（植物学专业论文）农杆菌介导的苜蓿遗传转化体系的建立与优化.pdf

摘要 盐碱胁迫是限制作物生产最严重的非生物胁迫因素之一。许多研究者正在培育耐盐 作物新品种来适应和利用盐碱地。然而，植物耐盐能力是一个非常复杂的生理性状，传 钪育种很难大幅度的提高植物的耐盐能力，通过基因工程手段能够很好的解决这个难 题。目前，随着分子生物学及生物技术的迅速发展，已经发现了一些与耐盐相关的新基 因，并获得了耐盐能力相对提高的转基因植株。紫花苜蓿( 拟甜却s 讲砌l ) 为世界 范围内广为种植的多年生优质豆科牧草。利用基因工程技术提高苜蓿耐盐性，获得抗逆 新品系，将对我国牧草业发展有重要的现实意义。本研究的目的是建立并优化苜蓿高频 再生植株转化体系，并将角碱蓬n 棚a n t i p o r t e r 基因导入紫花苜蓿公农1 号中，为利用 生物技术改良苜蓿品质搭建基础平台。 基因型是限制遗传转化的关键因素之一，选择高频再生基因型是苜蓿遗传转化成功 的保障，本试验从7 份紫花苜蓿供试材料中成功的筛选到一个具有高频再生潜力的基因 型公农1 号。 建立了苜蓿胚性愈伤悬浮培养系统，对影响悬浮培养的两个主要因子一胚性愈伤接 种量和悬浮培养转速进行优化，确定了本实验悬浮培养最佳接种量为3 鲋0 i i l l ，悬浮培 养理想转速为1 2 m m i n 。 建立超声辅助农杆菌介导苜蓿胚性愈伤遗传转化系统，以悬浮胚性愈伤作为实验材 料，应用超声波辅助农杆菌介导法，成功的建立了苜蓿遗传转化体系。在实验过程中， 优化了影响苜蓿遗传转化的因素，包括超声波最佳处理时间( 8 s ) 、a s 最佳使用量 ( 1 0 0 l l i i l o 地) 、最佳共培养时间( 5 d ) 、卡那霉素最佳抗性浓度( 5 0 1 1 1 9 l ) 。 转基因植株的分子检测，在本试验中成功的获得了1 5 株抗性植株，p c r 检测证实 外源基因已经整合到苜蓿的基因组中。 本实验成功的建立了苜蓿体胚高频再生体系，在此基础上通过农杆菌转化法成功的 筛选到转基因植株，为苜蓿遗传转化的理论和应用研究提供了有效的方法。 关键词：基因转化体系；农杆菌介导；胚性愈伤；悬浮培养；苜蓿 a b s t r a c t s a l t - 础k a l is n e s si so n eo f 血em o s ti i n p o 咖l t 狐t o r si 1 1i i “b i t i l l gt h ep r o d u c t i v i 锣o f c r 叩si i lw o r l d w i d e m a n yr e s e a r c h c r sa r ea i m i n gt o w a r dt l l eb r e e d i n go fs a l t - t o l e r a l l tc r o p c u l t i v a r st ou t i l 娩es a i i i l es o i l h o w e v e r ，s a l tt 0 i e r a n c ei sc o m p l e xp h y s i o l o 百c a l 仃a i t si np l a n t t r a d i t i o i 谢b r e e d i n gm e t h o di sd i m c u l t yt 0i m p r 0 v es a l tt o l e m c eo f p l a l l t s t h ep r o b l e mm a y b ed i s s o l v e db ya p p l i c a t i o no ft l l eg e n e t i ce n g i i l e e 血g a tp r e s e n t ，w i mm o l e c u l a rb i o l o g ya 1 1 d b i o t e c l l i l o l o g yd 【e v e l o p m e n t s ，s o m eg e n e sr e s p o n d i n gt os a l t s t r e s sh a v eb e e nf o u n di i lm a n y p l a n ts p e c i e sa i l dt h ea p p l i c a t i o no ft l l e s eg e n e sh a v eo b 幽e dal a r g en _ u i 】n b e r so fi i n p r o v i n g s a l t - t 0 1 e r a n ti i l 仃a i l s g e l l i cp l a n t s a l f a l f aq 刎f c 口罟口j 口胁懈l ) i sm em o s tf - 锄1 0 u sh e r b a g ei n w o r l d w i d e a l f a l f a ( 蚴翻泐驴册舭。