（微生物学专业论文）产几丁质酶菌株的筛选与鉴定及几丁质酶酶学性质研究.pdf

硕士学位论文 摘要 摘要 几丁质为自然界丰富的天然资源，具有可再生性，生物相容性，生 物可降解性，生物功能性等特点，是许多高新技术领域中不可替代的生 物医用和环境友好材料，具有广泛的用途。几丁质酶是几丁质专一性降 解所需的酶。开展几丁质酶的研究，对几丁质资源的转化，己成为全球 性热门科研课题。 本文从湖南养虾场，河流等地筛选到一株产几丁质酶的真菌c s 一0 1 ， 并对其进行了分类鉴定；对该菌株产的几丁质酶进行了分离纯化，研究 了温度和p h 对几丁质酶降解胶体几丁质的酶活性的影响以及葡萄糖和 胶体几丁质等底物对该菌株几丁质酶表达的影响。 ( 1 ) 1 2 份样品经富集培养后，采用平板透明圈法进行初筛，得到7 株可在以几丁质为唯一碳源的选择性固体平板上形成明显透明圈的菌 株，对该7 株菌进行复筛，获得一株产酶活力相对较高的真菌c s 0 1 。 ( 2 ) 利用形态学和分子生物学手段对该菌株进行了鉴定，通过对其 菌落特征、个体形态的观察和i t sr d n a 序列分析，最终确定该菌株为 烟曲霉。 ( 3 ) 采用盐析，凝胶过滤层析，透析，聚乙二醇浓缩，离子交换层 析，冷冻干燥等方法分离纯化几丁质酶。n a ti v e p a g e 和s d s p a g e 分析 确定了该几丁质酶为4 5k d a 的单体酶。 ( 4 ) 以浓缩纯酶为材料，研究了温度和p h 对几丁质酶表观活力的影 响。结果表明：在p h5 的缓冲液中，当酶反应温度达到5 5 时表观活 性最大；在4 5 - 6 5 间相对表观活性都在8 0 以上，说明该初酶液具有 宽的高温适应范围，这对直接利用该菌株进行发酵降解胶体几丁质具有 重要意义。 ( 5 ) 将烟曲霉菌株c s 0 1 培养于不同碳源的培养基中，发现，当以1 葡萄糖为碳源培养时，在整个培养过程中始终没有检测到几丁质酶活 力；而以1 胶体几丁质作为碳源进行培养时，培养至l j1 2 h 就有几丁质酶 活力产生，并在3 6 h 达至u 最大( 0 1 2 8u m l ) ；在以胶体几丁质和葡萄糖为 混合碳源的培养基中进行培养时，在培养早期没有检测到几丁质酶活力 的产生。通过对混合碳源中还原糖的测定，发现只有当培养基中葡萄糖 硕士学位论文 摘要 耗尽时，才能检测到几丁质酶活力的产生。上述结果表明，c s 0 1 产几 丁质酶属于诱导型表达。 关键词烟曲霉，几丁质酶，几丁质，纯化 硕士学位论文 a b s t r a ( 了r a b s t r a c t c h i t i ni so n ek i n do fw i d e s p r e a dn a t u r a lr e s o u r c e ，w i t has e r i e so f e x c e l l e n tp r o p e r t i e sv i z b i o r e n e w a b i l i t y , b i o c o m p a t i b i l i t y , b i o d e g r a d a b i l i t y , w h i c ho f f e r sa p p l i c a t i o np o t e n t i a l si nd i v e r s i f i e da r e a s ，e s p e c i a l l ya p p l i e di n p r e p a r a t i o n o fb i o r e l a t e da n de n v i r o n m e n t f r i e n d l ym a t e r i a l s c h i t i n a s e s e l e c t i v e l ys p l r sc h i t i n 1 1 1 es i g n i f i c a n c eo fr e a l i z i n gc h i t i nc o n v e r s i o nb y c h i t i n a s ei ss u b j e c to fs i g n i f i c a n tc o n c e r nt om a n yp e o p l ea l lo v e rt h ew o r l d i nt h i sd i s s e r t a t i o n , a c h i t i n a s e - p r o d u c i n g s t r a i nc s 一01f r o mh u n a n p r o v i n c eo fc h i n aw a si s o l a t e da n di d e n t i f i e d c h i t i n a s es e c r e t e db yt h es t r a i n w a sp u r i f i e da n di t sp a r t i a lp r o p e r t i e sw e r ei n v e s t i g a t e d t h e n ，e f f e c t so fp a a n dt e