（微生物学专业论文）改性壳聚糖的制备及抑菌效果评价.pdf

中文摘要 中文摘要 壳聚糖( c h i t o s a n ) 是甲壳素脱乙酰基的降解产物，由c l 一氨基d 一葡胺糖通过p 1 ，4 糖苷键连结成的直链状多糖，不溶于水和碱溶液，可溶于大多数的有机酸中，具 有许多独特的性质如无毒性、降解性、细胞亲和性和生物相容性等，是天然多糖 中唯一的碱性多糖。由于大分子链上分布着许多氨基和羟基，能够形成分子内和 分子间氢键，因而壳聚糖的结晶性较高、溶解性差，极大地限制了其应用。本研 究通过对壳聚糖与环糊精进行复合或者制备壳聚糖纳米自聚体，以伊维菌素作为 模型药物，目的是研制疏水性药物的载体。 本文采用戊二醛交联法制备环糊精壳聚糖复合物，利用官能团偶联的方法将 甲基聚乙二醇单甲醚接枝壳聚糖制备水溶性的壳聚糖衍生物。通过结构表征、载 药性能分析评价了这些改性材料的性能。 利用金黄色葡萄球菌和大肠杆菌进行抑菌实验，结果表明分子量为十万左右， 浓度为2 0 m g l 的壳聚糖对两种菌抑菌效果较明显，改性后的壳聚糖对金黄色葡萄 球菌，大肠杆菌抑菌效果均降低。 分别以p 环糊精( c d ) 及其与壳聚糖( c s ) 的复合物为载体对伊维菌素( i v m ) 进行包合。采用饱和溶液法制备i v m 1 3 - c d 包合物，用戊二醛交联法制备环糊精一 壳聚糖复合物，采用包埋法包载伊维菌素并测定其包封率及载药量，并用差示扫 描量热法( d s c ) ，x 射线衍射( x r a y ) ，傅里叶红外光谱( f t l r ) ，扫描电镜( s e m ) 对其性质进行了表征。结果表明p c d i v m 主、客分子比为6 ：l ，平均载药量为 3 0 0 8 4 - 0 1 1 ，平均包封率为2 9 5 4 _ - i ：1 2 1 。1 3 - c d - c s i v m 平均载药量为 1 0 2 , 4 - 5 7 5 ，平均包封率为1 5 1 3 a ：3 4 3 。f t i r 、x 一射线衍射和d s c 分析证实形 成了1 3 c d i v m 及p c d c s i v m 包合物，表明p c d c s m 的载药量及包封率低于 1 3 - c d m 包合物。用电镜扫描观察- ；1 3 环糊精壳聚糖微粒的表面结构，表明1 3 环 糊精壳聚糖微粒呈多孔性表面。p 一环糊精一壳聚糖的载药量和包封率受1 3 环糊精 壳聚糖重量投料比，交联剂用量和温度影响。结果表明采用戊二醛做交联剂时， 温度为6 0 ，重量投料比( 1 3 c d c h i t o s a n ) 为9 ：1 ，1 3 - c d c s 的载药量最大。 黑龙江大学硕士学位论文 本研究的另一部分工作是通过官能团偶联反应，合成甲基聚乙二醇单甲醚接 枝壳聚糖( m p e g g c s ) ，并使用d s c ，x - r a y ，f t i r ，s e m 对其进行了结构表征和 性质研究，根据其性质制备了纳米自聚体，与d 环糊精- 壳聚糖微粒相比在载药量 和包封率均有所提高，分别是1 9 6 5 0 o _ - 1 = 2 0 5 ，1 4 5 1 0 硅1 3 6 ，体外释放结果表明 m p e g g c s 纳米自聚体比p c d - c s i v m 具有较好的缓释效果，在8 个小时内累计释 放9 8 2 6 。 关键词：壳聚糖；环糊精；甲基聚乙二醇单甲醚；抑菌效果 a b s t r a c t a b s t r a c t c h i t o s a n , w h i c hi sal i n e a rp o l y s a c c h a r i d ec o m p o s e do fa - a m i n o - d - g l u c a nl i n k e d b yp 一1 ，4 - g l y c o s i d i cb o n d s ，i sp r e p a r e db ya l k a l i n ed e a c e t y l a t i o no fc h i t i n i ti si n s o l u b l e i nw a t e ro ra l k a l i n es o l u t i o n ，b u tc a nd i s s o l v ei nm a j o r i t yo f o r g a n i ca c i d s c h i t o s a nh a s m a n yu n i q u e f e a t u r e s s u c na s n o n t o x i c i t y , d e g r a d a b i l i t y , c e l la f f i n i t y a n d b i o c o m p a t i b i l i t y c h i t o s a ni st h eo n l ya l k a l i n ep o l y s a c c h a r i d e 、i t hm a n ya m i n oa n d h y d r o x y lg r o u p sd i s t r i b u t i n ga l o n