（蔬菜学专业论文）芥菜（Brassica+juncea+Coss）离体培养及形态发生机制的初步研究.pdf

芥菜( 召朋s 裘嘲爵霸瓣养及形态 蔬菜学专业硕士研究生：李彤 指导教师：宋明教授 王志敏副教授 摘要 本实验以芥菜的三个品种( 圆大头菜、永胜大儿菜、容渝香芥菜) 为材料，在以子叶和 胚轴为外植体建立离体培养体系的基础上，对芥菜组织器官发生过程中各发育阶段的生理生 化指标变化及可溶性蛋白质含量组分和过氧化物酶同工酶进行了研究，同时进行了组织细胞 学观察。实验结果如下： l 芥菜离体培养体系的建立 不同品种的芥菜及培养基激素配比都会影响芥菜离体培养体系的建立。实验结果表明： 芥菜种子消毒方法以采用5 n a c l o 溶液滴加2 滴1 0 0 吐温2 0 ，消毒1 5 分钟最佳；种子无 菌萌发培养基为：l 2 m s + 8 0 9 l 卡拉胶( p h 5 8 6 0 ) ；最适愈伤组织诱导和分化的培养基为： m s + 3 0 9 兀蔗糖+ 8 o g l 卡拉胶+ o 1 m g 兀n a a + 3 o m g l6 一b a ，当以子时为外植体时，圆大头 菜、永胜大儿菜、容渝香芥菜的分化率均为最高，分别为：7 2 、8 4 、7 6 ；当以胚轴为外 植体时上述三个品种的分化率分别为7 0 、7 2 、7 0 ；最适生根培养基为m s + 3 0 9 l 蔗糖 + 8 0 9 l 卡拉胶+ o 1 m g l n a a ，根系生长状态良好，生根率达到1 0 0 。 2 可溶性蛋白质含量及组分的研究 具形态建成的愈伤组织中可溶性蛋白质平均含量为2 0 8 8 m g 佗f w ，远远高于不具形态 建成的愈伤组织中的平均含量1 2 0 8 m g f w ，低水平的蛋白质表达量可能是使愈伤组织丧 失分化能力，转变为不具形态建成的愈伤组织的一个重要原因。s d s p a g e 电泳结果显示，在 具形态建成的愈伤组织增殖与分化过程中，有6 5k d a 、2 9k d a 、2 4k d a 、1 6k d a 的特异性 蛋白质组分出现，其中1 6k d a 蛋白在不定芽分化后不再表达，推测是这4 种特异性蛋白推动 了愈伤组织的形态建成。在不具形态建成的愈伤组织中有5 0 l a 和3 0 k d a 的蛋白质组分表达， i 两南大学硕+ 学何论文 可把这两种蛋白组分看作是芥菜子叶离体培养过程中不具形态建成的愈伤组织中的特异性蛋 白。 3 过氧化物同工酶酶谱的研究 通过过氧化物酶同工酶电泳，得到以下结果：具形态建成的愈伤组织的酶谱带比不具形 态建成的愈伤组织的酶谱带颜色相对要浓，同时多出了c 带和g 带，其中g 带是具形态建成 的愈伤组织所特有的，c 带是在不定芽分化后出现的，因此c 带可作为不定芽分化的生化标 记，d 带在愈伤组织诱导期出现的，可作为脱分化开始的标志。 4 生理生化变化的研究 两种愈伤组织随着培养时间的增加生理指标的差异越来越显著，具形态建成的愈伤组织 比不具形态建成的愈伤组织内部代谢增强。外植体培养的第8 天开始，具形态建成的愈伤组 织中抗氧化酶( p o d 、s o d 、c a t ) 活性、核酸( r n a 、d n a ) 含量均高于不具形态建成的 愈伤组织，呈明显的上升趋势，而可溶性糖和淀粉作为细胞中可利用的能源物质，在这个时 期含量下降；不具形态建成的愈伤组织中以上各指标的变化则比较平缓。 5 组织细胞学观察 利用石蜡切片技术对培养材料进行组织细胞学观察，结果表明，具形态建成的愈伤组织 其表面和内部会逐渐形成两个分化中心，即分生细胞团和分生组织结节，前者将发育成为芽 原基，后者将发育成为根原基。 关键词：芥菜离体培养形态发生 英文摘要 c u l m r e 砌v z f 加ofm u s t a r d 旧阳s i s - 初础托c e 口 c o s s ) a n dp r i m a r ys t l l d i e so n 。i t sm o 币h o g e n s i s m e c h a n is m s c a n d i d a t e ：“t o n g s u p e r v i s o r ：p r o f e s o rs o n gm i n g a s s o c i a t ep r o f e s s o rw 缸gz h i m i n a b s t r a c t 1 1 l i sw o r ka i l i l e da t 吐圮 s t u d yo fc u l n l r i i l g 吐玳e v 撕c t i e so fm u s t a r d ( y l l 锄d a t o u c a i ， y o n g s h e n g d a e r c a i ，r o n g y l l ) 【i 蕊舀i e c a i ) ，i n gw i m 扬j l ，豇r dc u l t u r eo fc o t y l e d 0 璐孤dh y p o c o 锣l s o fr n u s 硼e s t a _ b l i s h e do nm ep l 枷陀g e l l e m t i o ns y s t e m h lt i l ep 赋e s so ft 1 1 