（茶学专业论文）高含量高活性多糖的乌龙茶种质资源与加工工艺研究.pdf

福建农林大学硕士学位论文高含量高活性多糖的鸟龙茶种质资源与加工工艺研究 摘要 茶多糖具有降血糖、降血脂、增强免疫功能等多种生物活性。本论文研究了 高含量高活性多糖的乌龙茶种质资源与加工工艺。其主要研究结果如下： 1 通过3 个年度的重复实验，从8 3 份乌龙茶种质中筛选研究出茶多糖含 量高且稳定的种质o t v 5 3 ，其茶多糖含量高达2 8 8 ，是总平均含量2 0 5 的1 4 0 倍，是铁观音( 1 9 2 ) 的1 5 0 倍；茶多糖活性( 清除羟基自由基率，下同) 高且稳定的种质o t v 6 1 ，其茶多糖活性高达3 3 7 0 ，是总平均活性1 7 9 7 的1 8 8 倍，是铁观音( 5 5 4 ) 的6 0 8 倍；茶多糖含量、活性均高且活性稳定的种质 o t v 0 8 ，其茶多糖含量高达3 0 3 ，是总平均含量的1 4 8 倍，是铁观音的1 5 8 倍：其茶多糖活性高达5 1 3 9 ，是总平均活性的2 8 6 倍，是铁观音的9 2 8 倍。 2 以高血糖小鼠为材料，比较研究了三份乌龙茶优异种质( o t v 0 8 、o t v 5 3 、 o t v 6 1 ) 的茶多糖降血糖效果。结果表明：o t v 0 8 、o t v 5 3 、o t v 6 1 及铁观音的茶 多糖均能显著降低血糖浓度( p o t v 6 1 铁观音，但差异未达显著性水平。 3 建立了提高乌龙茶多糖含量与活性的加工工艺：对乌龙茶在制品茶多 糖含量与活性的影响大小依次是晒青( 或萎凋) 、做青 造型干燥 杀青。与 清香型加工工艺( 6 0 干燥，清香型) 相比，浓香型加工工艺( 1 0 0 干燥，浓 香型) 茶多糖含量( 1 9 5 ) 高出3 7 2 ，活性( 4 7 4 ) 高出1 5 1 0 2 ；且浓香 型加工工艺能提高乌龙茶内含物的含量，改善酚氨比，即适当提高发酵程度和干 燥温度可提高乌龙茶多糖的含量和活性，还能提高乌龙茶的感官品质。 4 分析研究了茶多糖提取率、含量、活性及其它内含成分的相关性：乌 龙茶鲜叶茶多糖提取率和含量呈极显著正相关( p 0 0 1 ) ，茶多糖活性与其提取 率呈显著负相关( p o 0 5 ) ，茶多糖活性与其含量的相关性未达显著性水平。乌 龙茶在制品茶多糖活性与其提取率则不存在显著性相关关系。分析茶多糖提取 率、含量、活性与其它内含成分的相关性，表明凡是能够引起茶汤沉淀的内含成 分均有利于茶多糖提取率的提高，进而影响茶多糖含量，且各内含物的影响大小 依次为咖啡碱、茶多酚和氨基酸。 关键词：乌龙茶多糖；含量与活性；种质资源筛选：加工工艺 i 福建农林大学硕士学位论文 高含量高活性多糖的乌龙茶种质资源与加工工艺研究 a b s t r a c t t e ap o l y s a c c h a r i d e sh a dm a n yb i o l o g i c a la c t i v i t i e ss u c ha sh y p o g l y c e m i ca c t i v i t y , r e d u c i n gb l o o dl i p i da n de n h a n c i n gi m m u n ef u n c t i o n i nt h i sp a p e r , g e r m p l a s m r e s o u r c e sa n dp r o c e s s i n gt e c h n o l o g yw i t hh i g ho o l o n gt e ap o l y s a c c h a r i d e sc o n t e n t a n da c t i v i t i e sw e r es t u d i e d t h em a i nr e s u l t sw e r ea sf o l l o w s ： 1 t h r o u g h3y e a r sr e p e a t e de x p e r i m e n t 。t h eh i g ht e ap o l y s a c c h a r i d e sc o n t e n ta n d a c t i v i t y ( r e m o v a lr a t eo fh y d r o x y lr a d i c a l ，t h es a m eh e r e i n a r e r ) o fe x c e l l e n t g e r m p l a s m sw e r es c r e e n e df r o m8 3o o l o n gt e ag e r m p l a s m t h eo o l o n gt e as p e c i f i c g e r m p l a s mr e s o u r c e sw i t hh i g hc o n t e n ta n dh i g ha c t i v i t yo ft e ap