gt h em a c r o m o l e c u l ec h a i n , w h i c hc a nf o r mi n t r a - a n di n t e r - m o l e c u l a rh y d r o g e nb o n d s t h e s ef e a t u r e sc a u s eh i g hc r y s t a l l i n i t ya n dl o w s o l u b i l i t yo fc h i t o s a n , l i m i t i n gi t sa p p l i c a t i o ne n o r m o u s l y t h i ss t u d yc o m p o u n d e d c h i t o s a n 谢t l lc y c l o d e x t r i no rp r e p a r e dc h i t o s a ns e l f - a g g r e g a t e sa t l l a n o - s c a l e ，u s i n g i v e r m e c t i n ( i v m ) 嬲m o d e ld r u g ，i no r d e rt od e s i g nt h ec a r r i e r sl o a d i n gh y d r o p h o b i c d r u g s c h i t o s a na n d c y c l o d e x t r i nc o m p o u n d sw e r ep r e p a r a e db yc r o s s l i n k i n gw i t h g l u t a r a l d e h y d e m p e g - g r a r - c h i t o s a n w a s p r e p a r e dt h r o u g ht h ef u n c t i o n a lg r o u p c o u p l i n g sm e t h o d t h e s em a t e r i a l sw e r ec h a r a c t e r i z e ds t r u c t u r a l l ya n da s s e s s df o r d r u g l o a d i n gc a p a c i t y a n t i b a c t e r i a l e x p e r i m e n ta l e c a r r i e d a g a i n s te s c h e r i c h i ac o l i 皿c o l i ) a n d s t a p h y l o c o c c u sa u r e u s 假a u r e u s ) ，t h er e s u l ti n d i c a t e dt h a t2 0 m g lc h i t o s a n 、) l ，i 吐l m o l e c u l a rw e i g h ta b o u t10 0 ，0 0 0h a do b v i o u s l yb a c t e r i o s t a s i se f f e c t , t h eb a c t e r i o s t a s i s e f f e c to fm o d i f i e dc h i t o s a na g a i n s te c o l ia n ds a u r e u sw a sa l ll o w e rt h a nt h a to f n o n - m o d i f i e dc h i t o s a n 1 3 - c y c l o d e x t r i na n dc h i t o s a n ( c s ) c o m p o u n dw e r eu s e d 私c a r r i e r sf o r mf o r i n c l u s i o n t h e p - c y c l o d e x t r i n - m w a s p r e p a r e db y s a t u r a t e ds o l u t i o na n d 1 3 - c y c l o d e x t r i n - c h i t o s a nw a sp r e p a r e db yc r o s s i n gl i n k i n g 、析m g l u t a r a l d e h y d e ； i v e r m e c t i nw a sl o a d e db yi n c u b a t i o nm e t h o da n dt h el o a d i n ge f f i c i e n c ya n da s s o c i a t i o n e f f i c i e n c yw a sd e t e r m i n e d i i i - 黑龙江大学硕士学位论文 t h ep r o p e r t i e so ft h e mw e