l ) i sn l em o s tf a m o u sh e r b a g ei nw o r l d w i d e i th a s i m p o r t 趾ts i 印i f i c a i l c et oh e r b a g ed e v e l o p m e n ti i lo u rc o u n t r y ，训c ha p p l i c a t i o no fg e n e t i c e n 百n e e rb r e e d sn e wa 1 僦f ac u l t i v a ra n de 1 1 l l a n c e ss a l tt o l e r 趾c eo fa l 僦f a i n t b j ss t u d y ，w e s u c c e s s e di n e s t a ：b l i s l l i n g a i l d o p t 砌z i n gg e n e t i c 吣f o r m a t i o ns y s t e mo fa l f a l f a ，a n d 锄n s f e 盯e dv a c u o l a rn 矿h + 锄t i p o r t e r ( & ，口砒c d 聊纪“肠玉i n t oa l f a l f ag e n o m e t h e s e r e s u n sw i l ls e tu pt h eb 硒eo fg e i l e t i ce n 垂1 1 e e r i n go fa l f a l f a t h ep r i m a 巧r e s u l t so fo u r e x p e r i m e n t 鹊l i s tb e l o w ： g e n o t y p ei so n eo fi i n p o r t a l l ti 幽i t o rf k t o rf o rp l a l l tg e n e t i c 觚l s f o n n a t i o n ，a 1 1 d7 c u l t i v a r sw e r e 址e n 嬲d o n o rm a t 碰a lt os c r e e nt h eb e s tg e n o t y p e t h er e 蹦ti n d i c a t e dt 1 1 a t g n - 1h a dh i 曲e rr e g e n e r a t i o n 舭q u e n c yt h a no t l l e rc u l t i v a r s t h es u s p e n s i o nc u l 七u r es y s t e mo fe m b r y o g e n e s i sc a l l u sw a se s t a b l i s h e di na l f a l f a w e o p t m z e dt h et 、7 l r ok e yf 犯t o r so fe f f e c t i i l ge m b 巧o g e n e s i sc a l l u sr e g e n c r a t i o n ，i n c l u d i n g i 1 1 0 c u l a t i o n 姗吼to fh y p o c o t y l sc a l l u sa i l dr o t a t i n gs p e e do fs u s p e n s i o nc u l t u r e u l t i 眦e l y ， t l l e3 舻o 血a n d12 0 r 1 1 1 i nw e r ed e t e n n i n e d 内rs u s p e n s i o nc u l t l 姐e e r i i b r y o g e n e s i sc a l l u s觚f o 如畸o ns y s t e mu s i n g s o i l i c舔s i s t e d 彳幻叼6 口c f 盯m 朋- m e d i a t i e dm e t h o d ( s a a t ) w a u se s t a b l i s h e da n do p t i i n i z e d w et o o ks u s p e i l s i o ne m b r y o g e n e s i s c a l l u s2 l sm a t e r i a l ，s u c c e e d e di ne s 切b l i s l l i i l ga l f a l f a 呦l s f o n l l a t i o ns y s t e mu s i n gs a a t m e t h o d d u r i i l gm et e s t ，w eo p t i i l l i z e dm a n yf a c t o r se f - f e c t i n go ng e n e t i ct r 黜f 0 如嘣i o n ， 妣l u d i n gt h et 妇eo fs o i l i c 仃e 细e n t ( 8 s ) ，m ea sc o n c e 删i o n ( 1o l l ) ，t h ec o c u l t i v a t e t i m e ( 5d a y s ) a i l d k a n 卸1 