（微生物学专业论文）褐煤混菌固态发酵及产物化学特性研究.pdf

摘要 黄腐酸是腐植酸中分子量较小，生物活性较高的组分，它在褐煤中的含量很低。本研究的目 的是在本实验室已有的研究基础上，采用农副产晶为主要发酵基质，通过混苗固态发酵褐煤提高 黄腐酸的产昔，并且弄清各褐煤降解菌株的作用机理，以及水溶性黄腐酸利降解前后的腐植酸的 化学特性，为该技术的r 业化应用做好进一步的准备。 主要采州单因素实验对同态混苗降解褐煤的条件进行优化，通过实验确定了真菌的种子培养 基为( g l 1 ) ：麦麸3 0 9 ，大豆粉2 0 9 ，k h 2 p 0 42 9 ，p n 自然；闹态降解培养基最佳接种鼙为( v w ) ： 真菌1 0 ，放线凶6 ，细菌9 ；最优过程参数为：先接入真菌和放线曲，加水量7 0 ，在2 8 培养3 天，然后接细菌，基质水分戍为饱和，在3 8 培养6 天；优化后的培养基组成为：褐煤 4 5 ，麦麸2 0 ，豆粉1 5 ，锯末1 9 ，尿素1 。在扩大实验中，基质厚度4 5 c m 为宜。 研究了斧菌株对褐煤的降解机理，发现a i 、a 5 、同1 、同2 和k 0 5 2 都可通过分泌生物酶及 产螯合剂和碱性物质降解褐煤，同1 及同2 的菌体对褐煤也有一定作用。 应川凝胶层析、元素及红外光谱分析、”c 核磁共振分析等方法对水溶性黄腐酸发降解前后 的腐植酸的化学特性进行分析。结果表明，经微生物降解后，腐植酸的分子量减小，氧和氮含量 增加，褐煤腐植酸的化学组成中芳香碳所i 比例减少，脂肪碳利羧基碳比例增加。 关键词褐煤同态发酵黄腐酸降解机理化学特性 a b s t r a c t f u l v i ca c i dw i t hl o wm o l e c u l a rw e i g h ta n dh i 醇a c t i v i t i e si sap a r to fh u m i ca c i d t h ec o n t e n to f f u l v i ca c i di sr a t h e rl o wi nl i g n i t e 。o nt h eb a s i s 。fp r e v i o u ss t u d y , t h i sr e s e a r o ha i m e da ti n c r e a s i n gt h e y i e l do ff u l v i ca c i db ym i x e ds o l i ds t a t ef e r m e n t a t i o n ( s s nt a k i n gt h ea g r i c u l t u r a lb y p r o d u c t sa st h e m a i ns u b s t r a t e m o r e o v e r , t h ec h a r a c t e r i s t i c so fd e g r a d a t i o nb yt h es i xm i c r o o r g a n i s ms t r a i n si nt h e s s fw e r es t u d i e d b e s i d e s ，t h ed i f f e r e n c e si nc h e m i c a lp r o p e r t i e so fc r u d el i g n i t eh u m i ca c i d ( a l i a ) , b i o d e g r a d e dl i g n i t eh u m i ca c i d ( b h a ) a n dw a t e r - s o l u b l ef u l v i ca c i f a ) f r o mb i o d e g r a d e dl i g n i t ew e r e a l s oi n v e s t i g a t e & i tw a sf m m dt h a tt h es u i t a b l ec o m p o s i t i o no fi n o e a t u mm e d i u mf o rp 6w a s ( g t 0 1 w h e a tb r a n ，3 0 ； s o y a b e a nm e a l2 0 ；k h 2 p 0 4 ，2 ；n a t u r a lp h t h e nc e r t a i nf e r m e n t a t i o np a r a m e t e r sw e r ei n v e s t i g a t e d s e p a r a t e l y t h ef a v n u r a b l ei n o c u l u mv o l u m e ( v w ) f o rp e n i c i l l h o ns p 蹬6 ) a c t i n o m y c e t e s ( a la n da s x b a c i l l i u ss p 如u l ，g u 2a n di ( 0 5 2 ) w a s1 0 ，6 a n d9 ，r e s p e c t i v e l