eo 唱a n o g e n e s i s ，t 1 1 i s w o r kn l a i l l l yf o c u s e do nt 1 1 er e s e a r c ho fb i o c h e i i l i c a li n d i c a t o 璐，s o l u b l ep r o t e i n s 柚dp e r o x i d 乏峪e i s o e n 驷e ，a n d 如n l l e rr e s e a r c ho n l em o 巾h o g e i l e t i cc a l l u sh 笛b e d o n ea t 廿l ec y t o h i s t o l o g y l e v e l - t h en l a i l lr e s u l t sa r e 销f o l l o w s ： lt h ee s 乞出l i s h r m n to f 执订f r dc u l t u r es y s t e mi i lm u s t a r d t h er e s u l ts h o w e dt l l a td i f r e r e n t 谢e t i e s ，h o 衄o n ec o n c e n 删i o np l a y c di m p o r t a n tr 0 1 e si i l 删蓝t a r do 玛锄o g e n e s i s t h e 叩t i 瑚1w a yo fs e e ds 白e r i l i z a t i o nw a s5 n a c l o 斗t w e 衄- 2 02d r o p s 矗m 1 5 n l i l l n e0 p t i i l l a lc u l t i 鹏m e d i u mf 0 rs t i 喇l i t a sp l 卸t sw 雒l 2 m s + 8 0 9 lc 猢g e e r 啪0 h 5 8 6 0 ) ；t t l ea p p m p r i a t e m e d i u m 矗d re x p l a r 如d i 艉r e n t i a t i o nw 丛m s + 3 0 9 几鲫c r o s e + 8 。0 9 几 c a r r a g e e n 时3 0 i t l g l6 - b a + o 1 m g ln a a ，w h 胁吐l ee x p l 柚t sw 盱ec o t ) r l e d o n s ，m eh i g h e s t d i 岱酹e n t i a t i o nr a t eo fm r e ev 撕e t i e s ( y u a n d a t o u c a i ，y r o n g s h e n g 妇a i ，r 0 n g ”i a n 西i e c a i ) w e r e 7 2 ，8 4 ，7 6 ；a n dw h e l ln l ee x p l a n t sw e r eh y p o c o t y l s ，t h eh i 曲e s td i 鼢e n t i a t i o nn t ew e r e7 册矗， 7 2 ，7 0 t h eb e s ti n e d i u mf o rr o o t i n gw 蕊m s + 3 0 9 ls u c r o s e + 8 0 9 lc a m g e e n a i l + 0 1 m g l n a a ，w i t l l9 0 0 d 啪ts t a t u sa i l d1 0 0 r o o t a g em t e 2n es t i l d i e so nc o r r 珥1 0 n e n t s 柚dc o n t e n t s0 ft l l es o l u b l ep r o t e i n s t h ea v e f a g ec o n t i e n to fs o l u b l ep r o t e i 璐i l lm o 印h o g e n e t i cc a l l u sw a s2 0 8 8m g 。f w i tw a s l l i g h e rm 柚m ec o n t e n ti l ln o n m o r p h o g e n e t i cc a l l u s ，w h i c hw a s12 0 8m g 儋f w ：t h e r e f o r e ，t h e l o w e r _ l e v e lo ft l ep r o t e i n sm i g h tb eo n eo ft l l ei i n p o r t a n tr e 笛o nt l l a tl e tm o i p h o g e n e t i cc a l l u sl o s t t l l ec a p a c i t ) ，o fr e d i 岱：r 锄t i a t i o na n dt i l m e di n t on o n m o r p h o g e n e t i cc a l l u s t h er e s u l t so fs d s p a g e e l e c 廿o p h o r e s i ss h o w e dm a td i f f e r e n ts p e c i f i cp r o t e i 粥f o u n ds e p a r a t e l yi l ld i 肫r e n ts t a g e s t h e r e i i i 两南大学硕十学位论文 w e r ef o l l rk i n d so fp r o t e i i ! 