（分析化学专业论文）纳米粒子组装电化学发光免疫传感器的研究.pdf

金纳米粒子组装电化学发光免疫传感器的研究 彭亚鸽 摘要电化学发光免疫分析法( e c l i a ) 是以电化学发光为检测手段，用电 化学发光物或电活性物质标记抗原抗体，利用其免疫反应前后电化学发光信号的 改变，对抗原抗体进行定量测定的一种方法。电化学发光免疫传感器是将抗原抗 体固定在电极上，以电化学发光强度为检测信号进行对应抗体抗原测定的一种新 型免疫传感器。电化学发光免疫传感器以其灵敏度高、选择性好、分析速度快、 样品用量少、使用方便等优点引起研究者们广泛兴趣。 金纳米粒子以其良好生物亲和性、导电性、高催化活性等突出的优点，在分 析化学中的应用越来越受到人们的关注。将金纳米粒子应用在电化学免疫传感器， 荧光免疫传感器，压电质量免疫传感器和s p r 免疫传感器中已有报道，但是，将金 纳米粒子应用在电化学发光免疫传感器中的报道较少。本论文研究工作旨在研究 金纳米粒子修饰电极上电化学发光检测信号的增强作用，并在此基础上，利用抗 原抗体的特异性识别作用，结合金纳米粒子组装技术和鲁米诺标记抗体技术，研 制高灵敏、快速、简单的纳米粒子组装电化学发光免疫传感器和抗原抗体的测定 新方法。 第一章为纳米粒子在免疫传感器中的应用综述，详细介绍了免疫传感器的原 理、分类、抗原抗体的固定化方法以及免疫传感器的再生；综述了近年来各种纳 米材料在免疫传感器中应用的研究进展。 第二章为金纳米粒子修饰电极电化学发光法测定二茂铁羧酸的研究。以金纳 米粒子修饰石墨电极为工作电极，建立了高灵敏测定二茂铁单羧酸的电化学发光 分析方法。发现在金纳米粒子修饰石墨电极上，鲁米诺一过氧化氢二茂铁羧酸体系 的电化学发光有强烈的增敏作用。详细考察了在金纳米粒子修饰石墨电极上鲁米 诺一过氧化氢一二茂铁羧酸体系的电化学发光行为，研究了影响发光信号的多种因 素，优化了测定二茂铁羧酸的分析条件。在2 5 x l o - 9 m o l l 鲁米诺1 o 1 0 3m o l l 过 氧化氢，0 1 0m o l l p h9 2 碳酸氢钠缓冲溶液中，以金纳米粒子修饰石墨电极为工作 电极，控制电位为+ 3 9 0m v ( v s a g a g c i ，饱和k c i ) ，二茂铁羧酸浓度在1 0 x 1 0 9 1 o 1 0 击m o l l 范围内与电化学发光强度呈良好的线性响应关系，检出限为7 o 1 0 “o m o l l ( s n = 3 ) 。 第三章为金纳米粒子固定人免疫球蛋白电化学发光免疫传感器的研究。以金 纳米粒子修饰石墨电极为工作电极，研究了鲁米诺在此修饰电极上的电化学发光 行为，建立了中性介质中高灵敏测定鲁米诺的电化学发光分析方法。并在此基础 上，分别以人免疫球蛋白抗体( a n t i - h l g g ) 和人免疫球蛋白( h l g g ) 抗原为分析 对象，以分别固定h l g g 抗原的金纳米粒子修饰石墨电极和固定a n t i ，h i g o 抗体的金 纳米粒子修饰石墨电极作为免疫电极，利用鲁米诺标记的抗体，通过竞争法和双 抗体夹心法实现对相应抗体和抗原的检测，研制了一种新型的纳米粒子组装电化 学发光免疫传感器。研究结果表明，利用金纳米粒子不仅增强电化学发光检测信 号，而且增加免疫试剂在电极表面的固定量，显著提高了传感器的灵敏度。 在采用竞争型的模式下，所制电化学发光免疫传感器对a n t i h i g g 抗体检测的线 性范围为3 0 x 1 矿3 0 x 1 0 。e j m t ，检出限为1 o x l 0 。6 9 m l ，线性方程弘3 3 1 4 l g c + 1 6 7 3 9 ( c 单位g g m l ) ，线性相关系数为0 9 9 4 6 。对1 o x l 0 6g m l 的a n t i h l g g 抗体 进行5 次测定，相对标准偏差为4 6 。所制夹心型免疫传感器对h l g g 抗原检测的线 性范围为3 o 1 0 1 0 3 o 1 0 一g m l ，线性方程s = 6 0 9 3 + 3 1 8 9c ( c 单位n g m l ) ， 检出限为1 ，8 1 0 1 0 9 m l ，线性相关系数为0 9 9 4 2 。对浓度为9 0 x 1 0 母g m l 的h l g g 作 5 次重复测定，相对标准偏差为3 8 。 本论文的研究工作为进一步研制高灵敏度的纳米粒子组装电化学发光免疫传 感器提供了一些基础性研究资料，对此方面的研究工作具有一定的促进作用。 