（分析化学专业论文）间氨基苯硼酸为功能单体的蛋白质分子印迹和qcm表征技术的研究.pdf

中文摘要 中文摘要 以抗原合成抗体的假说由p a u l i n g 在1 9 4 0 年首次提出，之后m o s b a c h 和w u l f f 在该领域做了开创性的工作，由此分子印迹成为一门独立的科学。蛋白质分子 印迹技术在小分子印迹丰厚经验的基础上，延承了分子印迹的基本理念，并且 适应蛋白质大分子印迹的需要，进行了很多方面的改进。蛋白质分子印迹聚合 物与目标蛋白质的作用是模拟抗原抗体的特异性结合，利用合成的聚合物对目 标蛋白质有特异性识别作用的性质，定性或定量检测复杂样品中的某种目标蛋 白质。与天然识别物质相比较，人工合成的蛋白质分子印迹聚合物性质更加稳 定、廉价易得、使用方便，并且可以反复应用，因而其在传感器、膜分离、色 谱分离等方面有了越来越广泛的应用。 本论文通过对间氨基苯硼酸这种可以印迹蛋白质的功能单体和q c m 表征 技术的探索，开展了分子印迹技术在蛋白质分离及检测方面的研究。论文中主 要是对间氨基苯硼酸这种功能单体与蛋白质的相互作用条件，以及蛋白质分子 印迹聚合物的合成与表征方面进行了一些探索，其中包括对石英晶体微天平传 感技术和以抗原决定基为模板制备可识别蛋白质分子的印迹聚合物的尝试。论 文大致可分为三大部分： 论文第一部分内容评述了分子印迹技术的分类和沿革；总结了间氨基苯硼 酸的应用及发展，尤其是在印迹生物大分子方面的突出范例；介绍了一种高度 灵敏的表征手段一石英晶体微天平技术，并对已有文献中，其在生物大分子( 或 小分子) 界面反应中的应用进行了总结。最后简要介绍了选题( 蛋白质分子印迹技 术) 的依据、意义及研究内容。 第二部分内容着重研究印迹蛋白质分子的功能单体一间氨基苯硼酸及以其 中文摘要 为功能单体的印迹聚合物的合成和应用，内容涵盖2 5 章。其中包括： ( 1 ) 间氨基苯硼酸与蛋白质分子的相互作用的讨论，以得出二者相互作用的 优化条件； ( 2 ) 以间氨基苯硼酸为功能单体，在玻璃微球载体上合成蛋白质分子印迹聚 合物的研究； ( 3 ) 在壳聚糖载体上合成蛋白质分子印迹聚合物的研究； ( 4 ) 所合成的聚合物对所考察的蛋白质的可逆吸附性质及在线色谱分析。 通过上述工作，首先得到了间氨基苯硼酸与蛋白质分子之间反应的优化条 件，并对有关聚合及洗脱反应的机理做了研究，应用到后续实验。然后，应用 上述结论分别制备了以玻璃微球和壳聚糖为载体的蛋白质印迹聚合物，以壳聚 糖为载体的蛋白质印迹聚合物的吸附量及选择性较之在玻璃微球载体上的效果 要更好，并且该聚合物吸附蛋白质的可逆性良好。这些体系在分离合成样品中 的目标蛋白时，均得到了满意的结果。 第三部分内容是以抗原决定基法制备蛋白质分子印迹聚合物纳米粒子的研 究。内容包括： ( 1 ) 采用反相微滴乳液聚合法制备以细胞色素c 的c 端决定基为模板的印 迹纳米粒子的研究； ( 2 ) 在功能化的石英晶体微天平( q c m ) 上对所合成的纳米粒子的特异吸附 性能进行表征。实验说明，q c m 在表征蛋白质分子印迹聚合物的性能 方面，灵敏度高、响应快。 关键词：分子印迹技术，蛋白质分子印迹聚合物，间氨基苯硼酸，石英晶体微 天平 i i a b s t r a c t a b s t r a c t p a u l i n gw a sa m o n gt h ef i r s ts c i e n t i s t sp o s t u l a t e df o rm a n u f a c t u r i n gas y n t h e t i c a n t i b o d yw i t hr e s p e c tt ot h ec o r r e s p o n d i n ga n t i g e ni n19 4 0 m o s b a c h ，w u l f fa n d c o w o r k e r sc a r r i e df o r w a r dt h i sh y p o t h e s i si n t oa ni n d e p e n d e n ts u b j e c t m o l e c u l a r i m p r i n t i n gt e c h n o l o g y ( m i t ) p r o t e i ni m p n n t i n gt e c h n i q u ei sb a s e do nt h et h e o r i e s o fs m a l lm o l e c u l e i m p r i n t i n g ，a n di m p r o v e da c c o r d i n gt ot h ei n s t i n c t so fp r o t e i n m o l e c u l e s m i m i c k i n gt h es p e c i f i ci n t e r a c t i o n sb e t w e e na na n t i g e n - a n t i b o d yp a i r , a r t i f i c i a l l ys y n t h e t i cp