（微生物学专业论文）靶向ftsz的细胞分裂抑制剂筛选模型建立的初步研究.pdf

i ：海师范大学顶l 学f t 论文摘要 靶向f t s z 的细胞分裂抑制剂筛选模型建立 的初步研究 摘要 f t s z 是e s c h e r i c h i ac o l i 等多种细菌细胞分裂所必需的蛋白，在细胞分裂中起 着重要的作用，已同益成为新型抗菌药物靶标研究的热点。本研究根据f t s z 蛋 白具有g t p 酶活性的特征，建立了一套靶向f t s z 的细胞分裂抑制剂体外筛选模 型，并以此从植物内生菌发酵产物中，筛选能够有效抑制f t s zg t p 酶活性的样 品，为寻找到有价值的细胞分裂抑制剂奠定基础。 1 、应用p c r 法，从e c o l id h 5 a 中扩增了伽z 基因，将其克隆到大肠杆菌表达 载体p e t 3 0 a 上，转化入e s c h e r i c h i ac o l ib l 2 1 ( d e 3 ) 中获得了带有h i st a g 的 f t s z 高效融合表达。通过超声破碎、n i n t a 柱高效亲和层析、透析、真空冷冻 干燥后得到了纯白色粉末状的f t s z 蛋白。 2 、建立了f t s zg t p 酶活性的测定方法：孔雀石绿磷钼杂多酸分光光度法。并 以孔雀石绿磷钼杂多酸分光光度法考察了该蛋白的各酶学性质。结果显示该融 合f t s z 蛋白以g t p 为底物时，最适反应p h 为7 5 ，最适温度3 7 。c ，米氏常数 为k i n = 9 9 1 0 一m o l 1 ，最佳保存条件为蛋白冻干粉7 0 。c 保存。 3 、根据f t s z 的最佳反应条件，以黄连素作为阳性对照，采用9 6 孔板反应及酶 标仪测定法，构建了靶向f t s z 的细胞分裂抑制剂的体外高通量筛选模型。 4 、从种2 5 6 种药用植物中分离了1 8 7 6 株植物内生真菌，制备了份1 8 7 4 发酵样 品，并将筛选模型应用于1 8 7 4 份植物内生菌发酵产物的活性初筛，进一步采用 液体培养、显微镜镜检的方法对2 8 2 份初筛活性样品进行体内活性复筛。结果获 得了菌株号为1 2 7 b 2 和1 4 0 a 1 0 两株活性菌株，其发酵样品能使e c o l ib l 2 1 产生细胞分裂抑制的典型拉长现象。 关键词：f t s z ；细胞分裂抑制剂；g t p 酶；植物内生菌 英文摘要f ：海师范人学硕f ：学化论文 曼曼鼍i i 曼曼曼曼皇曼曼曼曼曼曼曼曼皇皇曼曼曼曼曼曼皇曼曼曼曼皇曼曼曼曼曼曼! 曼皇! 曼皇曼曼曼曼曼曼皇曼! 曼! 曼! 皇曼曼曼! ! 曼曼曼曼曼! 曼曼曼 t h es t u d yo nt a r g e t i n gf t s z s b a c t e r i ac e l l d i v i s i o ni n h i b i t o r s c r e e n i n gm o d e l a b s t r a c t f t s zi san e c e s s a r yp r o t e i ni ne c o l iw h i c hp l a y sa ni m p o r t a n tr o l ef o rc e l l d i v i s i o na n dn o wi ti sah o ta n t i m i c r o b i a lt a r g e tf o rn e wd r u g ss c r e e n i n g t h i s r e s e a r c hi sb a s e do nf t s zw h i c hh a sg t p a s ea c t i v i t y , a n de s t a b l i s h m e dam o d e lw h i c h c a ns c r e e nc e l ld i v i s i o ni n h i b i t o r s t a r g e t f t s z t h es c r e e n i n gs a m p l e sw e r e f e r m e n t a t i o np r o d u c t sf r o me n d o p h y t i cb a c t e r i a o u rp o i n tw a st of i n dt h es a m p l e w h i c hc a ni n h i b i tt h eg t p a s ea c t i v i t yo ff t s z ，a n di tm a yb et h ec e l ld i v i s i o n i n h i b i t o r s 1 、f i r s t ，a m p l i f i e d f i s zg e n ef r o me c o l id h 5 au s i n gp c r ，t h e n f i s zw a sc l o n e di n t o p e t 30 aw h i c hw a sa ne c o l ie x p r e s s i o nv e c t o r t r a n s