两个光系统有各自的反应中心。p si 和p si i 反应中心中的原初 电子供体很相似，都是由两个叶绿素a 分子组成的二聚体，分别用p 7 0 0 、p 6 8 0 来表示。这里p 代表色素( p i g m e n t ) ，7 0 0 、6 8 0 则代表p 氧化时其吸收光谱中变 化最大的波长位置是近7 0 0 n m 或6 8 0 n m 处，也即用氧化态吸收光谱与还原态吸 收光谱间的差值最大处的波长来作为反应中心色素的标志。 1 2p s i i 的结构与功能 兰州大学硕士学位论文 光系统i i ( p s i i ) 位于高等植物，藻类和蓝细菌的类囊体膜上，催化依赖于 光的水的氧化和质体醌的还原。类囊体复合物p s i i 是光合电子传递链中的第一 个跨膜蛋白复合物，它催化水的氧化，同时释放氧气，这是光和过程中重要的 热动力学反应。( i a w a t a ，2 0 0 4 ) 。 p s i i 具有2 0 多种蛋白质和5 0 多个辅助因子，由核基因和叶绿体基因共同 编码。它包括反应中心色素蛋白复合体( p s i i r c ) ，外周捕光( 天线) 色素复 合体( l h c i i ) ，内周捕光( 天线) 色素蛋白复合体( c p 4 3 和c p 4 7 等) ，和锰簇 合物以及3 3 k d a ，2 4 k d a 等外周蛋白( s h i a ，2 0 0 4 ) 。其中，由叶绿体编码的 d i 、d 2 蛋白、细胞色素蛋白b 5 5 9 、以及p s b i 蛋白共同构成了p s i i 的反应中心， 负责光合作用过程中原初电荷分离重组等功能。d 1 和d 2 是一对氨基酸序列高 度保守的疏水性蛋白，分别有5 个跨膜区，在类囊体膜上形成n 端在基质、c 端在囊腔的二聚体跨膜蛋白。该二聚体与其他氧化还原组分如p 6 8 0 ，脱镁叶绿 素a ，非血红素铁以及醌等共同构成原初光化学反应的最小单位。p s i i 外周捕光 色素复合物吸收光能传递到反应中心引起远处电荷的分离，产生氧化的原初电 子供体p 6 8 0 + 和还原的原初电子受体脱镁叶绿素( p h e o ) ( a n d e r s s o na n d s t y r i n g ，19 9 1 ) ，生成还原型质体醌q b h 2 并启动相应的电子传递。p s i i 内周捕光 天线色素蛋白复合体( c p 4 3 和c p 4 7 等) 中核心天线c p 4 3 和c p 4 7 则分别由叶 绿体p s b b 和p s b c 基因编码，与叶绿素a 结合形成4 3 k d a 和4 7 k d a 的色素蛋 白复合物( b r i c k e r ，1 9 9 0 ) ，二者均为p s i i 中结合紧密、含有叶绿素的反复折叠 的跨膜6 次的跨膜蛋白质，均含5 个亲水环区。它们围绕p 6 8 0 ，比l h c i i 更快 的把吸收的光能传至p s i i 反应中心，所以被称为中心天线或“近侧天线”。除以 上三大组分外，p s i i 结构中还存在另外一个重要的功能组分，即放氧复合物。 它位于p s i i 囊腔侧，至少有3 种外周蛋白( p s b o ，p s b p 和p s b q ) 形成放氧复 合物，与p s i i 的锰簇结合在一起，对氧气的释放有重要的作用( a n d e r s s o na n d a k e r l u n d ，1 9 8 7 ) 。 p s i i 是一个多亚基的复合物。如图1 - 3 所示，复合物的核心是反应中心( r c ) ， 由d 1 和d 2 蛋白组成。这两个相互联系的反应中心亚基结合所有的辅助因子引 发原初和次级电子传递。原初的电子供体是p 6 8 0 ，原初的电子受体是褐藻素 ( p h e ) ，p 6 8 0 + p h e 。状态是原初电子对。接受电子的p h e 随着电子流将电子传递 兰州大学硕士学位论文 给质体醌分子q a ，这个辅助因子和d 2 蛋白紧密结合，它的功能只是携带电子 没有经历正常的质子化。与d 1 蛋白紧密结合的质体醌q b 能接受两个电子和两 个质子。