（微生物学专业论文）苯酚降解菌苯酚降解途径及c23o酶学性质研究.pdf

摘要 苯酚是造纸、炼焦、炼油等行业生产的原材料或中间体，它属于芳香族化合物，毒 性强且较难降解。未经处理的含酚废水对人类的生存环境会造成严重威胁。利用微生物 降解的方法处理含酚废水是一种经济、高效且无二次污染的方法。针对含酚废水中酚类 有机污染物的复杂性和难降解特性，引入具有较强的降酚能力及降解底物谱多样性的菌 种是生物强化处理的关键。因此了解强化菌种对酚降解的代谢途径及关键酶的生化特 性，是开展上述工作的基础。 在前期研究工作中，筛选得到了一批酚降解菌株，其中有4 株菌种具有很强的苯酚 降解能力，在苯酚废水处理中可被用作生物强化菌剂缩短好氧颗粒污泥驯化时间和提高 处理能力。微生物对苯酚降解途径不同，也会有不同的特征酶。本论文依据苯酚羟化酶 ( 邱h ) 、邻苯二酚2 ，3 - 力日氧酶( c 2 3 0 ) 、邻苯二酚1 ，2 双加氧酶( c 1 2 0 ) 三个关键 酶的基因保守序列设计其特异p c r 引物，以高效苯酚降解菌z w ( d i a p h o r o b a c t e r ) 、 u w ( a c i n e o b a c t e r s ) 、a w ( p l e s i o m o n a s ) 和s w ( b r e v i b a c t e r i u m s ) 基因组d n a 为模 板进行p c r 扩增，以分析上述关键酶的有无，从而分析其对苯酚降解的代谢途径，在 此基础上对4 种菌的芳烃底物谱、c 2 3 0 酶特性以及p c r 技术对环境苯酚降解微生物的 检测进行了初步研究。 采用快速微量提取法和化学改良法提取4 株菌基因组总d n a ，利用l p h 基因的特 异性引物进行p c r 扩增，结果4 株菌l p h p c r 扩增结果都呈阳性。对d i a p h o r o b a c t e rz w 菌株扩增出的同源片段进行了d n a 序列分析，该序列与已登录的( p s e u d o m o n a ss p m 1 ) 的苯酚羟化酶基因的相关序列同源性达到9 7 ( g e n b a n k 登记号为d q 0 2 6 2 9 4 1 ) 。进一步 利用c 1 2 0 基因和c 2 3 0 基因特异性引物对4 株菌总d n a 进行p c r 扩增，结果4 株菌 的c 2 3 0 基因扩增结果都呈阳性，而c 1 2 0 基因扩增结果都呈阴性。采用b l a s t 程序对 z w 菌株扩增得到的c 2 3 0 同源片段进行比对，发现该片段与g e n e b a n k 中已登录的 ( p s e u d o m o n a sp u d i t ab a c t e r i u m ) 的邻苯二酚2 ，3 - 力氧酶的相关序列相比较具有9 8 的同源性( g e n b a n k 登记号为x 5 9 7 0 1 ) 。上述结果表明4 株菌在利用苯酚时都是先通过 苯酚羟化酶将苯酚转化为邻苯二酚，然后在邻苯二酚2 ，3 - 力口氧酶作用下开环裂解进行 降解的。 c 2 3 0 酶不仅是苯酚降解过程中的关键酶，而且还是萘、菲等多环芳烃降解的重要 酶。4 株菌c 2 3 0 酶活的最适温度都在3 5 左右，在高于5 0 后酶活都明显下降。a w 菌株耐受温度最高，4 0 。c 时依然保持较高酶活。s w 、a w 、u w 株菌的c 2 3 0 酶具有较 宽的热稳定性范围( 1 0 4 0 c ) ，而z w 菌株则是在3 0 4 0 之间有较好的热稳定性。 在各自最适温度下，u w 菌株的c 2 3 0 酶活最高，a w 酶活最小；四株菌c 2 3 0 酶最适 p h 在7 8 之间。在各自最佳p h 条件下，其中u w 的c 2 3 0 酶活最高。十六烷基三甲基 溴化铵( 咖) 可以显著提高s w 、a w 、z w 3 株菌的c 2 3 0 酶活，当c t a b 浓度为 0 3 9 l 时，s w 和a w 菌株的c 2 3 0 酶活比原来提高了两倍多，z w 菌株提高近四倍， 而c t a b 对u w 菌株的提高作用不大，在0 3 9 lc r a b 作用1 5 分钟后酶活有提高，但 在0 1 9 l - 0 2 9 l c r a b 作用下酶活不但没有提高，反而下降。 在无机盐培养基中分别添加萘、菲、邻苯二酚和水杨酸作为唯一碳源，结果显示四 株菌均可以分解邻苯二酚。s w 和u w 菌株可对萘和菲进行初步降解；z w 菌株可分解 水杨酸。表明这四株菌可降解的底物具有一定的广谱性，不仅能够降解苯酚，而且对某 些多环芳烃也具有一定的降解作用。 用l p h 基因高度保守序列设计的特异p c r 引物分别对燕山石化污泥和冀东油泥样 品的总d n a 进行p c r 扩增，2 个环境样品均为阳性结果，表明用p c r 技术进行环境苯 酚降解菌的快速检测和生态学调查是可行的。 