f o r m e dt h ep l a s m i di n t o e s c h e r i c h i ac o l ib l 2 1 ( d e 3 ) t oe x p r e s sf t s z w i t hh i st a g a n dw eg o tw h i t e p o w d e r - l i k ef t s zp r o t e i nb yu l t r t a s o n i cd i s r u p t i o n ，n i - n t ae f f i c i e n ta f f i n i t yc h r o m a t o g r a p h y , d i a l y s i s ，a n dv a c u u mf r e e z e - d r y i n g 2 、e s t a b l i s h e df t s z sg t p a s ea c t i v i t ym e a s u r e m e n tm e t h o d ：p m a m a l a c h i t eg r e e n s p e c t r o p h o t e m e t r y a n du s e dt h i sm e t h o dt od e t e c tf t s z se n z y m a t i cp r o p e r t i e s t h e r e s u l t ss h o w e dt h a tw h e nw eu s eg t pa ss u b s t r a t e ，t h es o l u b l ef t s z so p t i m u mp h w a s7 5 ，s u i t a b l et e m p e r a t u r ew a s37 ，k m = 9 9x10 一m o l d ，o p t i m a ls t o r a g e c o n d i t i o n so ft h ef r e e z e 一曲e dp r o t e i np o w d e rw a ss a v e di n 一7 0 。c 3 、w ee s t a b l i s h e dav i t r oh i g ht h r o u g h p u ts c r e e n i n gm e t h o dw i t ht h eb e s tr e a c t i o n c o n d i t i o n so ff t s zi n9 6w e l lp l a t e ，a n du s e db e r b e r i n ea sa p o s i t i v ec o n t r 0 1 4 、w es e p a r a t e d18 7 6e n d o p h y t i cf u n g u sf r o m2 5 6s p e c i e so fm e d i c i n a lp l a n t s ，a n d p r e p a r e d18 7 4f e r m e n t a t i o ns a m p l e s ，w eu s e dh i g ht h r o u g h p u ts c r e e n i n gm e t h o dt o h i i 海师范人学硕l ，f 论上英文摘要 s c r e e nt h e s ef e r m e n t a t i o ns a m p l e s ，t h er e s u l tw a s2 8 2s a m p l e sc a l li n h i b i tt h eg t p a s e o ff t s z ，a n df u r t h e ru s e dl i q u i dc u l t u r ea n dm i c r o s c o p i ce x a m i n a t i o nt or e s c r e e n i n g 2 8 2s a m p l e s ，t h er e s u l tw a st h a tn o 12 7 - b 一2a n d14 0 - a 一10c a ni n h i b i tc e l ld i v i s i o n g ， w ef o u n dt h e yc a ne l o n gt h ee c o l i k e yw o r d s ：f t s z ；c e l ld i v i s i o ni n h i b i t o r ；g t p a s e ；p l a n te n d o p h y n i 英文摘耍 l ：海师范人学硕i ：学位论文 缩写英文全名 英文缩写说明 m i cm i n i m a li n h i b i t o r yc o n c e n t r a t i o n p d ap o t a t od e x t r o s ea g e r s d ss o d i u md o d e c y ls u l f a t e p a g e p o l y a c r y l a m i d eg e