r o t e i n - r e s p o n s i v em a t e r i a l sc o u l dh a v eah i g hb i n d i n ga f f i n i t y a g a i n s ti t st e m p l a t ep r o t e i n c o m p a r e dw i t ht h en a t u r a lr e c e p t o r s ，a r t i f i c i a lp r o t e i n r e c e p t o r sa r ev e r ys t a b l e ，l o w - c o s t ，e a s y h a n d l ea n dr e u s a b l e a c c o r d i n g l y , t h e s e m a t e r i a l sh a v eb e e na p p l i e di nw i d e - s p r e a df i e l d s ，s u c ha ss e n s o r s ，m e m b r a n e s e p a r a t i o n ，c h r o m a t o g r a p h i cs e p a r a t i o na n de t c s of a r ，s o m es t r a t e g i e s ，l i k ea f f i n i t yc h r o m a t o g r a p h ya n de t c ，h a v eb e e ng e n e r a t e d a g a i n s tt h es p e c i f i ci s o l a t i o no fat a r g e tp r o t e i nf i o mac o m p l i c a t e de n v i r o n m e n t ； h o w e v e r ，i ti s s t i l lab i gp r o b l e mi np r o t e o m i c s o u rp u r p o s ei st o p r o d u c ea p r o t e i n s e l e c t i v ep o l y m e rb yu s i n gm i t ，w h i c hc o u l dr e c o g n i z et h et a r g e tp r o t e i n s e l e c t i v e l y i nt h i st h e s i s ，m o l e c u l a ri m p r i n t i n gt e c h n i q u e ( m i t ) ，f e a t u r e si ns p e c i f i c b i n d i n g ，w a sa d o p t e dt os e t t l et h es a i dt r o u b l e a c c o r d i n g l y ，m - a m i n o p h e n y l b o r o n i c a c i d ( a p b a ) w a sa p p l i e di nt h ef a b r i c a t i o no fp r o t e i n i m p r i n t e dp o l y m e ra n da p r o m i s i n gc h a r a c t e r i z a t i o nt e c h n i q u e ，q u a r t zc r y s t a lm i c r o b a l a n c e ( q c m ) w a s a d o p t e da sw e l lt oi n v e s t i g a t et h es p e c i f i c i t yo fp o l y m e ri nb i n d i n gi t st a r g e tp r o t e i n t h i st h e s i sc o n t a i n e dt h r e es e c t i o n sa sf o l l o w s ： i i i a b s t r a c t t h ef i r s ts e c t i o ng a v ea no v e r v i e wo nt h eb a c k g r o u n d sa n dd e v e l o p m e n t so fm i t ， a p b aa n dq c m ，p a r t i c u l a r l y ，t h ep o i n t so ft h i sp r o j e c t t h es e c o n ds e c t i o nm a i n l yf o c u s e do nt h es y n t h e s i sa n dc h a r a c t e r i z a t i o no f p r o t e i n - r e s p o n s i v ep o l y m e ru s i n ga