o l y s a c c h a r i d e sw e r e s c r e e n e d t h eg e r m p l a s mw i t hh i g ha n ds t a b l ec o n t e n to ft e ap o l y s a c c h a r i d e sw a s o t v 5 3 i t st e ap o l y s a c c h a r i d e sc o n t e n tw a su pt o2 8 8 w h i c hw a s1 4 0t i m e so f o v e r a l la v e r a g ec o n t e n t ( 2 0 5 ) a n d1 5 0t i m e so ft ik u a n y i n s ( t i eg u a ny i n ，1 9 2 ) t h eg e r m p l a s mw i t hh i g ha n ds t a b l ea c t i v i t yw a so t v 61 i t st e ap o l y s a c c h a r i d e s a c t i v i t yw a su pt o3 3 7 0 ，w h i c hw a s1 8 8t i m e so f o v e r a l la v e r a g ea c t i v i t y ( 1 7 9 7 ) ， 6 0 8t i m e so ft ik u a ny i n s ( 5 5 4 ) t h eg e r m p l a s mw i t hh i g ha n ds t a b l ea c t i v i t y a n dh i g hc o n t e n to ft e ap o l y s a c c h a r i d e sw a so t v 0 8 i t st e ap o l y s a c c h a r i d e sc o n t e n t w a su pt o3 0 3 ，w h i c hw a s1 4 8t i m e so ft h eo v e r a l la v e r a g ea n d1 5 8t i m e so ft h et i k u a ny i n s ；i t st e ap o l y s a c c h a r i d e sa c t i v i t yw a sa l s ou pt o51 3 9 ，w h i c hw a s2 8 6 t i m e so ft h eo v e r a l la v e r a g ea n d9 2 8t i m e so ft h et ik u a ny i n s 2 u t i l i z i n gh y p e r g l y c e m i a m i c ea s m a t e r i a l ，t h e t e a p o l y s a c c h a r i d e s h y p o g l y c e m i cf u n c t i o nf o r t h et h r e ee x c e l l e n tg e r m p l a s m ( o t v 0 8 o t v 5 3 ，o t v 6 1 ) w a sc o m p a r e d o t v 0 8 ，o t v 5 3 ，o t v 61a n dt ik u a ny i nt e ap o l y s a c c h a r i d e sh a d o b v i o u sh y p o g l y c e m i cf u n c t i o n ( p o t v 6 1 t ik u a ny i n ，b u tt h ed i f f e r e n c ed i d n o tr e a c hs i g n i f i c a n tl e v e l 3 t h eo o l o n gt e ap r o c e s s i n gt e c h n o l o g yf o ri m p r o v i n gt e ap o l y s a c c h a r i d e s 福建农林大学硕上学位论文高含量高活性多糖的乌龙茶种质资源与加工工艺研究 c o n t e n ta n da c t i v i t yw a se s t a b l i s h e d i nt h eo o l o n gt e ap r o c e s s i n g ，t h ep r o c e s s e s w i t he f f e c t sf o ro o l o n gt e ap o l y s a c c h a r i d e sc o n t e n ta n da c t i v i t ys u c c e s s i v e l yw e r e w i t h e r i n ga n df i n em a n