le l e c t r o p h o r e s i s b s ab o v i n es e r u ma l b u m i n p m s fp h e n y l m e t h a n e s u l f o n y lf l u o r i d e e d t a e t h y l e n ed i a m i n et e t r a a c e t i ca c i d d t t d i t h i o t h r e i t o l 中文全名 最小抑制浓度 马铃薯葡萄糖琼脂 十二烷基硫酸钠 聚丙烯酰胺凝胶电泳 牛血清蛋白 苯甲基磺酰氟 乙二胺四乙酸 二硫苏糖醇 t r i s t r i s ( h y d r o x y m e t h y l ) a m i n o m e t h a n e 三羟甲基氨基甲烷 k a n a k a n a m y c i n a m p a m p i c i l l i n a p sa m m o n i u mp e r s u l f a t e p e p p h o s p h o e n o l p y r u v a t e 卡那霉素 氨苄青霉素 过硫酸铵 磷酸烯醇式丙酬酸 n a d hn i c o t i n a m i d ea d e n i n ed i n u c l e o t i d e烟酰胺腺嘌呤二核苷酸( 还原态) n a d +n i c o t i n a m i d ea d e n i n ed i n u c l e o t i d e烟酰胺腺嘌呤二核苷酸( 氧化态) g t p g u a n o s i n e - t r i p h o s p h a t e g d p g u a n o s i n e d i p h o s p h a t e a t p a d e n o s i n e t r i p h o s p h a t e a d p a d e n o s i n e - d i p h o s p h a t e p v a p o l y v i n y la l c o h o l i v 鸟苷三磷酸 鸟苷二磷酸 腺苷三磷酸 腺苷二磷酸 聚乙烯醇 附录 ：海师范大学硕f j 学位论文 论文独创性声明 本论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。论文中除 了特别加以标注和致谢的地方外，不包含其他人或机构已经发表或撰写过的研究 成果。其他同志对本研究的启发和所做的贡献均已在论文中做了明确的声明并表 示了谢意。 作者签名：芗饮食 日期矽、f s 论文使用授权声明 本人完全了解上海师范大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权 保留送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅；学校可以公布论文的全部或部 分内容，可以采用影印、缩印或其它手段保存论文。保密的论文在解密后遵守此 规定。 储弛芗丧量翩繇酌删期：加l s 第一章前言 二十世纪，人们不断发现新的抗生素，改造原有的抗生素，探索抗生素的机 制，使得各种细菌感染引起的疾病得以治愈。迄今，已有1 0 0 多种抗菌药物制 剂运用于临床。然而随之出现的问题是，细菌对抗生素的耐药性也不断增强，而 新发现的抗生素越来越少。自上世纪8 0 年代以来，仅有四种结构新颖的抗细菌 抗生素被批准用于临床是：假单胞酸类的莫匹罗星( m u p i r o c i n ，1 9 8 5 年上市) ； 嗯畔烷酮类抗生素利奈唑胺( 1 i n e z o l i d ，2 0 0 0 年上市) ，环酯肽类抗生素达托霉 素( d a p t o m y c i n ，2 0 0 3 年上市) 和截短侧耳素衍生物瑞他帕林( r e t a p a m u l i n ，2 0 0 7 年上市) 。细菌耐药性和新的病原菌的出现，严重威胁着人类健康，传统的基于 细胞水平的筛选方法已经很难发现新的抗生素，而随着抗生素作用机制和细菌耐 药机制，以及细菌生长和繁殖机制的不断阐明，为建立和应用基于分子水平的筛 选模型发现新的抗生素奠定了基础。近年来发展的靶向f t s z 细胞分裂抑制剂筛 选模型，显示了良好的应用自矿景。 植物内生菌的研究也是近年来微生物研究的热点，植物内生菌多样性与植物 多样性的相互关系以及内生菌次生代谢产物生物活性等方面的研究的展开，为新 药研究等提供了新的资源。 1 靶向f t s z 的细胞分裂抑制剂研究进展 1 1f t s z 在细胞分裂中的作用 f t s z ( f i l a m e n t o u st e m p e r a t u r e - s e n s i t i v ep r o t e i nz ) 是一种细菌细胞分裂所必需 的蛋白，其三级结构与微管蛋白的极为相似，为微管蛋白的原核类似蛋白。