晤( 6 5 k d a ，2 9 k d a ，2 4 k d a ，16 k d a ) e x p r e s s e dd u r i r 喀c a l l 惦d i 髋r e m i a t i o n a n dt 1 1 ep r o t e i nw e i g h tl6 k d ad i d i l te x p 他豁a 缸rc a l l u sd i 妇f e r e n t i a t e d t h e s ef o u rl d n d so fp r o t e i l l s i i l i 曲tb e 托l a t e dw i mn l em o 巾h o c h o r e s i so fo 玛a 1 1 s 1 kp r o t e i 璐、e i g h t5 0 k d aa n d3 0 k d aw e r e d e t e c t e di i ln 一i i 唧h o g 印e t i cc a l l u s 觚dn o ti i lm o 叩h o g e n e t i cc a l l u s s o ，m e s et ok i t 池o f p r o t e i n sc a nb eu s e d 豁i 瑚f k e r sf o rn o n - m 唧h o g e n e t i cc a l l u sd u 血gm u s t a r d 栩v 砌叼c u l t l l r e 3t h es t l l d i e so np e r o x i d a s ei s o z y m e t h ep e r o x i d a s ei s o z y t m 锄a l y 辩w 勰蠲f o i l o w s ：t l l en l i c h i e s so fi s o z ) r r 鹏b 觚d so ft h e m o 叩h o g e n e t i cc a l l u sw 弱 l i t t l e s n o n g c f t l l 粕吐l o s eo ft l l e n o n - m 唧h o g e r 圮t i cc a l l u s t h e m o r p h o g e n e t i cc a l l u sh a dca n dgb a n d st h a tt 1 1 en o n 锄。甲h o g e n e t i cc a l l u sd i d l l th a v e cb a n d a p p e a r e da r e rc a l l u sd i 艉r e m i a t i o n ，s oi tc o u l db e 惦e d 舔ab i o c h e r i l i c a lm a r k e rf o rc a l l u s d i 脏r e n t i a t i o n db a i l da p p e a r e dd 谢n gc a l l u si n d u c t i o n ，l i s1 1 1 i g h tb eas i 印矗盯吐圮b e g i l l i n go f e x p l 锄t sd e d i 妇f e r e n t i a t i o n 4s t i l d i e s0 np h y s i o l o 西c a l 觚db i o c h e i n i c a li n d e x e s t 1 1 ep h y s i o l o 舀c a l 锄d b i o c h e 俩c a li i l d e x e si l l 俩ol 【i i l d so fc a l l u sa r eo b v i o u s l yd i 触d 谢n g t h ec u l t i 鹏p r o c e s s t h ep h y s i o l o 舀c a l 锄db i o c h e 耐c a li n d e x e so fn l ei n o r p h o g e n e t i cc a l l t i sh a d 晰d e rc h 姐g e 瑚g et l 瑚t 1 1 0 s eo fm e n o n - m 0 印h o g e n e t i cc a l l u s w h e nm e c a l l 惦h a db e e nc u l t i v a t e d 矗竹8d a y s ，l ec o n t e r i t so f 肌c l e i ca c i d ( d l n 八r n a ) ，t l l ea n t i o x i d e se n z y n 圮( p