当q b 被完全还原后可以从d 1 蛋白的结合位点上释放出来进入膜的磷 脂相中。p s i i 的氧化侧是由四个锰原子形成的锰簇。锰簇位于p s i i 的腔侧表面 与d 1 和d 2 蛋白紧密接触。这个催化中一t l , 的精确定位和组织模式还没有被精确 l ， p s i i 图1 3p s i i 主要蛋白亚基以及电子传递 的了解。根据x 射线和共振技术证明，簇由两个双氧桥双核m n 单元通过氧桥 和- x , t 提供羟基桥的氨基酸相连接( b r i t te ta 1 1 9 9 6 ) 。这个结构模型为假设水氧 化的反应机制提供了基础。位于m n 簇和p 6 8 0 之间的次级电子供体是y z ( d 1 一t y r l 6 1 ) ，电子通过y z 由m n 簇传递给p 6 8 0 。d 2 蛋白上有一个与y z 对应的 酪氨酸y d ( d 2 一t y r l 6 0 ) ，y d 和y z 对称的分布于p s i i 原初电子供体的两侧。 两个色素结合蛋白c p 4 3 和c p 4 7 与d l 和d 2 紧密结合。它们的功能之一是作为 一个内周捕光天线系统，在腔侧表面它们有一个大的亲水l o o p s ( b r i c k e re ta 1 1 9 9 0 ) 。这些l o o p s 含有大约1 5 0 ( c p 4 3 ) 和2 0 0 ( c p 4 7 ) 个氨基酸，表观的多 肽分子量大约分别为1 6 k d a 和2 2 k d a 。这样的结构使我们相信这些l o o p s 中的 一个或者两个含有整合m n 簇的结构。比如，分离的缺少c p 4 3 和c p 4 7 的p s i i 复合物将不能放氧。除此之外，在所有类型的放氧生物中都含有一个亲水的 3 3 k d a 蛋白，它可能不直接与锰结合而是作用于锰簇的稳定性，因为在兰细菌 中编码这个组分的p s b o 基因被删除并没有阻止水的氧化过程( m a y e se ta 1 1 9 9 1 ： p h i l b r i c ke ta 1 1 9 9 1 ) 。这也可能是3 3 k d a 蛋白，以及p s i i 的其它外周蛋白，它 】3 兰州大学硕士学位论文 们通过对c p 4 3 和c p 4 7 的外在l o o p s 的构型的影响而非直接与m n 簇相互作用 来稳定锰簇。目前有2 5 个编码p s i i 核心蛋白的基因被鉴定出，在高等植物和藻 类中，这些基因的大多数是位于叶绿体的基因组，另外一些由核基因编码。还 有一些是编码一系列叶绿素a b 的结合蛋白的c a b 基因，p s b 蛋白组成p s i i 的核 心，与由l h c b 蛋白组成的外在天线系统紧密联系。几乎在所有的自养生物中， 除了一些在亚基含量上的微小差异以外，p s i i 的核心的基本结构是保守的。p s i i 核心的二聚体形式是最稳定的状态，它的分子量大约4 5 0 k d a ( h a n k a m e re t a 1 1 9 9 6 ) 。 p s i i 担负着吸收光能并利用光能来裂解水分子( h 2 0 ) ，产生质子和释放氧 气( 0 2 ) 的重要任务。由于p s i i 不仅是光合作用电子传递的起始步骤，并且也 是非常容易受到强光，高温，冷害，盐胁迫等环境胁迫因子破坏的复合物，所 以对其的结构功能以及环境适应性的研究倍受关注。 2 非生物胁迫对植物光合作用的影响 2 1 干旱胁迫 干旱胁迫对植物光合作用的影响比较复杂，它不仅会使光合速率降低，而 且还会抑制光合作用光反应中原初光能转换、电子传递、光合磷酸化和光合作 用暗反应过程，最终导致光合作用下降，从而直接影响植物的生长发育。有些 荒漠植物就是通过减少叶面积、降低蒸腾来抵御干旱、高温的环境。在干旱胁 迫下，气孔关闭，阻止了c 0 2 吸入，导致光合下降。同时，由于得不到外界c 0 2 ， 光能转化成的活跃化学能不能用于c 0 2 的固定，就会发生光抑制，造成叶绿体 超微结构持续的损害或不可逆的破坏。 