关键词：苯酚降解菌，代谢途径，p c r 扩增，c 2 3 0 酶，底物谱 a b s t r a c t t h ep h e n o l ，b e l o n g st oa r o m a t i cc o m p o u n dw i t hh i g h e rt o x i ca n dr e c a l c i t r a n tt od e g r a d a t i o n ，i st h e r a wo rm i d d l em a t e r i a l sd u r i n gt h ef i e l d so fp a p e r - m a k i n g ，t a ra n d0 i lf a c t o r y r e c e n t l yw a s t e w a t e rw i t h h i g hc o n c e n t r a t i o np h e n o lp o s e ds e r i o u st h r e a t so nt h ee n v i r o n m e n t t h ep h e n o lr e m o v a lb yb i o d e g r a d a t i o n ， e s p e c i a l l yt h eb i o a u g m e n t a t i o nw i t he f f e c t i v em i c r o b e s ，i so n eo fe c o n o m i ca n de f f e c t i v ew a y s d u r i n gt h e p h e n o ld e g r a d a t i o n ，t h es 缸a i n sw i t hh i g ha b i l i 哆a n dv e r s a t i l i t yw e r ei n t r o d u c e db a s e do nt h ec a t a b o l i c p a t h w a ya n dt h ee n z y m ea c t i v i t yc a t a l y z e dt h ek e ys t e p i nt h ep r e v i o u ss t u d y , m a n yp h e n o ld e g r a d a t i o ns t r a i n sw e r ei s o l a t e da n d4s t r a i n sw e r ee v a l u a t e dw i t h h i g h e rp h e n o lu t i l i z a t i o n a n da l s ot h e yc o u l ds h o r t e nt h em a t u r et i m eo fa e r o b eg r a n u l a ra c t i v a t e ds l u d g e w h e nw e r eu s e da st h eb i o a u g m e n t a t i o nc o n s o r t i a i nt h i st h e s i s ，t h ep h e n o lc a t a b o l i cp a t h w a yo f 4d i f f e r e n t s t r a i n sw a se v a l u a t e db yp c ra m p l i f i c a t i o no ft h ek e ye n z y m ee n c o d e dg e n e t h ee n z y m ea c t i v i t ya n d f a c t o r so fc 2 3 0i nt h ew h o l ec e l lw e r es t u d i e d a r o m a t i ch y d r o c a r b o n ss u b s t r a t r u ma n dd i r e c t e dp c r a m p l i f i c a t i o nf r o me n v i r o n m e n t a ls a m p l ed n a w a sa l s op r i m a r ys t u d i e d t h ep o s i t i v er e s u l t so fp c rr e a c t i o no fp h e n o lh y d r o x y l a s eg e n ea n dc a t a c h o l 一2 ，3 - d i o x y g e n a s eg e n e w e r eo b t a i n e df r o mt h e s e4s t r a i n s b u tn os i g n a l so fc a t a c h o l - 1 ，2 - d i o x y g e n a s eg e n ew e r ed e t e c t e df r o m t h e s e4s t r a i n s t h ep o s i t i v ep c r p r o d u c t so fl p ha n dc 2 3 0w e r es e q u e n c