关键词：金纳米粒子电化学发光鲁米诺二茂铁单羧酸免疫传感器 e l e c t r o c h e m i l u m i n e s c e n c ei m m u n o s e n s o rb a s e do ng o l d n a n o p a r t i c l e sm o d i f i e de l e c t r o d e y a g ep e n g a b s t r a c te l e c t r o c h e m i l u m i n e s c e n c ei m m u n o a s s a y ( e c l i a ) i saq u a n t i t a t i v e m e a s u r e m e n tm e t h o df o ra n t i g e no ra n t i b o d yt h a tb a s e do ne l e e t r o c h e m i l u m i n e s c e n c e ( e c l ) s i g n a lc h a n g eb e f o r ea n da f t e ri m m u n o r e a c t i o n s e c li r a r n u n o s e n s o ri sa n e w - s t y l ei m n m u o s e n s o rt h a tc o m b i n ei m m o b i l i z e da n t i g e no ra n t i b o d yo ns u r f a c eo f e l e c t r o d e 埘t he c li n t e n s i t ya sd e t e c t i o ns i g n a l i th a sg a i n e dc o n s i d e r a b l ei n t e r e s ta s t h eb i o a n a l y t i c a ld e v i c ei nr e c e n ty e a r s ，a n dh a sb e e nt h ea t t r a c t i v et o o lb e c a u s ei th a s k g hs e l e c t i v i t y c a na c h i e v ee x c e l l e n td e t e c t i o nl i m i t s 诵ls m a l lv o l u m e so fa n a l y t e a n dr e d u c ea s s a yt i m e ，a n di sc o n v e n i e n tt ou s c g o l dn a n o p a r t i c l e sh a v eo b t a i n e di n c r e a s i n gi n t e r e s ti na n a l y t i c a lc h e m i s t r yf i e l d g o l dn a n o p a l t i c l e sa l ec h a r a c t e r i z e db ys e v e r a la d v a n t a g e ss u c ha st h e “f o l l o w i n g ：g o o d b i o c o m p a t i b i l i t y ，c o n d u c t i v i t y ，h i g hc a t a l y z e e f f i c i e n c y i t h a sr e p o s e dt ot h e a p p l i c a t i o n so fg o l dn a n o p a r t i c l e si n e l e c t r o c h e m i c a li m m u n o s e n s o r ，f l u o r e s c e n c e i m m u n o s e n s o r , s u r f a c ep l a s m o nr e s o n a n c e ( s p r ) i r r m m n o s e f i s o ra n dp i e z o e l e c t r i c a l ( p z ) i m m u n o s e n s o r h o w e v e r ，l i t t l ew o r kh a sb e e nd o n ei nt h ea p p l i c a t i o no fg o l d n a n o p a r t i c l e st oe c li m m u n o s e n s o r t h ea i mo ft h ep r e s e n tw o r ki s t os t u a y e n h a n c e m e n to f e c ld e t e c t i o ns i g n a la tg o l dn a n o p a r t i c l e sm o d i f i e de l e c t r o d e ，a n d d e s i g nah i g hs e n s i t i v i t y , f a s t , s i m p l ee c li m m u n o s e n s o rt h a tb a s e do nt h es p e c i f i c i n t e r a c t i o nb e t w e e na n t i b o d ya n da n t i g e nu s i n gg o l dn a n o p a r t i c l e sm o d i f i e dt e c h n o l o g y a n dl u m i n o ll a b e l e da