用含等量叶绿素的叶绿体做实验时，发现来自受干旱胁迫植株的叶绿体， 它们对光能的吸收能力明显低于对照( 不受干旱危害同种植物的植株) 的叶绿体。 植物光合作用是以光能为原动力叶绿体对光能吸收能力降低，就难于保证为 它们光合作用提供足够所需的能量，能量不足，必然会限制光合作用的正常进 行，使叶肉细胞光合能力下降。 研究发现，受干旱胁迫的植物，其叶绿体中负责捕获和吸收光能的光系统 i i 捕光色素蛋白复合体( l h c i i ) 和内周天线色素蛋白复合体，及光系统i 的捕 光色素蛋白复合体( l h c i ) 的含量明显降低，而且随着干旱胁迫的加剧，这些成 】4 兰州大学硕士学位论文 分随之进一步减少，有的甚至完全被破坏，这些色素蛋白复合体是分布在叶绿 体类囊体膜上其含量的减少，必然使类囊体膜截获光能的面积变小，限制了 它们对光能的充分捕获和吸收，导致叶绿体对光能吸收能力的下降。l h ci i 不 仅在捕获光能时有重要作用，而且它还是叶绿体中类囊体膜垛叠的主导因素， 在干旱胁迫下，l h c i i 含量减少，会干扰植物执行正常光合功能时所必需的类 囊体膜的正常垛叠，。使类囊膜的结构发生紊乱。此外，l h c i i 通过在光系统i i 和光系统i 之间的迁移，调节着这两个光系统之间激发能的分配。由于l h c i i 含量的减少还会降低这两个光系统间激发能分配的调节能力，使两个光系统 间的激发能难于迅速达到平衡分配。而这种平衡分配又是植物实现并维持高的 光合速率所必需的内部微环境。在干旱胁迫下，不仅使捕获光能的色素蛋白复 合体的量减少，而且它们向负责进行光反应、从事把光能转化为化学能的反应 中心叶绿素蛋白复合体传递能量也受阻，同时后面这种复合体也受到损伤，不 能高效地把获得的光能转化为生物化学能，结果不能为光合碳同化提供足够的 能量。叶绿体对光能的吸收、两个光系统间激发能分配的调节能力以及反应中 心的转能效率的降低，能量传递受阻和叶绿体结构遭受损害，这一切都必然会 降低叶肉细胞的光合能力。 轻度干旱胁迫对光合电子传递速率的影响较小，而在严重干旱胁迫下，光 合电子传递活性受到明显抑制。使光系统i i 、光系统i 和全链电子传递速率明显 降低。光合磷酸化总是与光合电子传递相偶联的，由于光合电子传递速率降低， 光合磷酸化所形成的高能化合物a 1 p ( 三磷酸腺苷) 也随之减少。此外，非环 式光合电子传递是以n a d p ( 辅酶i i ) 为电子受体，当它接受来自非环式光合电子 传递链的电子时，便还原成n a d p h ( 还原型辅酶i i ) ，由于在干旱胁迫下电子传 递速率降低，便导致形成n a d p h 的量减少。此外，与形成a t p 有关的叶绿体 偶联因子，其活性和结构或蛋白质构象在干旱胁迫下也发生变化，使它与磷酸 化的底物a d p ( - - - - - 磷酸腺苷) 的亲和力降低，也导致叶绿体中a t p 合成量减少。 干旱胁迫还改变了类囊体膜的透性，造成膜内外质子梯度交小，从而部分丧失 推动a t p 形成的推动力使叶片a t p 的合成量进一步减少。通过实际测定，确 实证明在干旱条件下，叶片中的a t p 含量低于对照的叶片。a t p 和n a d p h 是 光合作用过程对c 0 2 固定和还原所必不可少的能量和还原能力，它们含量的减 兰州大学硕士学位论文 少，最终会导致叶肉细胞光合能力降低，使光合速率下降。 在干旱胁迫下与光合碳还原过程有关的其它一些酶，如蔗糖磷酸合成酶， 果糖1 ，6 二磷酸脂酶，在c 4 途径中起重要作用的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶， n a d p 苹果酸酶和n a d p 苹果酸脱氢酶，碳酸酐酶以及与5 磷酸核酮糖激酶等 的活性都受到不同程度的抑制。这有力地说明干旱胁迫也直接影响到光合作用 的暗反应过程。由于碳同化的有关酶活性受到抑制，它们所催化的反应过程， 其反应速度变慢，结果限制了光合作用对c 0 2 的固定和还原成有机物。