r ec h a r a c t e r i z e dw i t ht h ed i f f e r e n t i a l s c a n n i n g c a l o r i m e t r y ( d s c ) ，x - b e a md i f f r a c t i o n ( x r a y ) ，t h ef o u r i e ri n f r a r e ds p e c t r u m 口t i r ) ， s c a n n i n ge l e c t r o nm i c r o s c o p e ( s e m ) t h er e s u l ti n d i c a t e st h ep r o p o r t i o no f1 3 - c da n d i v mw a s6 ：1 ，t h el o a d i n ge f f i c i e n c ya n da s s o c i a t i o ne f f i c i e n c yw a s3 0 0 8 + 0 1 1 a n d 2 9 5 4 4 - 1 2 1 ，r e s p e c t i v e l y t h ea v e r a g el o a d i n ge f f i c i e n c ya n da s s o c i a t i o ne f f i c i e n c y o f1 3 - c d - c s - mw a s1 0 2 4 - 5 7 5 a n d1 5 1 3 = t = 3 4 3 ，r e s p e c t i v e l y 1 3 一c d 一ma n d 1 3 - c d - c s - mc o m p o u n dh a v eb e e nf o r m e db yf t i r , t h ex b e a md i f f r a c t i o na n dt h e d s ca n a l y s i sc o n f i r m a t i o n ，a tt h es a m et i m e ，t h el o a d i n ge f f i c i e n c ya n da s s o c i a t i o n e f f i c i e n c yo f1 3 - c d - c s - i v m i sl o w e rt h a n1 3 - c d - m s t h es u r f a c et e x t u r eo f 1 3 - c d - c sw a so b s e r v e d 、i 也t h ee l e c t r o nm i c r o s c o p es c a n n i n g ，i n d i c a t e dt h a t1 3 - c d c s p a r t i c l ew a sp o r o u s t h ea v e r a g el o a d i n ge f f i c i e n c ya n da s s o c i a t i o ne f f i c i e n c yo f 1 3 - c d - - c s 一mw a sa f f e c t e db yt h ep r o p o r t i o no f1 3 - c da n dc s ，t i m ea n dt e m p e r a t u r e t h er e s u ri n d i c a t e dt h a tw h e nt h eg l u t a r i cd i a l d e h y d ew a su s e da st h ec r o s s l i n k i n g a g e n t ，t h et e m p e r a t u r ei s6 0 ，t h et h ew e i g h tp r o p o r t i o no f ( 1 3 - c d c h i t o s a n ) - i s9 ：1 ， t h e a v e r a g el o a d i n ge f f i c i e n c yo f1 3 一c d c sw a sl a r g e s t a n o t h e rp a r to ft h i ss t u d yi ss y n t h e s i so fm e t h y lp o l y e t h y l e n eg l y c o lm o n o m e t h y l e t h e rg r a f t e dc h i t o s a n ( m p e g - g - c s ) t h r o u g ht h ec o u p l i n gr e a c t i o no ff u n c t i o n a lg r o u p s ， a n ds t u d yi t sc h a r a c t e r i z a t i o no ft h es t r u c t u r ea n dp r o p e r t i e s ，a c c o r d i n gt ow