n t i b o d yt e c h n o l o g y t h em a j o rc o n t e n t si nt h i st h e s i sa r ed e s c r i b e da sf o l l o w s ： c h a p t e r1 r e v i e wo fa p p l i c a t i o n so ft h e n a n o p a r t i c l e si ni m m u n o s e n s o r t h ep r i n c i p l e ， c a t a l o g u e ，i m m o b i l i z a t i o nm e t h o do fa n t i g e n ( o ra n t i b o d y ) a n dr e g e n e r a t i o n o f i n m m n o s e n s o rw e r ed e t a i l e dd e s c r i b e d t h e a p p l i c a t i o n s o ft h ed i v e r s i f i e d n a n o m a t e r i a l si ni m m u n o s e n s o rw e r es u l n n a r i z e d c h a p t e r2 e l e c t r o c h e m i l u m i n e s c e ，n , ，d e t e c t i o no ff e r r o c e n e m o n o c a r b o x y l i ca c i d a tg o l d n a n o p a l t i c l e sm o d i f i e di 。, 1 6 h i t ee l e c t r o d e ah i g h l ys e n s i t i v ee c lm e t h o df o rt h e d e t e r m i n a t i o no ff e r r o c e n e m o n o c a r b o x y l i ca c i d ( f m c ) w a sd e v e l o p e da t g o l d n i n a n o p a r t i e l e sm o d i f i e dg r a p h i t ee l e c t r o d e i tw a sf o u n dt h a tt h ee c li n t e n s i t yo f l u r n i n o l h 2 0 2 一f m cs y s t e mc o u l db eg r e a t l ye n h a n c e da t ag r a p h i t ee l e c t r o d e ( g e ) m o d i f i e dw i t l lg o l dn a n o p a r t i c l e s t h et e s tc o n d i t i o n si n c l u d i n gt h em o d i f i e da m o u n to f g o l dn a n o p a r f i c l e so ng e ，w o r k i n gp o t e n t i a l ，t h ec o n c e n t r a t i o n s o fl u m i n o la n d c o n c e n t r a t i o n so fh y d r o g e np e r o x i d ew e r eo p t i m i z e d t h ei n t e g r a t e de c l i n t e n s i t ya t t h eg em o d i f i e d 埘t l lg o l dn a n o p a r t i c l e s ，a tt h ea p p l i e dp o t e n t i a lo f + 3 9 0m v ( v s a g a g c l ，s a t k c i ) i no 1 0m o l lc a r b o n a t eb u f f e rs o l u t i o n ( p h9 2 ) c o n t a i n i n g 2 5 1 0 一m o t ll u m i n o la n d1 o x l 0 m o l lh y d r o g e np e r o x i d e ，s h o w e dag o o dl i n e a r r e s p o n s ew i t ht h e c o n c e n t r a t i o no f f m ci nt h er a n g ef r o m1 0 x l o - 9m 0 1 lt o1 0 1 0 4 m o l l t h ed e t e c t i o nl i m i ti s7 0 x1 0 ”m o l l ( s n = 3 ) t h ed e v e l o p e de c lm e