（海洋生物学专业论文）盲鳗、七鳃鳗、有颌类的进化关系和重组蛋白活性鉴定.pdf

盲鳗、七鳃鳗、有颌类的进化关系和重组蛋白活性鉴定 学位论文独创性声明 本人承诺：所呈交的学位论文是本人在导师指导下所取得的研究成果。论文中除特别 加以标注和致谢的地方外，不包含他人和其他机构已经撰写或发表过的研究成果，其他同 志的研究成果对本人的启示和所提供的帮助，均已在论文中做了明确的声明并表示谢意。 学位论文作者签名： 刁司谚 日 期：炒扩，彳，f 0 ， vv 学位论文版权的使用授权书 本学位论文作者完全了解辽宁师范大学有关保留、使用学位论文的规定，及学校有权 保留并向国家有关部门或机构送交复印件或磁盘，允许论文被查阅和借阅。本文授权辽宁 师范大学，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库并进行检索，可以采用影印、 缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。保密的学位论文在解密后使用本授权书。 躲习司如 指导教师签名： 日期： 盲鳗、七鳃鳗、有颌类的进化关系和重组蛋白活性鉴定 第一篇基于生物信息学的4 8 个基因家族的系统发生分析揭 示盲鳗、七鳃鳗和有颌类的进化联系 摘要 现存脊椎动物被公认为3 个主要类群：盲鳗、七鳃鳗和有颌类。关于它们 之间的系统进化关系，长期以来存在两种观点。一种传统的观点支持圆口纲理 论认为盲鳗和七鳃鳗作为无颌类群体是较有颌类低等的脊椎动物；另一种观点 认为七鳃鳗是有颌类的姐妹群体，盲鳗是较原始的脊椎动物。为了更清晰地阐 明盲鳗、七鳃鳗和有颌类之间的系统发生关系，本文选择了三个类群中同源的 4 8 个基因家族进行系统进化分析。结果表明：其中3 4 个核基因序列构建的进化 树支持圆口纲理论，而1 4 个线粒体基因序列构建的进化树揭示七鳃鳗是有颌类 的姐妹群。本文经过各方面论证最终给出了支持圆口纲理论的依据。此外，外 群的选择、构建系统发生树时所选择的软件和做树方法都将影响到系统发生关 系的判断。+ 因此，发展新的方法来解决这一问题是非常迫切的。 关键词：系统发生关系，盲鳗，七鳃鳗，有颌类，外群，建树方法 盲鳗、七鳃鳗、有颌类的进化关系和重组蛋白活性鉴定 a b s t r a c t i th a sb e c o m ec l e a rt h a tt h ee x t a n tv e r t e b r a t e sa r ed i v i d e di n t ot h r e em a j o rg r o u p s ， t h a ti s ，h a g f i s h e s ，l a m p r e y s ，a n dj a w e dv e r t e b r a t e s m o r p h o l o g i c a la n dm o l e c u l a r s t u d i e s ，h o w e v e r , h a v er e s u l t e di nc o n f l i c t i n gv i e w sw i t hr e g a r dt ot h e i r i n t e r r e l a t i o n s h i p s t oc l a r i f yt h ep h y l o g e n e t i cr e l a t i o n s h i p sb e t w e e nt h e m ，4 8 o r t h o l o g o u sp r o t e i n - c o d i n gg e n ef a m i l i e sw e r ea n a l y z e d e v e na st h ea n a l y s i so f3 4 n u c l e a rg e n ef a m i l i e ss u p p o r t e dt h em o n o p h y l yo fc y c l o s t o m e s ，t h ea n a l y s i so f1 4 m i t o c h o n d r i a lg e n ef a m i l i e ss u g g e s t e dac l o s e rr e l a t i o n s h i pb e t w e e nl a m p r e y sa n d g n a t h o s t o m e sc o m p a r e dt oh a g f i s h e s l a m p r e y sw e r es i s t e rg r o u po fg n a t h o s t o m e s t h er e s u l t so ft h i ss t u d ys u p p o r t e dt h ec y c l o s t o m e s c h o i c eo fo u t g r o u p ，t r e e - m a k i n g m e t h o d s ，a n ds o f t w a r em a ya f f e c tt h ep h y l o g e n e t i cp r e d i c t i