o d ，s o d ，c 卸 a c t i v i t i e so fm o 印h o g e n e t i cc a l l l l sw e r eh i 曲e r 廿l 孤n l a to fn m o 印h o g e l l e t i cc a l h 塔，a n dn 姐d so f t l l o s ei l l d e x e sw e r e0 nt l l er i s e a tt l l es 锄t i i n e ，t l l ec o n t e n t so fs o l u b l es u g a 埽a n ds t a r c hw 饿 d e c l i n e d w h i l e 圯c h a j l g e so fp h y s i o l o g i c a l 孤db i o c h e i i l i c a “n d e x e so fn o n - m o 叩h o g e n e t i cc a l l u s c h a i l g e dt i l i l d l y - 5h i s t o c y t o l o 百c a l 锄a l y s i s b ym eo b s e r v a t i o no f p 撒伍nw a xs l i c e ，t h em o 印h o g e r 圮t i cc e l l so f e x t e r i o r 孤di i l t c d o rg r a d u a l l y f o m e dt w ol 【i n d so fm e d s t e m a t i cc e n 臼e s ，w m c hw e r e 廿l ee m b r y o i l i cm e r i s t e l i l a t i cp a c k e dc e l l s 觚d n l em 硎s t e m a t i ct l l b e f c l e s t h e 蠡黝e rw o u l dd e v e l o pi n t op d m o r d i a lb u d s ，锄d 吐l el a 船rw o u l d d e v e l 叩i i l t op r i m o r d i a lr o o t s k e yw o r d s ：b m 姆向弘玎c 棚c o s s ；c u l t u r e 砌诎抛；m o r p h o g e n e s i s 两南大学硕十学何论文 缩略词表 独创性声明 学位论文题目：莶苤( 垦塑墅堑也丝丝g q 墨墨：2 离签壁羞区型奎发生扭 剑鲍塑生盟究 本人提交的学位论文是在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。论文中引用他人已经发表或出版过的研究成果，文中已加了 标注。 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解西南大学有关保留、使用学位论文的规 定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅。本人授权西南大学研究生部可以将学位论文的 全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫 描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书，本论文：叻：保密， 口保密期限至年月止) 。 学位论文作者签名： 嘲 签字日期：为孵年月1 日 导师签名： a 寺卜n 签字日期：) - 一r 年5月 日 第1 章文献综述 第l 章文献综述 1 1 植物离体培养概述 2 0 世纪初，在植物细胞全能性理论的指导下，特别是植物生长调节剂的应用，使植物离 体培养材料的生长和发育得以有效的调控，也促进了植物组织培养研究领域的形成和发剧。 植物组织培养( p l 锄tt i s s u ec u l t l l r e ) 是以植物生理学为基础发展起来的一项技术，它是指在无 菌和人工控制的环境条件下，利用适当的培养基，对离体的植物器官( 根、茎、叶、花、果 实等) 组织( 形成层、表皮、皮层、胚乳、花药组织等) 、细胞( 体细胞和生殖细胞) 及原生 质体进行培养，使其再生细胞或完整植株的技术，由于培养的植物材料已脱离了母体，又称 为植物离体培养0 l a l l tc u l t i l r e 加诩忉) 2 5 1 。 德国著名植物学家哈伯兰特( g h a b e d 锄m ) 根据细胞学说提出高等植物的器官和组织可 以不断分割，直至单个细胞，这种单个细胞是具有潜在全能性的功能单位，即植物细胞具有 全能性，并首次做了离体细胞在人工培养基上进行培养的尝试【l 】。经过科学家们几十年的研究， 现已完全证实了植物细胞的全能性，即植物的每个生活细胞都具有该植物的全部遗传信息， 在一定的培养条件下具有发育成完整植株的潜在能力。2 0 世纪3 0 年代末至4 0 年代初美国的 怀特( 、h i t e ) 【6 】等培养离体番茄根尖，建立了可以继代培养的第一个无性系，并首次成功的 设计了植物组织培养的综合培养基，确定了植物组织培养的基本方法【5 明。