h i c h ， n a n o a u t o p o l y m e ro fm p e g g c si sp r e p a r e d c o m p a r e d 、i t l l1 3 - c y c l o d e x t r i n - c h i t o s a n p a r t i c l e s ，t h er a t eo fd r u gl o a d i n ga n de n c a p s u l a t i o ne f f i c i e n c yi n c r e a s e dt o19 6 5 4 - 2 0 5 a n d1 4 5 1 4 - 1 3 6 ，r e s p e c t i v e l y , i nv i t r or e l e a s er e s u l t ss h o wt h a tt h es u s t a i n e d r e l e a s ee f f e c to f n a n o - - a u t o p o l y m e r o f m p e g - g - - c s w a sb e t t e rt h a n 1 3 - c d c s i v m ，w h i c hh a sc u m u l a t i v e l yr e l e a s e d9 8 2 6 i n8h o u r s k e y w o r d s ：c h i t o s a n ；1 3 - c y c l o d e x t r i n ；m p e g ；b a c t e r i o s t a s i se f f e c t - 黑龙江大学硕士学位论文 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他 人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得墨蕉延太堂或其他教育机构的 学位或证书而使用过的材料。 学位论文作者签名：弛鸶 签字日期拗年钥细 学位论文版权使用授权书 本人完全了解墨蕉江太堂有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本 人授权墨蕉江太堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索， 可以采用影印、缩印或其他复制手段保存、汇编本学位论文。 学位论文作者签名： 钽钮笺 签字日期函蝌月日 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： 导师签名： 孙勰 i 签字日期1 2 刃年月乡日 邮编： 电话： 第1 章前言 1 1 壳聚糖简介 第1 章前言 甲壳素( c h i t i n ) ，又名聚乙酰氨基葡萄糖，是结构类似于纤维素的生物大分子 聚合物，其含量仅次于纤维素，为世界上第二大类有机化合物。广泛的存在于虾、 蟹等甲壳动物及昆虫、藻类和真菌中1 1 1 。其化学命名为p 一( 1 4 ) 2 乙酰氨基2 一脱氧 d 一葡萄糖。壳聚糖( c h i t o s a n ) 是甲壳素脱乙酰基的降解产物，壳聚糖是a 一氨基一d 葡胺糖通过b 1 ，4 糖苷键连结成的直链状多糖j 壳聚糖不溶于水和碱溶液，可溶于稀盐酸、硝酸等无机酸，以及大多数的有 机酸中，具有许多独特的性质如无毒性、降解性、细胞亲和性和生物相容性，粘 膜吸附性等 2 1 ，特别是其具有游离氨基，是天然多糖中唯一的碱性多糖。由于大分 子链上分布着许多具有一定活性的氨基和羟基，可在重复单元上引入一定的基团 进行改性，生成相应的衍生物，扩大应用范围。壳聚糖还具有一些生物活性像免 疫性，抗菌性，创伤愈合活性【3 】o 因此，它们已在废水处理【蜘、食品工业、纺织、 化工、日用化学品【引、生物工程、药物传递1 9 1 及组织工程【1o 1 1 】方面等方面得到应用。 由于大分子链上分布着许多氨基和羟基，能够形成分子内和分子间氢键，因而壳 聚糖的结晶性较高、溶解性差，极大地限制了其应用1 2 4 4 】。 1 1 1 壳聚糖的化学改性 壳聚糖的化学改性【”d 8 1 会产生新的生物功能材料，这个反应并不能改变壳聚 糖的基本骨架，依靠引进的基团的性质仍然会保持其原有的物理化学和生化性质。 改性后的壳聚糖在药物传递1 9 1 及组织工程【2 9 1 方面等应用广泛。壳聚糖具有复杂 的双螺旋结构，分子键上有许多氨基、羟基及酰基。这些基团不但在各种反应中 起作用，而且会形成各种分子内和分子间的氢键，成为壳聚糖改性的物质基础。 壳聚糖容易进行酰基化、0 糖苷化 3 0 - 3 2 】、羧基化、醚化、n 酰化【3 3 。5 1 、酯化【3 6 - 3 8 1 和接枝共聚【3 9 4 刀等反应，增强其水溶性及稳定性。这些壳聚糖的水溶性衍生物一 般作为进一步化学改性的中间产物。 黑龙江大学硕士学位论文 壳聚糖的化学改性可以产生新的具有生物学功能的物质。这些反应不会改变 壳聚糖的基本骨架，但却能改善壳聚糖的物理和化学性质。在- n h 2 和o h 引入新 的功能基团可以改变壳聚糖的溶解性和其它性质，已经成为壳聚糖研究的最重要 的领域之一。 