o n ，w h i c hm a yh a v e c a u s e dm u c hd e b a t eo v e rt h es u b j e c t d e v e l o p m e n to fn e wm e t h o d sf o rt a c k l i n gs u c h p r o b l e m si ss t i l ln e c e s s a r y k e y w o r d s ：p h y l o g e n e t i cr e l a t i o n s h i p ；h a g f i s h ；l a m p r e y ；g n a t h o s t o m e ；o u t g r o u p s ； t r e e - m a k i n gm e t h o d 盲鳗、七鳃鳗、有颌类的进化关系和重组蛋白活性鉴定 第二篇重组日本七鳃鳗口腔腺分泌 l 2 5 1 蛋白表达纯化及活性鉴定 摘要 本项课题根据日本七鳃鳗口腔腺c d n a 文库中c d n a 序列和部分e s t 预测 功能基因片段，发现日本七鳃鳗口腔腺分泌物中大量存在选择性阻断t 淋巴细 胞k v l 3 通道样蛋白质，命名为l 2 5 1 。l 2 5 1 属于c r i s p 蛋白家族，该家族在结 构上具有三个区域：n 端的p r 1 结构域( p a t h o e g e n e s i s r e l a t e dg r o u p1d o m a i n ) 、 c 端的c r d 结构域( c y s t e i n e r i c hd o m a i n ) 以及连接这两个结构域的一段稳定 的铰链区。通过大量相关蛋白结构与功能的分析和比对，得出i , 2 5 1 蛋白与c r i s p 家族特有的代表性结构域c r d 具有相同的保守序列和功能位点。 根据序列特异性和酶切位点设计特异性引物，将l 2 5 1 功能基因从c d n a 文库 中调取全长基因，连接至u p e t 2 3 b ，转化到大肠肝菌r o s e t t a 表达菌中诱导表达出 包涵体蛋白质，经变性，亲和层析纯化和复性得到l 2 5 1 蛋白。用d y n a lt c e l l n e g a t i v ei s o l a t i o nk i tv e r 分选健康人外周血t 淋巴细胞进行l 2 5 1 蛋白活性检 测。结果表明：细胞计数和m 丌检测，l 2 5 1 在0 1 u g m l , 0 3u g m l ，0 5 u g m l ，0 7 u g m l 浓度梯度内对t 淋巴细胞增殖有抑制作用并呈现剂量依赖；细胞 周期检测显示，在以上浓度梯度内l 2 5 1 将分裂期细胞阻断在g 1 s 并呈现剂量依 赖；流式细胞仪f l - 1 通道检测c f s e 染色，荧光强度的变化表明l 2 5 1 对t 淋巴细 胞增殖的抑制作用。自身免疫性疾病病人的t 淋巴细胞k v l 3 通道高表达，正常 细胞仅有少量表达。k v l 3 通道阻滞剂的高度特异性和专一性使免疫抑制治疗自 身免疫性疾病而不损害全部细胞免疫这个新途径成为现实。l 2 5 1 蛋白有望成为 k v l 3 通道阻滞剂，作为一种新的免疫抑制剂其更高的特异性和更少的损害将成 为比经典免疫抑制更具吸引力的目标。该实验结果为我们进一步搭建l 2 5 1 和 k v l 3 通道的作用模型提供了一定依据。 关键词：t 淋巴细胞细胞增殖自身免疫性疾病k v l 3 通道 盲鳗、七鳃鳗、有颌类的进化关系和重组蛋白活性鉴定 a b s t r a c t t oi d e n t i f yt h ef u n c t i o n a lg e n ef r a g m e n t ac d n a l i b r a r yw a sc o n s t r u c t e df r o mt h e o r a lg l a n do f l a m p e t r aj a p o n i c a a f t e rr a n d o ms e l e c t i o no fc l o n e sf o rs e q u e n c i n ga n d b l a s t xa n db l a s t np r o g r a m su s e df o rs e q u e n c es i m i l a r i t ya l i g n m e n t ，as e l e c t i v e b l o c k i n go fk v l 3l i k ep r o t e i nn a m e dl 2 5 1w a sf o u n d l 2 5 1b e l o n g st oc r i s p f a m i l yw h i c hc o n t a i n st h r e es t r u c t u r a ld o m a i n ：p a t h o e g e n e s i s r e l a t e dg r o u p1d o m a i n ( p r 1 d o m a i n ) al i n kd o m a i na n dac y s