i p u l a t i n g r o l l i n ga n dd r y i n g p a n f i r i n g c o m p a r e dw i t h u s i n gt h et e ap r o c e s s i n gt e c h n o l o g yo ff a i n t - s c e n tt y p e ，t h ec o n t e n ta n da c t i v i t yo ft e a p o l y s a c c h a r i d e su s i n gp r o c e s s i n gt e c h n o l o g yo ft h i c ka r o m at y p e ( 1 9 5 ，4 7 4 ) w a s 3 7 2 ，151 0 2 h i g h e rr e s p e c t i v e l y ；t h ep r o c e s s i n gt e c h n o l o g yo ft h i c ka r o m at y p e c o u l di m p r o v et h eo o l o n gt e ai n c l u s i o n sc o n t e n ta n dt h er a t i oo ft e ap o l y p h e n o l sa n da m i n o a c i d ，t h a ti sa p p r o p r i a t e l ye n h a n c i n gt h ed e g r e eo ff e r m e n t a t i o na n di n c r e a s i n gd r y i n g t e m p e r a t u r ec o u l di m p r o v eo o l o n gt e ap o l y s a c c h a r i d e sc o n t e n t ，a c t i v i t ya n do o l o n g t e as e n s o r yq u a l i t y 4 t h ec o r r e l a t i o n sa m o n gt h et e ap o l y s a c c h a r i d ee x t r a c t i o nr a t e ，c o n t e n t ，a c t i v i t y a n do t h e ri n c l u s i o n sw e r e a n a l y z e d o o l o n gt e af r e s hl e a v e sp o l y s a c c h a r i d e s e x t r a c t i o nr a t ea n dc o n t e n ts h o w e dh i 曲l ys i g n i f i c a n tp o s i t i v ec o r r e l a t i o n ( p o 0 1 ) ， t h ea c t i v i t yo ft e ap o l y s a c c h a r i d ea n di t se x t r a c t i o nr a t ew a ss i g n i f i c a n t l yn e g a t i v e r e l a t e d ( p 0 0 5 ) ，a n dt h ec o r r e l a t i o nc o e f f i c i e n to fi t sa c t i v i t ya n dc o n t e n td i d n tm e e t t h es i g n i f i c a n tl e v e l w h i l et h et e ap o l y s a c c h a r i d e se x t r a c t i o nr a t ea n da c t i v i t yf o r o o l o n gt e as e m i f i s h e dp r o d u c t sw a sn o ts i g n i f i c a n t l yc o r r e l a t e d t h ec o r r e l a t i o n s a m o n gt h e ma n do t h e ri n c l u s i o n sa n a l y z e ds h o w e dt h a ta l li n c l u s i o n st h a tc o u l dc a u s e t e al i q u o rp r e c i p i t a t i n gw e r ec o n d u c i v et oi m p r o v et e ap o l y s a c c h a r i d e se x t r a c t i o nr a t e ， t h e r e b ya f f e c t e