1 1 2 壳聚糖的物理改性 壳聚糖的物理改性包括共混，半互穿网络( s e m i i p n ) 结构，聚电解质复合物， 小分子无机物填充等几种。壳聚糖可以与其他天然的高分子材料或合成的高分子 材料如糖类，多肽类，脂类，药物等共混，它能使复合在一起的各个组分的优良 特性相互结合，制备出的各种功能性材料可以满足各个领域应用需求。在幅照下 交联，将两端带有丙烯酰( c h 2 c 叭d _ ) 不饱和基的( p e o 卜印l a ( 或p c l h p e o ) 三嵌段物，与壳聚糖共混，即可形成半互穿网络( s e m i i p n ) 结构，改性后的壳聚糖 有较明显的可逆的p h 响应性h 8 4 9 】。而且，在吸水性，机械强度，干湿状态，生物 降解性等方面，与壳聚糖也不相同。壳聚糖是一种天然碱性多糖，同时它易于化 学修饰，可引入负性基团如c o o 、一s 0 3 。等形成聚电解质复合物【5 0 5 3 1 。当带有 正电荷的壳聚糖与带相反电荷另一组分相混时，形成p e c 。通过自组装也可将一 系列的带相反电荷的聚电质形成超滤膜【5 4 , 5 5 ，可用于气体、液体、离子化合物的 分离。 壳聚糖和小分子无机物的复合物可以作为仿生材料 5 6 , 5 7 l ，药物的传递系统【5 8 】， 创伤敷料【5 9 1 ，微型胶囊剂【删等。 1 1 3 壳聚糖抑菌机理研究进展 壳聚糖的抗菌性是由a l l a i l 【6 1 】等1 9 7 9 年提出来的，壳聚糖的抗菌性和抗菌机 理一直成为国内外学者观注的焦点。但对其抑菌机理尚无明确的结论，影响实验 的因素较多，较复杂。由于实验所用的菌种的不同、采用的壳聚糖的分子质量的 不同、脱乙酰度的不同和采用不同的实验方法等都可能造成实验结果不同。而且 人们的观察角度也有所不同，因此在抑菌机理方面还存在许多不同的看法。普遍 认为壳聚糖的抑菌机理有以下几种6 2 , 6 3 】： 第1 罩前言 ( 1 ) 壳聚糖影响细胞膜的透过作用，引起微生物的死亡，从而达到抑菌作用 1 6 4 , 6 5 。( 2 ) 壳聚糖激活几丁质酶的活性，使微生物细胞壁降解，引起微生物细胞死 亡【响。( 3 ) 壳聚糖选择性地螯合对微生物生长起关键作用的金属离子，抑制了微生 物的生长和产毒1 6 7 , 6 8 。( 4 ) 壳聚糖直接与菌体的d n a 和m r n a 作用f 6 9 7 3 1 。( 5 ) 壳聚 糖与细胞质发生相互作用。 郑连英【刎等人研究了不同分子量的壳聚糖对大肠杆菌饵c d 哟和金黄色葡萄球 菌的抑制效果的不同。 冯小强1 7 5 1 等研究表明壳聚糖的抑菌活性，只有在酸性介质中才能表现出来。 壳聚糖对大肠杆菌，金黄色葡萄球菌，变形杆菌，白色念珠菌，绿脓杆菌都有抑 制作用，其抑菌活性受壳聚糖的分子量的大小及浓度的影响。壳聚糖对革兰氏阳 性菌比革兰氏阴性菌的作用强。壳聚糖的抑菌活性随脱乙酰度的提高而有所增强， 壳聚糖的- n h 2 是在抑菌作用中起关键作用的因子。 滕丽菊7 6 1 等研究壳聚糖的抗菌活性结果表明：较大分子量的壳聚糖对大肠杆 菌和金黄色葡萄球菌的抑菌作用较强。壳聚糖起到抑菌作用可能是因为壳聚糖上 的氨基0 m 3 + ) 与细菌细胞壁中带负电荷的磷壁酸或脂多糖结合，并螯合m 9 2 + 、c a 2 + 等阳离子，从而改变细胞壁的通透性。 宋献周等【7 刀研究认为随着壳聚糖分子量的下降其抑菌作用有逐渐增强的趋 势；而y o u n s o o k 删的研究结果恰恰相反，即随着分子量的上升壳聚糖抑菌效果增 强。 1 2p 一环糊精的简介 p 一环糊精( p c y c l o d e x t r i n ；1 3 - c d ) 具有外亲水，内疏水，上窄下宽的闭合筒状特 殊的结构，是近年来受关注的新型药物的包合材料，在医药、食品等领域都有广 泛的应用 7 9 , 8 0 1 ，i b - c d 结构如图1 2 所示。b - c d 是一种无臭，微带甜味，无毒而又安 全的白色结晶粉末。环糊精易溶于水，不溶于乙酸乙酯、乙醚、乙醇类物质等有 机溶剂中。环糊精在碱、热和机械作用条件下相当稳定，对酸的稳定性大于淀粉 和糊精。 由于具有其特殊的空筒结构，使其具有良好的黏结性和乳化分散性、提高药 黑龙江大学硕十学位论文 物的溶解性、降低毒性、去苦除臭，延长制剂效力等功能。 对环糊精进行化学改性以改善其吸附性【8 1 , 8 2 】，特别是将环糊精与其它高分子 化合物交联后形成的p c d 复合物，这样的化合物既保持了环糊精专一性的识别包 结的特点，又增强了复合物的机械强度，具有较好的物理和化学稳定性，成为越 来越多的学者研究的重点。 近年来，在药物制剂方面的应用使人们对p 环糊精( p c d ) 包合技术更加关注 8 3 , 8 4 】。p 环糊精( p c d ) 是以a 1 ，4 型配糖键相连的环状低聚糖，可以选择性地包 合有机小分子，形成稳定性的包结物【8 5 】。通过1 3 c d 包合作用，可以提高药物的稳 定性，增加药物的溶解度【8 6 , 8 7 1 ，含b 。