p b aa sam o n o m e r ，i tc o v e r e dc h a p t e r2t h r o u g h 5 i tw a sc o m p o s e do f ： ( 1 ) c o n d i t i o n so ft h ep r e a r r a n g e m e n tb e t w e e ns e l e c t e dt e m p l a t ea n dm o n o m e r w e r es y s t e m a t i c a l l yo p t i m i z e d ； ( 2 ) p r o t e i n - r e s p o n s i v ep o l y m e rb yu s i n ga p b aa saf u n c t i o n a lm o n o m e rw a s c r e a t e do ng l a s sb e a d s ； ( 3 ) p r o t e i n s p e c i f i cp o l y m e rb yu s i n ga p b aa saf u n c t i o n a lm o n o m e rw a s p r e p a r e do nh o m e m a d ec h i t o s a np a r t i c l e s ； ( 4 ) t h er e v e r s i b i l i t yo fs p e c i f i ca d s o r p t i o na n do n - l i n ec h r o m a t o g r a p h i ca n a l y s i so f t h es y n t h e t i cp o l y m e r sf o r t h es e l e c t e dp r o t e i n sw e r es e r i o u s l yi n v e s t i g a t e d r e s u l t sd e m o n s t r a t e dt h a ta p b ai sac a p a b l em o n o m e ri ni m p r i n t i n gp r o t e i n m o l e c u l e su n d e rt h eo p t i m i z e dr e a c t i o nc o n d i t i o n s t h er e s u l t a n tp o l y m e rw a s p r o d u c e dw i t hah i g hb i n d i n gs e l e c t i v i t ya g a i n s ti t st e m p l a t ep r o t e i nm o l e c u l e s t h e p o l y m e ri sp r o m i s i n gi nt h ei s o l a t i o no ft a r g e tp r o t e i nf r o mr e a lb i o l o g i c a ls a m p l e s t h et h i r ds e c t i o ne m p h a s i z e do nt h ed e m o n s t r a t i o no fp r o t e i n - r e s p o n s i v ep o l y m e r u s i n ge p i t o p e i m p r i n t i n gt e c h n i q u ea n dt h em e a s u r e m e n t o fp o l y m e r u s i n g f u n c t i o n a l i z e dq c ms e n s o r s i tw a sc o m p o s e do f ： ( 1 ) b yu s i n g i n v e r s em i c r o e m u l s i o n p o l y m e r i z a t i o nm e t h o d o l o g y ，c y t c c t e r m - - i m p r i n t e dn a n o p a r t i c l e sw e r ep r o d u c e d ； ( 2 ) a n dt h es u c c e s s i v ec h a r a c t e r i z a t i o n su s i n gf u n c t i o n a l i z e dq c ms e n s o r s t h e f i n a lr e s u l t sa r ea p p r o v i n g an e wm e t h o do nt h ec h a r a c t e r i z a t i o no fb i n d i n g i v a b s t r a c t a f f i n i t yb yq c m h a sb e e nd e v e l o p e d k e y w o r