小鼠骨髓染色体制备及观察ppt课件.ppt

实验三小白鼠骨髓染色体制备及观察,1、实验目的与要求掌握动物骨髓细胞染色体制备技术学会动物细胞的滴片方法观察小白鼠染色体的形态特征和染色体数目,1,2、实验原理,小鼠骨髓细胞秋水仙素可破坏骨髓细胞分裂过程中纺锤体的形成，把分裂细胞阻截在中期。通过对小鼠骨髓细胞的低渗、固定、滴片、染色等处理，可观察到小鼠染色体。这种骨髓染色体制片方法简单，取材容易，不需无菌条件，方便易行。,2,3、实验材料,实验动物健康小鼠(Musmusculus2n=40)，体重约1820g，雌雄不限。试剂甲醇、冰乙酸、石炭酸品红、秋水仙素、KCl、生理盐水,3,3、实验材料,实验器材恒温培养箱、普通离心机、显微镜、分析天平、离心管(510mL)、吸管注射器(5mL)、100mL烧杯、载玻片（冰片）,4,3、实验材料,溶液配制：(1)0.01秋水仙素：称10mg秋水仙素，溶于100mL生理盐水中。(2)低渗溶液：称5.59克KCl溶于1,000mL蒸馏水中，其浓度为0.075M。2%柠檬酸钠溶液：称2.28克柠檬酸钠溶于100ml蒸馏水中。Giemsa溶液,5,4、实验方法,主要实验步骤秋水仙素注射解剖小鼠离心低渗固定制备细胞悬浮液滴片空气干燥染色水洗显微镜观察结果,6,方法与步骤,取材前34h，向腹腔内注射秋水仙素。注射浓度随动物种类不同而异。秋水仙素的主要作用是使分裂细胞阻断在有丝分裂中期，增加中期分裂相的比例。,7,腹腔内注射秋水仙素34小时后，断头处死小鼠。,8,取出小鼠的后肢骨，注意不要将股骨剪断，否则容易造成骨髓细胞的流失。,9,滴加适量生理盐水进行冲洗，并仔细地将皮肤、肌肉等组织清除干净。,10,加入适量低渗液，用剪刀将骨充分剪碎，并用吸管吹打，使骨髓细胞全部释放出来。,亦可用注射器抽取柠檬酸铵溶液冲洗骨髓，效果佳,11,将获得的液体收集到离心管中，离心后去上清液，加低渗液至8ml左右，室温下静置2030分钟，进行低渗。低渗结束后，加入1ml左右的Carnoys固定液进行预固定，轻轻混匀后，离心。,12,1000转/分，离心10分钟，弃上清，加入固定液，混匀后，室温放置25分钟，再次离心去上清，重复固定一次，离心后，向沉淀中加入1ml固定液，将细胞重悬。,13,预冷的玻片,14,滴片后，将片子晾干，滴加适量Giemsa染液染色1015分钟，弃去染液，水洗，镜检。,15,实验结果,苯酚品红染色效果,16,结果显示,在显微镜寻找分散良好的中期分裂相。小白鼠染色体一般呈“U”形，都为近端着丝粒染色体。染色体数2n=40。图示为吉姆萨染色效果,17,5、实验结果与分析讨论,绘制小鼠骨髓细胞染色体图统计小鼠染色体数目如果有条件时，要进行显微摄影，然后进行组型分析,18,使用柠檬酸钠的原因：在临床上采取新鲜血液时,需要加入一些消毒过的柠檬酸钠,就能起到防止血液凝固的作用,所以柠檬酸钠被称为抗凝血剂。枸橼酸根与血中钙离子形成难解离的络合物，钙离子是凝血过程中所需的物质之一，血液中钙离子减少，而使血液凝固受阻。,19,低渗的作用：低渗液是指渗透压和离子强度均低于正常细胞生理条件的溶液，例如水、低渗的柠檬酸钠或氯化钠、甘油磷酸钾（0.65M）、氯化钾（0.075M）等。低渗效果取决于低渗液的化学组成、低渗的温度和处理时间。低渗处理是凭借反渗透作用使细胞膨胀染色体铺展，同时可使粘附于染色体的核仁物质散开，以便能在一个平面上观察所有染色体形态。实验室中一般选用0.075MKCl为低渗液（具体情况取决于实际操作），其优点有：染色体轮廓清楚，可染色性强，染色时间短，用于显带染色时能充分显示带型特点。低渗处理为37，1525分钟，以预实验条件为准。,20,思考题,1KCl溶液低渗处理与滴片过程在染色体制片中有何