可见干 旱胁迫对植物光合作用的光反应和暗反应两种过程都有不利的影响，便限制了 有机物质的积累，必然影响到植物生产力和作物产量的提高。 2 2 盐胁迫 盐胁迫是限制植物生长和产量的重要环境因子( b o y e re ta 1 1 9 8 2 ) 。盐处理 限制植物光合作用有多条途径：离子胁迫( 过量的n a + 、c i ；亏缺k + 、c a 2 十) 、 渗透胁迫、水势降低造成的气孔与非气孔效应、糖分积累造成反馈抑制等。高 浓度盐会引起植物水分平衡的紊乱、降低膨压、限制生长，也引起气孔关闭、 降低c 0 2 的固定率、降低光能吸收与转化( p o i j a k o f f - m a y b e r ，1 9 8 2 ) 。盐胁迫也 影响了光合电子传递和碳同化作用( 朱新广和张其德，1 9 9 9 ) 。盐胁迫下拟南芥 p s i i 的光能转化明显受到抑制，光化学反应效率以及电子传递速率降低。盐( 尤 其是高浓度2 0 0m m o l ln a c i ) 胁迫会对拟南芥光合作用产生许多不利影响。表现 为高浓度n a c i 可降低叶绿体对光能的吸收能力和叶绿体的光化学活性，并使电 子传递速率、光能转化效率和q p 值等大幅度下降，从而使光能转化为化学能的 过程受阻，导致光合放氧和碳同化能力进一步下降。在自然环境中，盐胁迫的 发生经常伴随着强光胁迫，在强光条件下盐胁迫对p s i i 的影响已有数个研究。 如对莱茵衣藻( c h l a m y d o m o n a sr e i n h a r d t i i ) ( n e a l ee ta 1 1 9 8 9 ) 、大麦( h o r d e u m v u l g a r e ) ( s h a r m ae ta 1 1 9 9 1 ) 、高梁( s o r g h u mb i c o l o r ) ( s h a r m ae ta 1 1 9 9 1 ) 、 黑麦( s e c a l ec e r e a l e ) ( h e r t w i ge ta 1 1 9 9 2 ) 和蓝细菌( c y a n o b a c t e r i u ms p i r u l i n a p l a t e n s i s ) ( l ue ta 1 1 9 9 9 ) 的研究表明盐胁迫可以促进p s i i 的光破坏。然而，在 所参考的报道中还不清楚盐胁迫是加速对p s i i 的光破坏还是抑制了p s i i 的修 复。分别检测了盐胁迫对蓝藻的光破坏和修复的影响( a l l a k h v e r d i e ve ta 1 2 0 0 4 ； a l l a k h v e r d i e ve ta 1 2 0 0 2 ；a l l a k h v e r d i e ve l ；a 1 1 9 9 9 ) ，结果表明盐胁迫，0 5mn a c i ， 1 6 兰州大学硕士学位论文 抑制了光破坏的p s i i 的修复而非直接加速了对p s i i 的光破坏：蓝藻细胞的蛋白 标记结果表明d 1 蛋白的从头合成被盐胁迫抑制了( a l l a k h v e r d i e ve ta 1 2 0 0 4e ta 1 a u a k h v e r d i e ve ta i 2 0 0 2 ) 。另外，盐胁迫不仅抑制了d 1 蛋白的合成而且也抑制 了其它所有蛋白的合成。n o r t h e r n 和免疫印迹分析表明0 5m 的盐胁迫抑制了 d 1 蛋白翻译的水平( a l l a k h v e r d i e ve ta 1 2 0 0 2 ) 。尽管盐胁迫抑制蛋白合成看上 去是清楚的，但这种抑制的分子机理仍待确定。如下几种可能的机制看上去是 合理的：( 1 ) 根据体外试验发现第1 个可能的机制是高浓度的n a c l 使翻译的机 构失活( b r a d ye ta 1 1 9 8 4 ；g i b s o ne ta 1 1 9 8 4 ) ，因此随着n a c i 流进细胞，增加 细胞间的n a c i 浓度，可能直接抑制蛋白质的合成( t e s t e re ta 1 2 0 0 3 ) 。