在细 胞分裂时，首先是细胞中央开始内陷，分割部分的细胞壁成分肽聚糖水解，这个 过程受1 2 种蛋白控制：f t s z 、f t s a 、z a p a ( y s h a ) 、s e p f y l m f 、z i p a 、f t s e 、 f t s x 、f t s k 、f t s q ( d i v l b ) 、f t s b ( d i v l c ) 、f t s l 、f t s w 、f t s i p b p 3 、f t s n 、a m i c 、 e n v c ，其中f t s z 是分裂位点上的第一个蛋白，起到细胞骨架作用。f t s z 有一个 g t p 结合位点，具有g t p 酶活性。g t p 能够诱导f t s z 聚合，聚合化的f t s z 吸 引与其结合的蛋白，装配成原丝( p r o t o f i l a m e n 0 ，螺旋成为一个环状物z 环； 第一节前言 l ：海师范人学硕1 j 学位论文 z 环形成后，进一步吸引膜结合蛋白，通过直接或问接作用形成隔膜，然后引导 整个分裂过程( 图1 1 ) 。因此找到靶向f t s z 的抑制剂，就可以有效地抑制细胞 分裂，进而抑制细菌的生长繁殖。 畸制o d 昨c x 4 1 玎砣仃由枉r 恃 1 2f t s z 抑制剂筛选模型 图1 1 a f t s z 参与z 环的形成 bz 环吸引膜结合蛋白形成隔膜 c 细胞分裂完成 f t s z 作为药物筛选的靶点具有它明显的优势，它含量丰富，有1 0 0 0 0 - - - - 2 0 0 0 0 拷贝；在致病性细菌、真细菌和古细菌中存在且相当保守；存在于细胞膜内壁上， 化合物容易进入；真核细胞中不存在这类蛋白，只有其结构类似物( 如人体中的 微管蛋白或肌动蛋白) ，但细胞分裂专一性抑制剂不会影响到人体细胞。以f t s z 蛋白作为筛选靶点，已经发现了多种结构类型的对敏感菌和耐药菌都有效的化合 2 圈函戳 l ：海师范人硕f j 学化论文第一节前苦 i ni i_ 物，包括对耐甲氧西林金色葡萄球菌和耐万古霉素的肠球菌有抑菌作用，且这些 化合物不影响真核细胞的正常功能。目前已经开发了多种以f t s z 作为靶点的筛 选方法。 ( 1 ) g t p 酶试验 f t s z 是一种g t p 酶，在无抑制剂条件下，g t p 水解为g d p ，加入抑制剂后， f t s z 的酶活性丧失，g t p 无法水解。磷屏技术( p h o s p h o rs c r e e nc a s s e t t e ) ，可用于 坳l j a - 3 2 p 】g t p 的水解，它的工作原理在于同位素标记的p i 在磷屏上曝光，曝光 过程a - 3 2 p 核衰变同时发射p 射线，并触发磷屏分子的能态变化发出光子，通过捕 获光子信号，可定量磷的释放含量，间接判断是否对有f t s z 抑制作用。 p i 的释放还可以通过孔雀石绿一磷钼杂多酸分光光度法【2 1 来测定。在酸性条 件下，利用碱性染料孔雀绿与磷钼杂多酸生成绿色离子缔合物，可以定量测定反 应体系中的磷含量，该方法具有灵敏度高、精密度好、络合物稳定时间长的优点 适用于f t s z 抑制剂的高通量筛选。 m a r g a l i td n 3 等发展t g t p 酶试验，其原理足g t p 水解为g d p 以后，在磷酸 烯醇丙酮酸和丙酮酸激酶存在的情况下重新转化为g t p 。当lm o l 的g d p 转化为 g t p ，同时将会有1m o l 的n a d h 就转化为n a d + 。因此，n a d h 的减少就可以反 应出g t p 的变化，从而间接反应出f t s z 的酶活。该方法通过检测体系中n a d h 的 荧光值变化，能够间接测定f t s z 的g t p 酶活性。 ( 2 ) 聚合试验 印度学者d o m a d i ap 等运用9 0 0 角光散射分析法从肉桂根茎提取物中筛选到 肉桂醛【4 1 。它的原理是根据光散射变化值与f t s z 聚合物的量成比例关系5 1 ：放射 性标记的 y 一3 2 p g t p 诱导f t s z 聚合，如果在系统中存在有抑制剂，则由于f t s z 的聚合受到抑制而使光散射值变小。 t r u s c ad 6 1 等用质粒p e t ll a 连接肛z 基因，得到p e t ll a - f i s z w t ，点突变获得 p e t li a - f t s z t 6 5 c ，转化宿主e c o l ib l 2 1 。分别培养野生型和突变型转化株，离 心得菌体并纯化野生型f t s z 蛋白和突变型f t s z t 6 5 c 蛋白，f t s z t 6 5 c 蛋白用2 m m 的碘乙酰胺荧光素标记。聚合试验从加入d e a e - d e x t r a n 开始，d e a e - - d e x t r a n 能够使自然条件下微量聚集的f t s z 和f t s z t 6 5 c 全部沉降，从而使反应体系的上 清不含有f t s z 和f t s z t 6 5 c ，而加入抑制剂以后的f t s z 无法聚集，分散悬浮，因 3 第一章前言 j 海师范人学硕f j 学位论文 此上清中能够检测到带有荧光素的f t s z t 6 5 c 。通过前后的比照可分析待测物质 对f t s z 抑制作用，该模型是高通量筛选简便易行的方法。 ( 3 ) 免疫荧光法【z j f t s z 与z 环的形成有密切的联系，观察细胞分裂期z 环的形态是鉴别抑制 剂的另外一种方法。将候选抑制剂加入对数生长期的ec o l i 培养基中，每3 0 分 钟或者6 0 分钟取一次样，将一种针对f t s z 的兔多克隆抗体加入样品中进行免疫 反应，再加入荧光剂f i t c 连接的山羊二抗，可在电镜下观察z 环和细胞结构的 变化。抑制剂的加入会显著破坏细胞的结构和z 环的形态。该方法通过显微镜直 接观察z 环的形态变化，其优点是直观形象。相对于其他的模型来说，该方法比 较费时费力、且对实验材料要求较高，适用于对初筛到的抑制剂进行进一步验证。 ( 4 ) 基于细胞水平的细胞分裂抑制剂的筛选 s t o k e sn r 等1 7 在细胞水平上建立了新颖的细胞分裂抑制剂筛选模型。这个 模型的原理是无抑制剂情况下的细菌孢子形成时，会启动s p o l i a l a c z 基因的表 达，导致细胞浆中产生半乳糖苷酶和转录因子0f ，因此它能消耗底物4 甲基伞 形酮酰p 一吡喃半乳糖苷。然后细胞开始分裂形成不对称分裂隔膜，染色体分裂 成大小不同的两个隔膜室。隔膜形成后，在小的隔膜室中转录因子of 激活了0 f - s p o l i q 基因的表达，导致葡萄糖苷酸酶合成。专一性抑制剂存在下，抑制了不 对称隔膜的形成，因而o f - s p o l i q 不能激活，没有葡萄糖苷酸酶的合成。由于 s p o l i a l a c z 表达未被关闭，半乳糖苷酶累计可能会增加。非专一性抑制剂存在下， 同时抑制了细胞的活力或孢子的形成，因而抑制了两者的表达，都没有这两种酶 的活性。根据这个原理构建质粒，这个质粒包含两个启动子，一个是转录因子0 f 上融合一个编码b 葡萄糖：苷酸酶s p o l i q 的启动子，另外一个是l a c z 上融合编 码of 的s p o l i a 启动子。第二步用b a c i l l u ss u b t i l i s 转化，筛选出转化子。将它们 放到含有底物4 甲基伞形酮酰一p 吡喃半乳糖苷和p d 葡萄糖苷酸荧光素的体系 中去，在专一型抑制剂存在时，就使得4 甲基伞形酮酰d 吡喃半乳糖苷被消耗， 而b d 葡萄糖苷酸荧光素仍然存在体系中间。通过这个荧光值的变化，就可以 判断出是否存在抑制作用。s t o k e snr 等通过该方法筛选到两种抑制剂p c 5 8 5 3 8 和p c i 7 0 9 4 2 ，进一步证实了它们的作用靶点是f t s z 。 4 f ：海师范人学硕i 学何论文第一葶前苦 1 3 靶向f t s z 的细胞分裂抑制剂 ( 1 ) 抑制f t s z 的g t p 酶活性和聚合作用的化合物 1 ) 3 甲氧基苯甲酰胺3 甲氧基苯甲酰胺( 3 m e t h o x y b e n z a m i d e ，图1 2 ) 能够抑 制a d p 一核糖转移酶，并作用于f t s z ，可微弱抑制b s u b t i l i s 的分裂，其m i c 为 4 0 0 0p g m l 一。3 甲氧基苯甲酰胺作用以后使得细胞形成长丝状，最后导致细胞 溶解【8 】，其衍生物p c19 0 7 2 3 9 】【1 0 1 ( 图1 3 ) 等对b s u b t i l i s 和s t a p h y l o c o c c u sa u r e u s 分裂抑制的作用更明显( 图1 4 ) ，对耐甲氧青霉素葡萄球菌和多药耐药葡萄球菌 的m i c 约为0 5 1 0m g m l 。s t o k e snr 等在细胞水平上筛选到了p c 5 8 5 3 8 和 p c i 7 0 9 4 2 ( 图1 5 ) ，对b s u b 打l i s1 6 8 的m i c 分别为1 2 8 甥m l j 和1 61 t g m l 一， 对mc a t a r r h a l & a t c c2 5 2 4 0 的m i c 分别为1 2 8p - g m l 。和8p g m l ，对 d i p l o c o c c u sp n e u m o n i a ea t c c4 9 6 19 等其他菌株有弱活性。 n 鸭 图1 2 3 - m e t h o x y b e n z a m i d e n 心 c l 图1 3p c i 9 0 7 2 3 ! ：坠；! 型些；：些i 坚l ： b c o n t r o l p c i 9 0 7 2 3 s， 1 ， p c 5 8 5 3 8 0 岍j l 、，一 i 夕_ 幽l4 a 抑制f t s z 的定化 b2 i g m l 抑制枯草芽地杆菌的分裂 c2 g m l 抑制葡萄球菌的丹裂 0 h 。j l p c ir 0 9 4 z b 。囝l 5 、 刚l5p c 5 8 5 3 8 自l p c l 7 0 9 4 2 2 ) g t p 类似物g a lp a r a d i s b l e a u c 等i f f 固相有机合成法，合成了一系列g t p 口j旷广， i ：海师范人硕l 学f 移沦之第章前苦 类似物g a l ( 图1 6 ) 。