（物理化学专业论文）一种既能促进dna又能促进蛋白质水解的四核铁配合物.pdf

摘要 双竣巍多孩金满粼会物健避d n a 和蛋鑫疆承耨在生秘鼓零和生物医药领域具 有重要意义。许多天然水解酶的活性部位含有两个戚多个金属离子。我们研究了含 铁的多核众属配合物以水解途径切割d n a 和蛋白质，希望发展一种结构搽钟能获 取生物大分予懿区蠛梅黎售塞。 通过本文的研究发观， f e 4 ( n t b ) 4 ( # 一o h ( p 4 - s u c ) l ”在p h n d e u g d d y 的顺序减小。 该文献：i 纛缝合其它金溪蕊予夔数攥，讨论了金嚣鬻予在末蜒磷羧臻中器莛戆佟瘸。 b r a n u m 簿报道了一种新的双核铈( i v ) 配合物4 6 ，它能在p h8 和3 7 。c 时水解d n a 。 9 通过统计分析，认为线性d n a 的形成不是随机切割两条单链d n a 的结果a 动力学 分析表明缺口环状和线性d n a 形成的准一级速率常数有相同的数量级，约为l 酽 1 3 2 人工缀白酶 蛋自炭溅彦、是遴分掇、拆叠磅究移蛋皂厦主| 叁合戏等震要肖逸择蠖建承解恭莲； 毽可供剩溺熬东瓣酶窝套戒试蘩较多。在溢稻条锌下，蛋白酶黥选择注遗餐倪爨是 质断裂，偶只有少数几种被有效地利用，与天然鬣臼酶比较，融有的合成试剂往往 需要苛刻的展应条件，掰且相对底物鼹过量许多，逡择性低，产率不赢。溪他蘸是 常囊款像学凝裂试蘩，瞧奄尼令惩处：荔挥菱，囊海缝；程辩攀蘸羹i 蒙残蕊要遘量 1 0 0 倍，需溪7 0 甲酸作溶剂，而h 宵副反应发生，同时溴化氰产生的蛋自质片断 不再是天然的，因为甲黼氯酸残基被不可逆修饰了。现在需要研究新的高效、选择 断裂蛋鑫震缒诧学试裁。令研究驰较为详细戆体系是k o s t i c 小缝合或静食鞭筑 系列琵含褥辨t 饕。鬻d e k 尹鞠各耱p 舻+ 瓣二获配合裙麓蓰蓬舍半髋氨酸残蓦秘举巯氨 酸残基的多肽的水解，艨应是在低9 h 的条件下进行。在这些腻应中，催化荆的活 性形式是p d p 与底物形成的二聚体，来自两条多肽的硫原予分别桥连两个p d 服予， 形成一个鹚元环絮强i a ) 。嚣蔻硫爨予懿爱煎效应察溪进行实验翁骥挂繇浚，含 胺配体徽容易被永取代。这样，不篱起始物币 是游托粥2 还是p d ( e n ) ( h 2 0 ) 2 j 2 申藏是 【p d ( h 2 0 ) 3 ( o 聊】+ ，活性物种都是一样的。如果用硫麒子取代配体徽原子，那么随着硫 蘸子鲍数爨扶零逐濒增挺戮二，腹承解靛速率逐灏降繇，表瞬配继承匏重要链，谎 甓在p d 2 + 懿合凌孛与会满离子嚣霞靛农是箨灸亲梭避攻试裁程遴簸永勰嚣。 此外，含f e 3 + 5 6e u 2 + 5 7 , 5 8c o ，+ 卯、p p6 0 、c e “6 1 等金属离子的配台物也观 察到水解酰胺键。 f i g m e 1 , 4 孙op r o p o s e d a c t i v e s p e c i e s 翘畦糌h y d r o l y s i s 醴# e p 畦d e b o n d 。 1 4 震羹 到目前为止，已霄大量的糨凝文献见诸报道，人工水解体系在永解效举方蕊有 了摄丈撬凝，翟与天然辩摇魄敷鼹逡攀镄毙较低，天然拳鼹錾审金溪簧_ 予翡圣擎鼹逶 霈邂一步阐明。人工核黻酶在特异议剐嗣水解断裂d n a 方面，还需做进黔深索， 如可将多核金属配合物与识别元件栩涟，这个识别元件可以是根据反义( a a t i s e a s e ) 披术合成盼一段核菅酸链鸵，也可以懋与d n a 特嚣缕舍兹蛋自矮结构域6 3 。人工骚 囱酶的设计应注重蛋篷矮豹暴馥( i ns i t a ) 承黎，尽量僮复应强天然我条谗下避行， 这样可佟海结构搽针搽测蛋自质瀚天然褐爨攀。 1 5 选嚣戆嚣鲮意义 首先，合成酶核酸释可以终为人工限铡酶在慕霞工程中发探棒用：可以体为天 然限制惶内切酶匏於充，扩展天然簿识嬲的序列，在基因组溺黪中能够发撵黩夫佟 蠲。台袋瓣蛋鑫骜爱纛条薛潼彝，辩激弥耱常麓後霜静馥学灏袈试麓豹不避，翔演 化氰反成时条件苛刻、甯毒性、易撺擞。 合成的蛋白酶还可以作为探测涎然大分子构彖的结构探针。尽管蛋白质数目纛 大，但独特静天然蛋鑫凝结构壤或缝梅类蘩总数不蘧过1 0 0 0 令。属予不鞠缝搦蹙鍪 的蚤自璜麓葫镌上类戳予蛋白酶鹃装承寒鼹多棱焱属配合秘穗驻俸瘸髓，箕水辩速 率、水解模式或永解梳理，以及二豢的缝合常羧等霞素可能存凌明显盼差舞，帮虽 蠡蒺掰壤黢绪秘类鏊暑这三令鞫豢之漆霹麓存在宠戆对应关系。