m p e r a t u r e0 1 1t h ea c t i v i t yo ft h ec o n c e n t r a t e dp u r i f i e de n z y m ew e r e s t u d i e d a d d i t i o n a l l y ，e f f e c to fs u b s t r a t e sv i z g l u c o s ea n dc o l l o i d a lc h i t i no n t h ec s o1c h i t i n a s ee x p r e s s i o nw a sa l s os t u d i e d t h em a i nr e s u l t sa lel i s t e da s f o l l o w s ( 1 ) a f t e rt h et w e l v es a m p l e sc u l t u r e di nt h ee n r i c h m e n tm e d i u m 。t h e t r a n s p a r e n tf l a tc i r c l ew a sa d o p t e d t od ot h ep r i m a r ys c r e e n i n ga n d7s t r a i n s w e r eg o tw h e nc h i t i nw a su s e da st h es o l ec a r b o ns o u r c eo fs e l e c t i v es o l i d m e d i u mt of o r mc l e a rt r a n s p a r e n tc i r c l e a f t e rs e c o n d a r ys c r e e n i n go ft h e7 s t r a i n s ，ah i g h - a c t i v i t yf u n g is t r a i nn a m e dc s o 1w a ss e l e c t e da n d m a i n t a i n e do nc o l l o i d a lc h i t i na g a rs l a n tf o rf u r t h e rs t u d y ( 2 ) m o r p h o l o g i c a la n dm o l e c u l a rb i o l o g ym e t h o d sw e r eu s e dt oi d e n t i f y t h ec o l o n yc h a r a c t e r i s t i c s i n d i v i d u a lf o r m so f o b s e r v a t i o na n di t sr 【小a s e q u e n c ea n a l y s i so fc s - o1 ，a n du l t i m a t e l yc l a s s i f i e dt h es t r a i na sa s p e r g i l l u s f u m i g a t u s ( 3 ) p u r i f i c a t i o no ft h ec s - o1c h i t i n a s ew a sc a r d e do u tb ys a r i n go u t ，g e l f i l t r a t i o n c h r o m a t o g r a p h y , d i a l y s i s ，p e gc o n c e n t r a t i o n ，i o n e x c h a n g e c h r o m a t o g r a p h y , f r e e z e d r y m g ，f o l l o w e d w i t h e l e c t r o p h o r e s i sa n a l y s i s n a t i v e p a g ea n ds d s p a g ei n d i c a t e dt h a tt h ec h i t i n a s ef r o ma f u m i g a t u s c s 01w a sm o n o m e rw i t h4 5k d a ( 4 ) 1 1 1 ee f f e c t so fp na n dt e m p e r a t u r eo nt h ea p p a r e n ta c t i v i t yo ft h e c o n c e n t r a t e dp u r i f i e de n z y m ew e r ei n v e s t i g a t e d i tw a sf o u n dt h a tt h e i i i 硕士学位论文 a b s t r a c t m a x i m u ma c t i v i t yo ft h ec o n c e n t r a t e dc r u d ee n z y m ew