t e i n e r i c hd o m a i n ( c r d ) l 2 5 1m a ys h a r e i d e n t i c a lc o n s e r v a t i v es e q u e n c e sa n dt h es a m ef u n c t i o n a ls i t ew i t hc r db va n a l y z i n g o fm a s si n t e r r e l a t e dp r o t e i n s f u n c t i o na n dc o n s t r u c t i o n s e q u e n c es p e c i f i cp r i m e r sw e r ed e s i g n e dt oo b t a i nt h ef u l l l e n g t hc d n ae n c o d i n g t h el 2 51p r o t e i n t h e nt h ec d n aw a sd i r e c t i o n a l l yc l o n e di n t ot h ep e t 2 3 ba n d t r a n s f o r m e di n t oec o l dr o s e t t a ，a n de x p r e s s i o nw a si n d u c e db yi p t g a f t e rt h e i d e n t i f i c a t i o nb ys d s p a g e t h er e c o m b i n a n tp r o t e i n sw e r ep u r i f i e db yas p e c i f i c h i s - t a gb i n d i n gs t e pi nw h i c ht h et a r g e tp r o t e i ns t r o n g l yb i n dt oac h r o m a t o g r a p h y c o l u m nb e a r i n gn i z + a f t e rd e n a t u r ea n dr e n a t u r eb yd i a l y z a t i o n ，t h ea c t i v i t yo ft h e i n h i b i tp r o l i f e r a t i o no ftl y m p h o c y t ew a st e s t e di nw h i c ht l y m p h o c y t ew e r ep u r i f i e d f r o mh u m a np e r i p h e r a lb l o o db yd y n a ltc e l ln e g a t i v ei s o l a t i o nk i tv e ri i l 2 51 w a st e s t e dt oi n h i b i tt h ep r o l i f e r a t i o no ftl y m p h o c y t eb yt h em e t h o do fm t ra n d t a k i n gc o u n t so fc e l l st o w a r d sac o n c e n t r a t i o ng r a d i e n ti n0 1 u g m l0 3u g m l ，0 5 u u m l ，0 7u g m l m e a n t i m e ，t h ec e l lc y c l ew a sa l s ot e s t e db yf l o wc y t o m e t r yt h a t s h o w e dt h ed i v i d i n gc e l l sw e r eb l o c k e da tg 1 sp o i n tt o w a r d sac o n c e n t r a t i o n g r a d i e n t c f s es t a i n i n g ，f l o wc y t o m e t r y ，f l c h a n n e la n dr e l a t e ds o f t w a r ew e r eu s e d t od e t e c tt h ef l u o r e s c e n c ei n t e n s i t ya n da n a l y s i st h ei n h i b i t i o nf o rtl y m p h o c y t e p r o l i f e r a t i n g t h e r ea r ee l e v a t e dk v l 3p o t a s s i u mc h a n n e le x p r e s s i n go ntl y m p h o c y t ew i t h a u t o i m m u n ed i s e a s e sb u tl o wl e v e li nn o r m a l t h eh i g hs