d s ：m o l e c u l a ri m p r i n t i n gt e c h n o l o g y , p r o t e i n r e s p o n s i v em o l e c u l a r l y i m p r i n t e dp o l y m e r s ，m - a m i n o p h e n y l b o r o n i ca c i d ，q u a r t zc r y s t a lm i c r o b a l a n e e v 南开大学学位论文版权使用授权书 本人完全了解南开大学关于收集、保存、使用学位论文的规定， 同意如下各项内容：按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版 本；学校有权保存学位论文的印刷本和电子版，并采用影印、缩印、 扫描、数字化或其它手段保存论文；学校有权提供目录检索以及提供 本学位论文全文或者部分的阅览服务：学校有权按有关规定向国家有 关部门或者机构送交论文的复印件和电子版；在不以赢利为目的的前 提下，学校可以适当复制论文的部分或全部内容用于学术活动。 学位论文作者签名： 年月日 经指导教师同意，本学位论文属于保密，在年解密后适用 本授权书。 指导教师签名：学位论文作者签名： 解密时间：年月日 各密级的最长保密年限及书写格式规定如下： 南开大学学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师指导下，进行研究工作 所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本学位论文的研究成果不包含 任何他人创作的、已公开发表或者没有公开发表的作品的内容。对本论文所涉 及的研究工作做出贡献的其他个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本学 位论文原创性声明的法律责任由本人承担。 学位论文作者签名： 年月 日 第一章绪论 第一章绪论 1 1 应用分子印迹技术进行蛋白质分离的研究 1 1 1 分子印迹技术的背景及概述 近几十年来，随着生命活动与生命现象研究的不断深入，对有效地分离和 富集复杂的生物样品体系中的目标物的需要越来越迫切。科研人员根据不同的 原理研发出很多新型的分离技术，其中生物亲和分离的特异性最好，但由于生 物亲和物质的发现和分离十分困难，应用条件苛刻等原因，人工合成具有类似 生物分子亲和识别能力的介质的研究日益成为热点。分子印迹技术是依照模板 分子的大小、空间结构和电荷分布等性质，量身定制聚合物的一门技术。所合 成的分子印迹聚合物( m o l e c u l a r l yi m p r i n t e dp o l y m e r , m i p ) 对模板分子具有很高的 选择识别特性，与天然的识别系统相比( 如抗原一抗体，酶一底物) ，m i p 具有良 好的机械性能、高度的稳定性和较长的使用寿命，并且可以针对不同模板分子 各自的特性进行合成。因此，分子印迹技术在色谱分离、固相萃取、酶模拟催 化、临床药物分析、传感器技术等领域均表现出良好的应用前景。以下列举m i p 有代表性的一些应用。 1 1 1 1 对映异构体的分离 h a g i n a k a 等以小扑尔敏为模板分子制备粒径单分散的m i p ，用于水相中小扑 尔敏与其结构相似物非尼拉敏的分离【l 】。m i p 也可以用于其它一些几何异构体的 分离，如分离位置异构体辛可尼丁和辛可宁【2 1 。并且拆分方法己不仅局限于使 用高效液相色谱( h p l c ) ，所研究的拆分对象包括药物、氨基酸及其衍生物、肽 第一章绪论 勺蟹 号手o 1 1 1 2 膜分离和固相萃取 z o u g a g h 等在膜上合成分子印迹聚合物，用于实际样品中咖啡因含量的在线 定量分析。该方法的线性范围在1 0 1 0 0 0n gm l _ 1 之间。样品中咖啡因浓度为5 0n g m l _ 1 时，相对标准偏差为4 - 5 【3 】。 将印迹聚合物应用于固相萃取的报道较多，所涉及的目标物有烟碱【4 1 、心 得安5 1 、三嗪类6 7 1 等。 1 1 1 3 酶模拟催化 m o s b a c h 等采用自由基引发单体共聚合的方法，制备了具有催化活性的印迹 高分子。在c 0 2 + 存在的条件下，以某种氨基酸衍生物为模板分子制备的m i p ，对 p 硝基苯乙酸酯水解为p 硝基苯酚和乙酸盐的反应有特异性的催化作用【8 1 。 1 1 2 分子印迹技术的分类 分子印迹技术的目的是制备性能良好的分子印迹聚合物，即对模板分子有 特异识别性的高分子聚合物。经典的制备方法为：将模板分子与合适的功能单 体( 通常为小分子化合物) 及交联剂混合溶解于某种溶剂，使之相互作用并在 一定条件下引发聚合；再用适当的方法将加入的模板分子去除，形成对模板分 子具有高亲和力的识别位点，所得到的聚合物即为分子印迹聚合物。其制备方 法根据模板分子与功能单体之间作用力的不同，可分为预组装( p r e o r g a n i z e d ) 和 自组装( s e l f - a s s e m b l y ) 两种。 