y c i nc o n c e n 仃a t i o n ( 5 0 m l ) t o t a l15r e s i s t 姐tp l 肌t s0 b 诎l e di nt h j se x p e 曲l e n tw e r ea s s a y e du s i n gp c r 1 1 1 et e s t r e s u l tc o n f i n n e dt l l a te x o g e n o u sg e n eh a di r 兆g r a t e di n t oc h r o m o s o m eo fa l f a l f a h lt h i ss t t l d y ，w es u c c e e d e di ne s t a ：b l i s h i l l gt h e1 1 i g l l 丘e q u e n c yr e g e n e r a t i o ns y s t e mo f a l f a i f a ，a i 】l do b t a i n e dt r a i l s g e i l i cp l a n t sv i a 彳6 加6 口c 纪，i 胁m m e d i a t e dm e m o du s i n gm e r e g e n e r a t i o ns y s t e m 1 1 1 i sw i l ls u p p l ye f i f e c t i v em e t h o df o rt 1 1 et 1 1 e o 巧a l l da p p l i c a t i o ns 砌yo f g e n e t i c 仃a n s f o m a t i o ni 1 1a l f a l f a k e yw o r d s ：g e n e t i c 搬l s f o m 姐t i o n s y s t e m ； 么g 加抚配鲍砌堋- m e d i a t e d m e t h o d s ； 朗曲妒g e n e s i sc a l l l i s ；s u s p e 璐i o nc u l t u r e ；a l f a l f a 独创性声明 本人郑重声明：所提交的学位论文是本人在导师指导下独立进行研究工作所取得 的成果。据我所知，除了特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果。对本人的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中作了 明确的说明。本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名： 学位论文使用授权书 本学位论文作者完全了解东北师范大学有关保留、使用学位论文的规定，即：东 北师范大学有权保留并向国家有关部门或机构送交学位论文的复印件和电子版，允许 论文被查阅和借阅。本人授权东北师范大学可以采用影印、缩印或其它复制手段保存、 汇编本学位论文。同意将本学位论文收录到中国优秀博硕士学位论文全文数据库 ( 中国学术期刊( 光盘版) 电子杂志社) 、中国学位论文全文数据库( 中国科学技 术信息研究所) 等数据库中，并以电子出版物形式出版发行和提供信息服务。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：通垒备 指导教师签名： 日期：厶碰：。侈日 期： 学位论文作者毕业后去向： 电话： 邮编： 0 4 7 6 2 2 0 5 7 5 2 0 2 4 0 0 0 东北师范大学硕士学位论文 引言 土壤盐渍化是影响农业生产和生态环境的严重问题。全世界盐地约占陆地面积的三 分之一，我国盐碱地面积约o 4 亿h m 2 【l 】，仅海岸带、滩涂就达一亿多亩，且有逐年增大 的趋势，而地球上的淡水资源仅占地球表面水资源的1 6 ，在人口不断增加，耕地日趋 减少和淡水资源不足的严重压力下，如何利用大面积的盐碱地、荒漠化土地和丰富的咸 水资源发展农业，将是人类迫切需要解决的重大课题。随着现代分子生物学技术的飞速 发展，使植物育种取得了突破性进展，已有较多研究将抗盐、耐旱基因克隆后整合进目 标植物中，从而开辟了选育耐盐植物品种的新途径【2 】。 苜蓿( 彪秭磁g d 勋加) 是世界上最重要的优良豆科牧草之一，营养丰富，素有 “牧草之王”的美称【3 】，在我国已有2 0 0 0 年以上的栽培历史。苜蓿含有丰富的蛋白质、脂 肪、氨基酸、微量元素等多种营养成分，苜蓿干草中赖氨酸的含量比玉米高5 7 倍，维生 素中以胡萝卜素的含量最为丰富，微量元素中以铁和锰的含量较高。在同等条件下，紫 花苜蓿比禾本科牧草所收获的可消化蛋白质高2 5 倍左右，矿物质高6 倍左右，可消化养 分高2 倍左右【4 】。苜蓿不仅是一种重要的饲料作物，而且还在土壤改良、水土保持及生态 环境保护等方面发挥着重要而积极的作用p j 。因此，开展耐盐碱基因导入苜蓿的技术研 究具有重大的社会效益、经济效益和生态效益。目前，植物的耐盐生理结构及耐盐生理 生化调控机制在分子水平上已有了较深入的研究，这为研究苜蓿的抗盐性，以及应用转 基因技术提高苜蓿的抗盐能力奠定了基础。 