y t h eo p t i m u mp r o c e s sf o rs s f w e r e ：f i r s ti n c u b a t e dp e n i c l l l i u ms p a n da c t i n o m y c e t e sa t2 8 f o r3d a y ss i m u l t a n e o u s l y , w i t hi n i t i a l m o i s t u r ec o n t e n t o f 7 0 ，t h e n i n o c u l a t e d b a c i l l i u ss p a n d i n c u b a t e da t 3 8 f o r 6 如韩，w h i l e k e e p i n g t h em e d i u ms a t u r a t e dw i 饿w a t e r t h eo p t i m a l 受r m e n t a t i o nm e d i u mf o rs s fw a sc o m p o s e da s f o l l o w s ( w w , o nd r yb a s i s ) ：l i g n i t e ，4 5 ；w h e a tb r a n ，2 0 ；s o y a b e a nm e a l ，1 5 ；s a w d u s t ，1 9 ；u r e a , l t h es c a l i n g - u p e x p e r i m e n ts h o w e d t h a t t h e p r o p e r d e p t h o f s u b s t r a t e w a s 4 5 c m i tw a sa l s of o u n dt h a ta l lt h e s es t r a i n sd e g r a d a t e dt h el i g n i t et h r o u g he x t r a c e l l u l a re n z y m e s ， c o m p l e x i n ga g e n t sa n da l k a l i n e - l i k em e t a b o l i t e s a sf o rb a c t e r i a ls t r a h a sg u la n dg u 2 ，t h e yc o u l d p r o d u c e m o r e f a 艇t h ee x i s t e n c eo f t h e i r c e l l s 。 s i z ee x c l u s i o nc h r o m a t o g r a p h y , e l e m e n t a la n a l y s i s ，1 3 c - n m r ( 1 3 cn u c l e a rm a g n e t i cr e s o n a n c e ) a n df t - i r ( f o u r i e rt r a n s f o r m e di n f r a r e ds p e c t r o p h o t o m e t r y ) w e r eu s e dt oa n a l y s et h ec h e m i c a l p r o p e r t i e so fa i l a ，b h aa n df a t h er e s u l t ss h o w e dt h a t , a f t e rb i o d e g r a d a t i o 茸t h em o l e c u l a rm a s so f t h eh u m i ca c i dd e c r e a s e d 。w h i l et h eo x y g e na n dn i t r o g e nc o n t e n ti n c r e a s e d 。t 虹f ew a sa l s oac h a n g ei n t h ec h e m i c a ls t r u c t u r ec o m p o s i t i o no ft h ec r u d el i g n i t eh u m i ca c i da f t e rb i o d e g r a d a t i o n ，w h i c hw a sa d e c r e a s ei nt h ec o n t e n to ft h ed o m i n a n ta r o m a t i cc a r b o na n da l li n c r e a s ei nt h ec a r b o x y la n da l i p h a t i e c a t h o nc o n t e n t k e yw o r d s ：l i g n i t e , s o l i d - s t a t ef e r m e n t a t i o n ，矗l l v 淹a c i d ，d e g r a d a t i o nm e c h a n i s m ，c h e m i c a lp r o p e r t i e s i r 独创性声明 y - 9 3 8 3 2 5 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业大学或其它教育机构的学位或证书 而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示了谢意。 