由这耱黠波笑系 发展鹁簧惑震拳鲟壅络擒搽赞，蠢霹麓成为一荣等x 嚣线螽俸学、n m r 窝毽埝预 测互蛰魏俊逮绣静瞬究方法。 虽然许多天然水群穗利用金隅璃予发撵作耀，但是在永解瑟应中这些盎属离子 的精确终耀还需要避步礤瓷。逸邋慰会残金属援酸骜窝金嚣凝皇酶窳瓣撬聪懿理 解髓够梵阚骧天然永解薅中金耩离子的髓能提供帮助。 因此我们在以前工作基础上，设计合成多核袅属配合物水解断裂d n a 和臻白 质，考察众属离子问绒众属离子与配体闯的协同你用，希望发展一种结构撵钟熊获 凝生楞大分子蕊莲蠛掬象信息。 2 实验方法 2 1 f e d n t b ) 4 ( 1 t - o ) 2 ( p 4 - s u e ) 6 键进d l 蠛荣裂的研究 2 , 1 1 试剂、仪器 试剂# 鑫羼配合物瞪铀b x ( 分0 ) 2 ( 辩- s u c ) 】6 纛艇鲂无极化学溧题缀廖嶷翔老爨 提供：p b r 3 2 2d n a 购螽蜀本t a k a r a 公司；澳纯乙锭、t 矗s 碱、甘露醇、聚乙二 醇p e g 8 0 0 0 购自美豳s i g m a 公司；电泳级琼脂糖购自p r o m e g a 公司；聚蔗糖 ( f i c o l l 4 0 0 型，4 0 ) 购自上海试剂二厂，溴酚簸、二甲苯青购自上海试剂三厂， 其余纯学试裁稳曳分掇缝，瑟毒溶液均瑶三次拳黧嚣； 仪器；d y y - i i i 一4 型稳压稳流电泳仪( 北京六一仪器厂) ；d f - 2 3 b 型水平电泳槽 ( 北京东方仪器厂) ，紫外透射分析仪，t g 3 3 2 a 型微量分析天平：雷磁p h s 2 5 型 酸度计( 上海) ；电热憾滠水涤锅。 2 1 2 实骏方法 ( 1 ) 溶液的配置 凝黢热撵缓滓滚懿聚嚣：稼彀溪黔蓝、二举苯裔各o 1 2 5g ，溶于三次水中，爵 加入1 8 5 m l 聚蔗糖溶液，定容至5 0 l n l 。 金属酉已食物溶液的配置：称取o 0 0 2 7g 配合物，溶于三次水中，定容至l o 砒 配残0 1m m o t 誓熬贮菇渡，蠢蠢醚会甥溶解度鸯辍，麓入一悫爨簿d m f 键溶。 滨纯乙锭永溶液的配置：称取定量的溴亿乙锭，溶于三次水中配成1 0 0 “gm 1 的贮存液，用时再稀释成0 5p gm l o 的稀溶液。 5 x t b e 缓冲溶液的配置：称取t r i s 碱2 7g ，硼酸1 3 ，7g ，溶予三次来势加入 0 。5 t o o l 4e d t a ( p h 8 + o ) 1 0 矗，窥容至5 0 0 越l 。 0 1t o o ll “各种p h 系列的h a c n a a c 、n 龇p o 州a 2 h p 0 4 、t r i m h e l 缓冲溶液 按标准方法配置”。 ( 2 ) 聚合谚键进d 叁 a 叛裂弱茨应 在每支e p 管中拍入4 5 江o ，lt o o lu 1h a c n a a c 缓冲溶液，l mp b r 3 2 2d n a ( o 1g g 止“) ，在各管中加入不问浓度的配合物溶液( 终浓度分别为o 6 2 ，1 2 ，2 5 ，5 0 ， 3 t c 反应9 0 分钟。反威完成后，加入4 山加样缓冲液，然后用l 琼脂糖凝胶电 泳，至溴酚蓝和二甲苯衡染料带分开约2c m 后停止电泳，将凝胶在o 5 肛g 蹦“溴化 乙锭溶滚中染色半枣辩，蚕小心取出，予紫夕 透射纹上蕊察共照秘。震i m a g e t o o l2 0 凝胶分析软件定量处理电泳图片。 ( 3 ) 配合物、f e p 、配体n t b ( t r i s ( 2 - b e n z i m i d a z o l y l m e t h y l ) a m i n e ) 分剐和d n a 作用的比较 在反疲俸系孛，缓狰溶滚为0 + o lm o il o 撼 5 6h a c n a a c ，d n a 浓疫为 1 5 4 l a m o ll 。b p ，分别在每支e p 管中加入配含物( 终浓度1 0g t n o ll “) 、f e 3 + ( 5 0r m a o ll 1 ) 、n t b ( 4 0g m o l ) 溶液，反成9 0 分钟。后续步骤同( 2 ) 。同时 爻了验逶e d t a 能否终为配合兹断裂d n a 反应瓣终止试裁，分聚在反应懿秘爱应 后在配合物断裂d n a 的体系中匀弱入e d t a ( 终浓度5 0m m o ll d ) 。 ( 4 ) p h 对配合物促进d n a 断裂的影响 反应体系中配合物浓度为1 0 l a m o l 乙_ 1 ，p b r 3 2 2 d n a 浓度为1 5 ap z n o l u l 酾， 努鬟在每支p 誊中翔入鼙l3 , 6 ，4 , 6 ，5 6 ( h a e n a a c ) ：p h6 0 ，7 0 ，8 0 ， ( n a h 2 p o 淤i a 2 i - i p 0 4 ) ；p h7 , 4 ，8 0 ，9 0 ( 嘶s h c i ) 缓冲溶液( 终浓度0 0 5t o o ll 。1 ) 。 其他步骤同( 2 ) 。 ( 5 ) 磷酸根怼配食物程进d n a 甑爱数撺镁 反藏体系中配合物浓度为1 0 l m o ll 一，p b m 2 2d n a 浓魔为1 5 。4r t m o i0 1b p ， 在每支e p 管中分别加入不同浓度的磷酸二氢钠，终浓度分别为l ，5 ，l o ，2 0 ，3 0 ，4 0 ， 5 0m m o ll ，反应9 0r a i n 。后续步骤同( 2 ) 。将定量的数据谯m i c r o c a l o r i g i n7 0 孛震一缀攒数衰壤方稼羧会。 ( 6 ) 温度对配合物促进d n a 断裂的影响 切割殿应体系配置好以后，分别在四个不同的温度( o ，1 5 ，4 0 ，5 04 c ) 避行反 应。其余操作圊( 2 ) 。 ( 7 ) 离子强度对鬣台物健进d n a 断裂豹影酾 在反廒体系中，缓冲溶液为o 0 4m o ll p h5 6 h a c n a a c ，d n a 浓度为 1 5 4i | a n o tl b p ，配合物浓度为1 0 g m o ll 一，在每支e p 管中分别加入n a c i ，使n a + 终滚度努爨必4 5 ，7 6 ，8 6 ，9 6 ，1 0 6 ，t 1 6 m m o l r l ，爱瘫粥努甓。爱续步骤阖( 2 ) 。 ( 8 ) 配合物水解断裂d n a 的证明 轰塞钵系孛，琵会秘浓度为1 0 弹lu 1 ，d n a 浓凄先1 5 。4 辩撼l 印，分羯翅 入甘露醇( 0 0 4m m o ll “) 、聚乙二醇p e g s 0 0 0 溶剡懿配置 摹酪黥霪蒸与平簧：市售彗磊苯豁瘦予含寄氧纯杂囊等，使翔裁嚣经霪精蒸馏 处理，以除去杂质。在酸性条件下d n a 将溶于苯酚，因此苯酚需要用t r i s h c l 缓 冲液平衡甄p h 7 8 以上。将苯酚加热至6 8 。c 熔解，加入羟基囔f i i 至终浓度为o 。l ( 羟基囔辫是撬氧纯裁、r n a 酶掷灏蓑馨金耩离子鳌合裁) ，再燕入等体强镌 0 5m o l l “t f i s h c l 缓冷液( p hs ，在磁力搅摔器上搅拌i 5 分钟后静置分艨，吸 出水相，髓新加入缓冲 寝搅拌平衡，赢至苯酚的p h 值大于7 8 ( 用p h 试纸测定) 。 1 4 覆盖，冰箱保存。 酚：销仿混合溶剂：将平衡酚：氯仿：异戊醇按2 5 ：2 4 ：l 的比例混台藤冰 籍傈存。其中氯费套魏予蛋叁囊变犍静分离，异发酸霹溪豫接提避程孛产生魏泡滚。 ( 2 ) c t d n a 的提缝 c td n a 在使用前瀚要提纯。称淑适量的c td n a ，在磁力搅拌器搅拌下溶于 三次水。将c td n a 溶液转移至微鐾离心管中，加入等体积的釜丁酵，振荡瀑勾屡， 鬟囊，辍以5 0 0 0r p m 离心4 5 骖，雾去土层有瓿辐，重复羞予次直至反痊溶滚浓缡 至约o 3 - 0 + 5m t 。浓缩厝的溶液加入游体积的酚：氯仿，振荡混匀成乳状液，用离心 机以8 0 0 0r p m 离心1 分钟，使有机棚和水相分开，疼去下层有机相。重复至二次 至薅辊赛藤毳沉淀，挥搬久等俸获翦氯露瀑匀，离心分囊，赛去下层舂掇掇，除去 残蘩静苯酚。在经过耩缝懿d n a 溶液中鸯疆入5t o o l l i n a c l 溶液至终浓凌为 0 2t o o ll ”。然后加入= 倍体积的冰冷乙醇，充分混匀，置于0 ”c 冰箱静置3 0 分钟。 再用高速泠冻离心机予0 c 下以1 0 0 0 0r p m 离心t 0 分锌，小心吸走乙醇溶滚，震 7 5 己簿滤涤滚淀蠢管蹩，孬鼗冷冻离心，弃去上瀵。涛褒量管嚣于空气串骧干， 用o 1t o o ll p h8 0 t e ( t r i s e d t a ) 溶液溶解提纯的c t d n a ，测定a 2 6 d a 髂0 i 8 。 ( 3 ) d n a 滴定实验 在5 越试警孛麓入0 + s 砖0 + lm o tu p h5 , 6f l a _ c t n a a c 缓漳骥，o + 2 蠢 0 。 m m o to 配合耪溶液，依次鞠入c t d n a 溶液，定客至2 m i ，使d n a 翁终浓度 分别为0 1 8 ，0 5 2 ，o 8 8 。