（微生物学专业论文）重组大肠杆菌高密度发酵生产类人胶原蛋白Ⅱ工艺研究.pdf

重组大肠杆菌高密度发酵生产类人胶原蛋白i i 工艺研究中文摘要类人胶原蛋白i i ( h u m a n 1 i k ec o l l a g e n i i ，简h l ci i ) 是胶原蛋白族的系列衍生物之一，其生物学性能良好，可以促进上皮细胞和软骨细胞生成，还具有止血功能，且机械性能良好。真空冷冻干燥后质地较硬，室温条件下具成胶性，且胶体性质不易发生改变，适合做人工皮肤、人工血管、手术缝合线、人工骨等医用材料。本文在本实验室成功构建的重组大肠杆菌基础上，对分批碎f 、料培养生产类人胶原蛋白i i 的发酵条件进行了研究，主要考察了培养温度、p h 、溶氧控制条件、比生长速率和诱导条件五个方面对细胞生长和类人胶原蛋白i i 表达的影响，结果表明：1 重组大肠杆菌最适生长p h 为6 5 ，类人胶原蛋白i i 最适表达p h 为6 8 ，采取分阶段p h 控制方式，即诱导前控制p h6 5 ，诱导后控制p h6 8 ，与恒定p h 控制相比，不仅适于菌体生长，而且有利于类人胶原蛋白i i 的高效表达，细胞密度为8 2 3g l - 1 ，类人胶原蛋白i i 浓度1 0 8g l - 1 。2 初始培养温度为3 4 。c ，类人胶原蛋白i i 浓度为1 1 8g - l 。说明适当降低工程菌的培养温度有利于外源蛋白的表达。3 溶解氧浓度控制在2 0 时，蛋白表达率高，而且不会造成菌体的氧中毒。在此基础上可以采取分阶段供氧模式，即诱导前控制2 0 ，诱导后控制在4 0 ，可以提高类人胶原蛋白i i 表达量，发酵结束后，细胞密度和类人胶原蛋白i i 浓度分别为8 3 5g l 。和1 2 2g l 。4 诱导前后，比生长速率对细胞生长和类人胶原蛋白i i 表达的影响是不同的：诱导前，控制比生长速率在0 2 0 0 2 5h ，诱导后，控制比生长速率在o 0 5 0 0 6h 一，发酵结束后，细胞密度和类人胶原蛋白i i 浓度分别为1 3 2g l - 1 和8 3 9g l - 。5 诱导时机应该控制在细胞对数生长后期，类人胶原蛋白i i 的表达量达到1 4 5g l - 1 ，高于在对数生长中期和中后期进行诱导时类人原蛋白i i 的产量；采取3 4 c 培养1 0h后降温至3 0 。c 培养，至对数生长后期升温至4 2 c 诱导3h 后，降温至3 9 继续培养的诱导方式，最终细胞密度和类人胶原蛋白i i 浓度分别为8 4 5g l 。和1 5 7g l ，平均蛋白得率达到o 7 1g l i - h 一。关键词重组大肠杆菌，类人胶原蛋白i i ，高密度发酵，发酵条件i is t u d yo nt h ep r o c e s so fr e c o m b i n a n te c o l ih i g h d e n s i t yf e r m e n t a t i o nf o re x p r e s s i n gh u m a n - l i k ec o l l a g e ni ia b s t r a c th u m a n 1 i k ec o l l a g e ni i ( h l ci i ) i so n ed e r i v a t i v eo fc o l l a g e nf a m i l y ，w h i c hh a sp e r f e c tb i o a c t i v e p r o p e r t i e s ，h a sp r o m o t e de p i t h e l i a lc e l la n dc a r t i l a g ec e l lr e g e n e r a t e d ，h e m o s t a t i cf u n c t i o na n d m e c h a n i c a lc h a r a c t e ra l s ow e l l t h et e x t u r eo fh l ci ii sm o r eh a r da f t e r v a c u u mf r e e z ed r y i n g ，g e l a t i n i z e du n d e rr o o mt e m p e r a t u r e ，a n dc o l l o i dc h a c h a r a c t e ri sn o tc h a n g e d t h e r e f o r e ，i tc a nb eu s e dt om a k em e d i c a lm a t e r i a l s ，s u c ha sa r t i f i c i a ls k i n ，a r t i f i c i a lb l o o dv e s s e l ，s u t u r ef o rs u r g e r y ，a r t i f i c i a lb o n e ，a n ds oo n t os t u d ya n do p t i m i z et h ef e r m e n t a t i o np a r a m e t e r sf o re x p r e s s i n gh l ci id u r i n ge c o l if