a sa p p e a r e da tp h5 a n d5 5 i nt h eb u f f e rp n5 o v e r8 0 o ft h em a x i m u ma c t i v i t yw a ss h o w n a t4 5 6 5 c t h ea d v a n t a g eo fi t sh i g ha d a p t a b i l i t yt oaw i d er a n g eo fh i 曲 t e m p e r a t u r e sm a k e st h e s t r a i nu s e f u li nd i r e c t c h i t i nh y d r o l y s i sb y i t s f e r m e n t a t i o nb r o t h ( 5 ) a f u m i g a t u sc s 01 i sc u l t i v a t e db yd i f f e r e n tc a r b o ns o u r c e s c h i t i n a s e a c t i v i t yp r e s e n ti nt h es u p e m a t a n to f1 g l u c o s ec u l t i v a t i o nc o u l dn o td e t e c t e d a l lt h et i m e w h i l et h ec u l t u r es u p e m a t a n tf r o m1 c o l l o i d a lc h i t i nc u l t i v a t i o n p o s s e s s e de n z y m a t i ca c t i v i t ya f t e ri n c u b a t e df o r 12ha n dc h i t i n a s ea c t i v i t y r e a c h e dt oi t sm a x i m u m ( o 12 8u m e ) a t3 6h ，a f u m i g a t u sc s - o1c u l t i v a t e db y m i x e dc a r b o ns o u r c es h o w sc h i t i n a s ea c t i v i t ya tl a t es t a g eo fg r o w t h n l ea b o v e r e s u l t si n d i c a t et h a tt h ec h i t i n a s ee x p r e s s i o ni sc h i t i n - i n d u c i b l e k e y w o r d s a s p e r g i l l u s f u m i g a t u s ，c h i t i n a s e ，c h i t i n ，p u r i f i c a t i o n i v 原创性声明 本人声明，所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究 工作及取得的研究成果。尽我所知，除了论文中特别加以标注和致谢 的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不 包含为获得中南大学或其他单位的学位或证书而使用过的材料。与我 共同工作的同志对本研究所作的贡献均已在论文中作了明确的说明。 作者签名：鲣 日期：牛年月上日 学位论文版权使用授权书 本人了解中南大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校 有权保留学位论文并根据国家或湖南省有关部门规定送交学位论文， 允许学位论文被查阅和借阅；学校可以公布学位论文的全部或部分内 容，可以采用复印、缩印或其它手段保存学位论文。同时授权中国科 学技术信息研究所将本学位论文收录到中国学位论文全文数据库， 并通过网络向社会公众提供信息服务。 硕士学位论文第一章绪论 1 1 几丁质及其应用 第一章绪论 几丁质( c h i t i n ) 又名甲壳素、甲壳质、壳多糖，是由n 乙酰2 氨基2 脱氧d 葡萄糖以b 1 、4 糖苷键联结的直链多糖，即n 乙酰葡萄糖胺的聚糖，化学名称为 ( 1 ，4 ) 2 乙酰胺2 脱氧p d 葡萄糖【1 1 。 3 1 。自然界中，几丁质广泛存在于甲壳纲动物 虾、蟹的甲壳，昆虫的甲壳，真菌( 酵母、霉菌) 和植物( 如蘑菇) 的细胞壁中。 几丁质储量丰富，在自然界中其含量仅次于纤维素，年生物合成量达1 0 0 亿吨，是人 类取之不尽，用之不竭的巨大再生资源宝库1 4 】【6 j 。 1 1 1 几丁质的理化性质 通常情况下几丁质为白色、无毒、无味、耐晒、耐热、耐腐蚀、不怕虫蛀的结 晶或无定形物，相对分子质量可达几十万至几百万，采用不同原料和不同方法制备 的几丁质，溶解度、分子量、乙酰基值和比旋光度等均有差别。几丁质的化学结构 与纤维素极其相似。纤维素是葡萄糖以p l ，4 糖苷结合形成的多糖。