通过自组装方法制备的m i p ，模板分子与功能单体之间为弱分子间相互作 用，如静电作用、疏水作用、氢键、6 6 堆积作用、电荷转移等超分子作用。预 组装方法合成m i p ，模板分子首先要与功能单体进行衍生，形成强的、在一定 2 第一章绪论 条件下可逆的共价结合。 图示1 1 中左、右两边分别是通过自组装和预组装方法形成分子印迹聚合物 过程的示意图。采用预组装方式制备m i p ，其中关键的一个步骤就是在聚合反 应前对模板分子进行衍生化，使其与功能单体发生反应而生成共价化合物，并 且该共价键必须在一定条件下可逆，因此这种方法的局限性较大。它的优点是 结合力及专一性强。自组装方法的优点在于它的识别机理同生物识别较为接近， 结合作用主要为较弱的非共价作用。 证卸i 幽啦- 玎舛的舶a 。 加啊 q | q 图示1 1 分子印迹聚合物制备过程的图示 1 1 3 分子印迹聚合物的制备 1 1 3 1 材料的选择 3 一 鲡黜。 第一章绪论 模板分子的选择 根据预期的m i p 的可能用途及适应要构建的分析模型的需要，来选择相应 的分子作为印迹模板。并且应该考虑到可能采用的检测手段的特殊性，确保模 板分子能够被精确地定性或定量测定。比如，如果常规检测当中需要用到紫外 一可见检测器，则相应的模板分子要在适当的紫外一可见光波长范围内有适宜 的光吸收。一般来说，大部分蛋白质分子含有色氨酸残基、酪氨酸残基或苯丙 氨酸残基等芳香氨基酸残基，所以在紫外一可见光区有特征的吸收峰，其中以 2 8 0 n m 左右的吸收峰最为特征并且干扰少，便于使用紫外一可见、荧光检测器 进行检测。 功能单体的选择 单体的选择主要由模板分子决定。它首先必须能够与模板分子有特定的相 互作用，可以形成加合物；另外，在溶剂当中，该功能单体应该有适当的溶解 度，以确保与模板分子的充分作用。由于生物大分子所处的环境多为水溶液体 系，因此所选取的功能单体要有一定的水溶性。 引发剂的选择 分子印迹聚合物大多是通过自由基引发聚合反应制备的。过二硫酸盐( 及 四甲基乙二胺) 是制备以生物大分子为模板的聚合物的较为适宜的引发剂，该 引发条件较为温和，一般来说，聚合反应在室温下即可被引发。但通常只采用 过二硫酸盐，以热或光引发聚合反应，使反应完成。 交联剂的选择 为配合生物大分子印迹反应的需要，制备过程所采用的交联剂也应该在水 溶液当中有适当的溶解度。在制备该类型的m i p 时，反应过程中加入的交联剂 的比例( 即聚合物的交联度) 对识别位点的刚性有较强的影响。由于生物大分 4 第一章绪论 1 1 71 3 1l i 7i 1 7 1 i i 子尤其是蛋白质分子的体积较大、结构易变，刚性高的识别位点会延缓蛋白质 分子的传质过程，容易造成蛋白质的变性，因此一般的以蛋白质分子为模板的 m i p 的交联度应该控制在相对低的水平。 溶剂的选择 以生物大分子为模板的m i p 的作用，是模拟生物体系当中酶等物质识别的 特异性，进行生物样品中目标物的分离或富集。因此该类m i p 的应用领域应该 主要是水溶液体系。另外，为了保持m i p 在预聚合以及识别过程中条件的相似 性，其制备及识别过程都应该在水溶液或是适宜p h 值的缓冲溶液中进行。 洗脱溶液的选择 在印迹生物大分子时，功能单体与模板分子之间的结合力大多为氢键、疏 水力作用等较弱的分子间作用力，可以尝试采用较强的作用力( 如，可逆共价 键) 来取代分子间力的方式进行m i p 上印迹模板的洗脱。 1 1 3 2 目前广泛使用的各种合成分子印迹聚合物的方法 封管聚合 主要步骤是先将模板分子、功能单体混合于溶剂中得到均一溶液，预聚合 一段时间后，加入交联剂和引发剂，通氮气除氧，然后密封反应装置，经过热 引发或光引发一段时间后，得到块状聚合物。将聚合物粉碎、研磨、过筛后获 得合适粒径的聚合物颗粒，再经洗脱除去模板分子，得到相应的m i p 。方法的 主要优点在于实验设备和操作条件比较简单；缺点是制得的块状聚合物需要首 先经过繁杂的处理过程，在这些过程中不可避免地要破坏一定量的印迹孔穴。 虽然经过筛选，但是聚合物颗粒的大小和形状并不均一，会对识别效果产生一 定程度的影响，而且这些操作会降低聚合物的产率。 如图1 1 所示，s e l l e r g r e n 等以三苯基丙氨酸衍生物为模板分子，甲基丙烯酸 5 第一章绪论 为功能单体，制备印迹聚合物，在色谱条件下，实现了模板分子与其手性相似 物的基线分离，最大的分离系数为3 5 ，并且聚合物有较高的吸附容量 9 1 。 a i 图1 1d ，- 苯基丙氨酸酰替苯胺( 1 0 m o i ) 混合样在以三一苯基丙氨酸酰替苯胺为印迹模板的聚 合物填充色谱柱上的洗脱曲线9 1 洗脱液：l m o l l 醋酸的乙腈溶液；柱温：9 0 ；流速：0 3 m l m i n ；分离因子：3 5 ；分离度： 1 2 原位聚合 原位聚合是一种在色谱柱中制备印迹聚合物的方法，可以直接制得能使用 的分子印迹色谱柱。与封管聚合相比较，简化了后处理步骤，具有直接、简便 的特点和很强的实用性。 赵菊敏等用原位聚合法制备了一种以甲基丙烯酸缩水甘油酯( g m a ) 为单 体，7 _ , - - 醇二甲基丙烯酸酯( e d m a ) 为交联剂的整体色谱柱，并用二乙胺四氢 呋喃( v 胪1 ：1 ) 将其改性为弱阴离子交换柱。