e d b a t c hf e r m e n t a t i o n t h ee f f e c t so ft e m p e r a t u r e ，p h ，c o n t r o lo fd i s s o l v e do x y g e n ，s p e c i f i cg r o w t hr a t ea n di n d u c t i o n c o n d i t i o no nt h ec e l lg r o w t ha n dh u m a n - l i k ec o l l a g e ni ip r o d u c t i o nw e r ei n v e s t i g a t e dt oo p t i m i z et h ef e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n s t h er e s u l t s d e m o n s t r a t e d ：1t h eo p t i m u mp ho fe c o l ig r o w t ha n dh u m a n l i k ec o l l a g e ni ie x p r e s s i o nw a s6 5a n d6 8r e s p e c t i v e l y ，c o m p a r e dt oc o n s t a n tp h ，a d o p t i n gs t e p c o n t r o lp hw a sn o to n l yq u a l i f i e dt oc e l lg r o w t h ，b u ta l s ot oh u m a n l i k ec o l l a g e ni ie x p r e s s i o n c o n t r o l l i n gp hi np h a s eo fi n d u c t i o na t6 8a n di n i t i a lp ha t6 5 ，c e l ld e n s i t ya n dh u m a n l i k ec o l l a g e ni ic o n c e n t r a t i o nc o u l dr e a c h8 2 3g - l a n d10 2 0g l 2w h e ni n i t i a lt e m p e r a t u r ew a s3 4 。c ，h u m a n l i k ec o l l ae ni ic o n c e n t r a t i o nr e a c h e d7 8 9g l 1 p r o p e r l yc u t t i n gd o w nt h et e m p e r a t u r ei sb e n e f i c i af o re n g i n e e r i n gb a c t e r i u mt op r o m o t ep r o t e i ne x p r e s s i o n 3c o n t r o l l i n gd i s s o l v e do x y g e nc o n c e n t r a t i o na t2 0 ，t h ey i e l do fh u m a n l i k ec o l l a g e n 1w a sm o r e ，w h i c hw o n tc a u s eo x y g e nt o x i c i t yf o rb a c t e r i a o nt h i sb a s i s ，t w o 。s t a g eo x y g e n s u p p l yc o n t r o lm o d e ，c o n t r o l l i n gd oi np h a s eo fi n d u c t i o na t4 0 a n di n i t i a ld oa t2 0 ，w a sp r o p o s e da n de x p e r i m e n t l yp r o v e dt oi n c r e a s et h eh u m a n l i k ec o l l a g e nl ip r o d u c t i o n ，c e l ld e n s i t ya n dh u m a n 1 i k ec o l l a g e ni iy i e l dr e a c h e d8 3 5g - l - 1a n d1 2 2g - l 一，r e s p e c t i v e l y 4t h ei n f l u e n c e so fs p e c if i cg r o w t hr a t eo nt h ec e l lg r o w t ha n dh u m a n l i k ec o l l a g e ni i1 e x p r e s s i o ni nt h ep h a s e so fb e f o r ea n da f t e ri n d u c t i o nw e r ed i f f e r e n t ，c o n t r o l l i n gd i f f