当纤维素葡萄 糖环c 2 位置的羟基被乙酰胺基取代是几丁质( 图1 ) 【7 】【1 2 1 。 甲壳素 c h ，0 h c h , o hc h p h 刊馏l 俺b ，。o ho h o h 纤维鬃 图1 - 1 几丁质和纤维素结构比较 f i g 1 - ip r i m a r ys l l u c t u r eo fc h i t i na n dc e l l u i o s e 由于存在乙酰氨基和羟基，分子间的氢键作用比纤维素更强。因此，几丁质进 行化学反应比纤维素更难。难溶于一般溶剂，如水、有机溶剂、稀酸和稀碱，但可 溶于浓硫酸、浓盐酸、8 5 磷酸、无水甲酸及一些特殊溶剂中，如二甲基乙酰胺一 硕士学位论文第。章绪论 氯化锂、n 一甲基吡咯烷酮一氯化锂等混合溶剂。几丁质分子排列在高度结晶微纤 维的晶格中，这种微纤维位于无定形多糖或蛋白质机体中。根据x 衍射光谱得到的 结果，几丁质按晶体结构分为a 型、p 型和丫型三种，伉甲壳质具有紧密的组成，大多 数结晶的多晶区是逆平行链状排列；p - 甲壳质的晶型则是平行链状排列；i 7 i i a , 一甲壳 质是两条链之间上下排列。3 种晶型中a 型最为稳定，并在自然界中广泛存在f 1 3 】。【1 5 】。 1 1 2 几丁质及其衍生物的应用 几丁质( c h i t i n ) 是含氮的碱性天然多糖，作为存在于自然界中唯一带阳离子能生 物降解高分子材料，因此具有许多独特的生物活性。近2 0 年来，随着几丁质及其衍 生物多种生物活性不断发现，引起全球科技界和产业界的高度重视，全世界对几丁 质类产品的开发应用日益深入成果累累【l6 1 。关于几丁质的研究与应用，国内外有许 多相关报道。随着研究的不断深入，其应用范围也在不断拓展，现在己在医学、化 工、食品、日用品、环保和农业等领域得到了广泛的应用【7 】d 7 】。 1 1 2 1 医学领域的应用 几丁质无毒无味，酶降解后可被人体组织吸收，在医学领域有着广泛的应用【i 引。 以高质量的几丁质为原料制作的手术缝合线可认为是一种理想的材料，它具有 止痛和止血的功能，有抑菌消炎作用，因而能加速伤口愈合，且对人体不产生有害 反应和刺激，与创面贴合性好，在体内有良好的适应性，能被组织降解并吸收，其 性能在某些方面优于肠衣手术线，已被用于替代肠衣手术线【1 9 】。 几丁寡糖可以通过增强机体免疫作用而抑制肿瘤细胞的生长。1 9 8 6 年，s u z u k i 2 0 】 研究发现，聚合度为4 7 的几丁寡糖对b a l b c 小鼠的腹膜渗出液细胞显示了强烈的 吸引效应。1 9 8 8 年，t o k o r o 2 q 报j , i 苣 ( g i c n a c ) 6 和( g i c n ) 6 对移植至j j b a l b c 鼠m e t h - a 瘤细胞有明显抑制作用。这种几丁寡糖的抗肿瘤机制可能是通过增加淋巴因子，随 后由溶细胞的t 细胞增生来产生抗肿瘤效果。 1 1 2 2 食品领域的应用 在保健食品方面，几丁质是食物纤维中唯一的阳离子聚合物，研究发现，当它 进入人体后，能聚集在带负电荷的脂肪滴周围，如甘油三酯、脂肪酸等，使这些高 能物质不被人体吸收而排出体外，从而减少食品所提供的热量，达到减肥的目的【捌； 而几丁寡糖是双歧杆菌促生长因子的一种重要种类，它能调节动物肠道内微生物的 代谢活动，改善肠道微生物区系分布，促进双歧杆菌生长繁殖。从而提高机体免疫 力，使肠道内p h 下降，抑制肠道有害菌生长，产b 族维生素，分解致癌物质，促进 肠道蠕动，增进蛋白吸收。 2 硕士学位论文第一章绪论 在保鲜剂方面，水溶性脱乙酰几丁质稀溶液可在果蔬表面形成一层薄膜，该膜 可防止果蔬失水、保持果蔬原色原味、抑制果蔬呼吸强度、降低果蔬在储藏过程中 营养成分的损失。此外，还能阻止微生物的侵染，减少果蔬腐烂率。研究表明，应用脱 乙酰几丁质保鲜膜可较好地控制日本梨子、弥猴桃、黄瓜、胡椒、草莓和番茄的腐 烂变质，延长贮存时间和货架寿命【2 3 1 。 在食品添加剂方面，几丁质无味，无毒，可作为一些食品的加工剂，且不改变原 有的风味。研究表明，几丁质和脱乙酰几丁质具有一定的乳化、增稠、稳定的性能， 尤其是把几丁质、脱乙酰几丁质制成微晶几丁质或分散体后，它的这些功能会进一步 提高。生产面包或其他焙烤食品时，在面团中加入脱乙酰几丁质，能与蛋白质形成稳定 的乳化液。此种成品柔软可1 ：3 ，保湿性能好瞄】【2 5 1 。在冰淇淋的制作中，加入微晶几丁 质所制得的冰淇淋组织细腻、泡沫丰富、风味独特。作为增稠剂、稳定剂，它还可用 于果酱、花生酱、奶油替代品等食品生产中【冽【2 7 1 。 1 1 2 3 化工领域的应用 在分析化学中，用几丁质富集固相反射分光光度法可以用来测定矿物中的铁； 脱乙酰几丁质化学修饰电极可测定铂；而几丁质谱柱富集柱前显色快速分光光度法 可以用来测定环境式样中的痕量铁f 2 s l 。f 3 0 1 。 由脱乙酰几丁质制备的高性能分离膜，用于乙醇水分离，采用该技术提取无水 乙醇与通常的蒸馏法相比，可节约能耗1 3 1 2 引j 。 