e da n da l s ow e r ea l i g n e db yb l a s t i ng e n e b a n k t h es i m i l a r i t yb e t w e e n 枷s e q u e n c eo ft h es t r a i nd i a p h o r o b a c 纪rz wa n dp s e u d o m o n a ss p m 1d q 0 2 6 2 9 4 1w a s9 7 t h es i m i l a r i t yb e t w e e nc 2 3 0s e q u e n c eo ft h es t r a i nd 觇p 幻，d 6 口c 纪rz wa n d p s e u d o m o n a sp u d i t ab a c t e r i u m x 5 9 7 0 1w a s9 8 i ts u g g e s t e dt h ep h e n o lw a sf i r s to x y g e n a t e db y h y d r o x y l a s e ，t h ef o l l o w e dt h ec a t a c h o l - 2 ，3 - d i o x y g e n a s e ，n o tc a t a c h o l - 1 ，2 - d i o x y g e n a s eo fa l lt h e4s t r a i n s t h ee n z y m ec 2 3 0c a t a l y z e sk e ys t e po fa r o m a t i cc o m p o u n dd e g r a d a t i o n t h ea c t i v i t yo fc 2 3 0w a s m e a s u r e du n d e rt h ec o n d i t i o no fd i f f e r e n tt e m p e r a t u r e ，p h ，o d 6 0 0a n db i o s u r f a c t a n tc t a b t h eo p t i m a l t e m p e r a t u r eo fc 2 3 0f r o mt h e4s t r a i n sw a sa r o u n d3 5 c u n d e r3 5 c ，t h ea c t i v i t yo fc 2 3 0f r o ms t a i nu w w a sh i g h e s ta n ds t r a i na ww a sl o w e s t t h ea c t i v i t yd e c r e a s e do b v i o u s l yw h e nt h et e m p e r a t u r ew a sh i g h e r t h a n5 0 。c t h ec 2 3 0a c t i v i t yo fs t r a i n ss w , a w , u ww a sm a i n t a i n e dw i t hw i d et e m p e r a t u r er a n g e ( 1 0 c - 4 0 c ) b u tt h ea c t i v i t yo fz w w a sm a i n t a i n e do n l yb e t w e e n3 0 ca n d4 0 t h eo p t i m a lp ho fc 2 3 0 f r o m4s t a i n sw a sb e t w e e n7 - 8a n ds t r a i nu w p e r f o r m e dh i g h e s tc 2 3 0a c t i v i t y t h ea c t i v i t yo fc 2 3 0f r o m h i s w 、z w 、u wi n c r e a s e da l o n gw i t ho d 6 f r o m0 0 2 5t o0 3 b u ts t r a i na ww a sd i f f e r e n t t h e b i o s u f f a c t a n t ，c t a b ，c o u l di n c r e a s ec 2 3 0a c t i v i t yo fs t r a i n ss w , a w , z wo b v i o u s l y b u tt h e r ew a sn o e f f e c to ns t r a i nu w ： t h eb i o a v a i l a b i l i t yo fn a p h t h a l e n e ，p h e n a n t h r e n e ，c a t a c h o la n ds a l i c y l i ca c i dt o4s t r a i n sw e r e e v a l u a t e da st h es o l ec a r b o