e r e n ts p e c i f i cg r o w t hr a t ei nd i f f e r e n ts t a g ew a sa v a i l a b l ei no r d e rt oy i e l dh i g h e rc e l la n dh u m a n 1 i k ec o l l a g e n t h er e s u l t sp r o v e d ：t h eo p t i m u ms p e c i f i cg r o w t hr a t eb e f o r ei n d u c t i o nw a so 2 0 0 2 5h 一，a n dt h eo p t i m u ms p e c i f i cg r o w t hr a t ea f t e ri n d u c t i o nw a so 0 5 - 0 0 6h 一a tt h eo p t i m u ms p e c i f i cg r o w t hr a t e ，t h ef i n a lc e l ld e n s i t ya n dh u m a n l i k ec o l l a g e ni ic o n c e n t r a t i o nc o u l dr e a c h1 3 2g l a n d8 3 9g - l ，r e s p e c t i v e l y 5c o m p a r e dt ot h em i d d l eo fl o g a r i t h m i cp h a s ea n dm i d d l e e n do fl o g a r i t h m i cp h a s e ，i m p l e m e n t i n gi n d u c t i o na tt h el a t e ro fl o g a r i t h m i cp h a s ec o u l dg e tm o r et h a nb i o m a s sa n dh u m a n 1 i k ec o l l a g e ni i f i n a l l yb o t hr e a c h e d8 6 0g - l a n d14 5g l q ；a d o p t i n gan o v e li n d u c t i o nm o d e ，w h i c hc u l t i v a t e dt ot h el a t e rl o g a r i t h m i cg r o w t hp h a s ea t3 0 ca f t e ra t3 4 cf o r1 0 h ，a f t e ru pt o4 2 cf o r3 h ，l o w i n gd o w nt o3 9 ( 2 ，t h ec e l ld e n s i t ya n dh u m a n l i k ec o l l a g e ni iy i e l dc o n c e n t r a t i o nc o u l dr e a c h8 4 5g l a n d1 5 7g - l 一，r e s p e c t i v e l y k e y w o r dr e c o m b i n a n te c o l i ，h u m a n - l i k ec o l l a g e ni i ，h i g h - d e n s i t yf e r m e n t a t i o n ，f e r m e n t a t i o nc o n d i t i o ni v西北大学学位论文知识产权声明书本人完全了解学校有关保护知识产权的规定，即：研究生在校攻读学位期间论文工作的知识产权单位属于西北大学。学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版。本人允许论文被查阅和借阅。学校可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。同时，本人保证，毕业后结合学位论文研究课题再撰写的文章一律注明作者单位为西北大学。保密论文待解密后适用本声明。学位论文作者签名：壁! 垫壅指导教师签名：苴丛翌差2 0 0 9 年6 月6 日2 0 0 9 年6 月6 日西北大学学位论文独创性声明本人声明：所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，本论文不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得西北大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名：席囟至2 0 0 9 年6 月6 日西北人学硕上学位论文1 胶原蛋白第一章综述1 1 天然胶原蛋白1 1 1 天然胶原蛋白概述胶原蛋l 兰l ( c o l l a g e n ) 又称胶原，是由三条肽链拧成的螺旋形纤维状蛋白质，是结缔组织的主要成分，在哺乳动物中含量十分丰富，占体内蛋白质总量的l 3 ，是体内含量最多的一类蛋白质。