在纺织工业中，几丁质可以应用合成纤维、玻璃纤维的染色，以及可以作为染 色的增溶剂和织物的整形理剂；如以几丁质为原材料制成的整理剂，可改善染料的 结合性，提高结合度，减少染料用量和减少皱缩性【3 2 h 3 4 j 。 以脱乙酰几丁质为载体可以合成新型疏水色谱材料，有效分离提纯芽胞杆菌n 一 淀粉酶、鸡卵蛋白以及假单胞杆菌脂肪酶等。此外，脱乙酰几丁质还具有亲水、多 孔、均匀性，作为载体时，由于存在较多可促使酶活化的氨基，是一种较为理想的 亲和层析载体，可用于胰蛋白酶的提纯。因此，以脱乙酰几丁质为载体的亲和吸附 在蛋白质的分离提纯中具有广泛的应用价值【3 讣1 3 引。 1 1 2 4 日用品领域的应用 现代洗发香波，发型固定剂、保湿剂，毛发保护剂、柔软剂等都含有各种阳离 子聚合物。几丁质是天然阳离子高分子聚合物，它无毒、无味，具有耐酸碱、耐热、 耐晒、保湿、防静电、防灰尘、生物可降解、良好的成膜性能及对皮肤的调理作用， 使其在化妆品工业应用中独具魅力，应用领域遍及护发、护肤、指甲美化、洁齿、 口腔及个人卫生用品【3 9 1 。目前在欧美日等国已有上百种以几丁质和脱乙酰几丁质作 3 硕士学位论文第一章绪论 基质生产的日用化妆品出售【加j 。 几丁质及其衍生物制成的膜具有良好的透光性、湿润性，稳定的机械强度，对气 体尤其是氧气和二氧化碳良好的透过性以及高度的生物相容性，使得它成为制作接 触镜片( 隐形眼镜) 的理想材料，可以取代通用的聚甲基丙烯酸羟乙酯、纤维素乙酸 丁酸酯和聚硅氧烷等材料；而脱乙酰几丁质含有大量能与活性染色体起反应的基团 还使得其可被应用于制作具有颜色的隐形眼镜【4 0 】【4 1 】【4 2 1 。 1 i 2 5 环保领域的应用 几丁质及其衍生物在环保领域的应用相当广泛，可作为絮凝剂、络合剂、吸附 剂处理造纸废水、处理工业废水中的重金属离子以及处理废水中的有机毒物【4 3 】。 脱乙酰几丁质分子中存在的游离氨基，在稀酸溶液中可被质子化，从而使脱乙酰 几丁质分子链上带上大量正电荷，成为一种典型的阳离子絮凝剂，兼有电中和絮凝和 吸附絮凝的双重作用】【4 引，即高分子链上的阳离子活性基团与带负电荷的胶体微粒 相互吸引，降低中和胶体微粒的表面电荷，同时压缩了微粒的扩散层而使胶体微粒脱 稳，并借助高分子链的吸附粘结和架桥作用而产生絮凝沉降，用于除去水体中的无机 悬浮固体，处理蔬菜及罐头生产废水，回收蛋白质以及污泥脱水等取得良好效果。它还 可有效地去除废水中的有机农药、多氯联苯及废水中的石油等污染物。脱乙酰几丁 质对蛋白质、淀粉等有机物的絮凝作用很强，可以从食品中加工等废水中回收蛋白质， 淀粉用作饲料1 4 3 j 。 作为吸附剂剂，几丁质和脱乙酰几丁质在富集重金属离子方面显示了优异的性 能。几丁质，特别是脱乙酰几丁质可通过其分子结构中的氨基和羧基与h 9 2 + 、c u 2 + 、 z n 2 + 等金属离子形成较稳定的螯合物，可有效地除去工业废水中的有毒重金属离 子 4 6 1 。尤其对无机汞和高毒性有机汞( 如：c h 3 h g c i 等) 有很好的捕集效果【4 7 1 ，研究 发现当h 矿+ 浓度低于2 0 0 m g l ，p h _ 7 ，脱乙酰几丁质与h 矿+ 的比值为1 1 3 i f ，h 9 2 + 的去 除率为9 9 81 。 1 1 2 6 农业领域的应用 在农业方面，几丁质及其衍生物被认为是一种新型的植物生长调节剂【4 8 】【4 9 1 ，土 壤改良剂和农药载体，而且其用量很少、无毒并可被微生物降解，对环境无污染，因此 可在农业生产中发挥重要作用印】。 研究表明，作为植物生长调节剂，几丁寡糖是植物识别病原真菌入侵的非特异 性信号，对许多植物显示强烈的免疫诱导活性，可以激发植物的基因表达，产生抗 病的几丁质酶、脱乙酰几丁质酶、植保素和免疫蛋白，这些物质能抑制和杀灭病菌 的生长，达到抗病的目的。而作为土壤改良剂，脱乙酰几丁质可以与c u 、f e 、m n 、 4 硕士学位论文 第。一章绪论 z n 、c o 等微量元素螯合，生成稳定的可溶于水的螯合物，以利于植物的吸收和利用， 从而对农作物的生长起到促进作用【5 l 】；还有研究表明，在土壤中添加几丁质有利于调 节微生物的数量。 目前很多农药都是有机物制剂，在杀灭害虫的同时，还会残留在农作物上，在 食物链上发生传递，最终在人体上沉积，对人体危害很大，同时还会对生态环境造 成破坏，因此，急需一类对生物体和生态环境都无害的生物农药。几丁寡糖，因分 子中有游离氨基，是一种带阳电荷的离子化合物，对真菌和微生物的生长有抑制作 用，可将其制成杀菌剂，用于防治由真菌引起的病害；而由几丁质制成的农药缓释剂， 可以提高农药的使用率和药效，减少对环境的污染和对人体的危害【5 2 】印j 。 1 2 几丁寡糖的制备方法 几丁寡糖是由几丁质经水解后产生的一类低聚合度可溶于水的氨基糖类化合 物。研究表明，几丁寡糖不仅具有几丁质的一般特性，还具有许多独特的生物学功 能( 如抗诱变、促进免疫以及良好的水溶性等) 【8 5 】，因此其应用范围比几丁质更广。 目前，有关几丁寡糖的制备方法主要有四种，u p 化学法、糖基转移法、物理 法和酶解法。 1 2 1 化学法 化学法是目前制备低聚糖的主要方法，包括氟化氢法、酸水解法和氧化法等。 氟化氢法是上世纪9 0 年代发展起来的一种几丁质降解方法。