g a l 的核心结构是与g t p 相同，能够模仿g t p 结合到f t s z 上，导致正常的g t p 水解无法进行，抑制了g t p 酶的活性。在合成的一系列 g a l 化合物中，通过测定它们对ec o l i 和& a u r e u s 的半数致死剂量和抑菌圈大 小，发现该化合物具有抑菌活i 生( i c 5 0 = 0 6m m o l l 一) 。e d w a r d sp 同样用此方 法和合成了g t p 结构类似物( 图1 7 ) ( i c 5 0 = 0 1 4 5m m o l 屯_ ) ，浓度达1 0 m m o ll 1 时有抗菌活性，能阻断sa u r e u s 的生长【1 2 】。 h ：一婢如珉e 如 站辩成h n 二 图1 6g a l 图1 7g t p 结构类似物 n f t 。 3 1 紫杉烷类化合物h u a n gq 等【i3 】首先通过r t - p c r 的方法得到1 2 0 种紫杉烷类 化合物( t a x a n e s ，图1 8 ) ，这些紫杉烷类化合物表现出两种不同的活性，一种有 细胞毒性能稳定微管，而另外一种则没有细胞毒性，是紫杉烷多药耐药的逆转剂 ( t r a s ) ，它能抑制a t p 捆盒转运子外排泵，比如对p 糖蛋i 皇t ( p g p ) 、多药耐药 蛋f 刍( m r p 。) 和乳腺癌抗性蛋白( b c r p ) 有抑制作用。对这1 2 0 种紫杉烷类化合物 进行筛选，其中有许多表现出了显著的抗肺结核活性。它们对敏感的和耐药的结 核分枝杆菌有抑制作用( m i c = 2g m ) ，使结核分枝杆菌细胞形成长丝状菌体，这 种现象同典型的f t s z 抑制后细胞表现相同。 7 办 斟 糟 o i 巾；魏 n h o 八 第一章前言i ：海师范人学硕f j 学位论文 x 图1 8t a x a n e s 4 ) 血根碱血根碱( s a n g u i n a r i n e ，图1 9 ) 是一种苯菲啶生物碱，它是从血根草的 根部提取的，具有抗菌活性，被用于抑制癌细胞的增殖，还能阻止f t s z 的聚集， b e u r i atk 等研究了血根碱对f t s z 的作用，发现血根碱能够干扰e c o l i 和 b s u b t i l i s 分裂过程中z 环的形成。 图1 9 s a n g u i n a r i n e 5 ) 内源性细胞分裂抑制一t s h 和s u l a f t s h 是一种膜结合的、需要a t p 的 z n 2 + 金属蛋白，能够降解膜蛋白和细胞质蛋白【1 5 】，是a t p 酶家族中的一员，能 结合和水解a t p 。f t s h 有a t p 结合基序( a t p b i n d i n gm o t i f s ) 和锌结合基序 ( z i n c b i n d i n gm o t i f s ) ，是具有水解蛋白活性重要条件。f t s h 广泛存在于真细菌、 古细菌及真核细胞中。s r i n i v a s a nr 等【l6 】从e c o f it y e 0 2 4 中获取伽日基因，在 体外获得大量f t s h 蛋白，并构建了7 种f t s z 氮端或碳端结构缺失的突变株，f t s h 对突变株均有降解作用。s u l a 蛋白同样也是一种内生的细胞分裂抑制蛋白，同样 靶向于f t s z 蛋白。最初的研究发现s u l a 能作用于s o s 反应，引起细胞分裂停止。 将s u l a 浓度提高以后，发现其能抑制正常情况下的细胞分裂。 6 ) 黄连素( b e r b e r i n e ，图1 1 0 ) 黄连素又称小檗碱，是一种天然的植物碱，可 从黄连、黄柏、三颗针等植物中提取。能够结合在大肠埃希氏菌的f t s z 上，抑 i ：海师范人学硕f 。学f ? i 论：之第一带前吉 制z 环的形成，破坏f t s z 的原丝组装，抑制f t s z 的g t p 酶活性【1 7 1 。黄连素的 结构中含有取代的苯环和异喹啉环，密切参与了与f t s z 的互动，干扰z 环在细 胞中央的定位，使z 环的长度减低到细胞单位长度的一半。黄连素能结合在f t s z 的疏水位点，g t p 的存在可促进黄连素与f t s z 的结合，抑制f t s z 的睢体之间的 关联。总之，这些结果清楚地表明了黄连素抑制的作用，是f t s z 典型的抑制剂。 c 1 ，2 i - k 0 图1 1 0b e r b e r i n e ( 2 ) 影响z i p a 和f t s z 相互作用的抑制剂 1 ) 3 - ( 2 吲哚) 哌啶和2 苯基吲哚z i p a 和f t s z 的相互作用影响细胞分裂过程【1 8 1 。 l e ed 等【1 9 】运用核磁共振( n m r ) 法，分析了z i p a 和f t s z 之间的相互作用，发 现f t s z 的碳术端形成一个伐螺旋，通过疏水相互作用结合在z i p a 的表面空穴中， 并运用x 射线结晶法，找到了两个小分子化合物3 ( 2 吲哚) 哌啶和2 苯基吲哚( 图 1 1 1 1 。用极化荧光法考察了它们的衍生物对z i p a 和f t s z 的影响。