研究生签名：炙 时间： 文o o 占年月，驴日 关于论文使用授权的说明 本人完全了解中国农业大学有关保留、使用学位沦文的规定，即：学校有权保留 送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复 制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、 传播学位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议1 研究生签名：名 卜 铆虢韶确 时间： 疹o 。6 年石月，妒日 时阃：6 年rz 峄b 中国农业人学硕1 学位论文 文献综述 第一章文献综述 褐煤属低阶煤，具有化学活性好、发热鼙低、高水分、高灰分等特点一1 ：业虑剧价值不高。 世界上每年有9 4 亿吨褐煤产出，其中德国最多，为1 9 亿吨，年，其次是俄罗斯( 9 亿吨年) 和美 国( 约8 亿吨年) ( i n t e r n a t i o n a le n e r g ya g e n c y1 9 9 6 ，r h e i b r a u n1 9 9 7 ) 。我国也有丰富的煤炭资 源，1 9 9 5 年底中国已探明的褐煤储量达1 3 0 3 亿吨，1 1 i 全国煤炭储量的1 3 弱( 戴和武1 9 9 9 ) ，我 国褐煤主要分布在内蒙、东北及云南省。其中储量的4 5 分布在内蒙及东三省，以中生代侏罗纪 硬褐煤为主，这里是我国褐煤资源集中地区，它埋藏浅，煤层厚度人，有相当一部分资源可供露 天开采；储量的1 5 为新生代第三纪软褐煤，主要分布在云南省。四川、j l + 东、r 硝、海南、华 东等地也有少鼙褐煤，具体的分布情况见表1 - 1 。 表卜1 全国各省( 医) 褐煤储景 t h ed i s t r i b u t i o no fl i g n i t e c s c r v c so f d i f f e r e n tp r o v i n c e si nt h ec o u n t r y 目前，国内外关丁- 褐煤转化的工业途径可概括为四人类：褐煤的热解和炼焦，褐煤气化，褐 煤液化，另外，由丁褐煤中含有丰富的腐植酸，褐煤常被用于化学提取腐植酸制品( 戴和武等 1 9 9 9 ，郑平1 9 9 1 ) 。 利用微生物加t 处理褐煤是褐煤综合利用的种新的尝试和努力。f a k o u s s a ( 1 9 8 1 ) 首次发 现微生物可以利用硬煤作为生长的唯碳源和能源，并且得到褐色的培养物上清液。c o h e n 和 g a b f i e l e ( 1 9 8 2 ) 抖= | 两株自腐菌p o 垃p o r u sv e r s i c o l o r 雨i p o r i am o n t i c o l a 将风化褐煤完全溶解成水 溶性的物质，g u p t ae ta l ( 1 9 9 0 ) 从土壤中分离j | lp s e u d o m o n a sc e p a c i ad l c - 0 7 菌株，发现该菌株 能够减少煤结构中的羧基碳、醚氧、芳香环和共轭的碳碳双键的数量，引起c 。ce 键断裂。自此 以后，有很多科学1 作者开始对煤的生物降解进行研究，以生产有用的产品，如甲烷等气体或液 体洁净燃料，而且发现微生物的作用还可以使腐植酸中小分子的黄腐酸含量增加，闭而经微生物 作j j 后，褐煤腐植酸具有更高的生物活性。 中国权业人学颀 ：学位论文 文献综述 目前，褐煤的生物降解研究主要集中在高效降解菌株的分离与筛选、降解褐煤的机理研究以 及生物降解产物的性质分析等儿个方面。 1 1 降解煤类物质的微生物 目前，己发现有很多能降解煤类物质的微生物，包括细菌，放线菌和真菌。细菌主要有：b a c i l l u s s u b t i l i s ，且p u m i l u s ，b ，c e r e u s ( m a k ae ta 1 1 9 8 9 ) ，p s e u d o m o n a sf l u o r e s c e n s ( f a k o u s s a1 9 8 1 ) ， a r t h r o b a c t e rs p r 袁红莉1 9 9 8 ) ，p s e u d o m o n a sc e p a c i a ( g u p t ae la 1 1 9 9 0 ) ，b a c i l l u sl i c h e n i f o r m i s ( p o l m a ne ta 1 1 9 9 4 ) 。