从5 0 年代开始， s k o o g 、s t e w a r d 及其他的一些学者设计了许多适合各种植物组织培养的有效配方，如m s 、b 5 、 n 6 、s h 、w h i t e 等，使植物的外植体在适宜培养基上形成脱分化的细胞团即愈伤组织。各种 植物激素的作用不同，即便是同种激素在相同材料中的表现也有很大差异。激素的组合及浓 度在很大程度上影响着植株的再生频率。、n i e n 妯【e “1 9 9 6 ) 【叼等证明植物生长调节剂在诱导 苗再生方面的作用比植物激素本身更有效，生理活性更强。 一般来说，器官分化对激素的需要是必不可少的，早在1 9 5 1 年，s k o o g 和m i l l e r 就提出 了激素平衡学说，即培养基中适当的生长素和细胞分裂素的比例可以促进芽的分化【9 】。所以对 激素的研究也是人们进行组织培养工作时关注的焦点之一【1 0 1 1 ，s k o o g 和m i l l e r 、s 骶e t 、崔 潋等人证实了改变培养基上的植物生长调节剂( 细胞分裂素和生长素) 的相对浓度可以使烟 草愈伤组织分化出苗和根，并提出了激动素和生长素的比例决定根芽分化的理论9 2 _ 引。此 后，许多植物生理学家研究了激素比例与器官分化的关系，大量的实践结果表明，这种理论 在组织培养中具有普遍意义，特别是在双子叶植物中。不同的外植体对激素种类、浓度及配 比反应不同，器官发生过程中，激素之间的相互作用很复杂，细胞分裂素有利于芽的分化和 增殖【1 4 17 】，生长素有利于根的分化，二者同时使用，比值高时产生芽，比值适中时，可能维 持原组织生长而不分化。但也有一些植物对生长素和细胞分裂素的反应比较特殊，这与植物 本身的遗传性有密切关系【1 8 _ 9 1 。 众所周知，植物体内的各种组织、器官、细胞之间是相互作用、相互影响、相互制约的， 两南大学硕+ 学位论文 因此，用整体植株来探讨细胞分化等一系列重大理论问题的机制和生理生化过程就比较凼难， 是一个极其复杂的问题。此外，细胞突变筛选和遗传转化以及细胞杂交等也无法进行。为此 人们就会想办法来减少这种复杂性，提供可行的研究技术，建立相应的实验体系。而植物组 织培养正是现代植物生物技术的平台，它为遗传学、分子生物学、细胞生物学、生物工程等 提供了一种快速有效的方法。由于植物细胞所具有的潜在全能性，使得人们可以通过单个细 胞、组织切块或器官等的培养而获得植株再生。这一技术体系的建立，不仅减少了植物体内 相互制约的影响，而且还可以在人工控制的条件下，按预期的目标设置一些处理，研究细胞 分化和发育的规律，器官分化和形态建成在植物体中是如何控制的，内外条件的影响和发育 过程中的分子基础，细胞转化与突变体筛选等等f 5 2 0 2 3 1 。 1 2 植物组织培养的应用 植物组织培养发展到今天，已经不仅仅局限于最初的组织培养，而是广泛应用于农业、 林业、工业、医药业等多种行业，已经渗透到植物生理学、病理学、药学、遗传学、育种学 以及生物化学等各个研究领域，成为生物学科中的重要研究技术和手段之一【2 4 2 酊。 1 2 1 离体快速繁殖的应用 植物组织培养应用于植物的离体快速繁殖，是目前应用最多、最广泛和最有成效的一种 技术。组织培养不受地区、气候的影响，比常规繁殖方法快得多，为快速获得苗木提供一条 经济有效的途径。 1 2 2 脱毒及快速繁殖技术的应用 植物生长在自然环境下，十分容易受到病毒的感染。植物感染病毒后，虽然未必死亡， 但却会引起产量下降，品质变劣。采用无性繁殖的植物在繁殖过程中病毒可通过营养体进行 传递，逐代累积，使病毒的危害更为严重。为解决无性繁殖植物病毒的危害，2 0 世纪8 0 年代， 人们就广泛采用了茎尖脱毒的方法。茎尖通常没有或只有很少病毒颗粒，以1 0 0 1 0 0 0 岬大 小的茎尖为外植体，在无菌条件下培养可获得脱毒植株。脱毒植株生长势强，抗逆性强，产 量高，能够保持品种的优良特性。 1 2 3 组织培养在植物育种方面的应用 利用组织培养，可以生产大量的优良无性系；细胞融合可打破种属间的界限，克服远缘 + 杂交不亲和性障碍，在植物新品种的培育和种性的改良中有着巨大的潜力；还可获得单倍体、 三倍体及其它多倍体、非整倍体。 1 2 4 体细胞突变体筛选的应用 从2 0 世纪6 0 年代开始，植物组织与细胞培养迅速发展，已能使许许多多的植物组织、 2 第1 章文献综述 细胞或原生质体，经过离体培养再生成完整植株。在此技术的基础上，科学工作者们通过在 培养基中添加某种选择剂或施加某种胁迫物质( 因培养细胞处在不断的分生状态，较易受培 养条件和外加压力的影响而产生诱变) ，将组织和细胞培养物中特定的( 尤其是对人们有用的) 细胞突变体筛选出来。 1 2 5 原生质体培养和细胞杂交的应用 原生质体是遗传操作的理想受体系统，是细胞杂交的理想材料。至今世界各国已从1 0 0 余种植物的原生质体再生成完整的植株。二十多种植物的原生质体培养在我国首先获得成功。 其中，玉米( z 缸m 醒声l ) 、小麦( 7 m 函朋口劣打研) 、水稻( a 垆口s 锄f l 以l ) 、谷子( 细，缸妇，f c 口) 、 野生大豆( g 咖加e 聊盯) 等原生质体再生植株均为我国首先培养成功。