1 1 苜蓿遗传转化方法 一套完整的转化体系分为转化系统和受体系统。在目前的研究中，已经建立的转化 系统有载体转化系统、原生质体d n a 直接导入转化系统、基因枪d n a 导入转化系统及 利用生物种质细胞如花粉粒等介导转化系统等。目前使用最多、技术最成熟、成功实例 最多的是载体转化系统，植物基因工程中的载体主要包括t i 质粒转化载体、鼬质粒转化 载体以及病毒转化载体等。目前应用于苜蓿上的转化方法主要有以下几种： 1 - 1 1 农杆菌介导转化获得转基因苜蓿有多种方法，目前实验室最常用的是通过根瘤 农杆菌介导转化，因为农杆菌介导法转化受体时，外源基因整合的拷贝数少，重排程度低， 转化效率高。1 9 7 7 年，c 协n 等人证明根癌农杆菌的t i 质粒的一部分可以转入植物细胞， 并插入植物的基因组中。t i 质粒是细胞核外的双链环状d n a 分子，长度约2 0 0k b ，其中致 病区和t d n a 边界序列是t i 质粒将外源d n a 片段转移到植物细胞所必须的两个序列， 插入t d n a 两个边界序列之间的外源d n a 序列就有可能被转移到植物基因组中。w e b b 用5 种农杆菌对6 种豆科牧草( 包括紫花苜蓿) 进行遗传转化，发现有的农杆菌不能使紫花 苜蓿的茎和叶柄致瘤，即农杆菌介导的转化方法在紫花苜蓿中具有寄主局限性【6 】。虽然如 东北师范大学硕士学位论文 此，根癌农杆菌的t i 质粒系统仍是目前研究较多，理论基础较清楚，技术方法较成熟的苜蓿 基因转化途径u j 。 1 1 2 直接转化法直接转化法是通过物理或化学方法将外源基因导入植物细胞或原 生质体，由此获得转基因植株的方法【，j 。在苜蓿转基因研究早期阶段，常采用直接转化法。 1 9 8 6 年，r e i c h 等用显微注射法将t i 质粒导入紫花苜蓿原生质体，得到转化的愈伤组织【8 1 。 1 9 9 0 年，k u c h u k e 等用直接基因转移法将外源基因导入苜蓿属另一个物种肱砌g d 6 d m 凰的叶肉原生质体获得转基因植株【9 】。国内，黄绍兴等以紫花苜蓿根原生质体为材 料，采用电击法将g u s 基因直接导入紫花苜蓿原生质体中，产生转基因植株，转化频率为6 5 【l o 】，为紫花苜蓿的品质改良、抗逆性的提高等提供了一个有效的途径。直接转化法大 都不受组织类型限制，而且避开了组织培养和再生的困难，但该法转入的基因拷贝数是随 机的，导入的外源基因易沉默，因而转化效率低。 1 2 苜蓿遗传转化受体系统的建立 植物基因转化受体系统，是指用于转化的外植体通过组织培养途径或其他非组织培 养途径建立起来的高效、稳定的再生无性系，能接受外源d n a 整合，并对转化选择抗生 素敏感的再生系统。目前已经建立的有效受体系统主要有愈伤组织再生系统、直接分化 再生系统、原生质体再生系统、胚状体再生系统和生殖细胞受体系统等。 成功的基因转化首先依赖于良好的植物受体系统的建立。苜蓿基因工程研究的最终 目的是获得外源基因稳定表达的转基因植株以及培育性状优良的转基因苜蓿新品系。苜 蓿作为基因转化的受体，其本身存在着体细胞胚分化困难、分化率低、重复性差等问题。 这就制约了苜蓿转基因研究工作的进一步开展，也是多年来转基因苜蓿研究一直停滞在 实验室未能走向市场的症结所在。为此，有必要筛选出多种体细胞胚分化率高的苜蓿品种， 进一步完善受体再生系统，使该系统具备重复性强、操作简便、培养周期短、再生率高和 遗传性稳定的条件。为转基因苜蓿达到产业化规模做好技术储备。 2 0 世纪7 0 年代以来，对植物基因转化受体系统的研究已进行了大量的工作，先后建 立了多种有效的受体系统，适应于不同转化方法的要求和不同的转化目的。 1 2 1 愈伤组织再生途径 愈伤组织再生途径是指由外植体经脱分化培养诱导愈伤组织，并通过分化培养获得 再生植株的受体系统。张万军【1 l 】等对秘鲁苜蓿等品种的子叶和下胚轴愈伤组织再生植株 的过程进行系统研究，建立了紫花苜蓿愈伤成苗高频再生体系，该体系可使秘鲁苜蓿的 子叶愈伤组织分化率达到1 0 0 ，下胚轴愈伤组织分化率达到9 2 以上，且完成植株再生 只需6 0 7 0 d 。肖荷霞【1 2 】等以紫花苜蓿无菌苗的下胚轴、茎和叶3 种不同外植体为材料， 在添加不同浓度激素的m s 培养基上诱导愈伤组织再生成功，且分化率较高达9 0 9 。 1 2 2 直接分化再生体系 直接分化再生体系是指外植体细胞越过脱分化产生愈伤组织阶段而直接分化出不 定芽获得再生植株。用叶片、幼茎、子叶、胚轴等为外植体，直接分化的研究已取得很 多成功的事例。早在1 9 8 8 年m c c a b e 等用基因抢转化大豆茎尖获得了转基因植株。随后 2 东北师范大学硕士学位论文 v e l u l a m b i 等( 1 9 8 8 ) 在棉花上也获得了类似的结果。 1 2 3 原生质体再生途径 原生质体是“裸露”的植物细胞，它同样具有全能性，能在适当的培养条件下诱导出 再生植株。其主要优点是外源d n a 的摄取更加有效，嵌合体较少，但遗传变异大、稳定 性差，培养周期较长、难度较大，植株的分化率较低。