放线菌主要为链霉菌：s t r e p t o m y c e sv i r i d o s p o r u st 7 a ，s t r e p t o m y c e ss e t o n i i 7 5 v i 2 s t r e p t o m y c e s b a d i u s ( q u i g l e y e t a l 1 9 8 9 ) ，s t r e p t o m y c e s f l a v o v i r e n s ( m o o l i e k1 9 8 9 ) 。真菌是降 解褐煤的主要微生物，报道最多的是p h a n e r o c h a e t ec h r y s o s p o r i u m ，其它担子菌还有t r a m e t e ss p ， p o 眵p o r u ss p ，c o r 批sv e r s i c o l o r ( c o h e n1 9 8 7 ) ，p o r i a p l a c e n t a ( c o h e n1 9 8 2 ，r e i s s1 9 9 2 ) ，p l e u r o t u s f l o r i d a ，p l e u r o t u so s t r e a t u s ，p l e u r o t u ss a j o r - c a j u ，p l e u r o t u se ，) ，n g i i ，s t r o p h a r i as p ( r e i s s1 9 9 2 ) ， n e m a t o l o m 口# o w a r d i ih i 9 ，c l i t o c y b u l ad u s e n ib l l ( h o f r i c h t e r1 9 9 9 ) ；丝状真菌如：p a e c i l o m y c e st l i ， m u c o rs p ( w a r d1 9 8 5 ) ，p e n i c i l l i u ms p ( w a r d1 9 8 5 ，袁红莉2 0 0 0 ) ，4 唧，f m st e r r i c o l a ，a s p e 曙i l l u s o c h r a c e u s ( 袁红莉1 9 9 8 ) ，c u n n i n gh a m e l l a ( o u i g l e y1 9 8 9 ) ，t r i c h o d e r m av i r i d e ( r e i s s1 9 9 2 ) ，f u s a r i u m o x y s p o r u m ，t r i c h o d e r m aa t r o v i r i d e o o l k e re ta 1 1 9 9 9 ) ，d o r a t o m y c e ss p ( l a b o r d a1 9 9 9 ) n 可能是冈为小质素与褐煤的结构相似( 图1 - 1 及图1 2 ) ，目前已报道的降解褐煤的微生物人 多是本质素降解菌，同时，也有报道一些能在褐煤存在条件下分泌碱性物质的1 f 术质素降解幽， 也具有降解褐煤的活性，而降解褐煤的微生物却不一定可以降解木质素( m a k a e t a l 1 9 8 9 ) 。 图1 - 1 褐煤的典型结构示意图 f i g 1 - 1t h et y p i c a l s t r u c t l l r em o d e lf o rl i e n i t e 幽1 - 2 松类植物的术素结构示意幽( g o l de ta t 1 9 8 9 ) f i g 1 - 2s d l e m a t i cs t r u c t u r ef o rc o n i f e rl i g n i n 1 2 煤类物质微生物降解的机理 煤的形成是由植物残体经过生物化学和地球化学作用阶段，将残余的有机质转变为泥炭，进 一步转变为褐煤，划煤，无烟煤。虽然在煤化过程中植物体的物理形状和化学性状发生了很犬的 政变，但是小质素的典型结构却被保存了r 来。冈此，与木质素一样，褐煤是由芳香族化合物组 2 中国农业人学硕l ：学位论文 文献综述 成，并由盐桥，脂肪键等连接起来的三维大分子网状结构，由于体积人，它很难穿过微生物的细 胞壁进入胞内，所以褐煤的生物降解主要是由微生物将一些碱性物质、螫和剂、表面活性剂、生 物酶等分泌到胞外起作用。 l 2 1 微生物酶的作用 由于褐煤与术质素结构十分相似，决定了降解褐煤的酶主要是木质素降解酶系中的一些酶 类，包括：小质素过氧化物酶( l i p ) ，锰过氧化物酶( m n p ) 和漆酶( 1 a c c a s e ) 。这些酶的优点在 丁：a 皆为胞外酶，解决了人分子物质穿过细胞壁和细胞膜进入细胞内的困难；b 底物专一性 不太强，具有较高的氧化还原电位，可以氧化一系列的芳香族化台物；c 可以利埘一些具有反应 活性，可扩散的小分子来扩人底物范围，这些小分子在酶和虽终还原剂之间起氧化还原介质的作 _ l f j ，从而解释了为什么人分子底物可以被酶的活性中心氧化( 王风芹筲2 0 0 2 ) 。 