( 2 ) 根 据对t a m a r i x 等的研究发现，另一个可能机制是高浓度n a c i 可能使r u b i s e o 失 活( s o l o m o ne ta 1 1 9 9 4 ) 。因此，提出一个机制：初级的盐胁迫目标是r u b i s c o ， 盐胁迫诱导的c 0 2 的固定的抑制诱导了r o s 的产生，接着抑制蛋白的合成看上 去是合理的。然而，( 3 ) 胞间n a c i 浓度的增加使a t p 合成酶失活，减少了胞间 的对蛋白合成非常关键的a t p 浓度也是可能的( a l l a k h v e r d i e ve ta 1 2 0 0 5 ) 。 2 3 光胁迫 在植物中，光作为环境信号来调控植物的生理和发育过程并且为无机碳的 转化提供能量。光强从弱到强的过程导致许多分子的降解，例如叶绿素a b 结合 蛋白。相反的变化也会导致降解，例如早期的光诱导蛋白( e l i p s ) ( l i n d a h le ta 1 1 9 9 7 ) 。当光合自养生物吸收的光能超过光合作用所需时，多余的光能就会对细 胞造成损害。p s i i 的一个明显的特征是对各种各样的环境胁迫非常敏感。对p s i i 造成破坏的最主要的环境因素是强光。当光合机构接受的光能超过所需能量时， 强光会引起光合活性的降低，产生光抑制。光抑制的最显著特征是p s i i 的光化 学效率降低和光合碳同化的量子效率降低。光抑制的一个明显结果是导致p s i i 的结构和功能的破坏。在p s i i 的蛋白质中受光诱导破坏的主要目标是反应中心 的d l 蛋白质。光合作用反应中心蛋白d 1 尤其敏感( a r oe ta 1 1 9 9 3 ，a n d e r s s o na n d a r o2 0 0 1 ) 。3 2 k d a 的d 1 蛋白与d 2 蛋白一起结合p s i i 所有氧化还原组分( p s i i ； s e eh a n k a m e re ta 1 1 9 9 7 ) 光破坏的p s i i 功能的迅速修复需要一个完整有序的修 复系统。修复过程包括对破坏了的d l 蛋白的降解和叶绿体核糖体对新的d l 蛋 白的从头合成，加工，与叶绿素和其他中心伴侣的结合以及与p s i i 其他蛋白组 兰州大学硕士学位论文 成异源二聚体( a n d e r s s o na n da r o2 0 0 1 ，v a nw i j k2 0 0 1 ，a n dr e f e r e n c e st h e r e i n ) 。破 坏的蛋白质被降解随后由新合成的蛋白质来替换。这个有效的修复机制对维持 p s i i 处于功能状态是非常重要的。至少两个不同的位点表现出对光诱导的电子 传递反应所造成的损害是敏感的。一个位于供体侧，另一个位于受体侧。受体 侧的光抑制被认为是首先由原初受体的过度还原( q a 到q a h 2 ) 诱导，随后 q a h 2 从p s i i 释放。供体侧的光抑制是当放氧复合物失活后，造成从y z 到p 6 8 0 的电子传递的光失活。不论是供体侧或者是受体侧的光抑制都可能引发p s i i 的 蛋白质，尤其是d l 蛋白质的破坏和随后的降解。根据不同的研究者在实验样品 中检测到的2 3 k d 的n 端片段和1 0 k d 的c 端片段，认为在受体侧的光抑制， d l 的初级剪切发生在基质侧的d 和e 跨膜环。在供体侧的光抑制业已报道发现 剪切发生在腔侧的a b 或c d 跨摸环。在腔侧的a b 环的剪切产生1 0 k d 的n 端 片段和2 4 k d 的c 端片段。然而在c d 环的剪切产生1 6 l ( d 的n 端片段和1 8 l ( d 的c 端片段。 2 4 低温胁迫 低温胁迫后蛋白质合成小于降解，叶绿体分解加速，叶绿素含量下降，加之 酶活性又受到影响，因而光合速率明显降低。植株受冷害后，水解大于合成， 不仅蛋白质分解加剧，游离氨基酸的数量和种类增多，而且多种生物大分子都 减少。