早在1 9 8 0 ，l 【1 3 】等就用苜蓿叶 肉分离原生质体并诱导成苗，同时还发现苜蓿同一品种不同单株分离原生质体在分裂频 率及胚状体形成上有差异。黄邵兴【i o 】等利用电激法将( m s 基因直接导入紫花苜蓿根原 生质体，且再生植株成功。发现根原生质体经电击处理对成活率影响不大，并且再生的 频率高，因此，原生质体再生系统同样是理想的基因转化受体系统。 1 2 4 体胚再生途径 植物体细胞胚胎发生是指二倍体或单倍体细胞在未经性细胞融合的情况下，模拟有 性合子胚胎发生的各个阶段而发育形成一个新个体的形态发生过程。胚状体的诱导和发 育是植物细胞全能性的最可信证明，依此建立的再生体系也是最为理想的基因转化受体 系统。其优点是转化率高、嵌合体较少、遗传性一致。而且，由于胚状体具有两极性， 在发育过程中可同时分化出芽和根，形成完整植株，从而减少了不定芽发育过程中较为 困难的环节“生根培养”。有关利用苜蓿上胚轴、叶柄、花药等外植体在m s 、s h 等培养 基上分化体细胞胚并再生植株的研究报道很多。李望丰【1 4 】等通过不同浓度的2 ，4 d 对 几个苜蓿品种进行诱导研究，筛选出对2 ，4 d 敏感、体细胞胚发生能力和分化率均较高 的苜蓿品种，进一步完善了胚状体再生体系。梁慧敏【l5 ，1 6 】等以5 个紫花苜蓿品种的下胚 轴、叶片和子叶为外植体，成功地诱导出胚性愈伤组织和胚状体，并再生出植株。 1 3 苜蓿基因工程研究进展 1 3 1 抗逆性转基因苜蓿 1 9 9 3 年m c k e r s i e 等将蓝雪状烟草的m n s o d 基因利用农杆菌转入苜蓿，田间试验 证明，转基因植株的抗寒抗旱性都明显增强。2 0 0 0 年，b r o u w e r 等报道将f e s o d 合成 酶基因转入苜蓿，经田间两轮鉴定筛选目的基因植物，越冬率比对照平均提高2 5 抗 寒性明显提高。 苜蓿是中等耐盐作物，通过转基因工程提高耐盐能力，对进一步开发利用盐碱地和 增加苜蓿生产都有及其重要的意义。目前苜蓿的耐盐基因已被确认。公认的转录因子 ( a l f i i l l ) 在苜蓿根部可增加耐盐m s p r p 2 基因的表达( w i n c o va n db a s t o l a ，1 9 9 9 ) 。充分表 达甜丘n l 的转基因苜蓿表现出生长加快和耐盐性提高【r 7 1 。目前，已经证实盐过敏感( s a l t 0 v e r l ys e n s i t i v e ，s o s ) 信号途径在植物耐盐方面起着关键的调控作用，并同时控制着离 子自身平衡( h o i n e o s t a s i s ) 【1 8 】。这一信号通路中液泡膜型n a 堋+ 逆向转运蛋白基因 脚) 备受人们关注，它所编码的蛋白存在于植物细胞液泡膜上，可以将n a + 区隔化 至液泡中，避免细胞质中的高n a + 盐毒害，维持高的k 堋a + 比，达到离子平衡和渗透 平衡，以提高植物的盐耐特性，从而减轻或防止植物生长受抑制掣1 9 。2 1 】。 苜蓿对铝( a 1 ) 的毒性敏感，可导致根部发育受阻和低产。大多数植物的耐铝性与有 1 东北师范大学硕士学位论文 机酸含量有关( f u e n t ee ta l ，1 9 9 7 ；h o c k i n g ，2 0 0 1 ) 。带柠檬酸合成酶基因的转基因苜蓿， 因为柠檬酸含量高，故比未转基因的苜蓿表现出更长、生长更佳的根部特性( r o s e l l i l l ie ta l ， 2 0 0 2 ) 。带苹果酸脱氢酶基因的转基因苜蓿，因为柠檬酸、草酸、苹果酸、琥珀酸和醋酸 含量的增加，耐铝性也有相应增加【2 2 1 。 。 1 3 2 抗虫转基因苜蓿 病虫害是造成苜蓿减产的重要原因，近年来，苜蓿抗病虫基因工程的研究在提高苜蓿 抗病虫上展现出良好的应用前景。一批与抗病虫害相关的基因，包括几丁质酶基因，葡聚 糖酶基因，b t 基因和蛋白酶抑制剂基因等相继被分离和克隆出来。一些学者将苜蓿花叶 病毒( a l m 的外壳蛋白( c o a tpr o t e i i l ，c p ) 基因转入苜蓿中，转基因植株中c p 积累一般占 叶片总蛋白的o 0 5 o 4 ，最高达o 8 ，c p 积累量与转基因植株的抗病程度成正比，c p 含量为o 0 5 的转基因苜蓿对a l m v 具有良好的抗性，接种a im v 后5 个月不发病。转 a i 的c p 基因的苜蓿，还表现出对p v x ，c m v ，t m v 等病毒具有一定的抗性【2 3 】。j a v i e 等人将番茄蛋白酶抑制剂基因转入苜蓿，转基因植株对鳞翅目昆虫具有良好的抗性【2 4 】。 马铃薯植物m a i l d u c a s e x t ap i 基因导入苜蓿，转基因苜蓿对咀嚼式口器昆虫具有明显的 杀毒作用【2 5 1 。此外，转b t 基因的苜蓿，已在实验室内证实了对埃及棉花蠕虫和甜菜粘虫的 抗性。将苜蓿的葡聚糖酶基因口咖d 转入首蓿后，发现超量表达a 西u 1 的植株已表现出对 根霉疫腐病的抗性。 1 3 3 抗除草剂转基因苜蓿 目前，应用基因工程技术培育抗除草剂苜蓿主要有两种策略闭：一是修饰除草剂作 用的靶蛋白，使其对除草剂不敏感或促使其过量表达以使苜蓿吸收除草剂后仍能正常代 谢；二是引入降解除草剂的酶或酶系统，在除草剂发生作用前将其降解。