1 2 1 1 木质素过氧化物酶( l i p ) 术质素过氧化物酶( f a k o u s s a h o r i c h t e r1 9 9 9 ) 是研究得最深入的小质素降解酶，其首先在 白腐真菌黄孢原毛平革菌p h a n e r o c h a e t ec h r y s o s p o r i u m 中被发现。l i p 是以血红素为辅基( 含铁 原卟啉) 的糖蛋白。催化反应需要h 2 0 2 参与( g o l de t a l 1 9 8 4 ，t i e n k i r k1 9 8 4 ) 。l i p 以多 种芳香族化台物为底物能够氧化酚类和非酚类物质。前者经去一个电子氧化后生成苯氧自由基， 然后再经过岐化反应生成醌类f o d i e r1 9 8 8 ) ，而非酚类物质被氧化成芳香基正离子。l i p 的独特之 处是能直接氧化具有高氧化还原电势的甲基氧和非酚类的芳香族化台物。w o n d r a c k 等( 1 9 8 9 ) 认 为l i p 是一种有力的非专一性的单电子氧化荆，所产生的刚离子基团可以经多种方式非酶促性地 重排，导致c c 键的断裂以及非酶促反应的聚合。 大量的研究表明纯化的u p 具有降解煤大分子物质的能力，w o n d r a c k 等( 1 9 8 9 ) 发现，部 分提纯的p h a n e r o c h a e t ec h r y s o s p o r i u mu p 能将经硝酸处理的褐煤和次烟煤解聚成更小的水溶性 小分子片段，加入藜芦醇能增强这一解聚作_ i j 。r a l p h 和c a t c h e s i d e ( 1 9 9 9 ) f ；i ；lpc h r y s o s p o r i u ml i p 的、f 纯化制剂使甲基化可溶于水的褐煤脱色，在2 8 0 h m 和4 0 0 h m 的吸光度减少了2 6 平【13 9 ， 在反应过程中h 2 0 2 和藜芦醇是必不可少的，据推测，藜芦醇可能是l i p 和最终底物之间稳定的 氧化还原介质( 形成瞬间的芳正离子自由基) 。杨金水( 2 0 0 5 ) 对纯化得到的斜卧青霉p 6 分泌的 木素过氧化物酶的褐煤降解活性进行了研究，发现纯酶的褐煤降解活性依赖于h 2 0 2 的激活。 1 2 1 2 锰过氧化物酶( m n p ) 锰过氧化物酶也是在pc h r y s o s p o r i u m 中发现的，与l i p 一样都是胞外酶，糖蛋白，以铁 原朴啉为辅基，但m n p 在氧化还原反应中分别以m n 2 + 和m d + 作为特异性底物年介质。m n p 被 m n 2 + 还原，丽m n 2 + 被氧化成m n “，m n 3 + 离子被有机酸如草酸、苹果酸、酒i i 酸、乳酸等螯利剂 螯和后可以提高其氧化还原电位。螫合态的m n “作为可释放的氧化还原介质可以氧化酚、某种 甲氧基化的芳香族物质、硝代和氯代芳族化合物和有机酸( w a r i i s h i1 9 9 2 ) 。 加入合适的添加介质如硫醇、脂、不饱和脂肪酸及其衍生物( b o g a ne ta 1 1 9 9 6 ) 可以提高 m i i p 体系的氧化能力，这样m n p 就能够切断原本不易受到攻击的化学键( 如北酚类的芳香醚、 彰环芳烃) 。 3 中国农业大学硕十学位论文 文献综述 h o f r i c h t e r 和f r i t s c h e ( 1 9 9 6 ，1 9 9 7 a ) 发现在体内实验中，m n “诱导担子菌n e m a t o l o m a f r o w a r d i i 和c l i t o c y b u l ad u s e n i i 合成m n p ，并能迅速将煤腐植物质降解为小分子的黄腐酸。培养物中加入 煤后，m n p 的活性急剧增加，这表明煤瞒殖质对m n p 具有诱导作川。n e m a t o l o m af r o w a r d i i 的 m n p 也能够在非细胞系统中降解煤腐植物质，煤解聚时伴随着4 6 0 n m 处吸收值急剧降低。而 3 6 0 r i m 处黄腐酸类物质生成的吸收值增加。模式分子量从3 k d a 卜降剑0 7 】【d a ( h o f r i c m e r & f r i t s c h e l 9 9 7 b ) 。w i u m a n n 和f a k o u s s a ( 1 9 9 7 ) 发现一株担子菌( 代号为r b s l k ) 在对煤的人分 子脱色过程中诱导m n p 的台成，酶学分析表明在培养物上清液中有m n p ，但检测不到l i p 千 l a c c a s e 活性，m n p 是在加入煤膳植酸时诱导产生的。 z i e g e n h a g e n 平h o f r i c h t e 用c l i t o c y b u l ad u s e n “的m n p 对煤腐植酸的解聚条件进行优化，m n p 的用茸是0 2u l ，发现腐植酸和m n 2 + 的最适浓度分别为2 5 0m g l 和1m m ，h 2 0 2 可由葡萄糖氧 化酶不断提供，添加的少鬣硫醇类物质谷胱甘肽和有机溶剂n n 二甲基甲酰胺可刺激解聚作t 【 。 研究还发现m n p 在反麻条件f ( 3 7 ) 十分稳定，儿周后仍保持部分活( z i e g e n h a g e n1 9 9 8 ) 。 