ns o n r o gi nt h eb a s es a l tm e d i u m t h er e s u l t si n d i c a t e dt h a to n l yc a t a c h o lc a nb e u s e db yt h ea l l4s t r a i n s t h es t r a i n ss wa n du wc o u l dt r a n s f o r mn a p h t h a l e n ea n dp h e n e n t h r e n e o n l yt h e s t r a i nz wc o u l du t i l i z es a l i c y l i ca c i d i ts u g g e s t e dt h a tap a r to fp o l y c y c l i ca r o m a t i ch y d r o c a r b o n sc o u l db e d e g r a d e dt os o m ee x t e n tb yt h e s e4s t r a i n se x c e p tt h ep h e n 0 1 t h e 枷g e n ef r o ms a m p l e so fy a n s h a np e t r o c h e m i c a lc o m p a n ya n dj i d o n go i l f i e l dw e r ed e t e c t e d ， r e s p e c t i v e l y , b yp c rm e t h o d t h ep o s i t i v es i g n a l sw e r eo b t a i n e d i ti n d i c a t e dt h a tp c ra m p l i f i c a t i o nc o u l d b eu s e di nr a p i dd e t e c t i o no ft h ec a t a b o l i cg e n e si nt h ee n v i r o n m e n t a ls a m p l e sa n da l s ot h ee c o l o g y i n v e s t i g a t i o n k e yw o r d s ：p h e n o ld e g r a d a t i o ns t r a i n ，c a t a b o l i cp a t h w a y , p c ra m p l i f i c a t i o n ，c 2 3 0a c t i v i t y , s u b s t r a t r u m i v 主要符号表 v n 独创性声明和关于论文使用授权的说明 独创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已 经发表或撰写的研究成果，也不包含为获得河南师范大学或其他教育机构的学位或证书 所使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确 的说明并表示了谢意。 签名：罩耻日期：上进血l 关于论文使用授权的说明 本人完全了解河南师范大学有关保留、使用学位论文的规定，即：有权保留并向国 家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权河南师 范大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩 印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 签名：坼u 全导师签名：彰v c 闽哆日期：弘憎尹石肜 1 前言 1 前言 1 1 芳烃类化合物的微生物降解 近几十年来，随着工业、生活废水的排放和农业中污水灌溉措施的应用，大量有毒 的有机化学物质被释放到环境中。生态环境污染问题已经成为经济发展的制约因素，现 代农业生产中由于对病虫害的防治而大量使用化学农药造成农药残留污染；工业上大量 未经处理的化学工业废水的排放造成江河湖泊严重的环境污染，对我们生存的环境造成 严峻的威胁。污染环境的生物降解的研究与应用显得日益迫切而重要。这些有机污染物 主要包括酚类、卤代有机物、多环芳香族、硝基化合物等1 1 】，其中芳烃类化合物是主要 的有机污染物，它主要包括苯酚和多环芳烃( p a h s ) 。芳烃类化合物广泛存在于大气、 土壤和水体中，是环境污染物的主要有害成分，具有慢性毒性和致癌、致畸、致突变的 “三致”作用，这些化合物从水体和土壤进入植物体内，进而被动物和人体吸收，经生物 富集作用，严重影响生态环境和人类健康，已被许多国家列为优先控制的环境污染物。 尤其是近几年，汽车、电子、建筑及冶金工业的迅猛发展，促使芳烃类化合物，特别是 苯酚的下游产品需求增加，致使苯酚的危害日趋加剧，目前芳烃类化合物己被许多国家 列为优先控制的环境污染物【2 1 。 