1 9 9 4 年d e f a y e l 5 4 等 用氟化氢降解脱乙酰几丁质，得到较高产量的三糖到十糖但是最后需要移走大量的 氟化氢且进行进一步的脱氟反应；几丁质在无水氟化氢中室温下水解1 0 h ，主要产物 是二糖到四糖，且有p l ，6 糖苷键的低聚物异构体，从而在实践中受到限制，而且其 化学反应条件非常苛刻。 酸水解是使糖苷键水解的一种最普遍和最有效的方法。目前，工业上由几丁质 生产氨基葡萄糖就是采用浓盐酸高温水解。采用盐酸水解几丁质的历史较早，早在 上世纪5 0 年代就有相关的报道【5 5 】。 r u p l e y t 5 6 】曾比较系统的研究了浓盐酸对几丁质 的水解情况，盐酸浓度越高，水解温度越高，水解越快，但结果证明，这种方法难 以制备较高聚合度的低聚糖。 氧化降解是目前化学法中研究较多的一种脱乙酰几丁质的降解方法，最常用的 氧化剂是h 2 0 2 。通常取脱乙酰几丁质按一定比例加入到体积分数为6 的h 2 0 2 溶液 硕士学位论文 第一章绪论 中，在6 0 。c 反应6 h ，反应液过滤后，用体积分数为9 5 的乙醇沉淀出低聚糖。h 2 0 2 氧化法可制备相对分子质量 30 0 0 的甲壳低聚糖。h 2 0 2 的氧化与溶液的p h 值有关， 在中性或碱性溶液中，反应温和，副产物少，为非均相降解反应；若在酸性条件下， 氧化反应在均相中进行，反应快，可制备聚合度较低的产物【5 7 1 。 1 2 2 糖基转移法 糖转移法是建立在酶反应的基础上的，糖转移法是利用低聚合度寡糖在酶参与 作用后，延长糖链成为高聚合度的寡糖。单纯的酶反应合成较高聚合度的低聚糖比较 困难，坂井【5 8 】等巧妙地利用某些几丁质酶所具有的糖转移性，成功地以较好的收率 合成了具有生理活性的n 乙酰基六糖和n 乙酰基七糖，即使用来自诺卡氏放线菌或 木霉属具有高的糖基转移功能的几丁质酶，使二糖链发生连接反应，得到六糖的白色 沉淀。同样，以五糖为基质可合成七糖。此法不仅能调节聚合度，还可以通过对基质 的精心设计合成一些特殊结构的低聚糖衍生物。但此法只能用来制备几丁寡糖，而不 能制备脱乙酰几丁寡糖。 1 2 3 物理法 用于几丁质脱乙酰几丁质降解的辐射法、超声波法是受到研究最多的2 种物理 方法。放射性射线照射脱乙酰几丁质，使分子产生电离或激发等物理效应，进而产 生化学变化，既可使分子间形成化学键辐射交联，又可导致分子链断裂辐 射降解。日本原子能研究所用0 o l ，- - - 2 0 0 0 k g y 剂量的放射线照射脱乙酰几丁质，不论 是自然态、固态脱乙酰几丁质还是脱乙酰几丁质溶液，都可得到包括有几丁寡糖的 降解产物，该产物与丙三醇和双醋酚酊可构成植物生理调节剂。此外，采用钴y 射 线法照射天然高分子脱乙酰几丁质，辐照3 6 h 和4 8 h ，可制备粘均分子量分别为4 8 1 0 4 和4 6 1x1 0 4 的低分子量壳聚糖l 5 6 j 。 1 2 4 酶解法 酶降解又称生物降解，是用专一性或非专一性酶对几丁质进行降解而得到均分 子量较低的几丁寡糖。目前，已发现有近4 0 种酶可用于几丁质脱乙酰几丁质的降解 反应，这些酶包括专一性的几丁质酶、脱乙酰几丁质酶以及非专一性水解酶如脂肪 酶、蛋白酶和其它聚糖酶等，与上述其它方法相比，酶降解过程工艺简单，条件温 和，不产生环境污染，而且可控制聚合度5 6 1 。 6 硕士学位论文 第一章绪论 1 3 几丁质酶及其应用研究 1 3 1 几丁质酶的来源 自从1 9 0 5 年b e n e c k 首次发现b a c i l l u sc h i t i n o v i r o u s 能利用几丁质作为营养物以 来，人们对于几丁质酶类的研究已有近百年的历史，随着对几丁质酶研究的深入， 现已在许多微生物、植物、动物中发现了几丁质酶【5 刀。目前，人们对微生物产几丁 质酶研究最多，已经分离出了许多微生物几丁质酶，这些微生物涵盖了细菌、放线 菌、真菌和病毒等门类( 表1 1 ) 。 表1 1 产几丁质酶的微生物【瑚 ! 竺垒! 竺! ：! 垒i ! i 翌箜12 旦g ii 翌 _ _ _ _ 一- 细菌粘质沙雷氏菌，液化沙雷氏菌，嗜水气单胞菌，交替单胞菌属0 7 株，巨大芽孢杆菌，地衣芽孢杆菌，环状芽孢杆菌，成团肠杆 菌，蓝黑紫色杆菌，铜绿假单胞，嗜麦芽假单胞菌，创伤弧菌， 弗氏弧菌，哈氏弧菌，黄单胞菌属，类腐败梭菌，产气荚膜梭 菌，热纤维梭菌等 放线菌 真菌 病毒 褶皱链霉菌，浅青紫链霉菌，橄榄绿链霉菌，淡紫灰链霉菌， 灰色链霉菌，浅天青链霉菌，天蓝色链霉菌，热紫链霉菌，葱 绿毛链霉菌等 木霉属，酿酒酵母，白色扁丝霉，白色念珠菌，构巢曲霉，白 僵菌，少孢根霉等 小球藻病毒p b c v 1 、苹果蠹蛾颗粒体病毒( c p g v ) 、棉铃虫 单核衣壳核多角体病毒( h a s n p v ) 、苜蓿银纹夜蛾多核型多角 体病毒( a c m n p v ) 、杆状病毒等 1 3 2 几丁质酶的分类 人们在研究微生物几丁质酶的过程中，根据其结构和性质将微生物几丁质酶进 行了相应的分类。 根据反应的最适p h 值的不同，可将其分为酸性、中性和碱性几丁质酶。微生物 中的几丁质酶多为酸性酶；而植物中的几丁质酶大多为碱性酶，也有酸性酶，并且 可能出现在同一植株中。