其富含甘氨酸、脯氨酸及羟脯氨酸等，存在于几乎所有组织中，是一种细胞外蛋白质，以不溶纤维形式存在，具高度抗张能力，对动物和人体皮肤、血管、骨骼、筋骨、软骨的形成十分重要【1 捌。胶原蛋白作为一种纤维蛋白，其基本组成单元是原胶原分子。原胶原分子是由三股a 螺旋结构的肽链缠绕而形成的长度约为3 0 0 n m ，直径约1 5 n m ，分子量约为3 0 0 k d a的分子。其分子结构由n - 末端区域、螺旋区域和c 末端区域组成，借助于原胶原蛋白氨基蛋白酶和羧基蛋白酶，分别将原胶原的n 一末端和c 一末端区域断裂而形成胶原蛋白。原胶原分子平行排列成束，通过共价交联，可形成稳定的胶原微纤维，进一步聚集成束，形成胶原纤维。胶原蛋白家族至少包括2 7 种胶原蛋白，根据其超分子结构可分为成纤维胶原、网织胶原、微丝胶原、短链胶原及锚纤维胶原等，胶原基因突变将导致遗传性胶原病【3 】。每种类型胶原的结构特性均与其特定的功能相适应，同一组织常含有几种不同类型的胶原，但常以某一种为主。作为细胞外基质的重要组成成分，胶原蛋白是体内最主要的非水溶性纤维蛋白，对保持各种组织的结构完整性具有非常重要的作用。胶原蛋白的类型、质量以及分布的改变，将直接影响动物体正常的机能，如导致透明软骨的退行性关节炎、血管基质的动脉粥状硬化、血管和。肾胶原性基底膜的糖尿病、伤口愈合中异常的瘢痕形成、角膜和晶状体异常、结缔组织遗传性疾病等【4 1 。1 1 2 天然胶原蛋白性能及应用1 1 2 1 天然胶原蛋白性能( 1 ) 止血性能：血管内膜损伤后暴露出的内膜下组织主要是胶原，可激活局部凝血过程而生成由纤维蛋白多聚体构成的血凝块，与血小板一起组成牢固的血栓，控制出血。因此天然的胶原聚集体是很好的止血剂【5 1 。第一章综述( 2 ) 低免疫原性：虽然胶原是大分子物质，但结构重复性大，可溶性胶原的免疫性很低，不溶性胶原的免疫性更低，一般机体不对其产生慢性排斥反应。因此，由胶原制备的异体组织器械可以长期植入人体。( 3 ) 细胞适应性和相互作用：胶原蛋白作为哺乳动物细胞外结构基质的骨架，为细胞生长提供依附和支持。由于胶原蛋白富含二氨基二羧基氨基酸等亲水性化合物，而细胞表面存在类似纤连糖蛋白，对胶原表面的特定区域有高度亲和性，因此与细胞的粘附、生长及表型达均有密切关系，而且能诱导上皮细胞等增殖、分化和移行【6 。8 j 。( 4 ) 生物相容性：胶原蛋白是细胞外基质的骨架，其特有的三螺旋结构，使其不论作为形成新组织的骨架被吸收，还是被宿主同化，都表现出良好的生物相容性。( 5 ) 生物可降解性：胶原蛋白只有在胶原酶的作用下才能造成肽链断裂，破坏螺旋结构而被水解，这些水解片段在体温条件下能够自行变性，进一步被降解为寡肽或氨基酸，最后被机体利用或排出。因此，胶原蛋白可以用作人造器官进行移植。1 1 2 2 胶原蛋白的应用如上所述，由于胶原蛋白具有很高的生物相容性、生物可降解性以及生物活性，并且还具有低免疫原性、在体内易被吸收、促进细胞成活与生长、血小板凝结、细胞的迁移、分化和繁殖等的优势，并且还能使结缔组织具有一定的机械强度【9 】。所以，胶原蛋白应用很广泛。在生物组织材料中，用胶原制备的组织工程支架材料植入机体后，待新组织长成之后，胶原会被机体降解吸收，而且降解产物为氨基酸，不会给机体带来毒性，现在已经将胶原蛋白用在手术缝合线、止血海绵、人工皮肤、人工血管、人工食管、人工骨、一i i ,脏瓣膜、角膜等材料的制备上，胶原蛋白经特殊处理后，还可用于烧伤、创伤和眼角膜疾病治疗、美容、矫形、组织修复、创面止血、药物缓释剂、控释剂等 1 0 , 1 1 】；在食品工业方面，由于胶原蛋白富含除色氨酸、半胱氨酸和酪氨酸外的1 8 种氨基酸，种类丰富，蛋白质含量高，不含脂肪，而且胶原多肽可以在肠道中直接被吸收，经常食用含胶原蛋白丰富的食品，能有效地增加皮肤组织细胞的储水能力，增强和维持肌肤良好的弹性，强化肌肤的韧性，延缓机体的衰老，同时还可强筋健骨，增强体质。所以，可以作为肉制品改良剂、饮料、酒类食品澄清剂、乳制品添加剂、新型调味品剂、食品涂层材料和食品包装材料等【1 2 】；在化妆品行业，胶原蛋白之所以应用美容、美肤、美发用品中，是因为其含有大量的作为保湿因子的极性基团，同时含有的酪氨酸残基可抑制酪氨酸氧化2西北大学硕上学位论文酶的活性，防止黑色素沉积；另外还用于造纸、表面活性剂、膜制造工业及饲料添加剂竺f 1 3 一1 5 j可o1 1 3 天然胶原蛋白的生产，传统获取胶原蛋白的方法，主要是通过用酸、碱水解法或者是酶法从动物结缔组织中提取。现今采用的方法主要有传统提取法，化学合成法，现代生物技术生产法三大类【1 6 】。前两个获取途径，存在很大的局限性：首先，胶原蛋白在提取过程中，会丧失部分生物活性，还存在很大的病毒隐患1 7 】；其次，胶原蛋白制成的产品注入体内，会有排斥反应，导致炎症或是细胞毒性；最后，利用化学合成的胶原蛋白往往不具有生物活性结构，并且技术较为复杂，成本较高【1 8 】。因此胶原蛋白的应用受到了很大的限制。鉴于此，人们都在努力探索其他方法，以便获得无病毒隐患和排异反应，有着更强生物活性的胶原蛋白。当前，已经有人利用基因工程技术改造一些诸如转基因鼠、昆虫、转基因烟草、大肠杆菌和酵母等宿主生产重组胶原蛋白，产品安全性好、质量稳定【1 9 圳】。1 2 重组类人胶原蛋白研究状况胶原蛋白由于具有非抗原性、可生物降解和易吸收、无毒及生物相容等特性，在医学材料领域备受青睐，被广泛用作手术缝合线、止血海绵、人工皮肤、人工血管、人角膜、药物载体等。