对于这些芳烃类污染物，自然界中存在着物理的、化学的和生物的等多方面因素作 用的降解转化以及人为因素的降解转化。在这些降解作用中，微生物的降解与转化起到 特别重要的作用。目前对污染物降解的研究着重以下几个方面：1 分离具有特殊分解功 能的微生物，用分子探针监测他们在不同环境中的分布，以及与其它种类微生物之间的 关系；2 在分子水平上确定主基因与代谢分解相关基因的组成或片段；3 将分解基因转 移到受体微生物之中，实现分解功能在常见微生物体内的表达；4 走出单纯分解和矿化 的旧模式，探索对有毒污染物的转化，并实现生产工业合成中所需的中间产物或原料是 热门课题【3 l o 微生物是生态系统中最重要的分解者，微生物降解是指有机物，如蛋白质，糖类等 大分子物质，在微生物酶的作用下，逐步分解成为如二氧化碳，水等小分子无机物的过 程。由于微生物具有种类繁多、繁殖旺盛、遗传特性易于改造、适应环境的能力较强、 代谢和生理功能多样、能降解各种天然和人工合成有机物，直至彻底矿化等特点。所以 苯酚降解菌苯酚降解途径及c 2 3 0 酶学性质研究 生物处理法和其它方法相比，不会造成二次污染，而且设备简单、投资较小。因此，对 于芳烃类污染物的微生物降解与转化方面的研究受到了国内外的普遍重视【4 】。微生物转 化降解既是自然环境中有机污染物转化的重要途径之一，也是有机污染物污染控制与污 染环境修复的有效技术方法，开展芳烃类有机污染物微生物转化与降解机理的研究不仅 在探索微生物生理代谢、遗传基因多样性与进化机制、微生物与环境污染物的互作机理 等方面具有理论价值，而且还可为芳烃类污染物的生物处理，污染环境的生物修复提供 创新的技术支持【5 。9 1 。 近年的研究表明，大部分的芳烃类污染物都能被微生物不同程度地降解或转化，许 多污染物被微生物利用的代谢途径也不断得到了阐明。结构类似的污染物在降解过程中 的代谢途径有着类似的降解机理和共同的中间产物，因此将各类污染物的代谢途径连接 起来，就形成一条代谢的“主干”途径。图1 - 1 列出的就是以此为依据，部分污染物的被 微生物降解的代谢主干图【1 0 】。从代谢图中，不难看出这些有机污染物在被微生物代谢过 程中，联系紧密，有共同的中间产物及代谢的关键酶。例如：酚类和多环芳香族有机污 染物在被微生物降解代谢过程中基本都会产生邻苯二酚等中间产物，而且都会经过进一 步开环的降解过程。 在芳烃类污染物中，多环芳烃( p o l y c y c l i ca r o m a t i ch y d r o c a r b o n s p a h s ) 是指含有 两个或两个以上环的稠环化合物，是土壤、水体和空气环境中广泛存在的一类污染物。 主要来源于石化燃料的燃烧过程。p a h s 的水溶性差，化学性质稳定，而且具有致癌症、 致突变、致畸用，如何有效清除p a h s 造成的环境污染，长期以来也是一个世界性的热 点和难题【1 1 】。由于苯酚及多环芳烃在自然界中并不是单独存在，而是以混合物的形式存 在的，复杂的多底物混合状态势必影响微生物的生理生态及其对混合组分中单个底物的 利用状况，进而会影响整体生物治理的效率。目前已探索到p a h s 生物降解途径的多样 性，研究了微生物降解p a h s 的生化和分子遗传机制。据研究表明：在p a h s 降解途径 所需的酶中，双加氧酶是其中的关键酶之一【1 2 d 4 】。 利用微生物清除有害有毒有机污染物的关键在于提高微生物降解污染物的活力以 及它的稳定性和适应性，因此对微生物降解芳烃类污染物的分子机制及相关酶活作深入 研究，可以为研制治理各类有机污染物的生物强化菌剂奠定基础。 2 1 前言 图1 - 1 部分有机污染物被微生物降解的代谢主干图【l o l 1 2 芳烃类污染物的微生物处理方法及现状 微生物是生物界的一个最重要的类群，是重要的生物资源，这些年来，微生物学家 对利用微生物治理环境中有害、有毒有机污染物的研究取得重要进展。利用微生物对各 类不同的有机污染物进行降解和转化有着巨大潜力，这同微生物所具备的几方面的特点 密切相关：( 1 ) 个体微小，比表面积大，生理功能多样化，易于适应环境，易于与环境中 的各种基质( 营养物质和污染物质) 接触，并通过简单的细胞膜与基质发生相互作用，代 谢速度快；( 2 ) 种类繁多伶未培养的微生物) ，微生物在环境中存在的种群数量较大，分 布较广，几乎分布在人类活动所涉及的全部空间，即使在一些恶劣的极端环境中也会存 3 苯酚降解菌苯酚降解途径及c 2 3 0 酶学性质研究 在着各种各样的微生物种类，例如，强酸强碱环境、高温环境都会有微生物的存在f 1 5 】。 代谢类型多样；( 3 ) 繁殖快、易变异、适应性强( 含各类嗜极微生物) ，微生物简单的生殖 方式和快速的繁殖速度，也正是环境微生物被广泛利用的重要特征；( 4 ) 获得新的代谢能 力较强，微生物中的质粒( 含转座子) 快速转移，使别的细菌获得新的降解力，便于构建 新的、高效的降解有机污染物的“工程菌”，发挥其特定功能的降解作用；( 5 ) 生态系统中 微生物与微生物之间的协同作用和它们对有机污染物的共代谢，可加快或促进有机污染 物降解速率。 由于微生物转化有机物的优越性，国内外学者都对它进行了大量研究。