这两种策略都已 成功地应用。1 9 9 0 年，k u t l l 1 e e nd h a l l u i n 以农杆菌介导，将两种不同的c l l i l n c r i c b a r 基因导 入曹蓿体内，得到了抗除草剂( p p t ) 的转基因苜蓿，田间试验发现，转基因植株对除草剂 g l u f o s i - n a t e 黜0 1 1 i 啪具有明显抗性，对照植株喷洒除草剂后均生长不刚2 7 】。美国孟山都 公司将e p s p s 基因转入苜蓿，表现出了对除草剂( r 伽n d u p ) 良好的抗性。 1 3 4 苜蓿品质的改良 吕德扬等人通过农杆菌介导法将高含硫氨基酸蛋白) 基因转入苜蓿，对转基因 植株进行氨基酸分析，发现含硫氨基酸的含量有明显提甜2 8 1 。美国科学家狄克逊( d i ) 【o n ) 博士分析了苜蓿中控制木质素合成的咖啡酸甲基转移酶( c o m t ) 和咖啡酰c o a 甲基转移 酶( c c o a o m t ) ，并分离了c o m t 和c c o a o m t 的基因，进一步获得了转基因苜蓿。在这 种苜蓿中，咖啡酸甲基转移酶和咖啡酰c o a 甲基转移酶的酶活性降低了8 0 ，木质素含量 降低了2 0 3 0 。而且木质素的组成也有明显的改变，但是这种转基因苜蓿的生长发 育并没有明显的变化。 1 3 5 植物生物反应器 近年来，苜蓿作为一种植物生物反应器产生酶制剂，药用蛋白，植物疫苗等工作已经取 得了很大的进展。加拿大的m e d i c a g o 有限责任公司正将苜蓿作为一个生物工厂，生产高价 值的转基因蛋白【2 9 】。a l l s t i n p h n i p s 和z i e g e l h o f f e r 展示了一种含有真菌植酸酶的转基因苜 4 东北师范大学硕士学位论文 蓿，该苜蓿能够生产大量植酸酶，其中植酸酶是一种饲料添加酶，在饲料行业中有着非常广 泛的用途 3 0 1 。2 0 0 2 年，s 锄t o s 等将口蹄疫病毒( f m d 的v p l 蛋白的编码基因整合到苜蓿 基因组中并使其在苜蓿体内表达，牲畜采食了苜蓿植株后，体内产生抗体，取得对口蹄疫的 免疫能力【3 l 】。 1 4 植物的耐盐性研究 1 4 1 盐分对植物的伤害 l e v i t t 【j 列提出盐对植物的胁迫可分为渗透胁迫、离子毒害、离子不平衡或营养缺乏 三类。m u i l l l s 等提出的盐害假说认为【j 川：新叶生长速率减慢是植物对盐渍响应最敏感 的生理过程，且减慢的速率与根际渗透压成正比；叶片含盐量过高是植物死亡的最主要 原因；碳水化合物枯竭，导致植物死亡。对于盐害假说中提到的渗透胁迫和离子毒害日 前仍被认为是盐对植物危害的两个主要过程，而且关于这两个胁迫过程的先后顺序也有 人作过研究。m u n n s 认为【j 引，渗透胁迫在前，到一定时间后，离子毒害才发生；而赵可 夫等认为l j 川，渗透胁迫与离子毒害同时存在，但在植物整个受胁迫过程中，二者的表现 在同期内呈现的强弱不同。盐分对植物的伤害，主要表现在植物生长抑制、光合下降和 加速衰老等方面。 1 4 2 植物的盐胁迫适应机制 耐盐性是指植物在盐胁迫下维持生长、形成经济产量或完成生活史的能力【jo | 。植 物对盐胁迫的适应是一个相当复杂的问题，研究表明耐盐的单细胞不能再生成具有耐盐 遗传性状的植株p 蚶j 。目前，通过遗传操作，在植物体内组成型地过量表达特异基因 提高转基因植株的耐盐性【3 9 ，4 0 】，因而，通过基因工程操作细胞水平上的几个过程可提 高植物的耐盐性。 在高盐环境中，植物的水势和离子分配平衡遭到破坏，包括细胞水平和植物整体水 平的破坏【4 1 4 2 i ，而植物可以通过体内相互联系的三个方面的生命活动获得对盐胁迫的 耐性( 图1 ) 【4 3 4 4 】。 5 东北师范大学硕士学位论文 图1 盐胁迫和植物耐盐性的三条途径及其相互作用( z h u ，2 0 0 1 ) 内环境稳定包括离子稳定和渗透稳定。s o s 途径介导离子内稳定和n a + 耐性。m a p 酝途径与酵 母的h o g l 途径类似，介导渗透内稳定。两个初级胁迫，离子和渗透胁迫，引起次级胁迫如氧化胁迫。 低温、干旱和a b a 也会引起氧化胁迫。一些转录因子如c b 肋l 也b 介导胁迫基因如r d 2 9 a 的表达， 从而降低氧化伤害( 解毒作用) 。同时内环境稳定和解毒作用又调控细胞分裂和伸k ，调控生长调 ：符。 1 4 3n a + 的区域化作用 大量的研究表明，植物吸收的n a + 、c l 。等离子必须积累在液泡中，否则会干扰细胞 质和叶绿体等的生理生化代谢过程，这种作用称之为离子区域化作用。h a e y 等【4 5 j 用 组织化学定位方法证明，在盐胁迫下，作物的确把n a + 、c 1 等离子积累在液泡中。f l o w e r s 等【4 6 经过体外试验证明，盐生植物和非盐生植物的细胞质酶对n a + 非常敏感n a + 、c l 。的 区域化分配是植物对盐渍环境的适应结果。