c d 的高分子可同时具有两者的优点，能发挥 相邻分子问的协同作用【8 8 1 ，提高药物的生物利用度并调节释药速率等，环糊精及 其衍生物在提高药物生物利用度、稳定性以及改善药物溶解性等方面的特性，使 其能够广泛的用于药物控制释放系统中嗍。 o ，l 射 图1 - 1i b - c d 分子结构的各种表达式雏9 3 1 f i g 1 - 1t h e k i n d so fe x p r e s s i o no f1 3 - c dm o l e c u l a rs t r u c t u r e 【姗】 第1 章前言 1 3 甲基聚乙二醇单甲醚简介 甲基聚乙二醇单甲醚( m p e g ) 是一种不带电荷的线性大分子，可溶于水及绝大 多数有机溶剂，并具有较好的生物相容性，无毒性，抗凝血性、抗巨噬细胞吞噬 性等。目前，在新型生物材料的制备中，聚乙二醇可作为改性基团赋予材料新的 特性与功能。这些性质可延长胶束在体内的循环时间，避免被网状内皮系统吞噬， 并且末端具有功能基团的p e g 为胶束的靶向性提供了可能【9 4 ，9 5 1 。 近年来，m p e g g - c s 及其衍生物的研究非常广泛【9 6 - 9 9 1 。水溶性壳聚糖的开发 引起了许多研究者的关注【l o o i ，通常是在壳聚糖大分子链上引入亲水性聚合物短链 或亲水基团来改善其水溶性【1 0 1 1 。把m p e g 接枝到壳聚糖分子链上，可以提高壳聚 糖的水溶性及生物相容性。聚7 _ , - - 醇( p e g ) 是一种用途非常广泛的聚醚高分子化合 物，它可应用于医药、食品、卫生、化工等众多领域。主要集中应用于纳米药物 的载体 1 0 2 , 1 0 3 1 ，温度敏感的凝胶制型1 0 4 1 ，基因治疗【1 0 5 1 以及靶向治疗1 1 0 6 , 1 0 7 1 等。运 载的药物主要有全反式维甲酣1 0 8 1 、紫杉醇【1 0 9 , 1 1 0 l 、羟基喜树耐1 1 1 小5 】等。 1 4 伊维菌素简介 伊维菌素( i v e r m e c t i n ，r v m ) 是一种新型由阿维链霉菌发酵产生的半合成大环内 酯类抗生素类抗寄生虫药，是目前公认的具有广谱、高效、安全、残留少、无抗 药性的抗寄生虫新型良药【1 1 6 , 1 1 7 1 。对禽畜体内寄生虫( 线虫) 和体外寄生虫( 节肢动物) 有良好的预防和治疗作用【1 1 引。伊维菌素对吸虫和绦虫没有活性，但对线虫具有广 谱活性，对一些体外寄生虫( 节肢动物) 具有全身的杀灭作用，故有“内外杀虫 剂( e n d e c t o c i d e ) ”之称【1 19 ，1 2 0 1 。在剂型使用上，注射剂只能供皮下注射，不可静脉 注射和肌肉注射，肌肉注射时疼痛反应较明显，影响药物的使用效果。由于伊维 菌素常规剂型的有效期短，需要反复给药，因而有必要开发长效缓释和控释制剂 以延长其药效【1 2 1 1 。 1 5 壳聚糖及衍生物的抑菌作用的研究及应用 国内外目前所开发应用的抗菌剂种类有多种，大概可以分成无机抗菌剂、有 机抗菌剂、光催化抗菌剂以及天然抗菌剂等几种【1 2 2 1 ，壳聚糖做为一种天然的抗菌 黑龙江大学硕士学位论文 剂，因为其优良的特性而受到极其广泛的研究与应用。 天然抗菌剂是人类使用最早的抗菌剂，包括壳聚糖、天然萃取物等，大都是 从动植物中提炼精制的，具有毒性低、使用安全等优点，其主要缺点是耐热性较 差，药效持续时间较短。 壳聚糖是天然多糖中唯一的碱性多糖，壳聚糖抗菌剂已经在国内外都得到了 广泛的应用，但壳聚糖较低的溶解性使其应用受到限制，对其进行化学改性后的 水溶性衍生物可使其应用领域得到进一步的拓展。由于壳聚糖的大分子链上分布 着许多羟基和氨基，能够形成分子内和分子间氢键，使得壳聚糖溶解性差、结晶 性较高，极大地限制了其应用。为了扩大其应用范围，近年来人们应用各种方法 对其进行改性，在重复单元上引入不同的基团，生成相应的衍生物。 越来越多的人关注壳聚糖抑菌性能的研究及发展。许多实验已经证实了壳聚 糖的抑菌作用。但是由于壳聚糖的抑菌机理比较复杂，种类不同的微生物其抑制 作用可能不相同，而且影响壳聚糖抑菌能力的因素较多，壳聚糖对微生物的抑制 作用不仅与壳聚糖的脱乙酰度、分子量大小、浓度有关，还与试验菌的种类、环 境温度和p h 值等因素有关。 另外，大部分的壳聚糖需要在酸性环境溶解的条件下才能很好地发挥其抑菌 作用。而且通过大量的实验研究和应用新的实验方法，可以使人们更加明确其抑 菌机理，这将对推动其理论研究和应用研究起到重要的作用。 目前，甲壳素及其衍生物的应用已从纺织、造纸业扩展到了食品、环保、医 药、农林业、轻工业和生物工程等领域，有“2 1 世纪塑料 之称【1 2 3 1 。壳聚糖及其 衍生物具有良好的抑菌活性。通过抑制微生物d n a 的复制及转化，使微生物细胞 的分裂受到抑制【1 2 4 1 ，可以有效的抑制革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的生长。 目前，壳聚糖及其衍生物的抑菌活性的研究取得了很大的进展，壳聚糖抑菌 性能与其浓度、分子质量、脱乙酰度、p h 值、晶体形状等非生物因素有关f 垅m 8 】， 由于其受影响的因素较多且较复杂，其抑菌作用的机理尚不明确，对其抑菌趋势 及规律还没有一个一致的观点，但是，壳聚糖及其衍生物的抑菌活性仍然是可以 肯定的。