1 2 1 3 漆酶( 1 a c c a s e ) 1 8 8 3 年漆酶被首次发现，一卣多年米，人们通过人量研究发现漆酶广泛存在丁多种植物和菌 类的分泌物中，而且儿乎所有能够降解小质素的真菌都产生。在真菌中，漆酶人多分布在担子卣 如p o l y p o r u s 和子囊菌如p o d o s p o r a 等中( y a r o p o l o ve t a l 1 9 9 4 ，甘景镐1 9 8 4 ) 。后来，人们发现 一些细菌也能产生漆酶，如生脂同氮螺菌( a z o s p i r i l l u mt i e o f e r u m ) ( g i v a u d a n1 9 9 3 ) ，它可产生 一种类似漆酶的多酚氧化酶。还有人从地中海中分离到一株细菌，检测剑其细胞粗提液中既有漆 酶活性，又有酪氦酸酶活性，进一步研究表明该酶位丁- 细菌质膜上，弗且是多种组分聚合而成的， 这与典硝的漆酶结构特点有较大差异( 钞弧鹏等2 0 0 1 ) 。此外一些动物肾脏和血清中也发现了漆 酶。 漆酶是一种含铜的多酚氧化酶，糖蛋自，漆酶的分子蛀在6 4 3 9 0 k d 之间，除p o d o s p o r a a n s e r i n a 产生的一种漆酶是四聚体外，其它漆酶一般是单一多肽，由约5 0 0 个氨基酸组成( 千海磊 等2 0 0 3 ) 。不同种类的漆酶含铜数并不相同，一般含有四个铜离子。漆酶作用于酚类芳族化合物 后生成苯氧基，苯氧基容易进行基基配对、脱电子、歧化作用、水分子的亲核攻击等非酶反应， 多重反应最后导致聚合、烷基芳基键的断裂、c 氧化或酚类反应物的脱甲氧基化。 研究发现zv e r s i c o l o r 可以分泌大量的漆酶，而过氧化物酶活性却很低。在体内反应中，z v e r s i c o l o r 的漆酶能使来自褐煤的腐植酸脱色；在2 8 0 n m 和4 5 0 r i m 的光吸收结果证明酶处理后， 煤复合物发生了大分子的裂解，培养液的腐植酸浓度f 降，而黄腐酸的浓度上升。同时发现增加 腐植酸的含量，不会抑制漆酶的活性却会促进过氧化物酶的活性：加入煤颗粒可使漆酶的测定活 力人人减低，进一步提高过氧化物酶的活力( f a k o u s s a f r o s t1 9 9 9 ) 。 1 2 1 4 水解酶及其它 除了上述儿种木素降解酶以外，还发现有水解酶，如酯酶参与煤类物质的降解。c a m p b e l l ( 1 9 8 8 ) 研究发现部分纯化的zv e r s i c o l o r 漆酶具有降解风化褐煤的活性，进一步研究表明该漆 酶由两种蛋白组成，一种具有漆酶活性却不能降解煤，另种不具有漆酶活性却可以促进煤的液 化，后来发现该蛋白具有酯酶的活性。c r a w f o r d 和g u p t a ( 1 9 9 1 ) 1 l | _ j 褐煤腐植酸培养一些细菌， 4 中国舣业人学碗士学位论文 文献综述 发瓒一晕孛嚣氧纯酶类对臻挺羧袁瓣聚幸鏊翊，搜荬分子鼙壶1 7 4 k d a 降低为1 1 3 k d a ，筵壤葬露阔 会得划分子量更低的产物，如果煮沸这蝗细菌的培养物上清液将失去其降解煤的活性。h o l k e r e t a l ( 1 9 9 9 ) 对t r i c h o d e r m aa t r o v i r i d e 进行研究也得到类似的结累，发现其还分泌一种对热敏感、郝 分诱簿帮采癣靛静酶，髓够璜船渫豹溶瓣，舅矫za t r o v i r i d e 还霹产生尊酶奔矮魏簸往物质和螫 合荆，这些物质也能够有效她溶解腐植艘。因此，这种真菌对煤的降解慰水解酶和非酶冈子共同 作蹦的结果。但是目前还没番发现酯酶谯降解过科中存小分子物质作介旗，以至整个黪酶分子不 髓侵入煤的太分子嬲袄结翰中去，因姥它的活动可熊受到空阉阻碍。 除此之外，也有报道述原酶，纤维索酶等也有降解褐煤的能力( 袁红莉1 9 9 7 ) 。 表l - 2 摊解福攥的蘸似酶类特点 b 较表 ! ! 坐i ：竺竺生竺! ：堂竺竺塑! ! ! 尘! 望! 登壁坐銎! 警黧 l i pm n p l a e c a s 。 1 2 2 碱溶 由于煤中的崩植酸可以在碱性条件f 溶解，而鼠一些研究发现在用微生物液化煤的过程中培 善鏊瓣d 珏篷会瑟赢，禹戴议灸赣生秘溶媒麓甄毽之一是峦予产生了碱瞧麴矮。1 9 8 7 年c o h e n 罄 报道d h 升高有利于煤的溶解( c o h e n1 9 8 7 ) ，q u i g l e y 同年也报j 篾了微生物能够将煤液化是由于微 生物生k = 过群中利蹦培养基中的多肽或多胺产生的碱性物质提高了培养基的p h ( q u i g l e y1 9 8 7 ， 1 9 8 9 ) 。g u p t a 等( 1 9 8 8 ) 发耀能分解本凄素鹃放绒菡& v i r i d o s p o r u s 、& $ e t o n i i r 帮sb a d i u s 褥 褐煤转化成黑色水溶性物质，同时培养基的p h 傅显著升高，f 检测到分子量小丁n1 万d a 的热 稳定性的溶煤因子。