由于离子区域化，使得液泡中的n a + 浓度远 大于细胞质中的n a + 浓度，j e s c l l l ( e m 对此结果进行了详尽的研究和证明，并提出一个关 于质膜上n a + k 十交换系统以及导致液泡膜上对n a + 吸收和k + n a + 交换的促进模型。液 泡膜转运蛋白活性与n a + 、c l 一进入液泡有密切关系，耐盐的高梁液泡膜转运蛋白活性比 盐敏感的高梁高，而且在液泡膜上n a + h + 逆向输运蛋白，直接参与n a + 在液泡中的积 累。 1 4 4 液泡膜n a + 矿逆向转运蛋白基因在植物耐盐基因工程的应用 目前关于液泡膜n a + h + 逆向转运蛋白基因在植物耐盐基因工程研究中的应用已受 到重视，现已从不同植物中分离到许多液泡膜n a + h + 逆向转运蛋白基因，a t n h x l 定位 于植物和酵母细胞的液泡膜一m 驯j ，a t n h x l 可以在功能上替代s c n h x l ，并且这种替 代活性需要内质网液泡膜v - t y p ea t p a s e 活性以推动在酵母细胞中n a + 向液泡的离子区 域化【) 。在酵母细胞中表达a t n 脱或a t n h x 5 同样抑制了n h x l 细胞的n a c l 和潮霉 素敏感表型，表明这两种基因的产物具有n a + h + a n t i p o r t e r s 。组成性表达拟南芥a t n h x l 基因的转基因植株能够在高盐浓度下生长，如转a t n h x l 基因的番茄可以在 2 0 0 珈m n a c l 的条件下正常生长、开花、结实，而对果实品质没有明显影响，n a + 也没有 6 东北师范大学硕士学位论文 在果实中大量积累。转a 伽1 基因的油菜在含2 0 0 i 】心烈a c l 的培养基上生长，n a c l 的 积累量可以占到干重的6 ，但是没有对种子产量和油菜品质产生影响。转a 伽1 基 因的水稻可以在3 0 0 m m n a c l 胁迫条件下存活。有趣的是，转基因番茄的叶片中积累很 高的盐分，而果实中很低p 。而且，过量表达液泡膜n 涮逆向转运蛋白并未因为液 泡膜n a + 旷逆向转运蛋白对k + 运转活性的增加而破坏细胞质中k + 的平衡p z ”j 。同时 过量表达液泡膜n a + 一逆向转运蛋白，也没有干扰液泡膜n a - 矿逆向转运蛋白对细胞 质m j 或液泡p 训p h 、值的调节。国内也已有应用拟南芥液泡膜n 涮逆向转运蛋白基因 ( a 伽1 ) 转化玉米和小麦等农作物，并获得了耐盐能力相对提高的转基因植株的文 献报道l ) 训。这些结果均表明植物液泡型n 涮逆向转运蛋白基因对于改造农作物的耐 盐性状以及耐盐作物在农业生产中的应用有着不可估量的作用。 7 东北9 币范大学硕士学位论文 2 材料与方法 2 1 实验材料 2 1 1 植物材料 苜蓿：保定、公农l 号、沈农、武功、美国熊杂l 号、苜蓿王、中牧共7 个品种， 均由吉林省农科院惠赠。 2 1 2 农杆菌菌株与质粒 转化用的质粒为p b i g f p n h x l ( 图2 ) ，由本实验室李望丰博士惠赠。该质粒含有角碱 蓬来源的n h x l ( n a + 但+ 逆向转运蛋白) ，c a m v 3 5 s 启动子，绿色荧光蛋白( g f p ) 报告 基因和抗性筛选基因n p ti i 基因( 卡那霉素) 。供试菌株为l b a 4 4 0 4 。 图2 质粒p b i g f p n h x l 2 1 3 主要试剂 组织培养所用化学试剂均购自北京鼎国公司；头孢霉素、卡那霉素和利福平购自上 海生工有限公司；乙酰丁酰酮为s i 班a 公司产品；分子生物学试剂均购自上海生工有限 公司。 2 1 4 基本培养基 细菌培养基：y e b t r p t o n e 1o g l y e a s te x t r a c t 1 9 l m g s o t 7 h z 00 5 9 l s u c r o s e 5 9 l p h7 o ( 固体培养基加1 5 的琼脂) 植物培养基： m s 培养基配方见实用植物组织培养技术教程 u m 培养基配方见p 1 a n tp h y s i 0 1 ，1 9 7 4 ，5 4 ：9 3 6 9 4 4 种子萌发培养基：m s 。+ 3 0 蔗糖+ o 5 8 琼脂，p h 5 8 愈伤组织诱导培养基：m s 盐+ u m 有机+ c h2 9 + 2 4 一d2 m g l + k t o 2 5 m g l + 3 0 r 东北师范大学硕士学位论文 蔗糖+ 0 5 8 琼脂，p h 5 8 分化培养基：m s 盐+ m s 有机+ 6 一b ao 5 m g l + n 从o 5 m g l + 3 蔗糖+ o 5 8 9 l 琼脂，p h = 5 8 悬浮诱导培养基：m s 盐+ u m 有机+ c h2 9 + 2 4 一d2 m g l + k t 0 2 5 m g l + 3 o 蔗糖， p h 5 8 共培养液体培养基：m s 盐+ u m 有机+ c h2 9 + 2 4 一d 2 m g l + k t 0 2 5 m g l + a s l 0 0 u m l + 3 o 蔗襄；踣，p h 5 8 半固体共培养培养基：m s 盐+ u m 有机+ c h2 9 + 2 4 一d 2 m g l + k t 0 2 5 m g l + a s10 0 u m l + 3 0 硖蓑考奇，0 4 琼脂，p h 5 8 胚性愈伤组织分化培养基( 筛选培养基) ：m s 十n a a 0 0 5 m g l + 6 一b a0 5 m g l 十3 o 蕨蔓糖+ c e f 3 0 0 m g l + k a n a5 0 m g l ，0 5 8 琼脂，p h 5 8 体胚萌发培养基：m s + c e f3 0 0 m g l + 3 o 蔗糖+ o 5 8 琼脂，p h 5 8 2 2 实验方法 2 2 1 种子灭菌 7 份供试材料各取1 0 0 粒种子。