dt h et e ap o l y s a c c h a r i d e sc o n t e n t a n dt h ei n c l u s i o n sw i t he f f e c t d e c r e a s i n gs u c c e s s i v e l yw e r ec a f f e i n e ，t e ap o l y p h e n o l sa n da m i n oa c i d s k e yw o r d s ：o o l o n gt e ap o l y s a c c h a r i d e s ；c o n t e n ta n da c t i v i t i e s ；g e r m p l a s m s c r e e n i n g ；p r o c e s s i n gt e c h n i q u e s i i i 独创性声明 本人声明，所呈交的学位( 毕业) 论文，是本人在指导教师的指导下独立完 成的研究成果，并且是自己撰写的。尽我所知，除了文中作了标注和致谢中已作 了答谢的地方外，论文中不包含其他人发表或撰写过的研究成果。与我一同对本 研究做出贡献的同志，都在论文中作了明确的说明并表示了谢意，如被查有侵犯 他人知识产权的行为，由本人承担应有的责任。 学位( 毕业) 论文作者亲笔签名：舞邑鲂【日期：枷7 - 多谬 论文使用授权的说明 本人完全了解福建农林大学有关保留、使用学位( 毕业) 论文的规定，即学 校有权送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅；学校可以公布论文的全部或 部分内容，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。 保密，在年后解密可适用本授权书。 口 不保密，本论文属于不保密。母 学位c 毕业) 论文作者亲笔签名：弄丧每【 指导教师亲笔签名： 日期：跏7 6 f 汐 吼叩、多， 福建农林大学硕士学位论文高含量高活性多糖的鸟龙茶种质资源与加工工艺研究 第一章引言 从2 0 世纪7 0 年代起糖领域的三次革命，催生了糖生物学和糖工程。糖工程是以多糖结 构、功能和药用研究为核心的，被认为是继2 0 世纪7 0 年代基因工程、8 0 年代蛋白质工程 后生物化学和分子生物学领域最后一个巨大的科学前沿：如同2 0 世纪是蛋白质和核酸时代 一样，2 l 世纪应当是“多糖生命科学”的时代。而且多糖具有广泛的来源( 存在于动物、 高等植物、微生物和海洋生物等有机体中) 、多样的生物活性以及极低的细胞毒性，这使其 必将成为一类未来具有发展前途的新型药物和功能性食品。 以前，茶多糖的研究一直未得到应有重视，直到日本学者清水岑夫研究发现，中日民间 早有用粗老茶治疗糖尿病的习惯，其起作用的成分是茶多糖晗，引，茶多糖的研究与开发开始得 到广泛的关注。与此同时，国际国内掀起的糖生物学和糖工程研究热潮进一步推动了茶多糖 的研究开发与利用。其中，茶多糖多样的生物活性首先得到深入的研究。 1 茶多糖的功用 随着社会各方面的变化，尤其是生活方式的变化及人口老龄化程度的加深，癌症、糖尿 病、肥胖症等日趋严重。据中华人民共和国卫生部( ( 2 0 0 6 年中国卫生事业发展情况统计公 报的信息，2 0 0 6 年城市居民前十位死因为：恶性肿瘤、脑血管病、心脏病、呼吸系病、 损伤及中毒、内分泌营养和代谢疾病、消化系病、泌尿生殖系病、神经系病、精神障碍，共 占死亡总数的9 0 4 。与2 0 0 5 年相比，恶性肿瘤、呼吸系病、内分泌营养和代谢疾病、神 经系病的死亡率及所占比例有所上升。茶多糖具有广泛的生理活性，对癌症、糖尿症、心血 管疾病等多种现代顽疾均有一定的预防和辅助治疗的作用。 1 1 茶多糖的保健功能 茶多糖( t p s ，t e ap o l y s a c c h a r i d e s ) ，是茶叶中继茶多酚之后被发现的又一重要生理 活性物。药理研究表明，茶多糖，其毒性极低h 1 ，具有降血糖、降血脂、降血压、抗动脉粥 样硬化、抗凝血、抗血栓、抗癌、抗辐射、防治心血管疾病、增加冠脉流量、增强免疫功能、 耐缺氧作用、消炎等多种功效，尤其是显著的降血糖效果和免疫活性，有望开发成为防治糖 尿病、心血管疾病和增强肌体免疫功能的新型药物和功能性食品幅1 。 1 1 1 防治糖尿病 据世界卫生组织的资料，目前全世界至少有一亿七千一百万人患有糖尿病，每年至少有 3 2 0 万人死于糖尿病，相当于2 0 个死者就有一个是糖尿病人，每天8 7 0 0 个糖尿病人死亡， 福建农林大学硕士学位论文高含量高活性多糖的呜龙茶种质资源与加工工艺研究 每分钟6 个糖尿病人死亡，且有日趋严重的倾向，预计至2 0 3 0 年其患者将是目前的两倍多。 可见，糖尿病已成为威胁人类健康和生命的主要疾病之一。 i s i g u k ik t s i 等证明腹膜内注射茶多糖，可使大鼠血糖下降；将茶多糖用于糖尿病的辅 助治疗，所有患者症状好转。