不但壳聚糖本身具有抑菌作用，而且通过对壳聚糖的物理及化学改性， 第1 章前言 可以开发壳聚糖作为一种新型抗菌材料，应用于医药、化工、食品、农业等许多 领域【1 2 9 1 3 2 1 ，为社会的发展与科学的进步发挥了很大的作用。但目前为止，有关壳 聚糖及其衍生物的抗菌、抑菌方面的应用与研究还存在一些问题，因此在以后的 研究中应该加强对其抑菌机理及其规律性的深入的研究，从而认识其抑菌机理及 规律。 1 6 本论文研究的目的 本研究的目的在于拓展壳聚糖的应用范围，通过与环糊精复合或者接枝甲基 聚乙二醇单甲醚来增强其对疏水性药物的载药性能；另一方面，通过壳聚糖改性 前后抑菌性能的比较结果，来确定壳聚糖结构与抑菌性能的关系。 黑龙江大学硕士学位论文 第2 章p 环糊精一壳聚糖复合物的制备及性能评价 2 1 材料与仪器 2 1 1 试验材料 壳聚糖( 平均粘性分子量4 0 0 ，0 0 0 k u ，购于国药集团化学试剂有限公司) ； p - 环糊精( p - c d ) ( 平均分子量11 3 5 ，天津市科密欧化学试剂开发中心) ； 其余试剂为分析纯 大肠杆菌、金黄色葡萄球菌为本实验室保存 2 1 2 仪器 真空冷冻干燥机：l g 5 ，上海市离心机械研究所，中国 电子扫描显微镜( s c a n n i n ge l e c t r o nm i e r o s c o p e ，s e m ) ：s - 3 4 0 0 ，h i t a c h is c i e n c e s y s t e m s ，l t d ，日本 粒度分析仪：z e t a p a l s 9 0 ，b r o o k h a v e n ，美国 傅立叶变换红外光谱仪：s p e e t m mo n e ，p e r k i ne l m e r ，l t d ，美国 紫外分光光度仪：u v - 2 5 5 0 ，岛津，日本 x 射线衍射仪：d m a x 3 b ，日本理学公司，日本 d s c t g a 仪：s d tq 6 0 0v 2 0 5 ，t a 公司 超声波细胞粉碎机：j y 9 2 i id n ，宁波新芝生物科技股份有限公司，中国 双人双面净化工作台：s w - c j 2 f 型，苏州净化设备有限公司，中国 各规格移液器：3 1 1 1 型，e p p e n d o r f 公司，德国 数显恒温磁力搅拌器：h j 2 a ，江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司，中国 高压灭菌锅：m l s 一3 7 5 0 ，s a n y o 公司，日本 2 2 方法 2 2 1 载伊维菌素p 一环糊精包合物制备 ( 1 ) 饱和水溶液法：称取1 8 5 克的p c d 溶于磷酸盐缓冲液( p h = 7 4 ) 中使之 饱和，置于恒温磁力搅拌器上，另取一定量的伊维菌素，用无水乙醇溶解，缓慢 第2 章b 一环糊精一壳聚糖复合物的制备及性能评价 i i i i 滴入到p c d 溶液中，恒温磁力搅拌2 4 h ，冷藏过夜，抽滤，收集沉淀物，真空干 燥后，即得。 ( 2 ) 超声法：称取p c d l 8 5 克，加1 0 0 m l 蒸馏水加热溶解，另取一定量的伊 维菌素加无水乙醇溶解，缓慢滴加到b c d 溶液中，超声3 0 m i n ，后置于1 2 0 r m i n ， 2 8 。c 摇床振荡1 2 h ，冷藏过夜，离心，并用无水乙醇洗去未包合的伊维菌素，反复 洗三次，去上清，将沉淀真空干燥后，即得。 2 2 2 伊维菌素的含量测定 2 2 2 1 伊维菌素测定波长的选择 伊维菌素在2 4 5 n m 处有最大紫外吸收，而在此波长下d 。c d 无吸收，选择 2 4 5 n m 作为紫外检测波长测定样品或溶液中伊维菌素的含量。 2 2 2 2 伊维菌素测定标准曲线的建立 称取3 0 0 m g 伊维菌素标准品，精密称定，溶解于1 0 0 m l 无水乙醇中，得到 3 m g m l 的伊维菌素母液，低温保存。制作标准曲线的工作液时，将母液用无水乙 醇稀释得到0 0 4 、0 0 3 、o 0 2 、o 0 1 和0 0 0 5 m g m l 的伊维菌素溶液，在最大吸收 波长2 4 5 n m 处测定吸光度( a ) 并计算出平均值，以吸光度( a ) 对伊维菌素浓度 ( c ) 线性回归，得到标准曲线的回归方程为：a = 3 5 6 8 4 c - - 0 0 0 7 9 ，r = i 。 2 2 2 3 回收率、载药量和包封率的测定 根据不同制备方法所得包合物及壳聚糖与环糊精复合物中伊维菌素的含量， 采用紫外吸收法，将测得的o d 值代入标准曲线的回归方程中，计算出相应的浓 度值，根据所用无水乙醇的体积即可求出相应包合物中m 的质量，将值代入下 式计算包合物收率，载药量和包封率及回收率： 回收率( o u t p t i te 蹦e n c y ) = 而丽意掣器o 载药量( 1 0 a d i n ge 蹴e n e y ) = 砥鑫器翼器磊丽堋 包封率( a s s o c i a t i 。ne m c i e n c y ) = 号磊豢墨黼，。 