这些研究 大体上从以下三个方面着手【1 】： 第一，利用高效菌种降解芳烃类污染物。 ( 1 ) 从自然环境中驯化、筛选、分离得到能够去除特殊污染物的高效菌种。通过 从污染现场的分离，目前已经得到不少能够降解芳烃类及其它有机污染物的特殊菌种。 如中科院兰州化物所从土壤中筛选的“帕氏氢噬胞菌h i _ j 3 8 ”和“类黄氢噬胞菌l h j 3 9 ” 1 1 6 l ，对芳香烃类有较强的降解作用；王建龙等【1 7 】研究表明，p s e u d o m o n a s s pi b 4 0 0 中的 联苯双氧合酶能氧化较广谱的多氯联苯同系物。广州科研所【1 2 】研制出了具有广谱脱色能 力和降解苯胺能力的希瓦氏菌，该菌株具有还原三价铁，液化明胶、t w e e n40 和t w c e n 8 0 ，产生h 2 s 的能力。在乳酸钠存在的条件下，能还原硝酸盐、亚硝酸盐、铁氧化物和 硫代硫酸钠。可利用d 半乳糖、d 葡萄糖、蔗糖、丙酸钠、l 亮氨酸等多种有机物为 碳源； ( 2 ) 通过诱变、质粒转移、原生质融合和基因重组等手段构建工程菌。由于从自 然环境中驯化分离特殊菌种非常缓慢，远不能满足生物处理的需要，因此构建高效工程 菌种日益受到研究者的重视。如高枫等人以嗜蜡的不动杆菌4 - 1 作为受体菌【1 8 】，经溶菌 酶破壁后，用嗜胶的假单胞菌z 1 7 的全d n a 转化，构建具有嗜蜡、嗜胶双重性能的多 功能石油降解菌不动杆菌z h 2 0 。闫艳春等【1 9 】用抗性库蚊酯酶基因，引入原核表达载体 p r i a 3 9 ，转化大肠杆菌h b l 0 1 细胞，获得表达。通过酶切、s o u t h o n 杂交鉴定重组质粒。 发现该重组质粒p r l - b 1 表达的酯酶具有高酶活性并能高效降解酯酶的特异性底物a 乙 酸酯酶和b 乙酸酯酶； 第二，利用共代谢作用，提高苯酚类有机污染物的降解效率。所谓微生物的共代 谢作用是指在其它碳源和能源物质存在时，才能进行的污染物的生物降解过程。如j o h n 4 1 前言 等用葡萄糖、甲烷、酚和甲苯富集好氧培养物，并用1 6 种氯代化合物对它们进行驯 化，经驯化后的微生物用于对几种氯酚的生物转化研究，结果表明用甲苯富集的培养物 能够降解五氯酚和2 ，4 ，6 三氯酚，用酚和甲苯混合物富集的培养物能迅速降解2 ，4 _ 二氯酚。陈翠柏等人【2 1 l 对三氯乙烯的好氧生物降解研究表明在葡萄糖存在的条件下，降 解t c e ( t r i c h l o r o e t h y l e n e ，三氯乙烯) 的速率大于t c e 作为单基质的降解速率。 第三，优化微生物的生存环境，提高降解的反应速率。 ( 1 ) 固定化有效微生物的方法提高微生物的降解性能。生物法操作简便，易于就 地处理，但耗时较长，并且许多微生物体内缺乏有效的生物降解酶，因此固定化微生物 技术就应运而生。固定化微生物是使用物理和化学的方法将分散、游离的酶、微生物细 胞、细胞器等限制或定位在某特定范围内，以提高其浓度并保留其活性。如黄霞等瞄】 以p v a - 无纺布混合载体包埋固定化优势菌种，用于降解喹啉、易喹林和吡啶，结果表 明：三种难降解有机物经固定化细胞处理8 h 后，降解率均在9 0 以上；闰艳春等1 1 9 j 将 工程菌h b l 0 1 p r l - b 1 固定化后对有机磷农药1 6 0 5 进行降解，结果表明，固定化的工 程菌对该类有机农药的降解性能明显优于未固定化的工程菌。 ( 2 ) 控制系统的含氧情况来提高细菌对目标物的降解能力。根据微生物的厌氧好 氧属性来改变微生物生存环境。如陈元彩【2 3 1 等人对固定化好氧菌核厌氧菌颗粒污泥在不 同供养条件下降解氯酚进行了研究，结果表明，完全厌氧过程尽管能有效降低初始浓度 的五氯酚，但在高初始浓度下，由于厌氧微生物本身缺乏吸收、同化其代谢产物淡氯酚 和二氯酚的能力，降解效果并不好。而在有限供氧条件下，通过厌氧菌群与好氧或兼性 菌的协同作用，对五氯酚的降解则比较完全。 目前微生物处理技术研究的主要方向主要包括1 1 j ： ( 1 ) 寻求能够降解有机污染物的高效的多功能菌种。前面已经介绍了大量的国内 外关于这方面的报道。但是这些已发现的自然菌种或者已经构建的工程菌大部分都是专 一性菌种，寻找降解性更强的多功能降解菌群仍是研究的主要任务之一。 ( 2 ) 提高芳烃类有机污染物的可利用性。大部分的有机污染物都是经过水处理以 后富集在污泥当中的，这些污染物吸附在污泥上，难与微生物接触，由此导致有机物的 可利用性降低。为了提高有机物的可利用性，这方面的工作主要集中在对疏散和解吸污 染物非常有效的表面活性剂上。t i e h m a 等人【2 4 】用两种聚乙烯烷基苯基醚非离子表面活 性剂研究了多环芳香烃的生物可利用性。结果表明，由于表面活性剂增强了多环芳香烃 5 苯酚降解菌苯酚降解途径及c 2 3 0 酶学性质研究 的活性而加快了p a h s 的降解。房敏等人【2 5 】研究多环芳烃的降解性时添加了非离子表面 活性剂吐温8 0 ，发现吐温8 0 的添加对蒽和芘的生物降解率有着显著的作用，分别是不 添加表面膜活性剂对照处理的1 5 倍和2 5 倍。 ( 3 ) 探明高效降解菌株的代谢动力学和代谢机理。目前对于微生物降解有机污染 物的代谢动力学和代谢机理的报道还不太多，尤其是关于共代谢的机理，到目前也没有 形成统一的解释。对于机理的研究一般包括阐明共代谢底物的反馈机制、传递效率、氧 气供应等。但到目前提出的各种假设都不能圆满的解释实际工程中所发生的各种共代谢 现象，而且不同的生长机制培养出的细菌的驯化能力是不一样的【2 6 1 。 ( 4 ) 寻找一个适于微生物生存的环境。国内外对于微生物降解有机污染物的研究 基本上还处于实验阶段，用于实际工程的报道还比较少见。研究微生物活性即实际使用 效果一般考虑两个方面：一方面是提高微生物对有机污染物的耐受性，解决这一问题可 以对从受污染的土壤中分离出来的微生物菌系进行驯化，还可以通过各种基因工程培育 降解性适应性强的高效菌种。另方面就是改善微生物生存的环境，一般包括酸度、温 度、水分含量、营养物质、供氧条件等。孟范平等人【2 7 】对土壤中p a h s 的生物降解进行 了研究，发现p a h s 降解菌在含水率为3 9 0 ，氧气含量为1 0 4 0 ，c ：n ：p 的比例 为2 4 0 0 ：4 0 ：3 ，温度在2 4 3 0 之间的中性条件下降解率达到最高。 1 3 苯酚的微生物降解及代谢途径 苯酚，别名石炭酸，属于芳香族化合物。纯净的苯酚是一种无色的晶体，具有特殊 气味( 有令人作呕的甜和辣的气味) ，熔点是4 3 ，露置在空气里会因小部分发生氧化 而显粉红色。常温时，苯酚在水里溶解度不大，当温度高于6 5 时，能跟水以任意比互 溶。苯酚易溶于乙醇、乙醚等有机溶剂。苯酚有毒且难降解，易燃易爆，空气中含有3 1 0 的苯酚可引起爆炸。 苯酚具有广泛的用途，它是一种重要的有机化工原料，是丙烯的重要衍生物之一， 主要用于生产酚醛树脂、己内酞胺、双酚a 、己二酸、苯胺、烷基酚以及水杨酸等，是 多种行业生产的原材料或中间体，广泛应用于染料、煤气、焦化、石油化工、木材防腐、 合成树脂、造纸、肥皂、制革、制药及油漆等- r 业e e t 2 8 m 】。随着世界经济的进步，工农 业的繁荣发展带来苯酚的大量生产和消费，但由于污水处理技术水平和成本等原因，各 类型的工厂，如石油化工厂、农药厂、焦化厂等均大量排出未经处理或处理未达标的污 6 1 前言 水，其中酚类化合物是最常见的水体污染物【3 2 】。 酚类化合物对所有生物均具有毒性【矧。低浓度苯酚具有使蛋白质变性的作用，对皮 肤粘膜有腐蚀性；误服苯酚可引起口腔和咽喉剧烈的灼伤和腹痛，吐血性液体，有可能 引起胃穿孔；苯酚溅入眼内，立即引起结膜和角膜灼伤、坏死；若吸入高浓度苯酚蒸汽， 可迅速引起头痛、眩晕、无力、虚脱、体温、脉搏、血压都降低等症状，并可引起呼吸 衰竭；长期吸入低浓度的苯酚，可出现呕吐、腹泻、头痛、眩晕等症状。此外，它还可 以作用于中枢神经而引起痉挛；在水体中，5 - 2 5 m g l 的苯酚即可对鱼类的生存构成威 胁。如使用含酚废水灌溉农田，则会使农作物减产或枯死【川。 在自然环境中，尤其是在土壤环境中，存在着大量的可以代谢降解芳香族化合物的 微生物，其中大多是细菌，许多研究发现假单孢菌和不动杆菌对苯环及衍生的各类化合 物有一定的降解作用；革兰氏阳性的芽孢杆菌能代谢多种苯类化合物；大肠杆菌能降解 羟基苯乙酸，革兰氏阴性的产碱杆菌、黄杆菌等也有氧化苯环的功能，从含苯类化合物 的工业排水污泥积泥中分离得到脂肪芽孢杆菌等，可以利用苯酚和甲酚等作为碳源而生 长。当有这些化合物存在时，蓝细菌在进行光合作用时同时能氧化二苯或萘。假单胞菌 多为直或微弯的杆菌，不呈螺旋状，需氧，进行严格的呼吸型代谢，以氧为最终电 子受体，主要通过m e t a p a t h w a y 途径降解苯酚。不动杆菌为杆状，多为单个分散 表1 - 1 已被证明的与苯酚降解有关的微生物 主要研究者苯酚分解菌株 f i o n am d h e r m o p h i l i cb a c i l l u st h e r m o g l u c 傩池s 豇博【3 6 j k i v i s a a rm a p s e u d o m o n a s s p s t r a i ne s t l 0 0 1 1 3 7 1 n e u j a h rh yt r i c h o s p o r o nc e u f 口肿“【删3 8 】 m a k itc o m a m o n 口st e s t o s t e r o n er 5 1 3 9 1 enrica(王pse“domonass t u z e r io x i 4 0 i h e r r m a n nhpseudomonas p u t i d as t r a i nh 4 1 】 b e g g sj d a c i n e t o b a c t e rc a l c o a c e t i c u sn c i b 8 2 5 0 4 2 s h i n g l e rv pseudomonas s p s t r a i nc f 6 0 0 1 4 3 1 x uyqa c i n e t o b a c t e rc a l c o a c e t i c u sp h e a 2 4 4 i n g lc、pseudomonas p u t i d ap 3 5 x 4 5 1 h i n o s r a l s t o n i ae u t r o p h as t r a i ne 2 闱 a r a ih c o m 口m o r t 口st e s t o s t e r o n et a 4 4 1 1 4 7 1 排列，主要以o t h o - p a t h w a y 途径降解苯酚。