但是化学碱溶和生物产生碱性物质溶解搦煤是有区别的，两种方法所得产物 勰髋震不弼，在辐弱豹p 瓣条终f ，纯学碱溶产携豹最裹疆蔽蹲在2 1 0 a m 楚；生物漆瓣产物的簸 高吸收峰在2 5 0 n m 处，随p h 的升高，煤的溶解龄也在逐渐增火，p h l 0 时的溶解餐为p n 9 和8 时的1 0 倍。微生物溶解煤的过程可能既舂微生物与煤的相互戢：川，又有困为p i 升商而导致的化 学溶解，因此微生物溶解煤可能是一个间接的化学过程( m a k a1 9 8 9 ) ，可能是微生物产生碱性物 质，提高了培养基的p h ，导致了煤的溶解。 1 2 _ 3 微生物分泌的螯合剂和表面活性剂的作用 在自然状态f ，煤类物质一般通过多价金属离子的“桥连”的作川，形成稳定的多维复杂结 构，但如果加入更强结合力的螫合剂，多价金属离子将被夺走，煤分子的紧密结构就会被破坏， 水溶性就增强。 q u i g l e y 等( 1 9 8 8 ) 发现多价h 1 离子如c a “，a ，f e “等可以在羧基等基团之间作为盐桥。 c o h e n ( 1 9 9 0 ) 指出在生物液化风化褐煤时，螯合剂如草酸铵可能起重要作用，这些螯合剂可以将 金属离子从褐煤中去除。f r e d r i c k s o n 等( 1 9 9 0 ) 报道了t r a m e t e sv e r s i c o l o r 培养物中的螯台剂是 类似铁载体的小分子物质，分子量 。 ：照。妃酞煤中攘数黄凌黢麓方法主爱卷掰辩，一糟蹩蘸骥一弼戮法，舅一耱整离子交接挺徽法。 硫簸诩鳓法躲骤理燃；煤中的焚糯黢主要魁以钙镁的垒壤盐形褰存巍。搬入酸麓焉，起笺分解爱 褒，臻羧酸幸琶了黄瓣黢赫热爱媾辫子，蘧莛壤黢警游簿虢态，游褰瓣菠瓣酸糍被禽步鬣蹴( i 稿2 秭) 瓣嚣黎耨涛解，藤彩藏瓣瓣瓣骥潞秘生娥瓣巯黢熬粼不溶群，邂释裁簿鼗觳皇壤靛黄瓣酸擒提凄 米，蒸去溶荆后就得到低灰分的黄瘸酸。离予交换树胎法楚以强酸型m l 离子交按树腊代管硫黢取 黄藤酸楚静金瓣离予群菰鼹藤羧，出予离予交换秘艨拳喊渣不溶t 泰，艇鲢选瓣瘩姆生袋携黄 壤酸罄敬蹴寒f 辩平1 9 9 i ) 。 1 6 + 3 爨糖酸戆瓣露露濠 辩藏，圭= 韭一芝嚣耩酸静寇蘩羚耩方竣怒秘趱藤楗酸辩嘿搿酸之籁熊蓑德毫t 舞褥残，域容蹩法 分析沉淀黑麟酸厉滤渡中的鸯斟t 物作为黄搬酸禽蜒。妊泉分析煤嶷中鳆黄琏酸，这惩暑申方法档对 比较霹纛。辩壤黢有赣毪，盎紫 霸可熬熬撼濑内寄蹶彀，经没煮特疑! 壤鹱媾，蹶建溅簸波长煞 增瓣蘸满步 箨平t 9 9 1 ) 。 勇一秘赞蝮酸是趱分辑秀法嬷基予程一定浓度藏蕊国，藕挺黢鞠黄寝黢麴w 整必墩牧勰飙 瓤 b m 沁牲定稼。遴镭逸澍4 6 5 n m 或6 6 5 n m 测定壤巍袭，拣瓣按b e c r - 1 a m b e n 公式诗舞，竣 岛标礁懿线澎较，浓邂筵瓣酸或蕊德酸熬浓魔。镬i 是，苓惩来源熬斌槛酸戏莛壤骥捐瓣浓壤憋漆 渡，吸毙爱弗季蝴鞠。慰予缝微生镌终捌嚣的荧黧酸，凌 擞生携鹣麟煎撵嫫熬楚异，瓣一穆鞴 漾经馥生甥蹲擦纛黥产镌巍戮浓覆f 瓣教宠震霹鼗蠢不橱霜。巍善学等) 掇遂羹瘸簸褒 稀水溶液中盼a 4 6 5 n m 和a 6 6 5 n m 的吸光庶与溶液的浓凄鼙良好的线性关系- 与b e e r - l a m b e r t 定 挺究垒辍簿，覆p h 黠漆液翁壤魄寝嚣镌橙太，掰班菇糍酸燕擅搏定艇势橱l l 枣錾懑霆砖l 德，一 羧鑫0 0 5 m o t l 熬n a h c o ，爨滚渡巾遗舒。 1 6 4 蓑藤酸鹩佟舔 e 文溅奠有麟橙陵的一般糁糍帮魅旗，父泰一般罐键酸酝不其套鹣黎焘* 妻要裘疆崧戳f = 个方厩 一魁f a 的分乎量较小，嘲丽撼被生物吸收l 【l 刹则；二：楚f a 的官糍豳 如羧基、瓣羟 9 中国农业人学硕学位论文 文献综述 基芝) 禽挺较赢，比般腐植酸的生理疆性天；三楚鹰辍酸可直接垮予求，遮旗盐的永溶液残碱 往f a 可矗搂溶丁东，其水溶液鼍酸性。f a 的这三太特征其在农啦、医学、齑牧普医、食晶等 方面较般腐植酸具有更多的用遗和更佳的廊用效果。 实践证明，黄嬲黢在农业上主要寄珏个方嚣靛终弼，一是毙绩小气孔开张娥，减少本分蒸腾， 使植株幕i + 壤保持鞍多的水分，同时健避鞭系发育、据黼裰系活力，使作物吸收较多的水分和养 料；_ 二是自提高多种酶活性和叶绿素含量，使新陈代谢旺盛，光合作用加强，糖分和干物成增多， 飙瑟提裹侉凌抗猿、撬瘸等抗避糍力，提褰铭耪载产繁秘箍囊；二跫糍通过物理纯学豫璀农药 形成农药激素复合物，既可降低农药毒性，也可减少农药用量，提高农药药效；网楚络台微鼙 元素，提高植物对微链元素的吸收与运转能力，是一种优良的络台荆。 已经开发耱f a 抗华裁产菇鸯“f a 旱她笼”，“抗攀裁1 号”，“农气一号”等，在我翻于掣、 、p 干旱蛾隧显示了j “阔的应增前燎。果树施墙f a 旱地龙后，有抗毕增产效粜，增产幅艘可达 4 8 8 7 3 2 ，平均单果质量增加4 2 8 4 ，并且使果实品质得到改善；b 充分灌溉条件相 毙，承分翻蠲效率蠢鸯瑟提裹，鹰h m 2 箨约灌滠l 隶鬟4 8 7 + 5 ，韩二聂鞫等2 0 0 4 ) ；适宜的黻浓度 可以使玉米幼苗株离、主根跃、地上部干重群i 根干重增加；叶绿素含鼙、可溶性总糖含馘羊h 可溶 性蛋f 1 禽艇提高。