黑龙江大学硕十学位论文 2 2 3d 环糊精。壳聚糖复合物的制备 将一定量的p c d 与壳聚糖( 环糊精壳聚糖重量比9 ：1 ) 溶于2 的醋酸溶液 中，加入烧杯中磁力搅拌一定时间，待二者混合均匀后，在5 0 6 0 下，滴加交 联剂戊二醛，反应1 2h 后，用2 m o vln a o h 调p h 值至p h = 7 8 ，继续搅拌反 应0 5h ，冷却，将析出的沉淀用水浸泡并洗涤至中性，再用丙酮浸泡并洗涤2 - - 一3 次，冷冻真空干燥，得到p c dz s 交联物。 2 2 4 理化性能测定及结构表征 2 2 4 1b 环糊精包合物及复合物的扫描电镜观察 将制备好的i b - c d i v m 和1 3 - c d 壳聚糖i v m 包合物粉末薄薄的铺在粘有导电 胶布的样平台上，固定，设置的离子化电流为1 5 m a ，喷金1 2 0 s ，然后用扫描电镜 进行观察。 2 2 4 2 红外光谱分析( f t 瓜) 分别对1 3 - c d 、壳聚糖、1 3 - c d - 壳聚糖、m p e g 、m p e g g - c s 、甲醛进行傅里 叶红外光谱扫描，测定条件为k b r 压片，扫描范围4 0 0 0 3 7 0 c m 一 2 2 4 3 差示扫描量热热重分析( d s c - t g ) 在通空气条件下，用d s c t g a 仪对样品进行分析，取样品5 _ 2 0m g 左右， 升温速度为1 0 m i n 1 ，升温范围为1 0 - 8 0 0 。 2 2 4 4x 射线衍射分析 将1 3 - c d 、壳聚糖、i b - c d 壳聚糖进行x 射线衍射分析，波长o 15 4 0 6 n m ，电 压4 0 k v ，电流2 0 m a ，波滤器为石墨，取样点步长o 0 2 度，扫描速度8 度m i n 。 2 2 5b 一环糊精复合壳聚糖的抑菌效果 分别对e c o l i ，s a u r o u s 菌种常规培养至三代，采用梯度稀释法，得到大肠杆 菌和金黄色葡萄球菌的最佳抑菌浓度分别为1 0 9 和1 0 7 c f u m l 。将壳聚糖及改性 后的壳聚糖用2 醋酸溶解后用稀n a o h 溶液调p h 值至4 5 。先将素琼脂倒入平板 中，待凝固后，插上牛津杯，再一定量的茵悬液加到营养琼脂培养基中，混匀后 倒平板，拔掉牛津杯，使抑菌剂的终浓度分别为2 m g l 、2 0 m g l 、2 0 0 m g l 。以等 第2 章b 一环糊精一壳聚糖复合物的制备及性能评价 体积2 醋酸取代抑菌剂的平板为对照，每种处理均作两个平行样。将平板置生化 培养箱中3 7 ( 3 下培养，大肠杆菌培养2 4 h ，金黄色葡萄球菌培养3 6 h 。 2 3 结果与讨论 2 3 1p 环糊精包合物的制备方法比较 不同制备方法制备的包合物的收率和载药量见表2 1 。由表2 1 可见，饱和水溶 液法无论从收率和载药量上均高于其他方法，因此，采用饱和水溶液法制备包合 物。 表2 1 包合物的收率，包封率和载药量 t a b l e2 - 1o u t p u t , a s s o c i a t i o ne f f i c i e n c ya n dl o a d i n ge f f i c i e n c yo f t h ei n c l u s i o n 制备方法 收率慌包封率载药量 超声法 3 3 2 6 7 3 7 2 1 饱和溶液法1 3 1 6 2 9 5 4 3 8 0 9 2 3 2p 一环糊精一壳聚糖复合物的制备方法 本文采用的是戊二醛交联法制备的p 环糊精壳聚糖复合物，过程简单，加入 的试剂较少，影响实验结果的因素较少，且具有较高的产率，而刘卿f 1 3 3 】等采用一 种新的合成方法，在n 2 保护条件下，对壳聚糖酰胺化及氨基保护，然后再加入环 糊精，研究均相条件下壳聚糖固载p 环糊精( c s c d ) 的新合成方法，经红外光谱和 x 射线衍射c x r d ) 对其结构进行表征，该衍生物中环糊精的表观固载量为3 4 8 0 v m o v g ，比其他相似类型的非均相反应的接枝率要高。这个过程较复杂且使用较多 的试剂，反应条件受较多因素影响，与本文的方法相比较，较繁琐。 陈晓青和刘卿掣1 3 4 】研究的方法比较相似，合成一种新型的化学修饰b 环糊精 接枝壳聚糖，首先对d 环糊精进行羧甲基化、酰氯化，再通过酰胺化反应使p 环 糊精接枝到壳聚糖分子结构上，使产物兼具有壳聚糖和b 环糊精的结构和性能。 利用壳聚糖对酚的吸附和p 一环糊精对酚的包合作用，研究这种化学修饰p 环糊精 接枝壳聚糖对水溶液中酚类物质的吸附性能。 壳聚糖可通过双官能团的醛、环氧化物或酸酐等进行分子内或分子间交联， 黑龙江大学硕士学位论文 得到不溶的交联产物。 常用的交联剂有戊二醛、环氧氯丙烷、环硫氯丙烷等，壳聚糖分子中的活性 基团n h 2 和一o h 一方面是吸附作用的活性中心，同时又是发生交联反应的活性中 心。交联后的壳聚糖和未交联的壳聚糖在刚性、酸溶性、重复使用性、吸附性和 选择性等方面都有所改善1 3 5 , 1 3 6 】。交联反应可在室温下进行，并且反应速度较快； 反应既可在水溶液中进行，也可在非均