但是人工从动物组织提取的胶原蛋白存在很多隐患，人们开始把目光转向利用基因工程技术生产胶原蛋白【2 2 2 孔。伴随着基因工程，蛋白质工程等分子生物学研究的发展，人们开始运用基因工程技术制备胶原蛋白的研究，其中主要有重组胶原i 、i i 、i i i 、型的研发。目前，用于重组胶原蛋白研究的有：重组酵母细胞生产准人胶原蛋白i i ，重组哺乳动物细胞生产准人胶原蛋白i 、i i 、i 型，重组昆虫细胞生产准人胶原蛋白i i ，人肿瘤细胞生产准人纤维胶原i a l 和i a 2 。由于动物细胞培养成本高，周期长，分离提取步骤复杂、不易，且很难放大生产规模，实现产业化，仅限于实验室规模生产，供应量有限，限制了他的应用范围。现阶段制备重组胶原蛋白的方法很多。例如，通过转基因动物、植物和微生物制取重组胶原蛋白等。1 9 9 9 年，b r u i n e c 等分别使用汉森酵母和毕赤酵母作为宿主，表达人i 型胶原蛋白的肽链，发现使用胶原蛋白自身的信号肽能使汉森酵母表达并分泌重组蛋白，却不能使毕赤酵母分泌重组胶原蛋白【2 4 1 。n o k e l a i n e nm 等人使用两种杆状病毒转染的昆虫细胞做宿主，用以生产类人特异性软骨胶原i i 型，结果表达出具有稳定三3第一章综述维结构的蛋白f 2 5 l 。2 0 0 0 年m y l l y h a r j uj 等人报道了使用甲基酵母p i c h i ap a s t o r i s 表达生产准人纤维胶原蛋白i 、i i 、i i i 型。2 0 0 1 年，荷兰的w e r t e n mw t 等利用重叠延伸p c r法获得重组明胶的约3 0 0 b p 基因序列，改造后转入毕赤酵母中进行表达，生产出重组明胶。2 0 0 6 年，芬兰胶原蛋白研究中心继续利用毕赤酵母，选择性的分泌表达没有c端肽的单链重组胶原蛋白片断( 9 k d a - 4 5 k d a ) 2 7 】，还有使用甲基酵母p i c h & p a s t o r i s 高水平表达i 型前胶原，在啤酒酵母中表达出了携带有羟基化片断的类人i i i 型胶原蛋白【2 8 1 ，另外，还有在转基因烟草及转基因蚕中表达出类人胶原蛋白，利用重组大肠杆菌高密度发酵生产类人胶原蛋白及其衍生物 2 9 - 3 1 】。2 胶原蛋白一i i2 1 胶原蛋白i i 介绍2 1 1 胶原蛋白1 1 分布胶原蛋白i i 是胶原蛋白众多类型中的一种，属于纤维形成性胶原( f i b r i l f o r m i n gc o l l a g e n ) ，它具有胶原的基本特征，主要分布在机体透明软骨、玻璃体、髓核、胚胎角膜、神经视网膜肌腱等部位【3 2 1 。2 1 2 胶原蛋白i i 的结构特点胶原蛋白一i i 是在前胶原蛋白i i 的基础上5 b h - r 成熟而形成的。胶原蛋白i i 长约3 0 0 n m ，含有三条完全相同的链，命名为伪( i i ) 多肽链，其分子组成为胁( i i ) 3 。其中，每条链中，甘氨酸、脯氨酸、羟脯氨酸、赖氨酸和羟赖氨酸等主要氨基酸数量分别为3 2 0 、1 0 8 、1 0 0 、1 3 和1 2 个，且羟赖氨酸的羟基几乎全和糖结合，含糖量约1 0 。啦链中间含有3 0 0 个g l y x y 重复序列，g l y 为甘氨酸，x 位置上常常是脯氨酸，y 位置上常常是羟基脯氨酸残基，在g l y x y 重复序列的两侧是n 端和c 端前肽。由于胶原蛋白一i i 的胶原分子含有非胶原的氨基和羧基扩展肽，前a l 链转录后经过修饰，包括y 位置上的脯氨酰残基的羟化，然后折叠成热稳定的三螺旋前胶原蛋白分子分泌到细胞外，再经特异性蛋白酶切除n 端和c 端的非胶原的氨基和羧基扩展肽，转变成的原胶原可进一步有规则地聚和成胶原微纤维。三条诵链通过螺旋链之间的作用力构成稳定的三螺旋结构，然后通过n 端和c 端肽使胶原蛋白自动组装成纤维，再与其他大分子一起形成细胞外软骨生物机械的重要支架。因为胶原蛋白i i 构成了一个三维网状结构，蛋白多糖的多聚体就埋在这个网状结构中，所以胶原蛋白i i 纤维的形成还受其他大分子如蛋白聚4两北大学硕十学位论文糖和非纤维的胶原的调节【3 3 。3 5 1 。天然胶原蛋白是可溶性的，在一定温度下加热，其理化性质和生物学性质会发生很大变化，包括可溶性及粘滞度降低，沉降率和旋光行性明显改变，三股超螺旋结构被破坏变为单股无规律的卷曲而失去生物学活性。2 1 3 胶原蛋白i i 相关研究不同类型的胶原蛋白在机体内分布是不同的，因此其生理机制也就不同f 3 6 1 。在角膜中，胶原蛋白一i i 与其他类型胶原蛋白存在很多空隙，呈不规则状，不仅造出了角膜特殊的形状，而且赋予角膜透明性的特殊功能。作为软骨基质的主要有机成分，胶原蛋白i i 确保了软骨细胞栖息的场所，造出了致密的、立体的网状结构，其正常装配，可防止高度水化的蛋白聚糖的膨胀，是维持关节软骨组织正常理化性质、力学性能等的主要基质例。关节软骨的物理强度和特性所依赖的胶原网络实际上就是指完整的胶原蛋白一i i 网络，所以胶原蛋白一i i 的新陈代谢情况可以用来衡量关节软骨的健康程度。胶原蛋白一i i作为透明软骨的主要结构性组分，许多软骨性疾病的发生发展，都与胶原蛋白i i 的结构或功能异常密切相关【3 7 】。