e l e c t i v eo fk v l 3b l o c k e r s m a k et h en e wt h e r a p e u t i c a lw a ya b o u ti m m u n ei n h i b i t o rf o ra u t o i m m u n ed i s e a s e t h e r a p yd o i n gn oh a r mt oi m m u n es y s t e mr e a l i z e d l 2 5 1a r eh o p e f u lt oa c ta st h e k v l 3b l o c k e r sa n da san e wi m m u n ei n h i b i t o rw i l lb et u r n e di n t oam o r ea t t r a c t i v e t h e r a p e u t i ct a r g e tt h a nc l a s s i c a li n h i b i t o rb e c a u s eo fm o r eh i g hs e l e c t i v ea n dl e s s h a r m k e yw o r d s ：tl y m p h o c y t e c e l lp r o l i f e r a t i o na u t o i m m u n ed i s e a s e k v l 3p o t a s s i u mc h a n n e l 盲鳗、七鳃鳗、有颌类的进化关系和重组蛋白活性鉴定 第一篇基于生物信息学的4 8 个基因家族的系统发生分析揭示 盲鳗、七鳃鳗和有颌类进化联系 第一章基因与基因组进化研究中的生物信息学 1 1 生物信息学概述 生物信息学( b i o i n f o m a t i c s ) 是2 0 世纪9 0 年代以来，随着人类基因组计划 ( h u m a ng e n o m ep r o j e c t ：h g p ) 和计算机科学的发展而出现的- c j 新兴的边缘 交叉学科。其核心是研究基因组结构与功能间的关系，涉及生物信息的采集、 分析和应用等方面，也即用计算机辅助数据管理的方法来收集、分析、再现生 物信息以了解生命过程。生物信息学不仅仅是针对生物信息本身，还应包括医 疗( m e d i c a l i n f o r m a t i c s ) 和制药( p h a r m a c o i n f o r m a t i c s ) 等与生命活动相关信息的管 理和分析。随着比较基因组学、功能基因组学、蛋白质组学以及代谢组学等学 科的飞速发展，生物信息学所涵盖的范围也在不断的扩大f 1 。5 l 。 生命过程包含着信息的存储、处理和转化，而其中最根本的信息则蕴含于 基因组( g e n o m e ) 中。从上世纪末期开始，科学界便开始了模式生物全基因组 的测序工作，同时也宣告了后基因组时代( p o s t g e n o m i ce r a ) 的到来。伴随着 2 0 0 3 年人类全基因组序列测定的完成，生命科学研究的重点也推进到基因组解 码的阶段。生物信息学的出现和发展无疑提供了一条新的研究途径：其强大的 数据管理和分析能力，使之能够大海捞针、去浊还清，从海量的生物数据中发 现规律，提取有用的生物信息。生物信息学不仅仅局限于基因组的研究，事实 上它已被广泛地运用于生命科学、医疗、制药研究的各个方面。目前，生物信 息学的主要研究内容包括：基因组信息学、比较基因组学、进化基因组学、蛋 白质空间结构模拟与预测、药物分子设计、基因表达的调控、基因功能的预测、 芯片表达数据分析、分子进化与生物起源、分子调控网络、复杂疾病分子网络 以及系统生物学等。生物信息学已成为整个生命科学的重要组成部分，是生命 科学研究的前沿热点领域。生物信息学已在生命科学诸多领域研究中被广泛应 用1 5 d 引，业已成为重要的研究手段，相信生物信息学的发展将极大地加速生命科 学的进步。 盲鳗、七鳃鳗、有颌类的进化关系和重组蛋白活性鉴定 1 2 基因家族进化研究中的若干概念简述 1 2 1 基因家族与蛋白质家族 1 2 1 1 基因家族 染色体上的全套基因，或者更准确地说是单倍体染色体上的全套基因，被 称为基因组。而在基因组进化过程中，一个基因通过基因复制产生了两个或者 更多的拷贝，这些基因即构成一个基因家族，是具有显著相似性的一组基因， 编码相似的蛋白质产物【1 4 1 。 1 2 1 2 蛋白质家族 蛋白质家族是依序列或者结构相似性聚合成家族，具有大于5 0 的同一性， 且具有相似的生化功能的一组蛋白质。其中由序列相似性联系组成的不等 长度的蛋白质家族成员的组合构成蛋白质超家族。超家族的成员具有共同的进 化祖先，其序列排列中同一性小但由相当数量共同结构和功能的蛋白质可以分 在同一个家族中。尽管某一蛋白质序列可能包含从几个家族中发现的域，这也 表明其复杂的进化历史，但是通过多重序列的比对，该序列将基于相似性而被 划分到唯一一个同型超家族1 1 5 。2 1 1 。 结构域的分化和基因复制过程产生了蛋白质家族，随着物种的分化，一个 新衍生的基因组将继承祖先物种的家族，但同时也将发展新的家族以应对进化 挑战。