目前已有许多的微生物被证明与苯酚的 7 苯酚降解菌苯酚降解途径及c 2 3 0 酶学性质研究 生物降解有关( 见表1 - 1 ) 。 研究发现，不仅细菌可以实现酚类污染物在水体中和土壤中的生物转化或生物降 解，真菌、酵母【镐1 、高等植物以及某些藻类【4 9 】也可能降解这些物质。但真核生物和原核 生物有着完全不同的苯酚降解途径。 由于苯酚废水释放到环境中对动植物的生长和人类健康均具有很大的毒害作用，工 业含酚废水的处理，已成为工业废水处理方面急待解决的问题之一。开展含酚废水的污 染防治研究是保护环境、维持生态平衡的重要任务。高浓度含酚废水( 高于5 0 0 r a g l ) 过去一直采用物理回收处理，但由于存在溶剂损失、吸附剂再生困难等原因而不经济， 并且还会产生二次污染，因此，当今的研究已建议放弃这种回收而倾向于推行更为完整 的处理系统。因此目前实践中多采用经济有效且无二次污染的微生物降解的方法来处理 含酚废水。传统的生物法大多是对自然界生长的微生物群体经驯化、繁殖后利用，但是 由于含酚废水的难降解特性，仅靠从自然界获得的菌株，往往降解活性有限，不能较好 地适应冲击负荷的变化等，所以引入的菌种要有较强的降解酚能力，并且要能较好地适 应冲击负荷的变化。于是，投加经过筛选的具有特殊分解能力菌株的生物强化法受到了 人们的青睐【姗l ，所以近几年很多科研工作者都致力于高效酚降解菌株的研究。 目前，大量的研究工作集中在苯酚降解菌的分离筛选和性能评价，如吴培诚【则等从 被含酚废水污染的土壤中分离筛选到一株苯酚琼氏不动杆菌( a e i n e t o b a c t e r j u n i i ) ，能以苯 酚为唯一碳源生长，1 6 h 内可完全降解6 0 0 m g l ；徐玉泉等【5 1 l 等从工业废水中分离到一 株高效降解苯酚菌株醋酸钙不动杆菌( a e i n e t o b a e t e r ea l e o a e e t i c u s ) ，其最高苯酚降解率为 3 9 4 n m o l ( m g m i n ) ；杨光等【5 2 】从化工废水污染的土壤中筛选分离到一株假单胞菌 ( p s u e d o m o n a ss p ) ，在2 4 h 内可完全降解浓度为6 0 0 m g l ；陈吲5 3 】等从炼油厂污水中分 离的醋酸钙不动杆菌( a c i n e t o b a c t e rc a l c o a c e t i c u s ) 在2 4 h 内完全降解苯酚的浓度为 3 0 0 m g t , 。 为了有效地将生物技术应用于环境的整治，首先要对分离出来的可降解苯酚的纯种 菌株进行研究，特别是代谢途径和关键酶的研究，将有利于保持微生物的特性和提高污 染物的降解效率。 苯酚羟化酶是苯酚降解途径中的第一个酶，负责将苯酚转化成为邻苯二酚。在好氧 菌中，目前已发现2 种不同类型的苯酚羟化酶n e u j a h1 6 1 】，单链黄索蛋白苯酚单加氧酶 和苯酚羟化酶多组分寡聚蛋白。 b 1 前言 目前为止，苯酚的生物降解途径已有大量的研究，苯酚降解基因通常成簇排列，位 于大质粒上【3 7 t4 2 4 3 】，一些位于染色体上【4 3 ，6 2 】。一般认为苯酚的微生物降解可分为有氧 和厌氧降解两种类型，目前对于有氧降解研究的比较深入。 ( 1 ) 苯酚的有氧降解： 在好氧菌中，苯酚羟化酶基因是降解苯酚的关键基因，编码苯酚降解途径的第一个 酶，负责将苯酚转化成为邻苯二酚。苯酚羟化酶其通用名为苯酚2 单加氧酶( p h e n o l 2 - m o n o x y g e n a s e ) 在苯酚降解途径中负责将苯酚氧化为邻苯二酚，其反应式见( 1 ) ： p h e n o l + n a d p h 2 + o z - - c a t e c h o l + n a d p + h 2 0 ( 1 ) 应该说大多数苯酚降解菌都是采取好氧的羟基化途径，徐玉泉等【6 3 1 通过比较不同种 属苯酚降解菌的苯酚羟化酶大亚基的基因，发现它们有很高的同源性。p s u d o m o n a s p u t i d a h 的p h l d 6 4 1 、p s e u d o m o n a ss p c f 6 0 0 的d m p n 4 3 1 、a c i n e t o b a c t e rc a l c o a c e t i c u s n c i b 8 2 5 0 的m o p n 6 5 1 、r a l s t o n i ae u t r o p