在玉米、水稻等许多作物 上利用原生质体进行外源基因的导入已获得成功。 植物体细胞杂交也称为原生质体融合，利用体细胞杂交技术可以实现无法自然杂交的物 种间的杂交，通过原生质体融合，可以克服有性杂交的不亲和性，而得到体细胞杂种，实现 两个远缘基因组的结合。采用这种技术可进行异核杂种和胞质杂种及雄性不育系的培育。自 1 9 7 2 年获得烟草( r f c d 砌刀口6 册历口m 缸刀a ) 第一个种间体细胞杂种以来，已在许多种植物上进行 了试验，大量的抗性胞质杂种在烟草、马铃薯肠肛聊lm 6 惴聊1 ) 、萝卜僻q 砷册螂阳咖淞l ) 、 番茄伍垆d p e 坶f c d 刀缈删f i 明m 研m i l l ) 等作物上已有报道。应用该技术已培育出了一些新的植物， 如日本育成的“千宝菜”、“甜南瓜”等。 1 2 6 种质资源保存上的应用 自n a g 等( 1 9 7 3 ) 2 9 1 首次成功的利用超低温保存胡萝卜c 阮狂c 淞阳绍懈r s 口撂侬d c ) 悬浮培 养细胞以来，已对百余种植物材料进行了超低温保存的研究，并开发了快速冷冻法、缓慢降 温法、分步降温法、干燥冷冻法、玻璃化冷冻法等多种降温冷冻保存法。 1 2 7 人工种子 植物组织培养过程中能够产生与正常合子胚相似的结构，称为胚状体( e m b r y o i d ) ，将其 包裹在含有养分和具有保护功能的包膜中，并在适宜条件下能够发芽出苗的颗粒体称为植物 人工种子( p l a n t 枷f i c i a ls e e d s ) 。人工种子是在快速繁殖的基础上发展，它在推广良种无性系 品种、固定杂种优势、脱毒、简化育种程序等方面将起推动作用。 迄今为止，世界范围内已进行人工种子实验的物种有胡萝卜( 加“伽c 口r d 缸v 口r 硼f 加 d c ) 、芹菜m mg r 口坩d ，i 明s 阳r 幽，c pd c ) 、苜蓿 r p c 如q g d 跚f f l ) 、黄连( c 叩出c j i i 加阴s 捃 m 刀曲) 、玉米( z 阳，l q 声l ) 、刺五加m s 明腑傩“s ( r u p r e tm a ) 【i m ) z 地删小水稻( c 垆口5 口f 】砌 l ) 、莴苣口c m c 口s 口f f l - ) 、甘薯【i 乒，d 肌d 阳施细细5 ( l ) l a m 】、柑桔( d 们岱l ) 、橡胶树饵咖叩 6 ，船f 矗明s 如m u e l l 一a 唱) 、小麦( 晰比“所口f f c “ml ) 、大麦，出姗l 忱自妒陀l ) 、油菜 3 两南大学硕十学位论文 州身时f 胁l ) 、百合0 讹肌蹰力、桑树( ? l 如朋s 口加l ) 、杨树僻叩“m sf i 删绷f 口c ) 等3 0 多 种植物【3 0 3 3 1 。 1 2 8 次生代谢产物生产 利用组织或细胞的大规模培养，可以生产人类需要的一些天然有机化合物，如蛋 白质、脂肪、糖类、药物、香料、生物碱及其他活性化合物。尤其对于天然植物蕴藏 少、含量低但临床效用高的成分。如紫杉醇( t a x 0 1 ) 等，利用组织培养进行大规模生 产，具有巨大的经济效益和社会效益【3 4 1 。 1 2 9 与其它学科相结合 用于遗传学、分子生物学、细胞生物学、组织学、胚胎学、基因工程和生物工程等学科 的研究。利用组织和细胞培养技术为这些领域提供了一种高效快速的方法，这是基因重组、 遗传转化，揭示生命奥秘必不可缺的最基本的手段之一。 1 2 1 0 用于其它未知科学的研究 现代科学发展非常迅速，新发明、新发现、新创造层出不穷，利用组织培养技术也具有 许多尚未发掘的潜力。 1 3 植物组织培养过程中的形态发生 与动物细胞相比，植物细胞的一个重要特点，是它们具有很大的发育上的可逆性和可塑 性。大量事实证明，植物体成熟组织中己高度分化的细胞也保留了回复到分生组织状态的能 力。当然，细胞能够经历这一回复过程的程度是不同的，这主要取决于细胞所达到的发育上 的、生理上的和细胞上的状态【3 5 1 。 所谓形态发生就是生物个体发育或再生过程中，机体及其器官形态结构的形成过程。在 生物学领域内己成为一门学科，它是形态学、生理学和胚胎学结合生物化学、生理物理学和 遗传学的知识和技术、专门研究形态发生中有关分化、对称、极性和相关性等现象的外界条 件因子、内在生理化学及遗传基础，从而了解其机制，以达到控制目的的一门学科。植物组 织或细胞离体培养中的形态发生有器官发生( o 唱a j l o g e n e s i s ) 和体细胞胚胎发生( s o l m t i c e m b 呵o g e n e s i s ) 这两种途径。这两种形态发生途径都是以细胞分化为基础的，它包含了组织和 器官的形成。已分化的细胞各自组成了不同的组织，一般形态和机能相同的细胞组成同一种 组织，然后再由机能相关的组织形成器官。形态发生的最后结果是形成一个发育成熟的完整 植株。 1 3 1 器官发生途径 在器官发生途径中，根据起源不同可以将器官分化为两种情况，种是直接从外植体的 4 第1 章文献综述 细胞形成器官原基，继而发育成器官：另一种是从外植体上先形成愈伤组织，再在愈伤组织 上产生不同的器官原基【3 6 1 。通过器官发生形成再生植株的方式大体上有三种情况；第一种情 况是在芽形成之后，在芽的基部长出根而形成完整植株，这是组织培养中较为普通的一种植 株再生方式。