早在1 9 7 7 年，t m e h t m a 就检测到类风湿关节炎病人的血清及关节滑液中存在胶原蛋白i i 的抗体，并且用牛胶原蛋白i i 诱导大鼠关节炎模型成功，认为它的抗原性存在于螺旋型构型中。随后c o u r t n e c y 用小鼠建造关节炎模型成功，实验发现，用胶原蛋白i i 刺激大鼠可以诱发产生胶原蛋白关节炎，其病理发现和人类风湿关节炎有相似之处 3 8 , 3 9 】。随着分子生物学技术的发展和应用，发现原胶原蛋白i i 基因异常将导致多种原发性及继发性骨关节炎，大约有5 0 多种编码原胶原蛋白i i 基因( c o l 2 a 1 ) 的点突变、缺失、插入及倍增等突变与软骨发育不良有关【加1 。目前普遍认为，与类风湿性关节炎相关的原胶原蛋白i i 基因( c o l 2 a 1 ) 的变异，大多是导致前胶原蛋白i i 的0 ! 链g l y - x y 重复序列上必要氨基酸g l y 置换成c y s 的点突变( g l y - - , c y s ) ，也有导致y 位a r g - - - c y s 的点突变，而突变产物在正常条件下不能被正确装配成原纤维。另一方面，虽然突变的胶原蛋白i i的单位没有足够的亲和力以形成原纤维，但它对正常胶原蛋白i i 单体所形成的“核”的亲和力，足以影响正常型胶原蛋白纤维的装配，从而增加了装配的延迟期( l a gp e r i o d ) ，改变了正常胶原蛋白i i 链所形成的原纤维的形态结构，影响了关节软骨正常理化性质、力学性能，从而导致软骨损伤。y a n g 等研究发现，转基因小鼠前胶原蛋白i i 基因的缺失，可导致软骨细胞表现出5第一章综述核固缩、核d n a 断裂、b c l 2 下调的变化，这可能是因为整联蛋白的迁移、分化和增殖需要胶原蛋白i i 作其生理配体，它的缺失影响了整个由整联蛋白介导的细胞基质相互作用过程中的许多配体而导致软骨细胞的凋亡。w i l k i ndj 等最近报道k n i e s t 发育不良( k n i e s t d y s p l a s i a ) 也是由原胶原蛋白一i i 基因的三股螺旋链部分缺失或剪接位置改变导致胶原蛋白i i 骨架内部改变而成的。另外，胶原蛋白i i 的缺失，也可能影响无血供的软骨组织的氧、水营养成分的供给。这可能是骨关节炎的又一病理基础。胶原蛋白i i 除了作为关节软骨主要的结构成分，对软骨生物性能具有直接影响外，同时也为受体介导的细胞基质问相互作用提供底物。这些相互作用导致细胞骨架的重新排列，并通过一系列的蛋白酶激活信号传递系统，以上调早期反应基因，女n c - j u n 和c f o s 的表达。这些细胞一基质问的相互作用可调控细胞凋亡。椎间盘是由多种结缔组织构成的高度特异性结构，8 0 的椎间盘胶原由i 型和i i 型构成【4 1 1 。胶原蛋白一i i 主要存在纤维环的内层，特别是髓核中，其主要作用是承受和吸收传导压力。髓核之所以能吸收震荡、维持应力平衡，与椎问盘组织结构中存在大量的胶原蛋白i i 是分不开的。但是，椎问盘退变时，由于髓核中与胶原蛋白1 1 分泌合成相关的椎间盘内的细胞经常受到各种炎症介质、自由基等外来因素的影响，基因处于不能转录或者关闭状态，因此无新的胶原合成；而原胶原在被激活的胶原酶及其他各种中性蛋白酶的作用下分解加速，椎间盘胶原蛋白i i 的代谢失衡，椎间盘胶原结构框架出现变性、损坏、紊乱，对各种应力的耐受、传导能力明显减弱。在外力的作用下，椎间盘的形态结构容易发生改变，产生继发性变化【4 2 1 。2 1 4 胶原蛋白i i 特性及应用胶原蛋白i i 作为软骨基质的主要成分，可以制成制剂或口服剂，当进入人体之后能增强细胞再生功能，并在细胞与细胞之间发生连接作用，补充关节问的软骨粘性，对老化受损的软骨提供了再造的可能，对预防骨骼衰退、关节发炎、关节风湿等均有良好的再生功效。胶原蛋白i i 特殊的结构及性能，使其可以应用到生物组织材料方面。胶原蛋白i i具有以下特点，可以作为支架材料应用在骨组织工程和皮肤组织工程【4 3 】：( 1 ) 胶原蛋白i i 在软骨基质中含量最高，对软骨细胞的发生分化和迁移具有重要的诱导作用，有利于关节软骨的再生。另外，其在维持软骨细胞表型和细胞外基质的合成方面效果显著。6西北大学硕士学位论文( 2 ) 胶原蛋白一i i 具有生理活性和凝血作用，其特殊的四级结构使其有很好的凝血能力，可以作为止血材料应用在医疗方面。( 3 ) 可以促进细胞生长和形成新的胶原纤维，这对于构建人工真皮具有重要的意义。( 4 ) 胶原蛋白i i 是由完全相同的三条啦肽链螺旋构成的。其原胶原分子中不含色氨酸残基，酪氨酸残基也很少，因此原胶原分子的免疫原性低，具有很好的生物相容性，降解后无毒副作用。( 5 ) 制备的胶原蛋白一i i 海绵支架具有良好的孔隙率和组织相溶性，与胶原凝胶相比具有一定的机械强度。( 6 ) 现今，已经有很多关于胶原蛋白i i 提取、纯化及人工制备的方法，所以解决了原料供应问题，使其作为组织工程材料成为可能。2 2 重组类人胶原蛋白i i 研究现状胶原蛋白i i 仅在关节软骨等少数组织中表达，因此直接从关节软骨中提取m r n a非常困难。随着重组胶原蛋白产业化的实现，其在医药方面的应用价值r 益显现，并已经有产品上市，j t l f i b r o g e n 公司能提供重组人i 、i i 、i i i 、w 、等多种类型的胶原蛋白。