1 2 ，1 8 ，2 , 6 ，3 5 ，4 4 ，5 2 ，6 1 “o ll b p ，以相应浓 度的d n a 溶液为参比( 扣掉d n a 的吸收) ，扫描端合甥在2 0 0 6 0 0 她的紫外可见 暖浚：惫谱+ 聚舍蘩麓p h 交伍鲢光谱撬簿 o 。i m m o t l - 配合镪褡液分副与0 , i t o o l l p h3 , 6 、4 0 、4 4 、4 献5 6 ( h a c n a a e ) 、 6 ( t r i s h c l ) 缓冲溶液混合，配合物的终浓度为1 0p m o ll - 1 ，缓冲溶液终浓度为 0 , 0 4t o o l 1 。以相应浓度的缓冲溶液为参比，扫描飘舍物在2 0 0 - 6 0 0 眦的紫外可见 吸牧光谱。 2 3 金属配合物促进蛋白质降解的研究 2 3 + 1 试铡、技爨 试剂：盒属配合物印e 4 州t b ) 4 ( “一o ) 2 ( 一s u e ) ”、 f e z ( d t p b ) 0 t o ) ( 斗一o a c ) ”由生 物无枫化游课题组廖震如老师提供；牛血铜锌越畿倔物歧化酶( c u 2 z n 2 s o d ) 冻于 粉、西荦簇乙二藏( t e m e d ) 赡舀美国r o c h e 公弼；十二浣鏊虢酸钠一聚落烯酰驶 凝胶电泳( s d s p a g e ) 低分子量标准蛋白质、牛血清白鬣自( b s a ) 、溶菌酶 ( 1 y s o z y m e ) 购自华美嫩物工程公司：丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺等电泳材料购自 美国p r o m e g a 公霹；考马赣亮蓝g - 2 5 0 赡鑫美国s i g m a 公司。葵恁试裁翅为分辑缝， 所角溶液羽三次永配饕。 仪器：微型垂直板电泳系列装置和e s p 3 5 0 1 型电泳仪( 瑞典a m e r s h a mp h a r m a c i a b i o t e c h 公司) 、电热值激水浴锅。 2 3 2 实骏方法 ( 1 ) s d s 一聚丙烯酰胺凝胶电泳溶液的配餐 i 5 ( w v ) 分离黢瓣置：5 0m t3 0 麓聚秀爆熬骏溶滚，2 5 躐l 。5t o o lo p h8 0 t r i s i - i c l 缓冲液，o 1m l1 0 s d s ，0 1m l1 0 过硫酸铵，4v t lt e m e d ，2 3m l 水。 5 ( w v ) 浓缩胶配鼹：o 8 3m l3 0 聚丙烯酰胺溶液，o 6 3n 1 1o 5m o ll _ lp h6 8 t r i s h c l 缓冲滚，o 。0 5 蜮1 0 s d s ，o 0 5m l1 0 过蕊酸铵，5 撼t e n 歪d ，3 盛烈末。 电泳缓、挣滚：t r i s 簸3 0g ，曹鬣酸1 4 。4g ，s d s ig ，定容至1 0 0 0m l 。 上样缓冲液：2m lp h 6 8o 6 2 5t o o ll 1t r i s h c l ，0 2gs d s ，51 1 1 l 甘油，0 5 血 巯基乙醇，0 1m l 溴酚熊，2 4 m l 水。 ( 2 f e 4 ( n t b ) 4 ( t - o ) 2 0 t 4 一s 珏c ) 尹海解不弱蛋窭蒺装爨较 在0 , 0 4m o tu 1p h5 , 6 的h a e n a a c 缓冲液中，配合物( 1 0p m o ! l _ j ) 分剐与 b s a ( 5 m o i l “) 、s o d ( 1 0p a n o l l “) 、溶菌酶( 1 0 1 t m o ll 。) 于5 0 反威4 8 小 t 6 硕士学位论文 m a s t e r st h e s l s 对，熬螽翔入上样缓掸液，煮沸5 分锌，透行s d s - p a g e 电泳。电泳完毕，麓考骂 斯亮蓝染甑固定。 ( 3 ) p h 对 f e 4 ( n t b ) 4 ( “一o ) 2 ( m - s u e ) ”降解蛋白质的影响 分澍淼酸性( 0 0 4t o o ll p h5 6h a c 蕊a a c ) 露藏挂( 0 + 0 4t o o lo p h8 0 y r i s h c t ) 条件下，用不同浓度的配合物( 5t o3 5i m a o ll - 1 ) 与b s a ( 5u n l o ll 1 ) 反应。 磷酸根对反应鲍挪制：保持反应体系不变磷酸根鲍终浓度从1 变化到 5 0 m m o l l 。 ( 4 ) f e 4 ( n t b ) 4 ( 一o ) 2 ( 一s u e ) ”降解蛋白质的动力学规律 f e 4 ( n t b ) 4 ( p o ) 2 ( 脚- s u e ) ”降解灏白质的动力学规律：保持反应体系不变。反 应时闽从2 4 变化到9 6 小时。 ( 5 ) f e f f d t p b ) ( i a * o ) ( p 0 心) 】2 + 降解不同螫酝质的比较 f e 2 ( d t p b ) ( i i o ) ( 一o a c ) 】2 + 与溶黼酶反应：在o 0 4t o o ll 。p h5 , 6 的h a c n a a c 缓冲液中，不同浓度的配合物( 2 5 2 0 0i n o ll 1 ) 与溶菌酶( 1 0 雌o ll - 1 ) 予5 0 。c 反瘟4 8 小瓣，后续步骤嚣( 2 ) 。 ( 6 ) p h 对【f e 2 ( d 静b ) ( “- o ) ( 抄o a c ) 】2 + 降解b s a 的影响 反应步骤同( 3 ) ，配合物终浓度为2 5 到1 7 5j _ u n o ll 。 ( 7 ) f e 2 ( d t p b ) ( i t - o ) ( t x - o a c ) “晦鳃b s a 懿凌力学援建。 反瘦疹骤两( 4 ) ，反应时闯飘2 4 交纯到1 2 0 小时。 3 结果与讨论 3 1 f e 4 ( n t b ) 4 ( 秘- o ) 2 盼s h c ) l 静促进i ) n a 断裂懿讲究 许多天然核酸酶的溉性部位采髑硬个或多个惫属离子6 6 ，金属离子之融存在协 霪箨薅，毽冀确窝辩功麓餐需遗一步磋突；嚣谴，我蠡翔蔹酸酶模型他合蘩 f 1 e 4 ( n 豫) 4 ( p o ) 2 ( m - s u c ) ”与d n a 作用，迸一步研究多核金璃飘台物切割d n a 的 功能，探讨萁可能的作厢机理，为理解天然核酸酶的结构和活性关系提供线索。 我销鼹婢r 3 2 2d n a 作努久王棱羧酶蛉底甥。f e 4 ( n t b ) 4 ( p - o ) 2 ( & - s u c ) ”镪裁 p g r 3 2 2d n a 熬实验采躜凝葭龟溶匏方法寒骚究。 3 1 1 必核铁配合物促邀d n a 断裂的反应 f i g u r e3 1 ( u p p e 0a g a r o s eg e le l e c t r o p h o r e s i so f1 5 4m n o ll 1b pp b r 3 2 2d n aa f t e r9 0m i n i n c u b a t i o nw i t ht h ei n c r e a s i n gc o n c e n t r a t i o no f 【f 。4 科t b x ( 抄0 惋( 沁一s u c ) 】“穗0 0 4 5t o o ll _ p h5 0 h 一& e , n a a cb u f f e ra t3 7 c l a n el ：d n ae o n t r o t 2 - 9 ：t h ec v n c e n t r a t i o no ft h ec o m p l e xw 嚣 v m e df r o m0 6 2 ，i 2 ，2 5 ，5 , 0 ，1 0 ，2 0 ，3 0t o4 0r m a o l0 4 ( b o t t o m ) t h e p l o to ft h ec o n c e n t l z t f i o no f n i c k e dc i r c u l a rd n a v e r s u s 【c o m p l e x d n a 1 霉 f e 4 ( n t b ) 4 ( - t o ) 2 ( 脚一s u c ) 】补在酸性条件下能水解a t p ”，a t p 可以非为人_ i 孩酸 酶水解d n a 的模型底物。我们首先尝试将【f e 4 州t b ) 4 ( “一o ) 2 ( m - s u c ) ”与p b r 3 2 2 d n a 在p h5 0 的弱酸性条件反应，结果见图3 ，l 。图中显示的是1 5 4p m o ll 4b p p b r 3 2 2d n a - 与 r e 4 ( n t b ) 4 ( p o ) 2 ( 一s u c ) ”在3 7 c 反应9 0 分钟后的电泳结果， f e , ( n t b ) 4 ( 肚一o h ( m s u c ) ”的浓度从o 6 2 岬o ll 。逐渐变化到4 0p m o ll 。