一般认为，植物中的碱性几丁质酶与植物对真菌的抗性有 关【5 7 1 。 根据同底物的作用部位和产物的不同可分为三种【5 9 】，即内切几丁质酶、几丁二 7 硕士学位论文第章绪论 糖酶和b - n 乙酰葡萄糖胺酶。其中内切几丁质酶则随机地同底物寡糖链结合并切开 相应的糖苷键，然后再进行随机的结合和水解；几丁质二糖酶同底物寡糖链的非还 原端结合，切下几丁质二糖，同时沿寡糖链前移准备进行下一次水解；肛n 乙酰葡 萄糖胺酶是将内切几丁质酶水解得到的寡糖和几丁二糖酶水解得到的几丁二糖降解 为p _ n 乙酰葡萄糖胺单体，它只能作用于低聚合度的寡糖，通常聚合度不超过6 。 按照糖苷酶的分类标准，根据其氨基酸序列的同源性，可将几丁质酶分为1 8 和 1 9 两个家蒯删。1 8 家族几丁质酶广泛存在于病毒、微生物、植物和动物中；而目前 发现的1 9 家族几丁质酶除了在植物中广泛存在外，还存在于链霉菌属和一些拟诺卡 氏菌属的放线菌中，在气单胞菌1 0 s 2 4 株和唐菖蒲伯克霍尔德氏菌中也发现了1 9 家 族几丁质酶。绝大多数的微生物1 9 家族几丁质酶和植物的1 9 家族几丁质酶在催化区 有很高的同源性【6 l 】。对于目前研究过的所有1 8 家族几丁质酶来说，在其催化区都含 有2 个a s p 和l f g l u ，即d x e d x e 基序，这可能是保证1 8 家族几丁质酶活性的必需 关键氨基酸。1 8 家族几丁质酶具有相似的蛋白质三级结构，即都具有由俚螺旋和b 折 叠构成的圆桶形结构，中心是由平行的p 折叠结构组成的内桶，依次为p l 风，由a 螺 旋结构将它们逐个连接来，在a 螺旋和p 折叠之间有一段无规卷曲连接。1 8 家族几丁 质酶有2 段分别位于1 3 3 和d 4 链上的氨基酸序列是高度保守的，且它们具有相似的结 构，与底物结合的部位就位于由b 3 和f 1 4 链形成的环状缝隙中。而1 9 家族几丁质酶的 结构和溶菌酶的三级结构相似，由一个双叶的( 叶d ) 模体构成。到目前为止，所 有研究过的l8 家族几丁质酶的水解产物都是d 异构体，而1 9 家族几丁质酶的水解产 物都是t l , 异构体。 此外，根据一级结构氨基酸序列的不同还可将几丁质酶分为5 种类型 ( i 【6 2 】【6 3 1 ，i 型几丁质酶富含半胱氨酸的n 端( 几丁质结合区) ，定位于液泡，信 号肽富含l e u 和v a l ，大部分是胞内型。根据酸性和碱性进一步将i 型分为i a 和i b 两型。到目前，i 型几丁质酶发现是严格的植物来源。而i i 型几丁质酶可来自植物、 真菌和细菌。i i 型几丁质酶是由病原物诱导产生的，缺n 端半胱氨酸富含区，多为 胞外型i i i 型几丁质酶的序列与前两个没有任何相似型，而与原核生物几丁质酶有 相似性，而且显示出溶茵酶活性。i v 型几丁质酶与i 型几丁质酶有相同的特性，包 括免疫学特性，但分子量明显的小于i 型几丁质酶，是在c 端催化区有缺失。v 型 几丁质酶n 端结合区具重复性，总的来说属于i v 、v 型几丁质酶较小。 由于目前对几丁质酶还在研究阶段，研究者往往根据自己的研究情况和需要对 几丁质酶进行分类，从而导致目前几丁质酶的分类还比较混乱。现在普遍采用的是 按照国际酶学分类方法进行分类，根据其作为糖水解酶的氨基酸序列的同源性，将 8 硕士学位论文 第一章绪论 其分为1 8 和1 9 两个家族。 1 3 3 几丁质酶的表征 1 3 3 1 几丁质酶的诱导性 在自然状态下，绝大多数微生物几丁质酶具有可诱导性，譬如微生物几丁质酶 的产生往往需要甲壳素及其水解产物作为底物存在；而葡萄糖等的降解产物则对微 生物的几丁质酶的表达起抑制作用。但也有例外， 如拟诺卡氏菌n o c a r d i o p s i s p r a s i n ao p c 1 3 1 株表达几丁质酶的过程并不受葡萄糖的抑制【删 吲。 1 3 3 2 几丁质酶表达的时序性和组织特异性 植物几丁质酶的产生虽然与植物抗性相关，但在许多植物的一定发育阶段及特 殊组织中也发现几丁质酶的存在。在植物中，一般在顶部几乎检测不到几丁质酶，而 在基部老叶及根中的含量较多。认为此时几丁质酶是在植物一些发育阶段时，为适 应不利的外界环境而产生的一种保护机制，以确保发育过程的顺利完成。寄生线虫 产生的几丁质酶有专一性和时段性，主要是在其发育和传播中起重要作用【6 7 。 h i m y u l do s h i m a 等人首次从蟾蜍的胰脏中分离出一个6 0 k d a 的几丁质酶，此酶的 m r n a 只在蟾蜍的胰脏中表达，具有组织特异性【6 引。 1 3 3 3 几丁质酶的分子量 几丁质酶的分子量一般为2 0 1 2 0k d a ，但不同生物产几丁质酶其分子量差异较 大，如细菌的分子量通常在6 0k d a 11 0k d a , 放线菌产几丁质酶其分子量通常只有 3 0k d a 或更小，真菌的几丁质酶分子量一般超过3 0k d a 3 4 】，【4 8 】 【5 2 1 ，植物几丁质酶 分子量一般为3 0k d a , 而昆虫几丁质酶通常为5 0k d a 【6 9 卜【7 1 1 。 