考察了交联剂及致孔剂用量对色谱柱 压力的影响。用该柱对白介素1 8 的粗提液进行分离，同时考察不同固定相、缓 6 第一章绪论 冲液体系、p h 值、盐的类型以及有机添加剂对白介素1 8 分离效果的影响【1 0 o ，m i n 图1 2 不同流动相流速及梯度洗脱条件下白介素一1 8 样品的分离谱图【1 0 】流动相a ：o 0 1 m o l l 磷酸盐一盐酸( p h6 6 ) 甲醇( 10 0 2 ，、，v ) ：流动相b ：0 01m o l l 磷酸盐- 盐酸( p h6 6 ) - 1 5 m o l l 溴化钾：进样体积：2 0 p l ；检测波长：2 5 4n m a 线性洗脱梯度：2 0 r a i n 内1 0 0 a 至1 0 0 b ：流速：1 0 m l m i n ：b 线性洗脱梯度：1 0 r a i n 内 1 0 0 a 至1 0 0 b ：流速：2 0m l m i n 1 白介素1 8 微球形分子印迹聚合物的制备方法 1 悬浮聚合法 悬浮聚合过程是将含有模板分子、功能单体和交联剂的有机相加入水相当 中，经过高速机械搅拌，使其形成悬浊液。聚合反应在每一个分散相的小液滴 中进行，从而获得m i p 的球形颗粒。 经典的小分子印迹研究中，大部分m i p 仍然是采用本体聚合方法制备的；悬 浮聚合法能够克服本体聚合的前述弊端，快速简便地制备球形的m i p ，优点明显。 k e m p e 等将预聚合溶液直接滴入有机相中，在强烈的机械搅拌下，使小液滴分散 7 第一章绪论 在有机相中，并以光引发自由基聚合反应，生成最终的m i p 。过程中无须引入表 面活性剂或稳定剂等。将所制备的球形m i p 与本体聚合制备的m i p 的性质进行平 行实验比划1 11 。如图1 3 所示，心得安在球形和颗粒状m i p 上特异性吸附等温线 的解离常数分别为5 7p , m o l l 和3 9p m o l l ，而各自相应的结合位点数分别为3 6 9 p m o l g 和2 2 7p m o l g 。依照二者的结合位点数的数据来计算，球形和颗粒状的m i p 的印迹位点产率分别为4 7 和2 9 【1 1 1 。 e c ( 删 图1 3 心得安分别在球形( 红色实线) 和颗粒状m i p ( 蓝色虚线) 上的特异吸附等温线1 1 】 2 乳液聚合 反相乳液聚合过程：使模板分子、功能单体、交联剂溶于水相，然后将溶 液移入内含表面活性剂的有机相中，经搅拌、乳化，最后加入引发剂。单体处 在胶束中，引发及聚合反应在单体一聚合物乳胶介质内进行。经聚合反应，可 得到粒径较均一的球形m i p 。 f e l i c i a n o 等用微滴乳液聚合反应，合成了对模板分子一( d 心得安具有单克 8 丕exo卫a三。一oc-q)j山口芒蚕重，e 尊一章绑e 隆识别行为的分子印迹纳米材料，并用所制备的材料填充毛细管电色谱，对r 甜- 心得安进行分析，以表征该材料的性质( 图l4 1 。与虬该材料在高效液相色谱 ( f i p l c ) 表征的实验结果相比较，在毛细管电色谱( c e c ) 表征过程中，模板分子的 对映异构体没有呈现明显的拖尾峰，达到了分析物的基线分离，塔板数在2 5 0 0 0 “00 0 0 之间i ”i 。 芗 t - w 圈l _ 4 以功能化的表面活性剂* 十一碳烯酰基甘氨酸盐( s u g ) 为单体采用檄滴乳液聚合方 法合成印迹纳米粒子【1 2 ( 1 ) 预聚合；0 ) 交联聚合；( 3 模板的去除 3 两步溶胀聚合 首先在水相中进行乳液聚合，制备单分散的纳米粒子( 粒径为5 0 5 0 0a m ) 。 以此粒子为种子，在含有印迹分子、交联荆及致孔剂的混合物中溶胀然后引发 自由基聚合形成m i p 。 9 第一章绪论 郭天瑛等采用两步溶胀与悬浮聚合联用的方法，以2 乙烯基吡啶( 2 v p ) 为功能 单体，- l - - 醇二丙烯酸酯( d e g d a ) 为交联剂，制备了以- 苯甲氧羰基三色氨 酸( n - c b z - l t r p ) 为模板分子的单分散的m i p 。如高效液相色谱表征结果，图1 5 所示，该m i p 在很短的色谱柱中即可实现模板分子与其对映异构体的基线分离 i1 3 】 o osl ol s2 0z 5 - 一 t r a i n 图1 5 以苯甲氧羰基一- 色氨酸( n - c b z l r r p ) 为印迹模板的单分散的微球状聚合物的填充 色谱柱上进行手性分离的色谱图【1 3 1 柱长：5 0r a m ；内径：4 6m m ；进样量：1 0 血含有5 0 0n g 样品的溶液；流动相：乙腈；流 速：0 5m l m i n ；测定波长：2 8 0n m ；柱温：3 0o c 表面印迹法 由于蛋白质分子的体积庞大、结构易变，与小分子传质过程相比要缓慢许 多，因此，若聚合物网络层次过于丰富，会极大延长模板分子在聚合物上的吸 附与洗脱过程。表面印迹技术制备以生物大分子为模板的m i p 的过程可简述为： 生物大分子与单体混合、作用后，将溶液引入到载体表面，然后引发聚合。除 1 0 第一章绪论 去模板分子后，在载体表面上就留下相应模板分子的识别位点。