对一个生物编码的蛋白质与其它每一个进行比较( 即全部对全部比较) ， 可以揭示被扩增的蛋白质家族以及进化过程中发生的重分化。当该蛋白质组中 两个或多个蛋白质因具有相同的结构域而拥有高度相似性，它们很可能就是旁 系同源( p a r a l o g o u s ) ，其基因是由基因复制产生【2 2 - 矧。经直系同源聚类，若两 种生物的蛋白质组可以比较，就可以识别直系同源物。然而在许多情形中，每 个直系同源物属于一个家族，该家族由基因复制事件所产生的相关旁系同源序 列组成。因此，在进行数据库搜索时，直系同源物将不仅与第二个蛋白质组中 的直系同源序列相匹配，而且与那些其它的旁系同源序列相匹配，形成一个旁 系同源簇( c o g ) ，将不同生物中相关的直系同源物组进行聚类以形成一个直 系同源簇，其中包括直系同源物和旁系同源物。直系同源基因来自于共同的祖 先，在不同物种中垂直传递下来，可能有相同的功能，也可能具有不同的功能； 旁系同源基因是在同一个物种内由于基因复制而分离的，编码具有类似的功能 2 盲鳗、七鳃鳗、有颌类的进化关系和重组蛋白活性鉴定 但又不是完全相同的同源蛋白质瞄l 。k o o n i n 进一步对旁系同源基因做了定义， 即根据复制事件与物种分化事件发生的先后关系，提出了内旁系同源和外旁系 同源的概念，他认为对于一个给定的世系，在物种分化后发生的复制事件产生 的基因称为内旁系同源( i n p a r a l o g s ) 而复制事件发生在分化之前，则称为外旁 系同源( o u t p a r a l o g s ) 1 2 7 。 1 2 2 系统发生分析与系统发生树 早在2 0 世纪初，人们就开始在分子水平上研究生物之间的进化关系，但是 直到2 0 世纪中期，分子数据才被广泛的应用于系统发生分析的研究。2 0 世纪 6 0 年代，蛋白质测序成为可能。2 0 世纪7 0 年代，研究者开始能够获得基因组 信息，特别是d n a 序列。蛋白质序列和d n a 序列为分子系统发生分析提供了 可靠的依据四j 。系统发生分析首先是揭示物种之间的进化关系。在这些情形中， 需要选择合适的基因和d n a 序列来进行系统发生分析，这些基因或者序列需要 显示足够的但不是太多的变异【捌。其次，系统发生分析的新用途是分析基因家 族以及追溯特定基因的进化历史。在一类物种中追溯某一基因的进化历史，能 够推断出一个基因组中基因长期留存以及物种间基因水平转移。因此，系统发 生分析也可为了解基因组进化做出贡献。 在分子水平上，进化过程涉及到d n a 中发生插入、缺失、倒位、核苷酸替 换等变异。如果发生变异的d n a 片段编码某种多肽，那么这类变异就可能使多 肽链中氨基酸序列发生变化。在长期的进化过程中，这些变异就会被积累起来， 形成与其祖先存在很大差异的分子。因此，在核酸和蛋白质分子组成的序列中， 蕴藏着大量生物进化的遗传信息。在不同物种间，从相应的核酸和蛋白质组成 成分的差异上，可以估测它们之间的亲缘关系远近。从分子水平上研究生物的 进化有以下几个优点：根据生物所具有的核酸和蛋白质在结构上的差异程度， 可以估测生物种类的进化时期和速度，这比任何其它的方法都精确。因为它是 从数量上进行分析的；对于结构简单的微生物的进化，只能采用这种方法进行 研究；它可以比较亲缘关系极其疏远的类型之间的进化信息，这是其它方法难 以做到的。而根据各种生物间在分子水平上的进化关系，可以建立分子进化的 系统树( p h y l o g c n e t i ct r e e ) ，进而研究他们的进化动态和机制。系统发生树 ( p h y l o g e n c t i ct r e e 或e v o l u t i o n a r yt r e e ) 是表明被认为具有共同祖先的各物种相 互间演化关系的树，又被译作系统发育树、系统演化树、系统进化树、种系发 3 盲鳗、七鳃鳗、有颌类的进化关系和重组蛋白活性鉴定 生树、演化树、进化树、系统树。系统树是一种分支图( c l a d o g r a m ) ，在树中， 每个节点代表其各分支的最近共同祖先，而节点间的线段长度对应演化距离( 如 估计的演化时间) 【1 8 】。 1 2 3 基因或蛋白家族分析方法和步骤 分子系统发生分析的主要步骤：1 ) 选择可供分析的序列；2 ) 同源蛋白或 者核酸序列的多重序列比对，构建系统发生树并对进化树进行评估。其中，选 择蛋白序列还是核苷酸序列作为研究的对象，各有原因。比如，在大多数情况 下，对于蛋白质的研究是更为可取的，实际应用中更倾向于研究蛋白质的多重 序列比对，因为蛋白质相对d n a 序列而言，氨基酸替换频率较核苷酸替换率低 得多，使其更加适用于比较广泛分化的物种；蛋白质的序列信息较d n a 的序列 信息更容易获得。 1 2 4 基因家族进化研究中存在的问题 长期以来有关基因及基因家族的研究大都基于基因编码区序列特征，进行 分子进化树的构建，进而推测基因的进化动态和机制，或者主要是利用不同物 种中同一种基因序列的异同来研究生物的进化，构建进化树。既可以用d n a 序 列也可以用其编码的氨基酸序列来进行，甚至可以通过相关的蛋白质的结构比 对来研究分子进化。而近几年来由于较多模式生物基因组测序任务的完成，为 从整个基因组的角度来研究分子进化提供了条件。