第二种情况是先分化出根，再在根上产生不定芽而形成完整植株。一般地说， 培养物中先形成根则往往抑制芽的形成。但是也有例外，如在颠茄的悬浮培养中，先形成细 胞团，在细胞团上产生根原基突起，当细胞团的细胞生长与扩大后，可明显见到许多像钉状 根即分散地附着在细胞团上。这些钉状根可以从细胞团上脱落或细胞团解体后，钉状根即分 散在液体培养基中，并在根的非根尖的一端分化出不定芽，并进一步发育形成完整幼苗。第 三种情况是在愈伤组织的不同部位形成芽和根，再通过维管组织联系形成完整的植株。这种 方式发生在多种植物组织培养中，它们的芽和根的分化可以是同时的，也可以略有先后。芽 和根分化后一般是随愈伤组织中己存在的管状分子继续分化维管组织。芽中的维管组织向下 分化，并推测芽与根的两种维管组织，由此相互连接，成为统一的轴状结构而形成再生植株f 3 5 3 7 3 引。 1 - 3 2 体细胞胚发生途径 2 0 世纪5 0 年代末s t e w a r d 等发现胡萝卜根细胞离体培养可通过体细胞胚胎发生形成再生 植株，体细胞胚是指在植物组织培养中起源于非合子的细胞，经过胚胎发生和胚胎发育过程 形成的胚状结构。植物体细胞胚的发生也有两种途径：直接发生途径和间接发生途径。前者 是指外植体某些部位直接诱导分化出体细胞胚，如山茶子叶、槐树子叶等：后者是指由脱分 化形成的愈伤组织再分化形成体细胞胚，如槐树子叶、棉花下胚轴切段等【3 9 1 。 在植物组织培养中，诱导体细胞胚发生和诱导器官发生相比有一些显著的特点：两极 性：在体细胞胚胎发生早期就具有胚根和胚芽两极，胚性细胞第一次分裂多为不均等分裂， 形成顶细胞和基细胞，其后由较小的顶细胞继续分裂形成多细胞原胚，而较大的基细胞进行 少数几次分裂成为胚柄部分，在形态上具有明显的极性m 4 4 1 。存在生理隔离：体细胞形成 后与母体植物或外植体的维管束系统联系较少，即出现所谓生理上隔离( p h y s i o l o 百c a li s o l a t i o n ) 现象3 乳4 4 6 1 。遗传性相对稳定：通过体细胞胚形成的再生植株的变异性小于器官发生途径 形成的再生植株，这是因为只有那些未经过畸变的细胞或变异较少的细胞才能形成体细胞胚， 实现全能性表达。 1 4 植物组织培养外植体分化过程中生理生化及组织细胞学研究 近二十年，在愈伤组织水平、单个体细胞水平、原生质体水平和体细胞杂交细胞水平上 都获得了完整的植株，充分证明了细胞的全能性，从而在各种水平上使数百种植物的细胞都 能分化成再生植株，为扩大组织培养的应用奠定了良好的基础。然而在植物组织培养过程中， 并非所有的外植体都能脱分化成为胚性愈伤组织，有些愈伤组织在分化过程上并不能表现出 5 两南大学硕十学侮论文 胚性，即不能进一步分化成苗，因此愈伤组织分化的机理还有待研究。 1 - 4 1 植物组织培养外植体分化过程中生理生化变化 植物组织培养过程中，无论是器官发生途径还是体细胞胚发生途径，都是受细胞内外多 种因子所调控的，这些因子的实质是调节特定基因的表达，其分化与发育的实质都是基因有 序表达与调控的结果。而细胞分化是植物组织培养再生植株的重要生理生化变化的主动性表 现之一，细胞内外化学物质的变化是细胞分化的物质基础，而对细胞分化过程中生理生化交 化的研究是认识其本质的重要途径。 l ，4 1 1 可溶性蛋白质的变化 随着现代分子生物学的飞速发展，人们对植物组织培养过程中器官发生途径和胚状体的 发生途径的研究已不再局限于形态学范畴，而是从分子生物学水平上来探讨其发生的机理。 其中一个重要的研究方向就是对植物组织培养过程中的特异性蛋白质的研究【5 4 7 蜘。 蛋白质是基因表达的产物，植物的形态建成是基因组按一定的时空顺序选择性表达的结 果。有关调控基因活动的研究，最早是从蛋白质水平上进行的，不同的发育分化阶段中合成 类型和数量不同的蛋白质，因此，人们曾把蛋白质作为研究发育和分化的指标。有关愈伤组 织形态发生中可溶性蛋白质含量和组分的变化已有大量的研究报道，尽管有些结果不尽相同， 但变化的趋势是相近的。首先在可溶性蛋白含量上，各种材料中胚性愈伤组织的蛋白质含量 和合成速率远高于非胚性愈伤组织，表明前者代谢活性高于后者。如水稻胚性愈伤组织中， 水溶性和盐溶性蛋白质含量远远高于非胚性愈伤组织。胚性愈伤组织即使继代1 0 次后，其含 量虽有所f 降，但仍高于菲胚性愈伤组织。醇溶性和碱溶性蛋白在继代中表现稳定，而稍低 于非胚性愈伤组织，但从总的可溶性蛋白含量分析看，仍然是前者高于后者( 表1 ) f 鲥】。 表l 水稻不同愈伤组织( 干重) 可溶性蛋白含量( “咖g ) t a b l e1 s o l u b l ep r o t e i i lc o n t e n t si nd i 矗e r e n tk i n d so fc a l l u s( p m g ) 而胚性愈伤组织发育过程中可溶性蛋白质的含量也是在不断的变化着的，刘本叶等 ( 1 9 9 5 ) 1 5 2 在对非洲紫罗兰叶片脱分化的研究中发现，在培养的第一天内，发生脱分化的叶 片中的蛋白质含量明显下降，推测可能是已分化的细胞在脱分化之前，要分解掉原来的蛋白 质，同时合成新的蛋白质，蛋白质含量降低，但其性质发生了改变，使细胞获得了分裂能力， 第1 章文献综述 因此，已分化的外植体中的蛋白质含量迅速降低也许是脱分化的标志。