方法优点是载 体本身有较大的机械稳定性，可以通过对载体性能的调节来适应不同应用的需 要，并且印迹层较薄，有利于生物大分子的m i p 与溶液间传质过程的进行，能够 较快的达到吸附和洗脱的平甜1 4 】。 分子印迹膜的制备 制备的方法主要有( 1 ) 原位聚合法制备分子印迹膜【1 5 】；( 2 ) 将含有羧基、羟基 等官能团的聚合物溶解于溶有模板分子的溶剂中，通过相转移获得分子印迹膜 【1 6 】：( 3 ) p v c 删t1 7 1 。 1 1 4 分子印迹技术在生物大分子识别方面的应用 以生物大分子尤其是蛋白质为模板的分子印迹研究，已经成为了近期该领 域科研的主流，代表性的工作如下： a n m a 吣o f 聪m 讲懒r a g ) 图1 6 牛血红蛋白的吸附平衡曲纠1 4 】 ( ) ：牛血红蛋白的印迹纳米线；( ) ：非印迹纳米线 l l 警ve工譬_譬譬lj口盟蜀-是_锄皇黾暑 第一章绪论 l i 等报道了以氧化铝膜为载体，制备以蛋白质为模板分子的表面印迹纳米线 的方法。该方法解决了聚合物网络中截留的印迹蛋白质分子难以较完全洗脱的 问题，所合成的表面印迹纳米线对目标蛋白有良好的特异性识别能力。由于纳 米线有较高的比表面积，因此所合成的印迹纳米线有较高的蛋白质吸附容量。 如图1 6 所示，当印迹纳米线在吸附溶液中达到一定浓度时，原始溶液中约5 0 的目标蛋白被结合，而空白纳米线在相同条件下只结合了68 【l 。 s h 龃等以蛋白质分子上凸显在分子外端的抗原决定基为模板分子，在有机相 中制备了对含有该抗原决定基的虽白质有特异识别作用的m i p 。图1 7 为聚合物 的制备及识别过程机理示意图。实验结果表明，该m i p 具有优良的特异识别性 ”引。抗原决定基分子较小，一般只有8 1 2 个氨基酸，分子本身对制各条件的要 求不是很苛刻。该文是在有机溶剂中制各识别蛋白质的d i p 的突出范例。 图l7 抗原决定基为模板分于的印迹方案1a ) 玻片的修饰和肚的键和k m n 0 4 ( 05 r a m ) ，n g j 0 4 ( 1 95 m m ) 和k 2 c o “1 8 m m ；p h75 ) 氧化乙烯基硅烷表面n h s ，e d c 对咀羧基为 端基的单分子层的活化缓冲溶液中的抗原决定勤2 5 m g m l ) 在玻片表面的键和所示键 瑚 一 一 署 鹜 一 书 罄一一蛩一乎锺 第一章绪论 和方案仅适于似端的固定b ) m 1 p 玻片制备及表征过程的概述肽的端键和在玻片或氧化 的硅晶片表面，c 端外露紫外灯照射l o m i n ，将单体聚合在载体表面m i p 薄片与其所附着的 载体浸入缓冲溶液，4o c ，过夜载体与m i p 分开c ) 设想的m i p 识别机理目标蛋白在多重超 分子作用( 氢键、疏水键) 的共同作用下键和在识别位点上 1 1 5 生物大分子印迹技术存在的一些问题 题。 生物大分子印迹技术的研究已经取得了一定的进展，但仍然存在着一些问 1 1 5 1 溶剂 经典的分子印迹聚合物的制备和应用是在有机溶剂中进行的，而生命活动 以及有关物质都存在于水相体系中，因此，未来分子印迹聚合物要面临的实际 应用环境应主要为水相体系，如何能在水相环境中进行生物大分子的印迹和识 别是亟需解决的问题。 1 1 5 2 方法 一般来讲，经典印迹方法制备的m i p ，颗粒形状及大小不均一，识别孔穴 刚性较大，不利于生物大分子的传质。应用比表面积较大的溶胶一凝胶类印迹 材料，配合表面印迹技术，能够在较大程度上克服上述弊端，是分子印迹聚合 物未来发展的一个重要趋势。 1 1 5 3 试剂 目前可适用于制备生物大分子m i p 的交联剂种类较少，经典分子印迹技术 中常用的交联剂大多数不溶于水而易溶于有机溶剂。这些物质不仅价格较高， 而且所得产品均是高交联的刚性聚合物，这样的聚合物母体对于体积庞大的生 物分子( 如蛋白质) 本身非常不利。相比之下具有较好柔顺性的载体，对于生 物大分子的传质以及保持活性更为有利( 如以壳聚糖作为载体) 。另外，可用的 功能单体也非常有限，尤其是可用于水相体系印迹的功能单体种类更少，远远 13 第一章绪论 不能满足分子印迹技术发展的需求。因此，研发种类更丰富、更有效、成本更 低的功能单体和交联剂是保证分子印迹技术能够继续高速发展的重要前提。 1 1 5 4 生物大分子的结构特性 以天然药物、肽、酶和蛋白质等生物活性分子为模板的印迹研究日益活跃 【1 9 也7 1 ，但效果尚不尽人意。主要是因为这类分子的体积庞大、结构易变、对所 处环境要求苛刻，其印迹、洗脱和识别过程的操作困难远大于印迹普通小分子。 因而有必要对现有的分子印迹聚合物的制备方法进行彻底的改进与变革，以满 足生物大分子甚至是生物活体细胞印迹的要求。 1 4 第一章绪论 1 2 间氨基苯硼酸应用的研究进展 1 2 1 引言 间氨基苯硼酸( m a m i n o p h e n y l b o r o n i ca c i d ，a p b a ) 最为广泛的用途是作为亲 和树脂的接枝材料，在一定的p h 值条件下，与含有顺式邻位多羟基的物质，如 糖以及糖基化蛋白等形成特异性结合，将这种相互作用引入到各种传感器表面， 造成体系的相对荧光强度、导电性质等变化，从而对目标物进行定性或定量研 究，并且已经成为一门较为成熟的技术。