然而先前这些研究都未能充 分考虑基因结构，即上下游调控区、内含子、外显子等序列结构的变化特征， 导致了基因进化上的一些互相矛盾的结果，特别是对“分子钟”的研究一直存在激 烈争论。例如在进行蛋白家族进化分析时外群的选择的不同可能导致生成不同 的聚类和靴襻值；做树软件选择上的不同也会导致产生不同的结果，因为目前 并没有一种统一的定论。如在2 0 0 6 年n a t u r e 上就对尾索动物和头索动物 哪个与脊椎动物的亲缘关系更近做了讨论，通过选择不同的软件对多个基因家 族做进化树发现是尾索动物作为脊椎动物的姐妹群【2 9 。3 3 1 。可以设想，比较两个 或者多个完整基因组这一工作需要新的思路和方法，当然也渴望得到更加丰硕 的成果。因此，发展新的技术和方法为更深入地揭示基因家族以及超家族进化 机制已显得十分迫切。然而，生物信息学和比较基因组学的快速发展，为基因 及基因家族的进化研究提供了新的视角和手段。 4 盲鳗、七鳃鳗、有颌类的进化关系和重组蛋白活性鉴定 第二章盲鳗，七鳃鳗，有颌类进化关系的研究进展 2 1 传统的圆口纲分类及我国的主要种类 根据传统的圆口纲理论认为现存的圆口纲动物约7 0 多种，主要包括两个目， 七鳃鳗目和盲鳗目【3 4 1 。 七鳃鳗目( p e t r o m y z o n i f o f r e e s ) 只有一科即七鳃鳗科( p e t r o m y z o n i d a e ) ，计 有1 1 属4 8 种。常见种类有生活在北美洲海七鳃鳗属( g e n u sp e t r o m y z o n ) 的海 七鳃鳗( p e t r o m y z o nm a r i n u s ) ，产于南半球的袋七鳃鳗属( g e n u sm o r d a c i a ) 的 短头袋七鳃鳗( m o r d a c i am o r d a x ) 等f 3 5 1 。产于我国有三种，都属于七鳃鳗属 ( 眈t h e n t e r o n ) 【3 6 i ： ( 1 ) 日本七鳃鳗( l a m p e 护aj a p o n i c a ) 成鳗体较大，体长可达6 2 5 毫米。 系圆口纲( c y c p o s t o m a m ) 、七鳃鳗目( p e t r o m y z o n i f o r m e s ) 、七鳃鳗科 ( p e t r o m y z o n t i d a e ) 、七鳃鳗属( l e t h e n t e r o n ) 动物，主要分布于太平洋北部，南 至日本、朝鲜沿岸，北至阿纳德尔和阿拉斯加。在中国主要分布于黑龙江、松 花江、乌苏里江和图门江水，是我国唯一的海淡水洄游七鳃鳗。 ( 2 ) 东北七鳃鳗( l a m p e 押am o r i i ) 成鳗小，体长约1 6 0 毫米。产于鸭绿江， 不入海。 ( 3 ) 雷氏七鳃鳗( l a m p e 印ar e i s s n e r i ) 幼鳗体长达2 3 0 毫米，至成鳗后缩短 为1 2 0 1 8 0 毫米。产于黑龙江、嫩江、松花江、乌苏里江及图们江【3 7 1 。 盲鳗目( m y x i n i f o r m e s ) 有二科：粘盲鳗科( e p t a t r e t i d a e ) 和盲鳗科 ( m y x i n i d a e ) ，约有十几种。前者鳃囊6 1 5 对，后者鳃囊6 对。常见种类有分 布在大西洋的盲鳗( m y x i n e g l u t i n o s a ) 、太平洋和印度洋的粘盲鳗( b d e l l o s t o m a s m u a ) 以及产于日本海的杨氏拟盲鳗( p a r a m y x i n e y a n g i ) 等【3 剐。 盲鳗产于我国的只有一种，即粘盲鳗科的蒲氏粘盲鳗( e p t a t r e t u sb i i r g e r i ) 。 其特征为口须两对；鳃孔每侧6 个，左侧最后一个较其余为大，与咽皮管孔合 并；鳃囊每侧6 个，每囊具一出鳃管，最前的出鳃管最长；自鳃孔后方至尾鳍 基部具一行粘液腺孔；无鳞。分布于黄海、东海、日本海，偶见于闽、浙沿海【3 9 】。 2 2 最古老脊椎动物的活化石 七鳃鳗是迄今所知最原始的无颌脊椎动物，其最早的化石记录可以追溯到 奥陶纪，与寒武纪晚期底栖的甲胄鱼类有共同的祖先。自从七鳃鳗在3 5 0 0 万年 盲鳗、七鳃鳗、有颌类的进化关系和重组蛋白活性鉴定 前出现以来，它的外观几乎没有发生变化【删。盲鳗的进化地位以及与七鳃鳗的 关系尚有争议【4 ，因此，与盲鳗相比七鳃鳗更加受到进化生物学家和发育生物 学家的广泛关注i 矧。 七鳃鳗是有颌类脊椎动物的近亲，与有颌类脊椎动物不同的是，在七鳃鳗 体内缺乏活动的上、下颌，终生保留脊索，无成形的脊椎骨，脑的各部分排列 在同一平面上，无成对的附肢等1 4 引。但是，七鳃鳗与有颌类脊椎动物又存在一 些共同的特征，开始出现了复杂的脑的分化，具备背神经索，具有咽鳃裂，开 始出现肝脏以及心脏等【4 3 1 。由于七鳃鳗特殊的进化地位和存在多个与有颌类脊 椎动物相同的特征；因此，长期以来七鳃鳗被认为是现存最古老脊椎动物的代 表，难得的活化石i 州。 