从图可 以着出涟若配合杨浓度的增大，超螺旋d n a 的条带 i 黧) 逐渐变浅，丽切翻d n a 的条带逐渐变深，表明【f e 4 ( n t b ) 4 ( - o h ( m ：s u c ) 嘴效地促进超螺旋d n a 断裂成切 口d n a 。 f e 4 ( n t b ) 4 ( 1 x - o ) 2 ( f a 4 - s u e ) ”豹浓度大予2 0 瑚ll 一，超螺旋d n a 完全 断裂，全部转化为切翻d n a 。 为了进一步确 证 f e 4 ( n t b ) 4 ( p , 一o ) 2 ( 一s u c ) ”是有效的d n a 断裂试翔，我们将配 合物、f e ”、配体n t b 分剐与p b r 3 2 2 d n a 在p h5 6 缓冲液中反应( 图3 2 ) 。图 中最示的是1 5 4p m o ll “b pp b r 3 2 2d n a 分别与1 0l a n o ll 1 四核铁配合物( 泳道 4 ) 、5 0 雌o l l “f e 3 + ( 泳递2 ) 、4 0v t m o ll i n t b ( 泳道3 ) 在3 74 c 反应9 蛰分钟爱 的电泳结果。与泳道1 的d n a 对照相比较，单独的f e 3 + 离子和配体n t b 时反应没 f o r m i i f o r m l 旨 葛 三 主 包 f i g u r e3 2 ( l e f t ) a g a r o s eg e le l e c t r o p h o r e s i so f1 5 4 肛l o ll 。b pp b r 3 2 2d n aa f t e r9 0m i n i n c u b a t i o nw i t hd i f f e r e n ts p e c i e si n0 0 1m o ll p h5 6h a c n a a cb u f f e ra t3 7 c l a n e1 ：d n a c o n t r o l ；l a n e2 ：d n a + 5 0l 心a o ll “f e ”；l a n e3 ：d n a + 4 0 _ t r n o ll n t b ；l a n e4 ：d n a + 1 0 i , u n o l l - 【f e 4 ( n t b ) 4 ( p o ) 附s u c ) 】廿；l a n e5 ：d n a + 1 0p x a o ll - 【f e 4 ( n t b ) 4 ( ”o ) 2 ( s u c ) 轩+ 5 0m m o ll e d t a ( b e f o r er e a c t i o n i n i t i a t i o n ) ；l a n e6：dna+10 j t m o l l 【f e 4 ( n t b h ( b t - o h ( p - s u c ) r + 5 0m m o fl e d t a ( a f t e rr e a c t i o nc o m p l e t i o n ) 。( r i g h t ) t h ed l o to f t h ec o n c e n t r a t i o n o f n i c k e dc i r c u l a r d n a v e r s t l ss p e c i e s 1 9 说弱口b r 3 2 2d n a 静鼗袋羲潞楚醚台搦在怒雩# 露。为了准确装铡反建对滴，我销逐 骏证e d t a 能否作为配食物断裂d n a 濂艨的终止试剂。图3 2 泳遵5 ，程热入配食 虢翦热入5 0 m m o l 誓1 e d t a ；溶邋6 孛，柱覆应究袋轰( 9 0 分辨) 黧天5 0r o m o l e d t a 。从电泳结果可以看出，反感黼搬艨瘟体累中加入e d t a ，d n a 采发擞渐缎， 说明e d t a 能够络合醚含物中的f 矿离予，使配含物解离，反皮停止：反应尉谯厦 殿体系中擞入e d t a 并寒影响d n a 的羝裂，因戴e d t a 2 作必终止试裁控制蔽斑 进程。程戳嚣翡实验审，我稍黑e d t a 终止反应。 3 1 。2 p h 对嚣核铁瓣奁携键逡d n a 舔黎瓣嚣瓣 尧了夔溪器 薅爱褒熬影璃，凌镌袭不蠢鼙 蕊蔫箨下透嚣了甏含鐾鼗袋d n a 静实验。程3 7 ，薅1 0g m o l 己 f e 4 f n t b ) 4 ( r t 4 3 ) 2 ( m - s u c ) ”与1 5 4g m o l0 1 埝豹 p b r 3 2 2d n a 分别在不同砖 条 枣下袋虚6 0 分静，结果冤瀚3 3 。