首先，用7 5 酒精处理苜蓿种子1 0 1 1 1 i n ，无菌水冲 洗4 6 次，然后用o 1 h g c l 2 再处理2 0 i n i n ，无菌水冲洗4 6 次，最后，将灭过菌的种 子放到无菌水中浸泡2 4 小时备用。 2 2 2 外植体基因型的选择 2 2 2 1 愈伤组织诱导 将灭好菌的7 份种子接种在m s 。培养基中。卜2 d 后待下胚轴长出将其切下，长度约 为0 5 c m ，转到愈伤诱导培养基中诱导愈伤组织，2 0 d 后统计不同苜蓿品种愈伤组织诱 导率及愈伤组织生长状况。 2 2 2 2 体胚的分化 将愈伤组织转入分化培养基中诱导体胚，大约3 5 4 5 d 后体胚诱导出来，记录不同 苜蓿品种愈伤组织体胚诱导率。 2 2 2 3 再生植株 当体胚成熟后，将体胚转到m s o 中进行萌发试验。依据实验结果，最终确定基因型 公农1 号为最佳遗传转化材料。 2 2 3 农杆菌的活化及工程菌液的制备 取含有供试质粒的l b a 4 4 0 4 农杆菌，在含有5 0m g 咒卡那霉素和5 0m l 利福霉素 的y e b 平板上划线，2 8 培养4 8 h 后，挑取单菌落接入5 i n l 含相应抗生素的y e b 液体培 养基中，2 8 振荡培养过夜，再取1 l n l 转到5 0 i n l 的y e b 液体培养基中培养，当农杆菌 o d 值为0 6 左右时，离心4 0 0 0 r p m ，1 0 m i n ，收集菌体。用等体积共培养液体培养基重 悬两次备用。 2 2 4 苜蓿胚性愈伤悬浮培养系统的建立 2 2 4 1 外植体来源 9 东北师范大学硕士学位论文 将灭菌的公农1 号苜蓿种子接种到种子萌发培养基中，2 5 条件下，弱光培养1 天， 待下胚轴长出将其切下，长度约为o 5 c m 。 2 2 4 2 愈伤组织的诱导 将下胚轴接种到固体诱导培养基中培养2 0 天左右，愈伤组织生长状态较佳。 2 2 4 3 胚性愈伤悬浮培养条件的优化 ( 1 ) 不同接种量对苜蓿悬浮愈伤组织生长的影响：分别将1 9 、2 9 、3 9 、4 9 、5 9 的 愈伤组织接种到盛有4 0 i n l 悬浮培养液的1 5 0 l i l l 三角锥瓶中进行悬浮培养，每隔7 d 换一 次新鲜的培养基，摇床转速1 5 蛐，自然散光照射。1 5 d 后，测定细胞生长速度。 细胞的生长速度可表示为：r = ( m 2 m 1 ) d v 其中，r 为细胞生长速度( g d l ) ；m 2 为细胞最终生物量( 曲；m l 为接种量位) ； d 为培养天数；v 为培养液体积( l ) 。 细胞最终生物量的测定：将悬浮培养所得细胞用布氏漏斗减压抽滤后称重。 ( 2 ) 不同转速对悬浮胚性愈伤组织生长的影响：将合适的愈伤组织接种到已筛选 出的最佳胚性愈伤组织诱导液体培养基中，将摇床转速分别设定为8 0 、1 0 0 、1 2 0 、1 5 0 、 1 8 0 r r n i n 。每隔7 天换一次新鲜的培养基，自然散光照射。约3 0 天后，比较悬浮培养液 中活细胞密度。 细胞活性测定：取o 5 亚甲兰生理盐水溶液与细胞悬浮液以1 ：2 混合，1 0i n i l l 后 取适量混合液置于血球计数板上计数，可以染色的为活细胞。 活细胞密度测定：采用血球计数板，活细胞密度( 个血) = 2 5 个方格活细胞总数1 0 珥， 重复3 次，取平均值。 2 2 5 外植体卡那霉素敏感性试验 将悬浮培养得到的胚性愈伤组织放到分别含有1 0i 吲l 、2 0 删l 、3 0m g l 、4 0m l 、 5 0 i n g l 卡那霉素的诱导培养基中，2 0 天继代一次，统计愈伤组织分化情况，确定合适 的卡那霉素筛选浓度。 2 2 6 超声辅助农杆菌介导苜蓿胚性愈伤遗传转化系统的建立 2 2 6 1 超声波处理时间对瞬时表达的影响 将胚性愈伤组织装到2 o i n l 的小离心管中每管8 个，管中盛有6 0 0 u l 液体共培养培 养基，将装有胚性愈伤组织的小离心管放到超声仪中，参数为1 0 0 i n h z 分别处理o s 、4 s 、 8 s 、1 2 s 、2 0 s ，然后，快速将管中的液体培养基吸出，迅速加入1 m 1 的农杆菌重悬液， 侵染3 0 n l i l l ，共培养4 d ，在显微镜下统计g f p 阳性体胚数。 2 2 6 2a s 对转化瞬时表达的影响 将浸染后的悬浮胚性愈伤平放在含有o 、5 0 、1 0 0 、1 5 0 、2 0 0 硼儿a s 的半固体共 培养基中，温