但其产量低、分离纯化耗资大、价格昂贵。国外在9 0 年代初，已开始对重组人胶原蛋白一i i 进行研究，目前已经取得很大的进展。1 9 9 7 年，芬兰o u l u 大学胶原蛋白研究中心开始研究利用毕赤酵母表达人i 、i i 、i i i全序列胶原蛋白，后来取得了很大的成功。另外，在小鼠n i h3 t 3 细胞、人肾脏肿瘤细胞系h t l 0 8 0 及昆虫表达系统中，都成功地表达了重组人胶原蛋白i i ，并已应用于胶原纤维形成的研究【4 4 4 5 1 。虽然制备重组胶原蛋白i i 的方法很多，但大都采用动物细胞做宿主。胶原蛋白一i i 的前( i i ) 链需要至少8 种以上的酶参与翻译后的修饰，才能形成稳定的三螺旋结构原核。而细胞中由于缺乏这些修饰酶，因此在原核系统中表达胶原蛋白的研究未受到重视。然而在研究胶原蛋白i i 的免疫活性时，大多使用的是化学合成的多肽或动物性胶原蛋白一i i 及其片段。而化学合成的多肽并没有进行过翻译后的修饰，且都是单链，但这并未影响其免疫活性，这就为在原核细胞中表达也具有同样免疫活性的重组的胶原蛋白一i i 提供了理论依据，对在原核系统中表达胶原蛋白片段的研究也具有潜在的价值【4 6 1 。目前采用的宿主有转基因动物、植物、微生物等等。由于利用转基因微生物法制取重组类人胶原蛋白一i i 具有的优良特性而使微生物表达体系越来越被采用。用于制备胶原蛋白的微生物体系包括原核和真核表达系统。王宏坤等将重组的人型胶7第一章综述原蛋白2 5 0 2 7 0 多肽片段( 人源胶原蛋白i i2 5 0 2 7 0 ) 转入大肠杆菌基因组中进行表达，并对各影响因素做了系统优化，获得了高效表达的重组人胶原蛋白i i 多肽【3 7 1 。还有利用毕赤酵母高效表达重组胶原蛋白一i i 的相关研究。2 3 重组类人胶原蛋白i i 生物学性能重组类人胶原蛋白i i ( r e c o m b i n a n th u m a n 1 i k ec o l l a g e ni i ，h l ci i ) 是用重组大肠杆菌细胞经发酵生产的人源型胶原蛋白。首先，将人胶原蛋白一i i 的m r n a 经酶切后逆转录成c d n a ，修饰后并进行特定的序列重复，然后链接、转入大肠杆菌( e s c h e r i c h i ac o l i )内，在经过高密度发酵、分离、复性、纯化等工艺后，获得的一种生物活性高的蛋白。重组类人胶原蛋白i i 不但维持了胶原蛋白的特性，并由于其独特的重复结构赋予其一些新的特性，使其应用领域更加广阔。重组类人胶原蛋白i i 具有良好的生物相容性、细胞黏附性，可以促进新细胞、上皮细胞和软骨细胞生成，还具有止血功能，机械性能良好等功能。同时与天然胶原蛋白一i i 的生物活性相比，还具有以下的优势：a 重组类人胶原蛋白i i 不仅具有天然胶原蛋白i i 本身的特性，而且其三螺旋结构，使其在热条件下可逆成胶、在分子量及特性不变条件下具有可加工性，而由动物组织提取的胶原蛋白一i i ，如果不减少分子量，就不会重溶解。另外，可以按照需要加工成条状、薄片状、海绵状等便于使用。b 由于从动物组织中提取的胶原蛋白存在各种缺陷，直接限制了其用途的开发，而重组类人胶原蛋白弥补了这些不足，作为一种新的生物材料，它可广泛用于医疗卫生行业，而且还有待进一步开发它的其他用途。c 重组类人胶原蛋白i i 作为为水溶性蛋白，不同于水解性胶原蛋白，其分子量较大，无论用作皮肤的网状支撑、手术缝合线，或是骨组织材料支架，都具有很强的优势。d 重组类人胶原蛋白i i 是由人体胶原蛋白部分已知序列基因构建的，对其( i i )肽链进行改造，摒弃了容易引起免疫反应的色氨酸、酪氨酸等氨基酸残基并进行特定的序列重复。因此，在进入人体后，其免疫排异反应与来自动物组织的胶原蛋白相比大大减少。3 重组大肠杆菌高密度发酵3 1 高密度发酵概述狭义的发酵是指在厌氧条件下葡萄糖通过酵解途径生成乳酸或乙醇的分解代谢过程；广义则将发酵看作是微生物把一些原料养分在合适的发酵条件下经特定的代谢途径8西北人学硕上学位论文转变成所需产物的过程。高密度发酵( h i g h d e n s i t yf e r m e n t a t i o n ) 则是指微生物沉没培养时其细胞密度达到1 0 0g - l - 1 以上的水平，是近几年发酵工业的目标和方向。高密度发酵是现代发酵工程的一项新技术，能显著提高大肠杆菌菌体和基因工程产品的产量。实现重组大肠杆菌高密度发酵生产类人胶原蛋白，提高菌体的发酵密度，最终提高产物的比生产率，不仅可减少培养体积、强化下游分离提取，还可以缩短生产周期、减少设备投资，从而降低生产成本，极大地提高市场竞争力。这一目的的实现，除了重组菌本身的表达性质外，还必须赋予重组菌生长和产物表达的最适环境条件。而利用一般的发酵工艺培养基因工程菌，不仅细胞生物量，而且目的产物表达量都比较低，难以获得理想的生产效率和经济效益。因此，现在大都采用高密度发酵技术培养微生物，以期获得高产量的目的产物。3 1 1 高密度发酵培养方式可供选择的发酵方式主要有分批发酵、补料分批发酵、连续发酵及透析培养等几种方式。3 1 1 1 分批发酵分批发酵是一种准封闭式系统，种子接种到培养基后除了气体流通外发酵液始终留在生物反应器内。