李布青盯1 等报道，腹腔注射( i p ) 3 0 0 m g k g 剂量的t p s ，7 h 后正 常小鼠的血糖下降7 0 ，t p s 还能降低肾上腺素和四氧嘧啶高血糖模型小鼠的血糖浓度，同 时还使肝糖原大量增加。据此认为t p s 对糖代谢的影响与胰岛素类似。周杰阳1 等也报道，腹 腔注射( i p ) 5 0 m g k g b wt p s 有明显降低血糖的作用( p 1 o g k g b w 。t a d a d a z ut 叫等口服( p o ) 1 0 0 0 m g k g 剂量 的t p s ，5 h 后对s t z 诱发的高血糖模型大鼠有明显的降血糖作用( p o 0 1 ) 。陈海霞u 刨则证 实，从中低档绿茶中提取茶多糖对正常和实验性高血糖模型小白鼠血糖均有明显降低作用， 且能完全对抗肾上腺素和四氧嘧啶所致高血糖。倪德江n 等认为茶多糖对糖尿病大鼠肝肾组 织有保护作用：当糖尿病大鼠灌胃乌龙茶多糖4 周后，抗氧化能力增强，表现为肝肾s o d 和g s 卜p x 活性明显提高，m d a 含量显著下降。何学斌h 纠等发现水提醇沉的茶多糖可降低四 氧嘧啶所致糖尿病大鼠的空腹血糖及餐后血糖，且分别达到显著性( p o 0 1 ) 和极显著性 ( p o 0 1 ) 水平，其降血糖机制可能与其抑制q 一淀粉酶活性，从而延缓碳水化合物在小肠 的吸收有关。全吉淑n 3 1 等进一步认为茶多糖可抑制q 一葡萄糖苷酶及q 一淀粉酶活力和小肠 刷状缘囊泡葡萄糖转运能力，从而可延缓小肠对糖的消化吸收。 吴建芬n 刮等预防性给予i c r 小鼠茶多糖4 周，再四氧嘧啶造模3 天后，预防性给予茶多 糖的小鼠造模前后血糖无明显升高；与正常组比较，肝脏s o d 和g s h p x 活性提高，m d a 含 量降低。这验证了陈海霞副的研究。 茶多糖还可有效降低2 型糖尿病的血糖水平，芮莉莉n 引等通过对k k - a y 2 型糖尿病小鼠 的研究认为茶多糖可有效降低k k - a y 糖尿病小鼠的血糖水平，且呈剂量效应关系，并对肝脏 糖代谢、脂质代谢有改善作用，其作用机理可能是提高高胰岛素敏感性，改善了胰岛素抵抗。 薛长勇n 7 1 等证实此观点，但其研究发现茶多糖能激活p p a r y ( 过氧化物增殖体激活型受体 一y ) ，且呈现齐| j 量效应关系，据此认为茶多糖提高胰岛素敏感性的作用可能不是其降低血糖 的主要作用机制，而可能是通过激活p p a r - y 使其介导的胰岛素敏感性增高所致。 1 1 2 降血脂 高血脂是人类心脑血管疾病的主要原因。茶叶多糖能降低血浆总胆固醇，防止实验性高 胆固醇血症的形成，可使高脂血症的血浆总胆固醇、甘油三醋及低密度脂蛋白下降，高密度 2 福建农林大学硕士学位论文高含量高活性多糖的乌龙茶种质资源与加工工艺研究 脂蛋白上升。 已有研究表明，茶多糖腹腔注射1 0 0 m g k g 剂量或灌胃1 0 0 0 m g k g 剂量，可明显降低高 脂鼠的血浆总胆固醇及中性脂水平n 引。王丁刚n9 1 等报道，高血脂大鼠口服茶多糖2 2 5 m g k g 和4 5 m g k g ( 均为1 0 天) ，其血清总胆固醇比对照组分别下降1 2 和1 7 ，血清甘油三酯 降低1 5 和2 3 ，低密度脂蛋白胆固醇分别下降6 和2 9 ，高密度脂蛋白胆固醇均增加 2 6 。周杰哺1 等研究表明，腹腔注射5 0 m g k g 剂量的t p s 后，正常小鼠的血清胆固醇和血清 甘油三酯只是略有下降，但无显著差异。但茶多糖能提高脂蛋白酯酶( l p l ) 活性，并能降低 该酶对抑制剂的敏感性，与肝素有相似作用，并能同l p l 结合，促进动脉壁l p l 入血而起到 抗动脉粥样硬化作用，这证实了朱力军瞳刚的观点。 1 1 3 抗血栓 这几年的研究表明茶多糖也有抗凝血及抗血栓作用，且可能作用于血栓形成的所有环 节，包括血小板黏附和聚集、血液凝固、纤维蛋白溶解等。 王淑如瞳等发现：灌胃茶多糖剂量5 0 m g k g ，可使小鼠凝血时间延长3 1 9 ( p 0 0 1 ) ； 灌胃给药3 7 m g k g ，可抑制家免实验性血栓形成，明显延长血栓形成时间，缩短血栓长度， 减少血小板数2 0 ，降低血小板粘附率4 3 ，延长凝血酶元时间4 0 ，降低全血粘度及血 浆粘度( 分别为1 6 和l l ) ，降低红细胞压积2 0 ，增加血沉7 5 。灌胃给药4 0 m g k g ， 增加豚鼠纤维蛋白溶解酶活力7 7 。在混合人血浆中加入不同量的茶多糖，3 7 。c 孵育1 0 m i n ， 0 0 5 m g 的茶多糖即可延长复钙时间，0 4 m g 可完全抑制血浆凝固。即茶多糖不仅起抗凝血、 抗血栓的作用，而且在体内、体外均有显著的抗凝作用，并减少血小板数，延长血凝从而影 响血栓的形成。另外，茶多糖能提高纤维蛋白溶解的活力。 1 1 4 降血压、耐缺氧及增加冠状动脉血流量作用 已有研究表明，茶叶多糖有降血压和保护心血管的作用n 引。