t h o dh a s ap o t e n t i a la p p l i c a t i o ni nt h ee c l i r n m u n o a s s a ya n dd n ah y b r i d i z a t i o nd e t e c t i o nb a s e d o n t h e f m cl a b e l c h a p t e r3 e l e c t r o c h e m i l u m i n e s c e n c ei m m u n o s e n s o rf o ri n m m b i l i z e dh l g gb a s e do ng o l d n a n o p a r t i e l e sm o d i f i e dg r a p h i t ee l e c t r o d e ah i g h l ys e n s i t i v ee c lm e t h o df o rt h e d e t e r m i n a t i o no fh m f i n o lh a sb e e nd e v e l o p e da tag r a p h i t ee l e c t r o d em o d i f i e dw i mg o l d n a n o p a r t i c l e s a n o v e le c li n 2 m l m o s e n s o rb a s e do ni m m o b i l i z e dh u m a n i m m u n o g l o b u l i nga n t i g e n ( h i g g ) a n dh u m a ni m m u n o g l o b u l i nga n t i b o d yf a n t i - h i g g ) a tg o l dn a n o p a r t i c l e sm o d i f i e dg r a p h i t ee l e c t r o d eh a sb e e nd e v e l o p e df o ra n t i h i g ga n d h i g g a sam o d e ls y s t e m ，t w oi m m u n o a s s a yf o r m a t s ，c o m p e t i t i v ei m m u n o s e n s o ra n d s a n d w i c hi m m u n o s e n s o r ，w e r ep r o p o s e du s i n gl u m i n o l - l a b e l e da n t i - - h l g gt h er e s u l t s h o w s ，w h i c ht h eg o l dn a n o p a r t i c l e sn o to n l ye n h a n c e de c li n t e n s i t ys i g n a l ，b u ta l s o i n c r e a s e di m m o b i l i z e dc a p a c i t yo fi m m u n o r e a g e n to ns u r f a c eo fe l e c t r o d e ，r e m a r k a b l y i m p r o v e dt h es e n s i t i v i t yo f i m m u n o s e n s o r t h ec o m p e t i t i v ei m m u n o s e n s o rf o r m a t ，i m m o b i l i z e dh i g go ns u f a c eo fg r a p h i t e e l e c t r o d ew i t hg o l dn a n o p a r t i c l e sm o d i f i e d ，u s i n gl u m i n a ll a b e l e da n t i h l g ga n t i b o d y , a c a l i b r a t i o nc u r v ef o ra n t i m g gw a so b t a i n e di nt h ec o n c e n t r a t i o nr a n g ef r o m3 0 xlo t o 3 o x l o 。