飙翻中发现 【鹣搿稻) 驴o 菝辩一s u e ) “在h a e n a a e 缓渖溶滚巾( 泳遂2 0 ，鼙l3 6 ，4 。6 ，5 , 6 瓣镑显著促进p a r 3 2 2 d n a 翡断甏，犍p h5 6 豹条件下还蕊察劐线性条带的产徽f 箭 头所指的能震) 。但在n a h 2 p 0 4 n a 2 h p 0 4 ( 泳道5 7 ，p h6 0 ，7 , 0 ，8 o ) 和t r l s 。h c i ( 泳道8 * l o ，p h7 4 ，8 0 ，9 o ) 缓冲游波中， f e 4 ( n t b ) 4 ( i t - o ) 2 ( 1 - 1 4 s u e ) 叶降黼d n a 的效暴不蠲显，i 嚣显磷酸缓狰溶液中麴艨癜蘩媳1 挂s h c i 缓狰溶液中豁弱。 扶实稔缝栗来看器e 4 邻丐黔4 p o ) 2 ( 酗噶戳零+ 凝裂d n a 懿葳嶷对磷穰缓婚舟壤 赣露敏戆。在酸牲食疆审静反斑( h a c n a a e 缓潦溶滚) 钱予藏幢分矮( t f i s - h c t 缓潦溶滚孛瑟爱瘗，露程磷酸缓薄套囊孛凝裂蔑雯矮糕。岔在 【寥每袋鞋璇阑2 f 辩一s 蛩镧”瑟甏d n a 翡爱痰争慧蓑薅露重要黎薛嚣。簌醚台褥魏鑫 体缭梅寒瓣( 瑟3 a ) ，蠛瑶酸穰幸譬为瑟翡辩体授逡两个双孩魏中心，窿双棱铰中心 每个f e ”分剐与三个苯弗殊嗖的氮艨予、个n t b 配体上前毅胺氮孤子、个璇璃 蔽壤蕊羧潺氧蒙予毒羹一个辑违豹畿耩予熬挝，形簸。2 秘懿键环境，暴黻瓣搬a 黼体构型，配位已达到饱和。配合物瓣断裂d n a 必须存在空位与d n a 络念。酗体 n t b ( 见图3 4 ) 苯并眯唑环上n n * ) 的p k a 为5 5 6 8 ，与f e 3 + 配位聪，必籁在 姣强的酸性舔壤下，譬才能馒其攫予能。融j 毙舻缀蠢可熊趣到双援铁的珏嫦e 擀上， 爨桥转交贼羟褥，当轿连酌一个f 矿与您物螭会鹣黼敲，婪一羟轿甑裂并以端灏始会 熬方式与舞一个f 一+ 缝食，形成豹f 矿+ 一o 臻嚣豫没亲核试裁遴玻d n a 。巍 m ip h 3b 口h i 州5bp 懈m 邮0 时0p h 74p h e0p h 9 a h 删4 舢“，o 一时 t r i s h c f i g u r e3 3 p 辨垮t 如d e p e n d e n c eo f1 5 。4 _ m 。l l 1 b pp b r 3 2 2d n ac l e a v a g ep r o m o t e d 跨 1 0 瓣l 毛。 f 毫鼹砭l x 弘w 嘞( | 趣s 强嚣辩a t3 了强毒 l a n e ：d n ac o n t r o l ；l a n e2 - 4 ：砖l3 正， 4 6 ，5 6 i n0 0 5m o to h a c n a a cb u f f e r ；l a n e5 - 7 ：p h6 0 ，7 0 ，8 0 i n0 0 5t o o ll 4 n a h 2 p o d n a z h p 0 4b u f f e r ；l a n e8 - 1 0 ：p h7 4 ，8 0 ，9 0 ，i nt r i s - h c lb u f f e r ( b o t t o m ) t h ep l o to f t h e c o n c e n t r a t i o no f n i c k e dc i r c u l a rd n av e r s u sp 醚。 f en 0 c 毁 “， l u f i g u r e3 4m e c r y s t a l l o g r a p h i cs t r u c t l 】r eo f f e 4 ( n t b ) 4 ( 1 t o h ( i 1 4 - s u c ) l “( r j g h t ) s t r u c t u r eo f i i g a n dn t b 缓冲介质中断裂效果非常不明显，考虑到d n a 是幽磷酸二酯键将核苷酸遴接起来， 可能原因燎缓冲介质中的磷酸根与d n a 竞争性结食到配合物上，从而抑制d n a 的 薮袭； 3 1 3 磷黢根对四核铁配合物促进d n a 断裂的抑制 鸯了进一步验迂磷酸摄对艮稍张添p o ) 2 龄s 毽c ) 】拜鹭裂d n a 兹搀毫l 效瘦，我 稍在配含耪与d n a 靛葳应傣系中褥辚酸根匏浓液从l 逐渐交化捌5 0m m o il ，电 泳结果见豳3 , 5 。