以茶多糖2 2 5 m g k g 的剂量 进行十二指肠给药，1 0 r a i n 后s d 大鼠血压开始降低、心率减慢，3 0 m i n 后麻醉大鼠的血压下 降7 2 m m h g ，心率减慢1 5 ，且均显著低于对照组( p 0 0 5 ) 。经腹腔注射给药5 0 m g k g 和 1 0 0 m g k g 后，在密封缺氧的环境下，正常小鼠在常压下存活时间分别延长5 0 和6 6 ，而 并用异丙肾上腺素小鼠存活时间分别延长3 l 和2 9 ；心脏插管侧支注入茶多糖0 4 m l ( 1 0 m g m 1 ) 可显著增加离体心脏冠脉血流量3 7 ( p 0 0 1 ) 。 1 1 5 增强机体免疫功能 已有大量的实验研究表明，茶多糖具有增强免疫功能的作用瞳列。王丁刚他引等发现腹腔 3 福建农林大学硕士学位论文高含量高活性多糖的乌龙茶种质资源与加工工艺研究 注射茶多糖2 5 m g k g 和5 0 m g k g7 天时小鼠碳粒廊清速率分别增加6 0 和8 3 ，即茶多糖 能促进单核巨噬细胞的吞噬功能，增强机体自我保护能力。周杰伸1 等报道，茶多糖连续口服 1 4 d 后，处理组小鼠的脾脏指数、胸腺指数分别增加5 0 和5 2 。w a n gd t z 4j 等的研究结 果表明，茶多糖在3 0 m g m 1 1 0 o m g m l 的浓度范围内具有以血清凝集素为指标的体液免疫 增强作用，其中以浓度3 o m g m l 效果最佳，与对照相比差异达p o 0 0 1 水平；茶多糖还具 有促进单核巨噬细胞系统吞噬功能、增强机体自我保护能力。胡忠泽乜副等在从肉鸡的饮水 中分别加入0 、0 2 和0 4 的茶多糖，发现茶多糖能显著促进肉仔鸡胸腺的生长发育， 能明显升高血清中免疫球蛋白l g g 含量，提高t 一淋巴细胞数和淋巴细胞转化率，增强白细 胞吞噬功能，能显著提高肉仔鸡血清中s o d 活力、g s h p x 活力和c a t 活力，明显降低血清 中m d a 含量，且均都达到显著性水平( p 秋季，糖醛酸含量高低依次为夏季 秋季 春季，蛋白质的变化较小。 任健旧等研究认为茶叶存放时间越长，多糖含量越高。 2 3 2 茶叶加工工艺 原料相同的茶叶，绿茶初加工仅高温杀青，多糖向单糖转化的程度低；乌龙茶的晒青与 做青有利于多糖的水解；红茶为全发酵茶，多糖水解程度最大，多糖含量相对最低。汪东风哺训 等的研究表明级别为六级茶的红茶茶多糖的含量为0 8 5 ，而同一等级的绿茶则为为1 4 1 ； 同一产地的茶叶，绿茶中茶多糖较乌龙茶多，红茶最低。同一品种红茶和绿茶中，茶多糖含 量前者为0 8 5 4 - 0 1 0 ，后者为1 4 1 0 0 6 。 另外，茶叶的加工过程也影响茶多糖的提取率汹1 。黑茶渥堆是湿热作用、微生物作用和 酶促作用的后发酵过程，随着渥堆时间的增长，发酵程度加深。云南农业大学阳刳的研究表明 翻堆样中茶叶渥堆时间越长，茶多糖含量越高，一翻堆含量仅0 4 5 ，到四翻堆上升到1 6 8 。这一红茶与绿茶、乌龙茶相比发酵程度深而含量低相反，可能是发酵类型或发酵程度的 不同影响茶多糖的含量。 2 3 3 提取工艺 原料预处理：溶质与溶剂的接触面积越大，提取率越高。为此，一般将茶叶粉碎至4 0 5 0 目或更高，但要防止茶叶颗粒太小，加大固液分离难度。 脱脂处理：茶叶细胞外有脂质包围，为提高水浸出率可除去脂质。可使用的脱脂溶剂为 甲醇、乙醇、乙醇乙醚混合液( 1 ：1 ：1 ，水浴加热搅拌l h ，或回流提取卜3 h ) ，或单纯使用某 一有机溶剂如乙醇。 浸提参数：浸提技术指标包括浸提温度、时间、次数、料液比及浸提溶剂等。汪东风阳3 1 、 李布青盯1 等的研究表明，茶多糖宜用低温下浸提，以利于保持其活性。而清水岑夫晗1 的研究 则表明保持茶叶最佳降血糖作用的浸提温度还与茶叶的种类有关，对于绿茶多糖提取，其降 血糖效果依次是冰水( o c ) 温水( 4 0 。c - 5 0 。c ) 热水( 1 0 0 。c ) ，而对于红茶，多糖降血糖效果 则相反，即浸提温度要视茶叶产地、种类等而定。倪德江引等也认为不同来源的茶叶的加工 工艺、原料老嫩度各不同，其多糖理化性质存在一定差异，不同茶类茶多糖浸提所掌握的各 项提取参数也要有一定的差异。故对不同茶叶品种要采用各自适宜的参数，在保持最佳药理 8 福建农林大学硕士学位论文高含量高活性多糖的乌龙茶种质资源与加工工艺研究 活性的前提下，尽量提高提取率。然而，倪德江等认为对茶多糖提取率的影响的重要程度 依次为p h 值、温度、时间、茶水比，在酸性或碱性环境下提取的茶多糖糖含量和蛋白质含 量低，活性最低，温度对茶多糖活性有一定影响，但并未达到显著水平。这与长期以来，普 遍认为温度对茶多糖活性有较大影响相矛盾。 浸出量一般与浸提时间成正比。但扩散平衡后，时间即不起作用。所以浸提时间与溶剂 体积、浸提温度有关暗5 1 。 增加浸提次数能大大提高浸出率，一般2 - 3 次即可。溶剂不同，则提取成分不同，茶多 糖得率也不同。 曹鹏飞汹1 研究表明料液比、提取时间、温度及酒精浓度这4 个因素，其中浸提时间、温 度对茶多糖的提取率的影响最为显著，而乙醇浓度、料液比的影响则不明显。