g m lw i t had e t e c t i o nl i m i to f1 o x l 0 4g m l t h el i n e a rr e g r e s s i o ne q u a t i o n w a s s - 3 3 1 4 l g c + 1 6 7 3 9 ( u n i t o f c i s i _ t e j m l ) a n d t h ec o r r e l a t i o nc o e f f i c i e n t w a s o 9 9 4 6 t h er e l a t i v es t a n d a r d d e r i v a t i o n f o r3 0 1 0 4 9 m l a n t i - m g g w a s 4 6 ( n = 5 ) t h es a n d w i c hi m m u n o s e n s o rf o r m a t ，i m m o b i l i z e da n t i h l g go ns u f a e eo fg r a p h i t e e l e c t r o d ew i mg o l dn a n o p a r t i c l e sm o d i f i e d u s i n gl u m i n a ll a b e l e da n t i h l g ga n t i b o d y t h ei n t e g r a t e de c li n t e n s i t yw a sf o u n dt ob e l i n e a r l yp r o p o r t i o n a l t o h l g g c o n c e n t r a t i o ni nar a n g ef r o m3 0 x 1 0 1 0t o3 o x l o 9g m lw i t had e t e c t i o nl i m i to f 1 8 1 0 1 0 9 m l t h e l i n e a rr e g r e s s i o ne q u a t i o n w a s s = 6 0 9 3 + 3 1 8 8 c ( u n i to f c i sn g m l ) a n dt h ec o r r e l a t i o nc o e f f i c i e n tw a so 9 9 4 2 t h er e l a t i v es t a n d a r dd e r i v a t i o nf o r9 o 10 - 9 g m la n t i h l g gw a s3 8 ( n = 5 ) k e yw o r d s ：g o l dn a n o p a r t i c l e se c ll a r n i n o l f e r r o c e n e m o n o c a r b o x y l i c a c i di m m u n o s e n s o r v y9 0 0 ； 2 9 学位论文独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是我在导师的指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。尽我所知，除文中已经注明引用的内容外，论文中不包含其他个人已经 发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得陕西师范大学或其它教育机构的学位 或证书而使用过的材料。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中 作了明确说明并表示谢意。 作者签名：多；粤够日期：塑! ， 学位论文使用授权声明 本人同意研究生在校攻读学位期间论文工作的知识产权单位属陕西师范大 学。本人保证毕业离校后，发表本论文或使用本论文成果时署名单位仍为陕西师 范大学。学校有权保留学位论文并向国家主管部门或其它指定机构送交论文的电 子版和纸质版：有权将学位论文用于非赢利目的的少量复制并允许论文进入学校 图书馆、院系资料室被查阅；有权将学位论文的内容编入有关数据库进行检索； 有权将学位论文的标题和摘要汇编出版。 作者签名：垄! 鳢日期：迎6 = ：3 第一章纳米粒子在免疫传感器中的应用( 综述) 本章将详细介绍免疫传感器的原理、分类、抗原( 或抗体) 的固定化方法以 及免疫传感器的再生；综述各种纳米材料在免疫传感器中的应用；阐述本论文的 研究思路和目的。 1 1 免疫传感器 生物传感器( b i o s e n s o r ) 是将生物识别分子固定在信号转换器上而构成的一种 分析检测器件l 】j 。生物识别分子是具有分子识别能力的生物活性物质如酶、抗体或 抗原、核酸、微生物、动植物组织切片等；信号转换器通常有电极、光极、热敏 电阻、场效应晶体管、压电石英晶体及表面等离子共振器件等。当分子识别物质 与待测物发生特异性反应后，信号转换器将待测物质的浓度信号转变为可以检测 的电或光等信号，从而达到分析检测的目的。生物传感器根据生物分子识别物质 可以分为以下几类：酶传感器、免疫传感器、基因传感器、组织传感器、微生物 传感器。生物传感器具有选择性好、灵敏度高、分析速度快、样品用量少、成本 低、能在复杂体系中进行在线连续监测的特点。生物传感器的高度自动化、微型 化与集成化，减少了对使用环境和技术的要求，适合野外现场分析，在生物、医 学、环境监测、食品、医药及军事医学等领域展现出十分广阔的应用前景【2 ) 。 免疫传感器( i m r n u n o s e n s o r ) 是利用固定化抗体( 或抗原) 对抗原( 或抗体) 的结合识别功能而研制成的一种生物传感器。