誊= a m n i o t a ：l 涸 需 “轺越n p h i m a l 董l 量l )a c t i l l o p 协碍g i a 琊鼻l 暑l 复 量 看 誊 i ； q 皇 o a 越 立 图1 - 1 动物系统发育树n 钾 f i g 1 - 1t h ep h y l o g e n e t i ct r e eo fm e t a z o a 七鳃鳗是联系无脊椎动物与脊椎动物之间的重要阶元，从遗传信息基础来 说，它必定印记了无脊椎动物的进化历史，同时作为脊椎动物最直接的祖先， 又为脊椎动物的起源与进化提供丰富的遗传信息基础。因此，深入开展以七鳃 鳗为基础的遗传发育研究对于理解和揭示脊椎动物的起源和进化具有重要意 义。 2 3 进化关系的研究进展 无颌类的化石见于古生代中奥陶纪。在志留纪和早泥盆纪，无颌类有最大的 辐射演化。关于无颌类之间的关系也众说纷纭，多数学者同意这样的观点：现 6 o，孽，暑sto_邑 盲鳗、七鳃鳗、有颌类的进化关系和重组蛋白活性鉴定 生无鳞的圆口类和以灭绝的体被骨质硬甲的甲胄鱼类( o s t r a c o d e r m i ) 不是一个 自然演化的类群。s t e n s i o 认为盲鳗类可能是下志留纪至上泥盆纪的鳍甲鱼类 ( p t e r a s p i d e s ) 的后裔1 4 5 1 。现生七鳃鳗则是上志留纪至上泥盆纪的头甲鱼类 ( c e p h a l a s p i d e s ) 的后裔。越来越多的证据表明盲鳗可能是最原始的无颌类，而 从分支分类学的角度来看，与化石头甲鱼类有关的七鳃鳗类更接近与有颌类， 而不是盲鳗类与之更接近畔刀。但是h a r d i s t y 在对无颌类相互关系的重要审查 中指出，在无颌类中原始和进步性状的决定比我们以前所想象的复杂得多，他 认为鳍甲鱼类是有颌类最为接近的无颌类祖先i 钙1 。在j a n v i e r 的研究中，把头甲 鱼类和有颌类合并为肌鳍鱼纲( m y o p t e r y g i i ) ，而不包括盲鳗类和鳍甲鱼类在 内就是这种观点的反映【4 7 ，4 9 】。目前流行的观点有利于下述假说：七鳃鳗和有颌类 共有许多形态上和生理上的相似特征( 盲鳗类除外) ，例如，肾小管分化程度 大，不是永久性的前肾；半规管不止一个；具有大的胰腺；有感光作用的松果 腺器官，脊索背方具有相当于髓弓的软骨片；有腺性垂体；这是因为七鳃鳗和 有颌类有共同的祖先，而不是因为趋同演化。盲鳗类和七鳃鳗类之间的相似特 征大多为表面的和原始的，不能肯定无疑的用来支持它们可以组成一个单系类 群的观剧删。 盲鳗，七鳃鳗和有颌类的系统发生关系一直以来都有争议( 图1 2 ) 。最初 d u m e r i l 提出七鳃鳗和盲鳗作为一个单系类群既现在的圆口纲观点，这一观点很 长时间都没受到质疑闭j 。直到1 9 7 7 年l o v t r u p 鉴于七鳃鳗和有颌类一些共同的 形态学特征，这些特征不存在盲鳗和头索动物中，提出了七鳃鳗是有颌类姐妹 群体的假说，而盲鳗只是较原始的物种【5 1 l 。这一观点的提出也得到了很多分类 学和系统学专家的支持【4 7 4 9 ，5 2 删当然七鳃鳗和盲鳗存在许多共同的形态特征，但 这些大多为表面的和原始的特征【4 9 5 1 ，5 5 巧6 1 。随着分子生物学的发展，近年来对 1 8 s ，2 8 s ，a n d5 8 sr r n a 序列的分析【5 7 妣j ，t a k e z a k i 等对3 5 个编码蛋白的基因 家族的分析研究1 6 3 l ，d e l s u c 等对核基因的研究【3 3 1 ，和g o o d m a n 对g l o b i n 的 研究【泓5 】都支持无颌类圆口纲观点。相反对线粒体d n a 序列【鲫，1 8 sr r n a1 6 7 ， 7 skr n a 基因1 6 引，和v a s o t o c i n 基因【6 9 】等的研究则支持七鳃鳗有颌类姊妹 群体的观点，同时s h u 对寒武纪两种低等的无颌类动物的化石研究也为这一观 点提供了论据1 7 u 1 。 7 盲鳗、七鳃鳗、有颌类的进化关系和重组蛋白活性鉴定 图1 2 盲鳗，七鳃鳗和有颌类的系统发生关系 f i g 1 - 2p h y l o g e n e t i cr e l a t i o n s h i p sb e t w e e ng n a t h o s t o m e s ，l a m p r e y s ，a n dh a g f i s h e s 最近对头索动物和尾索动物进化关系研究，确定谁是脊椎动物的姊妹群体， 就很明确的说明了在生物进化中普遍存在着争论。普遍意义上都认为尾索动物 较头索动物原始，但v i e 皿e 和p o n t a r o t t i 的研究确指出尾索动物进化上更接近 脊椎动物，头索动物较原始r 7 1 】。为了明确一直都存在争议的盲鳗，七鳃鳗和有 颌类的进化关系，本研究通过对编码4 8 个蛋白的基因家族进行系统进化研究， 采用不同的软件和算法及不同的外群构建系统进化树，对结果进行统计分析明 确了它们的进化关系也解释了一直存在争议的原因。本研究还进一步阐明七鳃 鳗作为模式动物所具备的重要特征，揭示七鳃鳗作为研究模式动物遗传发育模 型的重要意义，为深入研究脊推动物遗传发育模式及其进化机制提供认识基础。 