陈玉玲等( 1 9 9 9 ) j j 酶联免疫( e l i s a ) 法测定了黄腐酸处理后冬小麦幼苗删i 曝乙酸( i a a ) 、残薄酸( a b a ) 瓣瘩乎，缝莱发现黄瓣酸笺健鸳l 曝乙酸彝麟薄酸的承乎增热， 这与黄腐醴能刺激樾物生艮、抑制气孔开启致。 黄瞄酸具有抑诎、抗炎、抗溃疡、促进刨伤愈合、l 血、助眠、提高人体免疫力并且调节内 分泌等作蠲( 榜慧珍2 0 0 0 ) 。j = | y - 演疗浇俊烫伤时，对镧蟊捌嫩小，结簸绥，不彝惑染，疆少穗 疤( 千莉萍1 9 9 7 ) 。衔牧业上黄腐酸可作为饲料添加刺，促进动物的生长，摄商动物的抗病性和 免瘦力。闽此，黄精酸产品倍受人们青艨，利用微生物酶解褐煤提取黄腐酸不仪能提高黄爝酸的 产鳘，还霹班提矗黄腐酸戆生物活性。 1 。7 微生物降瓣褐煤生成黄腐酸的硪究进熙 乖j 羽国内外3 2 个数据库避行检索发现除本实验室的研究报遂捧，来觅文献帮专乖l 掇遂关 ： 微生物降解褐煤产生黄腐酸和腐植酸的研究，国外有较多文献报道用微生物降解低聚合艘的煤 ( 包括榻煤) 豹研究，饺有l 麓巍降解产物挚涉及到磨援馥和类似赞鹰酸的物鹱( w i t i i m a n1 9 9 7 ， h o f r i c h t e r1 9 9 7 w u n d e r w a l d2 0 0 0 ，h 6 1 k e re t 口f 2 0 0 2 ) 。 本嶷验室从1 9 8 7 年开始微生物降解褐煤的研究= 】二作对微生物降解褐煤生产黄腐酸及高活 性鲍壤搪貔进行了犬艇、细致熬l ：于# 。经过长期的研究转离筛选到系列具商褐煤酶解熊力的越 株，研究，单个菌株降解褐煤的特性，荠笈瑷混菌降解比单菌降解能产生更多的黄腐酸，辫此进 行了态混菌降解褐煤的研究，优化了菌株组合方式及接菌顺序，优化了褐煤降解的过料参数和 培姜基缀袋。弱露，瘴翊凝黢摄辑、元素及红搏走谱分糖等方法硬宠了选弯麓椿青霉越粥辫姆 褐煤的产物的化学特性，发现经微生物降解后产生的褊煤腐植酸与来经降解的腐植酸相比，氢、 氧、氨禽避都明显增加，而碳禽鬣降低，裁明分子内含氧及含氮的官能团有所增加；红外光谱分 辑表臻鹚潆在镦生携释瓣过程中泽基被氧化藏羧基及裁基，攮嚣嫒含氧餐增搦；经降辚嚣褐煤褒 植酸的分子量减小，絮凝极限明姓增人( 囊红莉1 9 9 9 ，2 0 0 0 ) 。与未经降解的褐煤腐植酸相比， 降解产物的生物活性明显增强：对+ 壤微生物区系的刺激作用明掀 对萝h 枯萎病病原菌表现山 1 0 捧裁捧髑；幢太豆投瘸莲在天鼗土绩瘗麓纂癣重及在蓥糖上l 孽缤瘸数番l 单瘿重均萎羲增数；两蔓 能显著蛾健进豌豆种子发芽及幼苗生长( 袁红莉2 0 0 2 ) 。 同时，对褐煤降解菌株p e n i c i l l i u m d e c u m b e n sp 6 的降解机理进行了研究，发现其能产生术素 过氧佳携瓣( l i p ) ，劳薅该酶遴盼了提取秘缝纯，研究了该酶豹特嫂，著证蜜缝蘧靛该酶基夺箍 煤降解活性，同时获得了其c d n a 克隆( 辆金水2 0 0 5 ) 。而且对p 6 产l i p 的产酶条件谶行了优 化，并进行了中试，在发酵时间7 6 5 h 时，最高酶活达划3 0 3 u m l ( 阮芳勇2 0 0 5 ) 。 1 8 研究内容及目的 本研究在原有基础上，采用固态发酵技术，利用农剐产品作辅料优化混龋降解揭煤的疑佳条 髂及技零蹲线，弗粒溉藩缀台中备福潆降瓣蓬探静谗翊辘堙，酶勰产秘嚣纯学餐性避行搽讨。磅 究目的在于提高褐煤的微生物降解效果，降低生产成本在阐明诚降解过样，了解降解产物化学 特性的基础上，为该技术的r i ：业化鹿圳做空，准蠢。 1 1 第二章祸煤混蘸固态发酵条件优化 固态发酵是指没有贱几乎没有自由水存在r ，在有一定湿度的水1 ；溶性同态越质中。j j 种 域多秘微生物靛一个生物反应过秣。底麴( 基艟) 是不溶j ：水的聚台物，它不仅w 以提供微生物 所需碳源、瓤源、无视盐、水及其它营养物，述楚微生镌生陡的蛹蕊( 徐福建蒋2 0 0 2 ) 。 腐植酸，特别是小分子的黄腐酸( e a ) 具有多方面的生理活性，如增强植物的呼吸作州、抑 制蒸腾、提赢酶的活性、健避植物生长发育娃疑吸牧无搬葬分等。缀多研究结聚裘明：建撼酸的 生理功能与冀分子大小和结构密切相关，尤其烧它霄有的酚类和醌类缩构直接决定藤檀酸静生理 效应( 陈玉玲年| i 曹敏1 9 9 9 ) 。州化学法提取黄腐酸产姑低，生物活性篇，而且消耗化i 原料，污 辩臻境。本磷囊剥捌微生魏降鳃褐煤，施够生产夫鼙小分子的、赢生物活性的瘩潞聋圭黄琏酸，月 时减少环境污染。 为了适庸j ：业化生产的要求，本研究试图往本实验盎千风芹( 2 0 0 2 ) 的研究蛙础上，利h i 一 些廉蹬戆表潮产晶豫为骧氮源，采矮糍态发酵的方式隆勰搦蝶，产生天鼙裹活性鳇水溶性黄嬲酸。 本研究采脚下风芹( 2 0 0 2 ) 的菌种粥伍及改进的接种顺序，同时对一姥条件如援种鼙，培养时间 投温度，培养基组成等进行改进，以达到同态发酵条件的煅优化，随后进行放人实验。 2 1 材料筠方法 2 1 1 褐煤 箍潆南癌蒙霍转郭鞠矿穆裁据供。赫l 襻爨为