由于抗体与抗原的结合具有很高的 特异性，提高了检测的准确性，且检测范围宽，因此，免疫传感器不仅能灵敏的 检测高分子量的各种抗体或抗原，而且可以灵敏地检测低分子量的半抗原( 如药 物、毒素、激素等) 。免疫传感器是近年来生物传感器研究领域的热点之一1 3 - 9 】。 在免疫传感器的研究中，抗原( 或抗体 的固定化方法是影响其性能的一个 重要因素。只有通过适当的固定化方法，才能使生物识别分子在保持活性的前提 下牢固的固定在信号转换器上，因此，抗体( 或抗原) 的固定方法的研究是免疫 传感器研究的关键内容。常用的固定化方法有物理吸附法、包埋法、交联法和共 价键合法等。近年来，将纳米材料引入免疫传感器的研究已经成为一个研究热点。 研究发现，纳米材料修饰电极固定生物分子既可以保持生物分子活性，增加生物 活性分子在电极上的负载量，并能提高传感器表面和酶( 或蛋白质) 上氧化还原 活性位点之间的直接电子转移能力，因此以纳米材料代替以往的有机试剂或高分 子材料来固定生物分子成为一个新的发展趋势。银纳米粒子、金纳米粒子【l0 j 、碳 纳米管1 、半导体纳米粒子【12 l 等纳米粒子固定生物分子的研究均有文献报道。利 用纳米粒子多标记技术放大生物传感器检钡口信号的文献也有报道。 1 1 1 免疫传感器的原理和特点 免疫传感器的检测原理与免疫分析方法的检测原理相似，免疫传感分析法与 免疫分析法都属于固相免疫分析法，既把抗体( 或抗原) 固定在固相支持物表面， 固定化抗体( 或抗原) 识别与它相对应的抗原( 或抗体) 形成稳定的复合体，与 传统免疫分析法不同的是免疫传感器能够对整个免疫反应过程的动态变化进行实 时监测，能够连续，可逆，有选择性地对分析物进行定量检测 1 5 】。免疫传感器 的主要优点【1 1 ： 目标物具有很高的特异性，免疫反应具有可逆性； 响应时间短，检测速度快； 分析复杂样品时( 血清，食品，废水等) ，无需对样品进行前处理； 能够在环境监控，药物分析和工业过程中实行连续监控； 能够设计成便携式装置，可进行活体分析和少量样品中多组分测定； 能和其它装置结合实现免疫传感器的自动化，数据能以多种方式被处理， 存储，输出和显示。 1 1 2 免疫传感器的分类 免疫传感器根据免疫试剂是否被标记分为非标记免疫传感器和标记免疫传感 器【1 6 1 。 1 1 2 1 非标记免疫传感器 非标记免疫传感器原理如图1 1 。非标记免疫传感器不用任何标汜物，能直接 监控抗原和抗体之间的免疫反应。其测定原理为：抗体( 或抗原) 被固定在换能 器表面，当发生免疫反应后，抗体与抗原形成的复合体改变信号转换器表面的物 理性质，如电位，电阻，质量、光学性质。根据使用的信号转换器，非标记免疫 传感器可分为电化学免疫传感器、光化学免疫传感器、压电免疫传感器及表面等 离子共振( s p r ) 免疫传感器等。 p i b y l 等t ”】人将莠去津( a t r a z i n e ) 的单克隆抗体用蛋白a 法固定在压电晶体上 的金电极表面，样品中的莠去滓抗原与固定的莠去津单克隆抗体发生免疫反应时， 引起石英晶体上负荷质量的改变，使晶体振荡频率发生变化来测定待测物种浓度， 检测莠去津抗原的浓度下限达到1 5n g m l ；他们还试验了另一种测定方法，将莠 去滓抗原用自组装法固定在压电晶体表面，当含有莠去津抗原和莠去津抗体的缓 冲溶液流过压电晶体表面时，缓冲溶液中的莠去滓抗原与固定在压电晶体表面的 莠去津抗原竞争缓冲溶液中的莠去津抗体，抗体与固定抗原结合引起振荡频率变 化，通过振荡频率的变化，间接检测待测溶液中莠去律抗原，检测限为0 0 2 5n g m l 。 2 n g e h - n g w a i n b i 等【1 8 】将对硫磷( p a r a t h i o n ) 抗体固定在压电晶体的两侧用以直接测 定气相中的对硫磷，压电晶体的振荡频率变化值，与对硫磷浓度之间呈线性关 系，其线性范围为2 3 5n g l 。p a c h o l s k i 等i l9 j 在硅基底上修饰两层多孑l s i 0 2 ，将 捕获探针蛋( t a 固定在多孑l s i 0 2 上，当捕获探针蛋白a 与兔i g g 之间发生相互作用 时，引起反射干扰傅立叶转换光谱( 砌f t s ) 的变化，根据此变化检测溶液中待测 的兔i g g 。 固 图1 - 1 非标记法免疫传感器原理 f i g 1 - 1s c h e m a t i cd i a g r a mo f f r e el a b e l e di m m u n o s e n s o r 非标记免疫传感器的优点：操作简单，响应快；缺点：非标记免疫传感器的 灵敏度比标记免疫传感器的灵敏度低【2 。】，样品需求量较大。 1 1 2 2 标记免疫传感器 标记免疫传感器是将酶( 辣根过氧化物酶1 2 ”、葡萄糖氧化酶1 2 2 1 、碱性磷酸酯 酶2 3 1 等) 、电化学发光试剂( 鲁米诺、钌联吡啶等) 、电活性物质2 5 2 6 1 、荧光 物质1 2 7 - 2 8 】、放射性同位素( 碘1 2 9 1 ) 、等作为标记物，对抗原( 或抗体) 进行标记， 抗原( 或抗体) 与抗体( 或抗原) 之间的反应过程通过电化学、电化学发光、光 学等手段进行检测，同时对浓度信息加以放大( 如酶标记) ，从而实现对目标物 的高灵敏检测。 