这种亲和树脂作为测试糖尿病人血糖 含量的试剂盒被广泛地采用，其效果理想。由于a p b a 的苯环上同时含有氨基 和硼酸基两种较为活泼的基团，可以作为反应中间体发生许多化学反应，如电 自聚合，或与羧基、卤素以及含有环氧基团的物质反应等，为a p b a 在许多方 面开展研究奠定了良好的基础。 近年来，蛋白质组学研究广泛开展，迫切需要一种行之有效的分离、纯化 生物体系蛋白质的方法。a p b a 作为一种新型的水溶性较好的功能单体，在印迹 生物大分子方面已经有了一些应用2 8 3 21 。其中有些结果是借鉴了a p b a 与顺式 邻羟基物质作用的经验，用所合成的聚合物分离糖蛋白；也有些工作是将a p b a 作为一种普通的功能单体进行分子印迹的研究1 9 2 7 1 ，但是至今对a p b a 与模板 分子间的相互作用方式并没有清楚的阐述。 1 2 2 反应机理 1 2 2 1 分离顺式邻羟基化合物的机理 结合反应机理 硼酸基团作为一种l e w i s 酸，不能直接游离出氢离子，而是首先要在一定p h 1 5 第一章绪论 条件下水合，再释放出氢离子形成硼酸阴离子，这样硼酸基团就从三角形平面 结构转变为更稳定的四面体结构。它在水中表现出来的弱酸性，并不是硼酸基 团本身电离出h + 所引起的，而是0 h 一离子中氧的孤对电子填入b 原子中的p 空轨 道，加合生成i 卜b ( o h ) 3 一。反应式如图1 8 【2 8 ，3 3 3 4 。 艮2 。瓣惜b 搿于 o h 。 协跗+ 肆一 r = n h 2 图1 8 硼酸阴离子的形成 1 e l+ 2 h 2 0 j 硼酸基团与顺式邻羟基化合物络合反应的机理为：水溶液中，一定p h 条件 下，硼酸基团首先水合，转化为r - b ( o h ) 3 一，释放出h + ；然后再与多羟基化合物 反应形成1 ：1 络合物，并且还可以进一步反应形成1 ：2 络合物。 洗脱反应机理 由于上述反应均可逆，调节体系p h 值，反应可向逆方向进行，r b ( o h ) 3 一 与不带电荷的r - b ( o h ) 2 可以相互转化，这样被吸附的顺式邻羟基化合物也可从 吸附材料上洗脱下来。 1 2 2 2 作为功能单体合成m i p 的反应机理 如表1 1 所示，本论文对于以a p b a 为功能单体制备生物大分子印迹聚合物 1 6 q ， t h -_l 第一章绪论 i i i i 宣宣iit l i i i 研究的报道进行了列表总结2 0 2 7 1 。以往文章对于a p b a 与模板分子之间的作用 机理没有做过明确详细的阐述，本论文进行了这方面的工作，具体内容将在后 面的实验部分进行介绍。另外，利用a p b a 易于与顺式邻羟基化合物形成可逆共 价键的性质，用相对较强的可逆共价键取代相对较弱的分子间作用力，可洗脱 m i p 上结合的目标物分子，从而达到分离、富集的目的。 1 2 3 合成 1 2 3 1 间氨基苯硼酸接枝亲和层析树脂的方法 周慧将间氨基苯硼酸接枝得到氨基聚苯乙烯球表面，将其作为色谱固定相， 对洗脱条件、柱径长比、流速和洗脱温度进行了优化，静态络合果糖2 2 4m g g 。 载体装柱后可连续进样，自动化收集3 5 1 。经推测的接枝聚合物( 苯硼酸聚苯乙烯) 可能的结构如图1 9 。 o h ， o b h n n h 2 图1 9 聚合物不恿图 1 2 3 2 以间氨基苯硼酸为功能单体合成分子印迹聚合物的方法 将a t b a 与模板分子作用后，加入过氧化物引发聚合反应，形成所需的分子 印迹聚合物。根据所用载体的形式不同，又有以下几种类型： 以二氧化硅为载体 w a n g 等在功能化的玻璃微珠载体上进行了以牛血清白蛋白为模板分子的蛋 白质印迹研究【2 4 1 。r i c k 等以玻璃板为载体，在其表面合成了a p b a 为功能单体 的m i p ，用来印迹溶菌酶和细胞色素c 【2 5 1 。b o n i n i 等在功能化的二氧化硅球形载 1 7 第一章绪论 体上，以a p b a 为功能单体制备了以人血清白蛋白为模板蛋白的m i p 来进行识别 蛋白质的研剜2 6 1 。 以聚苯乙烯为载体 b o s s i 等用聚苯乙烯材料的酶标板作为载体，在上面合成m i p ，用于识别蛋 白质一微过氧化物酶、辣根过氧化物酶、乳过氧化物酶、血红蛋白等2 2 1 。 c m m i z z o 等用苯乙烯、二乙烯基苯以及含有卤代烷基的苯乙烯微乳液聚合成 表面有卤代烷基的纳米粒子，a p b a 与粒子表面的卤素发生消去反应，将a p b a 接枝在粒子的表面，利用其上的硼酸基来识别目标物3 6 1 。合成路线如1 1 0 所示。 v 8 c i o ，w m i c r o e r n u s i o n p o l y m e n s a t i o n i ) 一： n l - b ( o h ) z n l - c h z x o 帅l p o s t f u n c l i o n a l i s a t i o n ( i i ) 图1 1 0 修饰硼酸基团的纳米球3 6 1 ( i ) o l 发剂：安息香双甲醚( d m