邹建( 2 0 0 2 ) 【3 9 】的研 究表明，具形态建成的愈伤组织从培养的第3 天开始，可溶性蛋白质含量会有显著增加，到 第9 天时到达高峰，愈伤组织在分化过程中进行了剧烈的代谢反应，以合成更多的代谢产物 来满足不定芽发生和生长的需要，而不具形态建成的愈伤组织其可溶性蛋白含量则变化较小， 各时期的蛋白质含量均低于前者。一般认为胚性愈伤组织比非胚性愈伤组织的蛋白质合成快， 胚状体发育过程中蛋白质的合成动态大致成s 形。苜蓿、胡萝卜、红豆草等的蛋白质合成动 态均成s 形【5 3 ”l 。 植物体细胞胚胎发生与发育过程中，胚性细胞的起始分化是关键。在愈伤组织增殖阶段， 胚胎发生与发育的遗传信息存储在每个细胞中，当其受到适宜的外界因子( 如激素) 调节后， 即转化为早期胚性细胞。外界因子促进这些信息按一定的时空顺序选择性的表达，最终发育 成完整的植株。因此，胚性细胞中特异性蛋白的表达与调控机理成为研究的重点。有研究表 明，冷杉子叶在生芽培养基上培养两天，低分子量蛋白质合成增加，4 天达最高水平。这种低 分子量蛋白质的合成受诱导愈伤组织培养基的抑制，外植体在生芽培养基培养两天，再转移 到愈伤组织诱导培养基上，低分子量蛋白质的合成受到抑制，形态上表面为芽的形成受阻。 这两种培养基的不同点在于n 从含量的差异。这不仅反映了n a a 在不同浓度下作用性质的 差异，而且也进一步证实了激素的作用涉及到蛋白质的合成。实验表明，这些低分子量蛋白 质的合成可能和不定芽形成的早期阶段有关，而且是不可逆过程。在生芽培养基上培养两天 的外植体，紧接着转移到诱导愈伤组织培养基上培养，即使再转回到生芽培养上培养，愈伤 组织也失去了再生不定芽的能力【1 1 1 。2 0 世纪8 0 年代，在对胡萝卜、水稻、玉米和豌豆等植物 的体细胞胚发生的研究中，也都发现有特异性蛋白质形成，尽管结果千差万别，但所有这结 材料的胚性愈伤组织中都存在4 5 5 5 k d a 的胚胎发生特异性蛋白质的合成【5 卜6 1 】。随后，王亚 馥( 1 9 9 3 ) 1 6 2 】在小麦体细胞胚发生早期检测到4 6 k d a 的胚胎相关多肽，陈雄( 1 9 9 5 ) 在枸杞 体细胞胚发生早期检测到3 5 k d a 和4 4 k d a 的胚胎特异性蛋白，朱长甫( 1 9 9 7 ) 【6 3 】研究胡萝卜 体细胞胚发生时发现在胚性细胞中具有6 3 k d a 、6 5 k d a 和4 5 k d a 的蛋白组分，并认为这些胚 性细胞蛋白对于具有潜在胚状体形成能力的胚性细胞的获得起重要作用。在苜蓿体细胞胚发 生中，单向与双向电泳的结果表明，有5 0 i ( d a 蛋白质表达，并证明该蛋白是一种膜相关蛋白， 胚性细胞的m i 矾a 体外翻译产物中也含有5 0 k d a 带，而非胚性细胞m r n a 体外翻译产物中 则缺少这条带，由此认为胚性细胞膜上的5 0 k d a 蛋白可作为苜蓿体细胞胚发生的分子标志【“ 删。 然而在组织培养过程中，并非所有外植体的愈伤组织都能再分化出不定芽，为分析其原 因，一些研究者比较了胚胎发生过程中产生的胚性愈伤组织与非胚性愈伤组织中可溶性蛋白 组分的差异。h u a n g ( 1 9 8 9 ) 【4 9 l 以拟南芥为材料，发现5 8 k d a 和6 5 k d a 的两种蛋白仅存在于胚 性愈伤组织中，而在非胚性愈伤组织中则朱见到。杨和平( 1 9 9 1 ) 【6 刀在马唐的研究中发现除 胚性愈伤组织中存在五种特异性蛋白成分外，在非胚性愈伤组织中也存在一种胚性愈伤组织 7 两南大学硕十学何论文 中没有的特异性蛋白。郑晓峰( 1 9 9 4 ) 在对西洋参、香雪兰、光棘豆、草木犀四种植物的胚 性、非胚性愈伤组织及发育中的胚状体的可溶性蛋白质组分的研究分析中发现，在它们的胚 性愈伤组织中均检测到了非胚性愈伤组织中所不存在的特异性蛋白，可能与组织的胚性状态 有关，在香雪兰和光棘豆的非胚性愈伤组织中也发现了胚性愈伤组织中所没有的特异性蛋白 质【6 8 】。陈雄( 1 9 9 5 ) 【5 1 1 、陈婷( 2 0 0 0 ) 泗1 分别以枸杞和水稻为实验材料，在非胚性愈伤组织 中均发现了胚性愈伤组织中没有表达的特异性蛋白质。 所有这些实验证明，在体细胞胚发生过程中，总会有与胚胎发育相关的一些新的特异性 蛋白的表达。尽管其分子量有一定的差别，但可推测这些特异性蛋白质可能是胚胎发生的关 键蛋白，能够调控一定的体细胞胚胎发生相关基因的表达。这些蛋白可能作为调控因子，或 是作为结构蛋白、贮藏蛋白和酶蛋白起作用。 1 4 1 2 同工酶谱的变化 同工酶在植物体内普遍存在，是来源于生物体结构不同而能催化同一反应的酶，在不同 的发育阶段、不同的组织中表现出特有的酶谱类型，它与植物体内生物化学反应的多样性、 可变性及其对环境的适应性有关。同工酶是基因表达的产物，是生物代谢过程中的直接参与 者，与植物体正常代谢紧密相关。在体细胞胚发生发育过程中，作为细胞代谢的生物化学必 然发生显著的变化，而各种生理生化变化又都离不开酶化学，同工酶分析为有机体顺序发育 提供了手段。有研究认为，同工酶系统是研究分化的