标记免疫传感器的分析方法主要有竞争法和夹心法，其原理参看图l 一2 。前者 是用标记的抗原与样品中的抗原竞争结合固定在传感器界面的抗体( 图1 2 a ) ：后 者则是先使样品中的抗原与传感器界面上固定的抗体结合后，再加标记的抗体与 样品中的抗原结合，形成夹心结构( 图1 - 2 b ) 。 ( a ) 蘑羔蘑羔蘑 睁蘑讳 换能器 = 抗体= 抗原 = 标记物 驴= 标记抗体 图1 - 2 标记免疫传感器原理 f i g 1 - 2s c h e m a t i cd i a g r a mo fl a b e l e di m m u n o s e n s o r ( a ) 竞争型( b ) 夹心型 p e n a l v a 等1 3 0 j 在用竞争型荧光免疫传感器测定西维因( c a r b a r y l ) 的实验中，将 几种西维因的衍生物半抗原与标记物辣根过氧化物酶( h p r ) 偶联，分别用于竞 争免疫反应，在含有待测物西维因抗原的溶液中，加入一定量h p r 标记的抗原， 标记抗原和非标记抗原竞争地与传感器上固定的西维因抗体发生反应结合到传感 器表面上，再结合酶催化底物产生荧光信号的过程来测定西维因抗原的浓度。y u 【3 l j 等在用夹心型电化学免疫传感器检测人血清白蛋白( h s a ) 抗原的实验中，首先 将h s a 抗体固定在羧基化的单壁碳纳米管修饰电极上，固定的h s a 抗体与待测溶 液中的h a s 抗原结合后，再与h r p 标记的h s a 抗体结合，形成双抗体夹心结构， 通过标记的h r p 与i - 1 2 0 2 反应检测h s a 抗原，检测限达到7 5p m o l m l 。 1 1 3 生物分子的固定化方法 一 王 踟缴维 在免疫传感器的制作中，抗体( 或抗原) 的固定化方法一直是传感器研究的 关键环节之一p o 】。抗体( 或抗原) 的固定方式直接影响传感器的稳定性、选择性、 灵敏度、循环使用等一系列性能指标，决定免疫传感器能否制作成功i ”，3 1 - 3 3 。通 常一个好的固定化方法应满足下列条件： ( 1 ) 固定化后的生物分子仍能保持良好的生物活性。 ( 2 ) 生物分子识别物质必须与换能器紧密接触，有良好的稳定性和耐用性，能 适应多种测试环境。 ( 3 ) 减少固定的分子识别物质之间的相互作用以保持其原有的高度选择性。 目前普遍采用的抗体( 或抗原) 固定化方法有吸附法、包埋法、交联法和共 价键合法等，如图1 3 所示。 雌 吸附固定法 包埋固定法 交联固定法 a d s o r p t o n e n t r a p m e n t c r o s s - l i n k i n g 锪抗原( 或抗体) 伊变袋i l q 图l - 3 抗原( 或抗体) 的固定化方法 f i 昏1 - 3i m m o b i l i z a t i o nm e t h o d sf o ra n t i g e n s ( o ra n t i b o d i e s ) 1 1 3 1 吸附法 吸附法是一种通过物理吸附作用将抗原( 或抗体) 固定在换能器表面的方法。 这是一种比较简单的固定化方法。一般是将换能器表面经过适当的处理或修饰后， 再把换能器浸在含有抗原( 或抗体) 的溶液中或者将含有抗原( 或抗体) 的溶液 滴涂在换能器表面，使抗原( 或抗体) 通过极性键、氢键、疏水力或冗电子的相互 作用吸附在换能器表面上。常用的吸附法主要有高分子膜吸附法，先在换能器表 面修饰一层合成高分子或天然高分子，然后将生物识别分子吸附到高分子膜上， 构成传感器1 3 4 】；无机材料吸附法，利用无机材料分子筛( 或氧化铝等) 的强吸附 特性，将分子筛用聚乙烯醇调制后固定在换能器表面，然后使生物识剐分子通过 吸附作用固定于分子筛内，即构成生物传感器陟3 6 】；纳米粒子吸附法，俞汝勤等1 蜘 利用巯基与金纳米粒子之问的共价键合作用，在c y s 膜上组装一层金纳米粒子单层 膜，然后通过金纳米粒子与抗体之间的吸附作用，将i g m 抗体固定在电极表面，研 制成用于检澳j j l g m 抗原的压电免疫传感器。实验结果表明，以金纳米单层作为界面 固定抗体时，具有传感界面不需活化、固定抗体的活性高、检测时的非特异性吸 附小、传感器能反复再生等优点；静电自组装吸附法，k a r y a k i n 3 8 1 , 、组报道了利用 抗体本身的巯基能与金相互作用的特点，将抗体固定在金电极表面。 物理吸附法无需使用化学试剂进行偶联、活化步骤简单，传感器可获得较好 的响应，可以简化分析过程、降低成本。物理吸附法同化学法相比，对抗原( 或 抗体) 的活性影响较小，但是，容易脱落，对溶液p h 值、温度、离子强度和换能 器表面状况较为敏感。 1 1 3 。2 包埋法 包埋法是将抗原( 或抗体) 分子包埋在高分子三维空间网状结构中，在换能 器表面形成稳定的生物敏感膜。包埋法有三种类型：( 1 ) 聚合物包埋法。将分子 识别物质与高分子溶剂混合，当高分子溶剂形成聚合物时将生物分子识别物质包 埋在其中，制成具有生物活性的聚合物，再将此聚合物固定在换能器表面，构成 传感器。常用的材料有纤维素膜口9 1 、尼龙膜h 0 1 、淀粉川、聚乙烯醇h 2 等。 ( 2 ) 电聚合物包埋法。将聚合物单体和生物分子同时混合于电解液内，通电，使单体 在电极表面氧化而聚合成聚合物薄膜，将生物组分直接固定在电极表面。此法简 单，聚合物厚度和生物组分的量容易控制，修饰层重现性好。常用的导电聚合物 有聚吡咯( p p y ) 1 4 3 】、聚苯胺( p a n ) 1 4 4 1 、聚噻吩( p t h ) 1 4 5 】。( 3 ) 溶胶一凝胶包 埋法。溶胶一凝胶技术是指有机或无机化合物经过溶液、溶胶、凝胶而固化，再经 过热处理而制得氧化物或其它化合物固体的方法。此方法以制备的膜纯度高、均 匀性强，处理温度低，反应条件易于控制等优势而展示出广阔的应用前景h 岳5 2 j 。 包埋法的特点：实验条件温和，固定的生物分子比较牢固，对生物分子活性 影响较小，聚合物膜的孔径和几何形状可任意控制，可固定高浓度的活性生物组 分等；但是，该方法中使用的高分子凝胶或半透膜分子的尺寸选择性不利于大分 子底物与产物的扩散，而且聚合物形成过程中产生的自由基对生物组分可能产生 去活化作用；容易泄露。 1 1 3 3 共价键法 将抗体( 或抗原) 通过共价键固定在换能器表面的方法称为共价键合法1 5 ”。 共价键合法的过程通常包括三个步骤：换能器表面的活化，抗体( 或抗原) 在换 能器表面的固定，清除未键合的抗体( 或抗原) 。这三步中，每一步合适的实验条 件取决于抗体( 或抗原) 及偶联试剂的特性。 要引入共价键合官能团，首先必须对换能器表面进行活化，例如电极表面经 硅烷化试剂 5 4 - 5 5 l ，电化学氧化处理，或经过带有氨基、羧基或羟基等试剂 5 6 - 5 7 1 的 处理，均可在换能器表面引入能与抗体( 或抗原) 结合的官能团，通过官能团将 抗体( 或抗原) 固定在换能器表面；或者使用双功能团试剂【5 8 。5 9 】，将抗体( 或抗 原) 固定在换能器表面；还可以采用生物素( b i o t i n ) 抗生物素蛋白( a v i d n ) 在 换能器表面固定抗体( 或抗原) 6 0 - 6 ”。 共价键合法比前面两种固定化方法固定的抗原或抗体稳定性好，但是共价键 合反应使抗原抗体的活性损失较大，而且操作过程复杂、成本较高。 1 1 3 4 交联法 交联法是采用双功能基团试剂，在抗原或抗体之间、抗原或抗体与凝胶聚合 物之间交联，形成网状结构而使抗原或抗体固定在换能器表面的方法。常用的双 功能基团试剂有碳二亚胺( e d c ) 、n 2 羟基琥珀酰亚胺( n h s ) 和戊二醛 ( g l u t a r a l d e h y d e ) 等。m i n u n n i l 6 2 1 等用e d c n h s 活化传感器表面，清洗后，将含 有莠去津衍生物的d m f 一硼酸一乙醇溶液滴涂在传感器表面，2 5 。c 下放置7 5m i n ， 清洗除去非特异性吸附后保存，制成测定饮用水中莠去津的表面等离子体共振免 疫传感器。w i t t m a n n ”1 等也用e d c 将2 , 4 一d 固定到经氨基硅烷化的石英晶体表 面，制成测定2 , 4 一d 的光纤免疫传感器，2 , 4 一d 半抗原的检测限0 2 “l 。 s e l v a n a y a g a m i 叫等制作的离子敏感场效应晶体管生物传感器( i o n s e n s i t i v ef i e l d e f f e c tt r a n s i s t o r ，简称i s f e t ) 也是利用同样的方法将抗b 金环蛇毒素 ( 1 3 - b u n g a r o t o x i n ) 的抗体固定在晶体表面。 交联法操作简单、固定化效率高，常用来作为其它固定化方法的辅助手段以 防止分子识别物质的泄露。此方法的缺点主要有：反应难以控制、形成的分子识 别物质膨松、所需生物样品量多、扩散阻力大。 1 1 3 5 自组装法 自组装法( s e l f - a s s e m b l y ，简称s a 法) 是一种基于化学反应的化学吸附法1 6 ”。 自组装膜的基本组装步骤是：将基片放入含有抗体( 或抗原) 的溶液中，抗体( 或 抗原) 在基片表面发生自发的化学吸附或化学反应，在其表面形成化学键连接的 二维有序单层膜。如果单层膜表面也是具有某种反应活性的活性基团，则又可与 别的物质反应，如此反复，构筑同质或异质多层膜。采用自组装技术制备的超薄 层体系通常有两类：一类是巯基化合物在金、银、铜、铂表面吸附形成的单层； 另一类是在硅、玻璃、金属氧化物表面通过硅烷化反应形成的单层。其中，硫醇 7 类分子自组装单层( s e l f - a s s e m b l e dm o n o l a y e r ，s a m ) 是被研究得最为广泛和深入 的体系。如在单晶金电极表面先修饰一层硫醇类化台物，这是通过分子间引力进 行自组装构成的单分子层，然后再通过自组装法，将酶介体和酶一层一层地修饰 于电极上，构成传感器。 自组装单分子膜制作简便，具有良好的稳定性、有序性。但由于起步较晚仍 是一种不成熟的方法，许多问题如杂质吸附、分子聚合、溶剂选择、基片表面加 工、分子设计、有序性、缺陷的程度和性质等需要更深入的研究。 l - 1 3 6 蛋白a ( 蛋白g ) 固定法 蛋白a (