最佳提取条件 为：料液比1 ：l o ，浸提时间为6 0 m i n ，浸提温度为1 0 0 。c ，沉淀时所用的乙醇浓度为7 5 。 对于溶剂，其体积所占比例越大，提取越彻底，但会增加溶剂用量、浓缩工作量等，一 般| 司液比为l ：2 0 1 ：3 0 嘲1 。 沉淀剂的选择：茶叶浸出液中成分复杂、且各成分相互作用，沉淀剂及其用量不仅影响 茶叶复合多糖的得率，还影响其组成。刘亚林旧1 、黄桂宽等用乙醇沉淀出茶多糖；任健岛踟 等用丙酮沉淀多糖。杨其林吣引等通过正交试验确定了c t a b 沉淀法提取茶多糖的最佳工艺条 件为：离心时间1 2 m i n ，c t a b 加入量2 5 m l ，沉淀时间6 h ，该条件下多糖得率为1 3 4 。 陈海霞刨等研究表明超滤法所得多糖纯度高，且清除羟基自由基活性也最高，对羟基自 由基抑制率可分别比c t a b 沉淀法、醇沉淀法提高了2 3 5 、3 7 1 。 2 4 茶多糖的分析方法： 2 4 1 茶多糖含量分析 茶多糖的含量分析方法除了苯酚一硫酸法口刚( 后面有详细说明) 外，还有以下几种方法。 葸酮一硫酸法：葸酮浓度0 0 5 ，样品溶液与蒽酮一硫酸的比l ：4 ，1 0 0 反应5 m i n 后 立即于冰水中冷却3 0 m i n ，6 7 5 n m 比色，以半乳糖为标准，可提高茶多糖测定的准确度。平 均回收率达9 4 5 8 1 6 8 ，重现性好，r s d 为0 5 4 8 ( n = 6 ) 。而苯酚一硫酸法受颜色的影 响更大，茶多糖在提取和初步纯化过程中伴有大量的茶色素，因此多用葸酮一硫酸法口。傅 博耐7 2 1 等对葸酮一硫酸法进行了改进。 近红外光谱测定法：罗一帆盯3 1 等建立茶多酚和茶多糖的测定模型，模型的结果表明建模 的茶多酚和茶多糖的r ，r m se c v ，r se c v 分别为0 9 8 4 7 ，0 4 6 0 ，0 1 2 3 和0 9 4 7 0 ，0 1 3 6 ， 0 2 2 4 ：预测集的r ，r sep ，r sep 则分别为0 9 8 0 4 ，0 5 2 9 ，0 0 1 7 和0 9 6 8 2 ，0 1 1 1 ， o 福建农林大学硕士学位论文高含量高活性多糖的乌龙茶种质资源与加工工艺研究 0 0 3 0 。由此说明建立的近红外光谱一人工神经网络模型可用于预测茶叶中茶多酚和茶多糖的 含量。 另外，本实验之所以采用苯酚一硫酸法，是因为在茶多糖的提取过程中有进行初步的纯 化，基本上排除了茶色素的影响，而且前人在研究活性多糖时多有采用苯酚一硫酸法。 2 4 2 茶多糖的活性鉴定 对羟基自由基和超氧阴离子自由基的抑制效果：茶多糖对羟基自由基( o h ) 的抑制率 的测定多采用d 一脱氧核糖一铁体系法口引；茶多糖清除超氧阴离子自由基率测定采用黄嘌呤氧 化酶法。采用此类方法鉴定的较多，还有采用通过比较茶多糖对q 一淀粉酶酶活抑制效果口副 和进行动物实验，虽然进行动物实验的只有在药理成分和功能研究等方面时采用。 宋春和汹1 采用d 一脱氧核糖一铁体系法和黄嘌呤氧化酶法研究同一品种、不同季节鲜叶的 茶多糖和不同品种茶多糖等对羟基自由基和超氧阴离子自由基的清除。 3 茶树特异种质资源的研究进展 作为携带各种遗传物质并能亲子相传的茶树种质资源，是生产上直接利用、生物技术研 究和品种创新的物质基础口6 1 。而茶树特异种质资源的发掘和利用更有着无可比拟的应用前 景 3 1 茶树特异种质资源的研究价值 特异种质资源指超常规成分的种质及其它具有特殊性状( 如高光合效率、具特殊的树姿 的种质、高抗病性的种质等) 的种质，其中超常规成分的种质可分为两大类：某一营养成分 高于常规茶树品种、某一营养成分低于常规品种或无及含有特异成分的种质。本文拟主要阐 述超常规成分的茶树特异种质资源的发掘和利用。 3 1 1 作为生物技术研究和品种创新的物质基础 在作物种质资源中，特别是那些特异种质材料、收集与利用更可以带来作物育种的革命。 比如：我国水稻矮杆种质的发掘利用，成功地育成了丰产抗倒伏系列水稻矮杆品种，使我国 水稻单产每公顷增加7 5 0 k g 盯7 1 。此外，特异种质资源还可用于遗传研究、图谱构建、基因定 位和功能基因组研究。 茶有极其丰富的栽培种、地方品种和野生种的种质资源，其中有许多是特异种质资源， 只要我们认真发掘和收集，将在我国茶树品种创新方面，起到不可替代的作用。 1 0 福建农林大学硕上学位论文高含量高活性多糖的鸟尼茶种质资源与加工工艺研究 3 1 2 营养保健价值 伴随着社会的发展变化，癌症、糖尿症、肥胖症等日趋严重( 前已有详述) ，以及“人 类营养科学、食物科学和农业科学的发展以及学科间的交叉渗透，特别是农产品品质科学研 究的深入以及农产品与人类营养保健关系的揭示，人类的食物消费进入了科学的消费阶段， 即营养保健阶段盯引”。茶叶作为一种农产品，其保健品质日趋受到关注，成为当前茶叶的研 究热点。超常规成分的茶树种质加工的茶叶，在某方面往往比常规茶叶具有更好的保健品质。 3 1 3 市场潜力 创新是差异化的源泉，是帮助企业确立新的核心竞争力的主要动力盯引。