该类别的衍 生物大多具有很强的抑菌效果。 州 2 - ( p i p e r i d i n - 3 - y 1 ) l h - i n d o l e s 2 巾h e n y l l h - i n d o l e s 图1 1 1 2 ) 羰基二苯基吲哚衍生物羰基二苯基吲哚衍生物( 图1 1 2 ) 能绑定在z i p a f t s z 相互结合的关键位点，能有效作用于革兰氏阳性细菌【2 0 1 。 9 l ? r 剖l1 2 c a r b o ) y b i p h e n y l i n d o l e f 3 1 降低f t s z 原丝化的抻制剂 1 ) 肉朴醛肉桂醛( 圈1 1 3 ) 是从中同肉桂中分离出的天然成分，是一剥t 传统药 材。具有杀茚消毒防腐：抗溃疡、加强胃、肠道运动；抗病毒：抗血4 、扳凝集； 抗变异等功效。d o m a d i ap 锋证实了肉桂醛的靶标是f t s z ，抑制坌| | 1 j 也分裂过稃r l z 环的形成( 图l1 4 ) 、f t s z 的聚集和原雌化( 图1 15 ) 。 幽i13 c i n n a m a l d e l l y d e 斟l1 4 ；e 焦疆徽镜f 肉桂醛对z 环空间特征的影响 注：a ：正常情况f 处丁分裂期的细胞中问形成z 环结构，蚓中箭头指向z 环部位 1 0 埘 ! ，耋些耋耋耋堡：耋堡耋耋篓：茎塑耋 b ：1 0 0 m m 肉桂醛加 以后，细胞形成长丝，z 环形成的频率辟低 图1l5 电镜r 观察到的内枉醛抑制f t s z 的原丝化 注：a ：止常情况f f t s z 聚集形成原丝，图中黑色箭头指向朦丝。 b ：1 0 0 m m 肉梓醛加入以后，f t s z 解聚，原丝无法形成。 2 18 。溴鸟苷5 一三磷酸f t s z 是一个g t p 酶，它的结构域上有7 个g t p 结合残 基 g g g t g t g l ，这是微管蛋向结合g t p 的典型序列。g t p 的c 8 位点被某些取 代基取代以后不会影响到它结合到f t s z 单体蛋白上，但是会影响到到f t s z 单体 聚合和形成原丝删i 。t i l m a nl 等瞄1 利用这个特点，合成了g r i p 类似物：8 滇乌 苷5 一三磷酸( b r g t p ) ( 图l1 6 ) ，b r g t p 与g t p 表现出刈逆的竞争性抑制，b r g t p 对细胞的半数致死剂量取决于两者的比侧关系，当b r g t p ：g t p = i ：i 时，就会抑 制f t s z 的g t p 酶活性，当b r g t p ：g t p = i ：2 时，f t s z 的聚合能力降低。 l 七r 呷o g i n ，d p | o 叩岫h 1 日r 6 t p l 图1 1 6 3 ) z a i l 及其结构类似物z a l l 仃i n s ( 图l1 7 ) 是5 种破坏f t s z 聚合或者导致 细胞形成长丝状的化合物，对很多革兰氏阳性和阴性菌株有抑制用，包括敏感性 和耐药性菌株，对革兰阳性菌的效果更佳( m i c = i 1 0 p m ) 。z a n t r i n s 对细胞分裂 第一章前苦i i 海师范人学硕i ：学位论文 曼皇曼! 。 i i i 鼍曼! ! 曼曼曼曼量! 曼曼曼舅! 苎曼量曼曼曼! 曼! ! 曼曼! ! ! 曼曼曼曼曼皇曼! 鼍 有抑制作用的机理是：f t s z 与微管蛋白样，均属g t p 结合蛋白，且水解g t p 时不需要其他辅助蛋白，更重要的是，f t s z 可以象微管蛋白那样装配形成原丝和 微管结构，z a n t r i n s 使破坏了f t s z 的聚合，导致原丝长度减小、数量变少，或者 使原丝的配对、捆绑频率降低，因此干扰了细菌内的z 环组装【5 】。 s a m e e ru 等【2 3 1 发现了天然多酚类化合物( ) d i c h a m a n e t i n 和 ( + ) 一2 - h y d r o x y - 5 ”- b e n z y l i s o u v a r i n o l b ( 图1 1 8 ) ，它们的结构与z a n t r i n l 类似， 能有效地作用于革兰阳性菌。 ( 4 ) 其他 1 2 州b z 1 m w4 10 z 2l m w4 8 8 ) z 3l m w 4 3 1 z 4l m w6 0 5 z 5i m w 4 1 2 图1 1 7z a n t r i n s 2 d i c h a m a n a t k a 3 2 - h y d f o x y - 5 - b e n z y l i s o o v a r i n o i - b 图1 1 8 i i 海师范大学硕l 。学化论文第一章前言 4 氨基呋咱( 4 a m i n o f u r a z a n ) 提取物，能够抑制大肠杆菌细胞分裂和z 环 在其体内的组装；对多药耐药性的ec o l i 和sa u r e u s 有效2 4 1 。 w h i t ee l 等根据微管蛋白抑制剂的结构推断f t s z 抑制剂，从2 0 0 种2 烷氧 羰基氨基吡啶中筛选出两种肺结核分枝杆菌抑制剂s r i 3 0 7 2 和s r i 7 6 1 4 2 5 1 。 