分批发酵中，接种后就不再加入或移去任何物质，微生物生长是按典型的生长曲线进行的。虽然其操作简单，周期短，减少了染菌的机会，生产过程、产品质量易掌握，但不适用于测定过程动力学，因使用复合培养基，不能简单地运用m o n o d方程来描述生长，存在基质抑制问题，出现二次生长( d i a u x i cg r o w t h ) 现象。3 1 1 2 补料分批发酵补料分批( f e d b a t c h ) 发酵是在分批发酵过程中补入新鲜料液，以克服养分的不足而导致的发酵过早结束。因只有料液的输入，没有输出，故发酵液的体积在增加。其中，补料一分批培养已被确认为实现高密度、高表达的最有效的方法，补料分批发酵的优点在于：能在这样一种系统中维持最低的基质浓度；避免快速利用碳源的阻遏效应和能够按设备的通气能力去维持适当的发酵条件，并且能减缓有害物的不利影响；避免由于菌体快速生长而造成的质粒不稳定问题。3 1 1 3 连续发酵连续发酵是在发酵过程中一面补入新鲜的料液，一面以相同的流速放料，维持发酵9第一章综述液原来的体积。连续发酵克服了分批培养中遇到的营养物耗尽以及细胞衰亡的问题，抑制性副产物不会积累，菌体生长一直处于指数生长期。连续发酵过程的设备利用率高，操作简单，产品质量较稳定，可及时排除在发酵过程中产生的对发酵过程有害的物质。但其增加了染菌的机会，生产菌种不稳定。3 1 1 4 透析培养透析培养是通过半透膜有效的去除有害的低分子代谢产物，并向培养液提供充足的营养物质的培养方式【4 7 】。这种培养方式可以增加生物量的积累，降低营养物质的损失。l e es y 等利用中空纤维素过滤装置除去乙酸，可在较高葡萄糖浓度下实现高密度发酵 4 8 1 。但是这种培养方式所需的反应器需要添加额外的透析组件或膜过滤系统、辅助泵及其它发酵罐等，投资较大。本课题采用补料一分批发酵方式，它吸取了连续培养的优点，可消除高浓度底物对细胞生长的抑制作用，还可弥补低浓度底物限制细胞生长的缺陷，流加高浓度营养物质既可满足高密度发酵时对营养源的大量需求，又能减少生长抑制物的产生，从而有效地控制了菌体的生长过程。3 1 2 补料方式的选择采用补料一分批发酵技术，可以解除基质过浓的抑制、产物的反馈抑制和c r a b t r e e 效应，避免在分批发酵过程中因一次性投糖过多造成细胞大量生长，耗氧过多而供应不足的状况。重组大肠杆菌高密度发酵成败的关键是补料策略和诱导策略。补料过多，基质在反应器中积累，会对细胞生长和产物形成造成抑制，同时积累大量有机酸：补料不足，会导致营养物的匮乏，影响细胞生长，进而不利于产物的表达【4 9 1 。因此大肠杆菌高密度发酵中，合理流加碳源以降低葡萄糖效应是成功的关键。根据补料方式是否受生物传感器的反馈控制，补料分批发酵的操作方式可以分为非反馈补料和反馈补料两大类：a 非反馈补料方式中，包括恒速补料、变速补料和指数补料。恒速补料是指，预先设定的恒定的营养流加速率，细菌的比生长速率逐渐下降，菌体密度呈线性增加；变速补料是在培养过程中流加速率不断增加，细菌比生长速率在不断改变；指数补料是指培养基流加速度呈指数增加，比生长速率为恒定值，菌体密度呈指数增加。b 反馈补料方式包括：一i g p h 值法，即在线检测葡萄糖或甘油浓度控制碳源的浓度。通过p h 值的变化，推测细菌的生长状态，调节流加葡萄糖速度，调节p h 为恒定值；l o两北大学硕十学位论文恒溶解氧法，是以溶解氧为反馈指标，根据溶解氧的变化曲线调整碳源的流加量；菌体浓度反馈是通过检测菌体的浓度，拟合营养的利用情况，调整碳源的加入量； c e r法则是通过检n - 氧化碳的释放率( c e r ) ，估计碳源的利用情况来控制营养物的流加。d o s t a t 法，通过控制溶解氧、搅拌和补料速率，维持恒定的溶解氧，控制减少有机酸的生成。3 2 高密度发酵的影响因素高密度发酵对发酵设备和发酵条件要求比较高，影响高密度发酵的因素非常多。研究显示，培养基组成、培养方式，以及培养过程中诸如p h 、培养温度、溶解氧浓度、发酵过程中生长抑制物的积累、诱导方式、补料方式等的变化，可以影响重组外源蛋白的转录、翻译、水解活性、分泌表达的水平和稳定性。在重组蛋白的高密度发酵时需要对这些影响因素进行优化。3 2 1 底物因素高密度发酵要获得高生物量和高浓度表达产物，般使用的培养基为半合成培养基。培养基各组分的浓度和比例要恰当，过量的营养物质反而会抑制菌体的生长，特别是碳源和氮源的比例。如果碳氮比偏小，会导致菌体生长旺盛，进而造成菌体提前衰老自溶；碳氮比过大，菌体繁殖数量少，细菌代谢不平衡，不利于产物的积累。底物浓度过高会积累大量代谢抑制物，使细胞生长和外源蛋白的表达受到抑制，降低生产效率：底物浓度过低，又不利于菌体生物量的提高，难以达到高密度发酵的目的【5 0 】。因此，优化底物浓度和营养物的配比，可以满足细胞旺盛的新陈代谢的需要，获得高密度发酵的理想结果。在高密度发酵中，基质内的微量元素及各种无机盐的含量对细胞的生长繁殖和目的基因产物的表达也有很大的影响。微生物对钙、铁、锰、锌等微量元素的需求量很小，但微量元素对微生物的活性却起到很大的作用。如朱才庆等在培养大肠杆菌d a l 9( d h 5 c t 的耐乙酸突变株) 时，发现在基本培养基中添加混合微量元素后菌体生长大大改善【5 1 1 。另外还