1 3 3 4 几丁质酶的最适p h 及等电点 由于微生物产生的几丁质酶种类较多，性质差异较大，即使同一微生物产生的 几丁质酶也各不相同，微生物几丁质酶反应的最适p h 值的变动范围也很大，一般认 为是3 1l ，但绝大多数微生物几丁质酶最适p h 值为4 6 的偏酸性环境，酶的等电点p i 为3 每8 6 【6 1 1 。 1 3 3 5 几丁质酶的最适温度及稳定性 微生物几丁质酶往往对热都比较稳定，在4 6 0 时都具有酶活性，而像激烈热 球菌的几丁质酶在9 8 1 0 0 c 时仍然能正常进行水解反应，但大多数微生物几丁质酶 的最适反应温度为4 0 5 0 c ，在2 0 c 保存2 年仍有酶活性，微生物几丁质酶的这种 热稳定性特点，使其在生物技术产业方面具有巨大的应用潜力【7 2 。 1 3 3 6 金属离子对几丁质酶的影响 9 硕士学位论文第一章绪论 一些金属离子能影响几丁质酶的活性，如f e 3 + 、f e 2 + 、z n 2 + 通常对酶的活性有较 大的抑制作用，而m 孑+ ；f 1 m n 2 十则一般有一定的激活作用，其作用机理因酶的来源不 同而异【7 3 】。 1 3 3 7 几丁质酶的结构组成 随着分子生物学技术的迅速发展，科学工作者通过大量的实验，已发现了多种 几丁质酶，检测或推断出它们的序列组成、结构，并将该基因进行克隆，构建出各 种高效表达的基因工程产物。总的说来，目前所发现的微生物几丁质酶，虽然差异 较大，但多数微生物几丁质酶都具有相似的结构域，从n 端到c 端依次含有信号肽 ( s i g n a lp e p t i d e ) ，几丁质酶催化域( c a t a l y t i cd o m a i n ) ，几丁质结合域( b i n d i n gd o m a i n ) 以及一个短的c 端区域( 图1 2 ) e 7 4 1 。 匿夏 = 二= 二二甏受翟至互= 习口 信弓肽几r 赁酶位化域儿r 睡结台域c 璇区域 图卜2 微生物几丁质酶的一级结构 几丁质酶大多是胞外酶，都具有信号肽序列。信号肽的分裂位点常在两个a l a 之间。几丁质酶不同，其信号肽的长度及特点也各不相同，但同源性较高的几丁质 酶之间，信号肽序列较相似。 几丁质酶的催化域负责几丁质的水解，是几丁质酶真正起作用的部分。催化域 具有同源性。不同几丁质酶的催化域中，有两个高度保守的区段，但是催化域的同 源性与菌株的亲缘关系没有联系，即近缘菌株可能具有完全不相同的催化域，例如 同是来自= = a e r o m o n a ss p n o 1 0 s 2 4 菌株的几丁质酶c h i l 、c h i 2 和c h i 3 ，其催化域 的相似性并不是很高。 w a t a n a b e 等【7 5 】首先从b c i r c u l a n s 的几丁质酶c h i a l 中发现了几丁质结合区， 接着又在b c i r c u l a n s 的几丁质酶c h i d 中发现了相似的区域，此后在许多微生物几 丁质酶中都发现了几丁质结合区，它们具有同源性。催化区域相似的几丁质酶，它 们的几丁质结合区域并不相类似。但是，与催化区域不同，来源于同一菌株的酶的 几丁质结合区域具有相似性，即与菌株的亲缘关系有联系。一般认为几丁质结合区 域主要负责与几丁质结合，使催化域更好地发挥水解作用。 几丁质酶c 端序列的作用现在还不清楚，t s u j i b o 等t 7 6 】报道彳抛，d 加朋傩s p s t r a i n 0 7 的c 端序列由2 0 个氨基酸形成一个疏水核，在酶蛋白通过细胞膜时，此疏水核起 重要作用。 1 0 硕士学位论文 第一章绪论 并非每个几丁质酶都含有上述几个部分，有的几丁质酶缺少几丁质结合区。而 有专门负责结合几丁质的蛋白，例如s t o l i v a c e o v i r i d i s 在几丁质诱导下，可产生2 0 k d a 的几丁质结合蛋白，帮助酶结合几丁质，但是它与其他几丁质酶的结合区、催 化区没有相似性 明。 1 3 4 几丁质酶的应用 1 3 4 1 在处理几丁质废物上的应用 海产品加工产生的虾壳、蟹壳等下脚料是富含几丁质的废弃物，这些下脚料不 经过处理，不仅造成资源浪费，而且污染了环境。但采用常规的化学方法对几丁质 酶处理需要耗费大量的酸碱，且会产生废水排放等环保问题。而利用几丁质酶降解， 不仅可以有效处理废弃物，还可以保护环境【7 引。 1 3 4 2 在功能性低几丁寡糖制备上的应用 几丁质经降解得到的低分子量的寡糖在功能食品、保健药品等行业具有广泛的 应用。与几丁质壳，几丁寡糖不仅有水溶性好、易吸收等优点，还具有抗细菌、真 菌，调节机体免疫及抗癌等功能【7 9 】【删。 制备几丁寡糖的方法目前主要有化学法和酶法降解。但化学法存在诸多缺点， 如对反应条件要求非常苛刻，产物分子量范围不易控制，有活性寡糖含量少，并且 由于会产生大量的副产物d 葡糖胺，使得分离过程非常复杂，用酸水解还会对环境 造成严重的污染。而酶降解法具有反应条件温和，对环境污不造成染，而且可控制 聚合度，易得到所需分子量范围的低聚糖产品，反应专一性强，不会引起结构的破 坏，降解过程不需要加入大量的反应试剂，副反应少，产物的安全性高等优点，因 而将是几丁寡糖