该图臌示随着磷酸糨的浓度逐渐增大( 从泳邋8 到泳道2 ) ， f i g u r e3 , 5t h ei n h i b i t i o no fp h o s p h a t eo n1 5 ，4g m o l p b r n 2d n ac l e a v a g ep r o m o t e db y 1 0g m o ll “l f e 4 ( n t b ) 4 ( “- o h ( m - s u e ) “t h er e a c t i o nw a si n c u b a t e df o r9 0m i na t3 7 f a n ei d n a 。o n t r o l ；l a n e2 8 ，n 博p h o s 曲a t ew a sa d 船d 船蛙持豫a c 蛀。娃蝌袋e mw i t hd e c r e a s i n gc o n c e n t r a t i o n f r o m 5 最4 e ，3 毽2 0 ，t 0 ，5 ，谂1 m m o i l - 5 ， f i g u r e 3 t h e p l o t o f t h e c o n c e n t r a t i o no f n i c k e d c i r c u l a r d n a v e r s u s t h ec o n c e m a 噍m 。f p h o s p h a t e 。 将i i 型d n a 的浓度对磷酸根浓度作图( 图3 6 ) ，从拟合的曲线表明磷酸根对 f e 4 ( n t b ) 4 ( 壮o ) 2 ( 阻一s u e ) “断裂d n a 的揶制符合指数衰减规律，从图中估算出i c 5 0 ( 半季晕毒l 浓疫凌受1 0 m m o l 0 2 。 3 1 4 温畿对四核铁配禽物促进d n a 断裂的影娴 在已缀递懿人工瘩解酶当中，鸯一些凝裂试裁凝裂d n a 慰滠度菲鬻敏感，懿 q u e 等舍藏了c e 2 ( h p t a ) 鞠l a 2 ( h p t a ) ，这些配合褥必须在较高鹣瀑度( 5 y c ) 才能 有效断裂d n a ，温度凰降低( 3 7 ) 配合物的潜性消失”。因此，我们通过改变 反应温度米研究【f e 4 ( n t b ) 4 ( p 一o ) 2 ( 灿n s u e ) ”断裂d n a 对温度的依赖。我们选撵四个 不霹翡瀑魔( 0 ， 5 ，翡，弱) 逶零予配合凌与d n a 麓反立，结果霓嚣3 + 7 。放蚕 中显示随糟温度增高， f e 4 ( n t b ) a ( t t - o ) z ( 9 4 - s u e ) 计辑袈d n a 的效果逐渐增强，即使 在较低濑度( 0 ) d n a 的断裂程度达到2 8 。从实验中袭明 f e 4 ( n t b ) a ( i a - o ) 2 ( m - s u e ) l ”龌裂d n a 龄爱应可戳在一令较宽姻滋度范围避行。 量 主 堂 薹 皂 t e m b 博h 椭c f i g u r e3 7 ( l e r ) t h ed e p e n d e n c eo f1 5 4v m o ll p b r 3 2 2d n ac l e a v a g ep r o m o t e db y1 0g m o ll _ 【f 母圆砖m 闻羚s 嘲矿o nt e m p e r a t u 撺黼e ：d n ac o n t r o l ；i a n e2 - 5 ：r e a c t i o nt e m p e r a t u r e w 0 ，t 5 ，4 0 ；5 8 ，r e s p e c t i v e l y ( r i g h t ) t h ep t o to f t h ee o a e o n t r a t i o r to f n i c k e dc i r c u l a rd n av c i $ u s t e m p e r a t u r e - 3 1 ，5 嵩- t - 强褒对蹬撩镶配合壤键邀d n a 枣 裂懿繇睫 金满_ 舀己含物与d n a 可以有多种方式发生作用，如静电相互作用、氢键、姆d n a 应体系中的离子强度采研究静电作用对配合物断裂d n a 的影响。在反应体系中保 持其他条件一致，使n d 的终浓度从4 6r n m o ll 。变化到1 1 6m m o ll ，反应9 0 分钟 后斡电泳缝采霓墨3 8 。觚鹫中显示，当群胡兔7 6m m o lo ( 泳遂3 ) 瓣，帮 n g i f e 4 f n a l 3 ) 4 ( p - o h ( p 4 s u c ) 】为7 6 0 0 ，配合物断裂d n a 朱受到影响，寝明