8 一 一 一 一 一 一 一 盲鳗、七鳃鳗、有颌类的进化关系和重组蛋白活性鉴定 第三章4 8 个基因家族的系统发生分析及其探讨盲鳗、七鳃鳗 和有颌类的进化联系 3 1 数据的获得 3 1 1 下载数据 从数据库提供的可用序列中，下载了七鳃鳗的7 5 7 个蛋白质序列和盲鳗的 5 1 8 个蛋白质序列( h t t p ：c a e x p a s y o r g s r s 5 b i n c g i - b i n w g e t z ) 。用手工的方法从 两个物种的序列中筛选出4 8 个完全同源蛋白质序列。分别用4 8 个蛋白序列为 诱饵序列，在n c b i 中做b l a s t p ( h t t p ：w w w n c b i n l m n i h g o v b l a s t ) 和 e m b l - e b i 中做w u - b l a s t p ( h t t p ：w w w e b i a c u k b l a s t 2 i n d e x h t m l ? u n i p r o t ) 同 源性比对，获得其他物种的序列( 4 8 个蛋白及选择物种见附录一) 。基于模式生 物和代表生物的重要性，本文研究选用下列物种包括：人( h o m os a p i e n s ) 小 鼠( m u sm u s c u l u s ) 家鸡( g a l l u sg a l l u s ) 非洲爪蟾( x e n o p u sl a e v i s ) 红鳍东 方纯( r a k i f u g ur u b r i p e s ) 河鲶( 1 c t a l u r u sp u n c t a t u s ) 斑马鱼( d a n i or e r i o ) 小 斑星鲨( s c y l i o r h i n u sc a n i c u l a ) 七鳃鳗( p e t r o m y z o nm a r i n u s ，l a m p e t r aj a p o n i c a ， 和lf l u v i a t i l i s ) 盲鳗( m y x i n eg l u t i n o s a ，e p t a t r e t u sb u r g e r i 和e p t a t r e t u ss t o u t i o 文 昌鱼( b r a n c h i o s t o m af l o r i d a e ，b r a n c h i o s t o m al a n c e o l a t u m 和b r a n c h i o s t o m a b e l c h e r i ) 海鞘( c i o ni n t e s t i n a l i s ，s t y e l ac l a v ah e d m a n ) 和海胆( s t r o n g y l o c e n t r o t u s p u r p u r a t u s ) 。 3 1 2 可用序列的检测 为了避免由于氨基酸转换引起系统树构建的差异，用t r e ep u z z l e 软件对选取 的蛋白质序列进行检测验证。所有序列均符合要求。 3 2 分析方法 3 2 1 序列串联 选择哺乳类( hs a p i e n s ，mm u s c u l u s 鸟类( g g a l l u s ) ，两栖类( x e n o p u s l a e v i s ，x e n o p u st r o p i c a l i s ) ，硬骨鱼( zr u b r i p e s , 上p u n c t a t u s ，d r e r i o ) ，软骨鱼 ( s c y l i o r h i n u sc a n i c u l a ) ，七鳃鳗( p e t r o m y z o nm a r i n u s ，l a m p e t r aj a p o n i c a ， l u v i a a t i s ) ，盲鳗( m y x i n eg l u t i n o s a ，e p t a t r e t u sb u r g e r i 和e p t a t r e t u ss t o u t i i ) ，文 昌鱼饵f l o r i d a e ，且l a n c e o l a t u m 和且b e l c h e r i ) 作为构建系统进化树的分支。将 9 盲鳗、七鳃鳗、有颌类的进化关系和重组蛋白活性鉴定 每一个物种的4 8 个蛋白的氨基酸序列串联作为一个蛋白质的氨基酸序列，组成 一个大矩阵，用来构建系统树补充说明单一序列的结果【7 2 1 。同样3 4 个核基因家 族和1 4 个线粒体基因家族编码蛋白质序列分别串联，用来构建系统发生树。 3 2 2 构建系统发生树 对以上蛋白质的氨基酸序列分别用同源比对软件c l u s t a l x1 7 3 】进行同源性 序列比对，采用m e g a 7 4 l 和p h y l i pi t s 】构建系统进化树，在软件m e g a q b 运 用m p 法( m a x i m u m