低温可使叶绿体的光化学反应活性和暗反应活性均受抑制从而导致c 0 2 同化降低，且光反应活性较暗反应活性似乎对低温伤害更敏感。用荧光分析得 出的结果表明，低温使类囊体膜上的光系统i i ( p s i i ) 的光能传递效率和光能转换 效率均降低。低温胁迫也明显影响到植物的生长和产量( 0 q u i s te ta 1 2 0 0 3 ) 。在 强光条件下低温胁迫明显的促进p s i i 的光抑制( 0 q u i s te ta 1 1 9 9 1 ；o q u i s te ta 1 1 9 9 3 ) 。在蓝细菌( a l l a k h v e r d i e ve ta 1 2 0 0 4 ) 和高等植物( m o o ne ta 1 1 9 9 5 ) 中 我们分别检测了低温胁迫对光破坏和修复的影响。我们的结果表明低温胁迫抑 制了p s i i 的修复但并没有影响对p s i i 的光破坏。蓝藻细胞的蛋白标记表明在低 温条件下d 1 的重新合成被抑制了。抑制的程度与温度相关，并且看上去好像低 温胁迫抑制了各种蛋白的重新合成( a l l a k h v e r d i e ve ta 1 2 0 0 4 ) 。低温对d l 蛋白 合成的抑制的步骤还有待研究。低温胁迫也会抑制d l 蛋白由前体加工成成熟的 d 1 蛋白的处理过程( k a n e r v oe ta 1 1 9 9 7 ) 这步对组装成有活性的p s i i 复合物 1 8 兰州大学硕士学位论文 是必要的。低温对蛋白的合成和加工的影响是直接或间接通过产生r o s 和或者 减少胞间的a t p 的水平还仍待确定。 2 5 热胁迫 热胁迫也是造成p s i i 产生光抑制的一个重要因素，因为在自然条件下，强 光照射的同时往往会增加光合作用器官的温度，所以强光总是会伴随着高温。 强的热胁迫可以直接使p s i i 的放氧复合物失活( n a s he ta 1 1 9 8 5 ) 。然而，中等 强度的热胁迫并不直接使放氧复合物失活，而是加速p s i i 的光抑制( b e r r ye ta 1 1 9 8 0 ) 。最近在水母寄主细胞中的藻类共生体中发现了这一现象( t a k a h a s h ie ta 1 2 0 0 4 ；w a r n e re ta 1 1 9 9 9 ；t c h e m o ve ta 1 2 0 0 4 ) 。在珊瑚中的甲藻共生体中，中等 热胁迫造成的光抑制是由于抑制了光破坏的p s i i 的修复而不是加速了光破坏 ( t a k a h a s h ie ta 1 2 0 0 4 ) 。然而将甲藻共生体从珊瑚中分离出来，中等热胁迫则 加速对p s i i 的光破坏( w a r n e re ta 1 1 9 9 9 ) 。因此，在某些甲藻株系中，中等热 胁迫诱导即抑制了p s i i 的修复又诱导了对p s i i 的光破坏( y a n ge ta 1 2 0 0 6 ) 。在 烟草叶片中，分别测定了光破坏和修复，表明中等热胁迫抑制了光破坏的p s i i 的修复，对光破坏的程度并没有影响( y a n g e ta 1 2 0 0 6 ) 。卡尔文循环的c 0 2 的 固定对中等热胁迫也是很敏感的( w e i se ta 1 1 9 8 1 ；w e i se ta l 。1 9 8 1 ：w e i se ta 1 1 9 8 2 ；f e l l e re ta 1 1 9 9 8 ；l a we ta 1 1 9 9 9 ) 。尽管在热胁迫条件下高等植物的 r u b i s c o 含量是稳定的，但是在中等热胁迫下，r u b i s c o 活性是不稳定的( f e l l e re t a 1 1 9 9 8 ；e c k a r d te ta 1 1 9 9 7 ；c r a f t s b r a n d n e re ta 1 2 0 0 0 ) 。另外，中等热胁迫加速 了h 2 0 2 的产生( t c h e m o ve ta 1 2 0 0 4 ；y a n ge ta 1 2 0 0 6