1 4f t s z 作为筛选靶标的应用前景 抗生素耐药性不断产生，迫切需要具有新型作用机制的抗菌药物。f t s z 作为 一种重要的参与细胞分裂的蛋白，是一个较好的新型抗菌药物的筛选靶标：一是 因为它具有细菌中含量高、同源性高、且药物易进入等优点，就目前筛选到得抑 制剂来看，它们普遍具有广谱抗菌作用；二是通过该方法筛选到的药物不易产生 耐药性，因为目前临床应用的抗菌药物都不是抑制细胞分裂的作用机制。迄今已 经有多种靶向f t s z 的抗菌药物筛选模型已经建立，多种f t s z 的细胞分裂抑制剂 已经被发现，但还需对它们进行进一步的研究。 由于细胞分裂是多种蛋白相互作用的结果，因此，通过深入研究，有可能建 立针对这个体系中的多种蛋白以及它们的相互关系为靶标的新的细胞分裂抑制 剂筛选模型。另外，由于细胞内还存在着对f t s z 等细胞分裂关键蛋白进行调节 的物质，比如目前已经发现的f t s h 和s u l a ，因此，继续探索细胞分裂的整个过 程，探究细胞的自身调节机制，更好地利用菌体自身合成的内源性细胞分裂抑制 剂，相对于外源抑制剂来说，能有效地解决细胞毒性问题，这也是寻找细胞分裂 抑制剂的一个思路。 2 植物内生菌 植物内生菌( p l a n te n d o p h y t e ) 是指那些在其生活史的一定阶段或全部阶段 生活于健康植物的各种组织和器官内部的微生物。内生菌普遍存在于各种陆生 及水生植物中，具有分布广、种类多的特点。1 8 9 8 年y o g i 从黑麦草种子内分离 出第一株内生真菌，迄今已发现有8 0 多个属的几百种禾本科植物都有与之共生 的内生真菌。近二十年来，内生真菌在一些重要的经济林木如针叶类的各种冷杉、 云杉、红杉、紫杉、松柏等以及阔叶的栎树、桦树、桤木、桉树等植物树皮、枝 第章前玄f ：海师范人学硕 ：学化论史 叶内相继被分离和鉴定。在多种灌木、草本植物、栽培作物、果树、苔藓和蕨类 植物中也陆续发现了内生真菌或内生细菌。从目前研究来看，尚未发现没有分离 到内生菌的植株，因此可以推断内生菌在植物体内是普遍存在的。 植物内生菌是一类次生代谢产物丰富、应用前景广阔的资源微生物。近年来， 植物内生菌由于能够产生丰富多样的具有农药活性的次生代谢产物，在自然界中 具有重要的生态学作用，引起了人们广泛的关注并取得很大进展。从微生物中寻 找发现新型先导化合物，是新农药研制的重要途径。内生菌作为微生物中的重要 类群，其物种丰富，数量庞大，这为新农药的研究和开发提供了巨大的资源库。 另外，植物内生菌的代谢产物也是寻找新的医用化合物的一个有效的途径，最近 一个全面的研究显示，5 1 的从植物内生菌分离的生物活性物质是以前没有发现 的化合物，而从土壤微生物发现的新物质仅为3 8 。通过植物内生菌寻找抗癌药 物、抑菌剂、杀虫剂、植物激素、抗氧化剂等成为新的研究热点。 3 立项依据 随着抗生素的滥用，大量的耐药菌随之出现。近几十年来，人类并未开发 出多少新抗生素，开发的品种中绝大部分为已有抗生素的结构修饰和改良，对耐 药菌收效甚微。因此研究新的靶点、建立新型筛选模型或扩大微生物资源成为获 取新型抗生素的重要途径。 已有的抗菌药物作用机制主要是针对细胞壁、d n a 、蛋白质或叶酸的生物 合成。要想研究出全新针对尉药细菌的新型抗生素，避丌已有耐药机制的靶标是 选择新靶标的指南针。f t s z 是细胞分裂过程中的重要蛋白，已日益成为新型抗生 素的热点靶标。 传统的全细胞筛选模型已经很难再寻找到新型抗菌素，越来越多的研究已 经转向细胞中的一个或多个重要的靶点，以克服某些化合物难以透过细胞膜进入 细胞，或者某些化学成分由于浓度过低而难以发现它们的抑菌效果。因此本文拟 基于全细胞的特定靶细胞筛选技术，构建高效的f t s z 酶水平抗菌高通量筛选模 型。 植物内生菌不仅能够参与植物次生成分的合成或对植物次级代谢产物进行 转化，而且还能够独立产生丰富的次级代谢产物，是天然产物的重要来源。就目 1 4 l ：海师泡人 硕l 。 化论文镐一章前亩 前的研究来看，靶向f t s z 的细胞分裂抑制剂的筛选，多用现有的化合物库纯品 来筛选，而未有使用植物内生菌发酵液筛选的报道。本文使用上海来益生物药物 研究开发中心丰富的植物内生菌资源，通过模型进行活性筛选，为发现新型天然 f t s z 抑制剂提供可能。 第二章加z 恭拍e c o l i 中的克降表达f ：汽师范人学硕f j 学位论艾 第二章f t s z 基因在e c o l i 中的克隆表达 本课题的胚z 基因是从e c o l id h 5 a 中钓取的，提取e c o l id h 5 a 的总d n a ， 设计引物，通过p c r 扩增加z 基因，构建到表达载体质粒p e t - 3 0 a 上。考虑到 p e t - 3 0 a 上自带的h i s t a g 表达基因在表达后可能会造成f t s zg t p 酶活性的丧失， 因此设计了两组酶切位点来连接p e t - 3 0 a 和加z ，分别为b a m h i & h i n d l i i 和 n d e i & h i n d l i i ，具有b a m h