我国目前茶叶企 业是一种小型、分散的格局，其销售规模较小，呈现一种“大的吃不好，小的吃不饱”的局 面，面对跨国公司及国内茶叶企业的激烈竞争，走一条差异化经营道路，以求得生存和发展， 这对企业来说是非常重要的油1 。茶树特异种质的发现和利用能够为企业的产品创新提供一个 根本的资源，从而有利于茶叶企业取得竞争优势，获得发展。 3 2 茶树特异种质资源的发掘 3 2 1 超常规成分的种质资源的发掘 “七五”至“八五”期间，在国家科技攻关项目的资助下，分别对遍布1 4 个省的茶树种 质资源进行了鉴定船1 8 引，筛选出了高多酚含量( 3 4 ) 9 份、高氨基酸( 3 7 ) 的有4 份、 高咖啡碱( 5 ) 7 份、高水浸出物含量( 4 8 ) 4 份，以及内质化学成分有茶多酚含量 高达3 3 、水浸出物含量达4 5 的小坡头茶和高氨基酸( 4 1 1 ) 、高咖啡碱4 1 的丫口 小茶。“九五”期间，又在国家科技攻关项目的资助下对遍布1 4 个省的茶树种质资源进行了 评价，筛选出了茶多酚含量 3 8 的资源4 份( 如弄岛野茶、河头白毛尖) 、咖啡碱含量 5 2 的资源6 份( 如东河大叶茶、曼喷龙大叶茶) 、筛选出品质超过国家品种的优咖啡碱 含量 4 5 ) 的特异品种或品系：白毫早，3 7 - 2 ，福安大白具有特性。 茶多酚方面：据陈亮和周智修对5 9 6 份资源生化成分研究的结果表明，茶多酚含量也是从 北到南逐渐升高，以云南资源为最高( 变化趋势与水浸出物一致) ，平均为2 8 4 1 1 福建农林大学硕士学位论文高含量高活性多糖的乌龙茶种质资源与加工工艺研究 ( 1 3 6 - 4 7 8 ) ，而儿茶素总量以湖南资源最高，平均为1 4 4 1 6 9 k g ( 8 1 1 9 2 6 2 1 7 9 k g ) c t e 。 龚志华旧引等从1 9 个茶树品种中筛选出了高茶多酚( 3 4 ) 的特异品种或品系：碧香早、 3 7 2 、福安大白茶。林金科呻5 1 等以福建省茶树品种园7 8 0 份资源为试验材料，筛选出了5 个品种或株系，其酯型儿茶素春、夏、秋三季平均含量高于1 9 ；8 个品种或株系，其新梢 酯型儿茶素含量在儿茶素总量中所占比例高达8 0 以上( 一般品种为6 8 ) 。林金科嘲1 等又从 4 5 个品种或株系( 福建省茶树品种园7 8 0 份资源中初步筛选出的) 筛出1 1 个品种或株系， 其在春、夏、秋三季平均含量高于1 3 ，其中，1 0 0 5 ，其新梢e g c g 含量在儿茶素组分中所 占比例高达7 5 3 0 - 8 0 5 7 ( 一般品种为5 0 ) ，其酯型儿茶素在儿茶素组分中所占比例高达 8 5 2 4 8 8 3 2 ，为极特异资源。吕海鹏7 1 等采用h p l c 分析技术从2 0 0 份高多酚茶树种质 中发现6 个e g c g 3 ”m e ( 表没食子儿茶素一3 一伊甲基一没食子酸酯，与其他主要儿茶素e g c g 、 e g c 、e c g 和e c 等相比具有更强的抗过敏和消炎等药理作用，比e g c g 更能有效的抑制柱状 细胞中多种蛋白激酶的活性和巨噬细胞中一氧化氮的产生与诱导型一氧化氮合成酶的表达 及比e g c g 高9 倍口服吸收率) 含量大于1 的茶树种质。 氨基酸方面：据陈亮和周智修对5 9 6 份资源生化成分研究的结果表明，氨基酸总量南部 地区资源比北部和东部地区低得多，平均为3 1 3 ( 1 1 一6 5 ) h 引。 龚志华哺4 1 等通过对1 9 个茶树品种的研究，筛选出了高氨基酸( 4 5 ) 的特异品种或品 系苹云。张俊嘲1 等分析了云南大叶种和福鼎白毛茶及其f l 代的4 2 个品系的茶氨酸含量， 挑选出茶氨酸含量高的材料5 份，平均含量为9 2 9 3 0 m g l o o g ；茶氨酸含量低的5 份，均含 量为2 9 8 4 1 m g l o o g 。福建农林大学农产品品质研究所筛选出了白茶优异新种质“w t 0 3 ”， 其新梢茶氨酸含量高达2 2 7 ，是种质资源平均值( 1 3 0 ) 的1 7 倍、含量最低品种“w t 4 0 ” ( o 9 5 ) 的2 4 倍蚓。 咖啡碱方面：据陈亮和周智修对5 9 6 份资源生化成分研究的结果表明，咖啡碱含量平均 为4 2 ( 1 2 - 5 9 ) ，高咖啡碱资源以云南为最多，福建次之h 引。 日本获得了咖啡碱含量在0 4 2 - 1 0 5 的单株1 1 个啪1 。中山大学张宏达教授也选育出 了天然无咖啡碱可可茶，其他科技人员对其在推广等方面的特性及其遗传物质进行研究，并 开发出了低咖啡碱茶饮料等9 1 镗9 3 州。龚志华旧引等通过对1 9 个茶树品种的研究，筛选出了下 高咖啡碱( 4 ) 特异品系水仙8 4 1 。 此外，王会m 1 等从1 2 份茶树种质资源中筛选出发芽早，并且茶多酚、氨基酸、咖啡碱 含量较高的j p 2 1 、j p 2 3 、j 2 2 及j 2 3 ，将可作为进一步开发研究早生、优质茶树品种的育种 材料：j 2 1 ，j 2 2 和j p 2 4 咖啡因含量较低，是培育低