DNA重排的检测方法.ppt

DNA重排的检测方法,马欣荣高方远康海歧,一、形态学观察二、细胞遗传学如：染色体核型分析、染色体显带等三、分子细胞遗传学如：荧光原位杂交四、分子生物学如：Southern杂交，PCR及相关技术等,一、形态学观察例子：上个世纪40年代科学家BMcClintock观察研究玉米籽粒和叶子时发现有颜色变化。这种颜色变化是由遗传结构的基本改变引起的，从而导致转座子的发现。肿瘤细胞与正常细胞肿瘤细胞中基因重排现象非常普遍，遗传结构的改变引起表型的改变。因此从形态学上可以鉴定肿瘤。,二、细胞遗传学染色体核型分析、染色体显带一个物种的染色体核型及带型是稳定的染色体核型分析：观察中期染色体，初步分析染色体有无较大片段的缺失、断裂、易位、及附加常规核型分析荧光核型分析光谱核型分析(Spectralkaryotyping,SKY),光谱核型分析原理(Spectralkaryotyping,SKY)1996年Schroch等首次描述了SKY技术。应用5种荧光素同时标记24条人染色体，制成染色体涂染探针，应用Fourier光谱仪，CC成像和荧光显微镜进行检测分析，经计算成像处理，46条染色体形成具有不同颜色的核型影像,可用以分析各种染色体异常。优势：特异性和分辨率比传统的显带技术高，它可以检测到1.5mb碱基的转位一次杂交即可分辨人的24条染色体,人染色体光谱核型分析,乳腺癌细胞染色体复杂的畸变,2.染色体显带技术：C-banding主要染异染色质R-banding与C-banding相反，主要染常染色质区域G-banding是Giemsa染色结果，产生深浅不同的条带Q-banding是用喹丫因（quinacrine）染色得到的荧光条带，带型与G带相似,G-带c.正常染色体末端缺失d.末端倒位末端单向易位e.着丝粒周倒位,G带显示人急性骨髓白血病异常染色体9、10、11染色体间易位，右为异常染色体,三、分子细胞遗传学原位杂交（Insituhybridisation）标记的核酸探针变性后与已变性的靶核酸在退火温度下复性，在不改变被分析对象，即维持其原位的前提下对靶核酸进行分析。2.荧光原位杂交Fluorescentinsituhybridisation(FISH)核酸探针用荧光染料标记，荧光信号通过显微镜观察。,3.染色体涂染(Chromosomepainting)又称为多重荧光原位杂交(multiplex-fluorescenceinsituhybridisation,M-FISH)可同时检测多个染色体，一次杂交即可检测人的24条染色体可检测简单及复杂的染色体重排,荧光原位杂交，据标记物不同可分为：间接法：用生物素或地高辛标记探针，通过与荧光染料结合的抗生物素或抗地高辛抗体将信号放大而进行检测。直接法：直接用荧光素标记，如Vysis公司的FISH探针。,荧光原位杂交原理示意,荧光原位杂交过程,急性骨髓白血病10、11号染色体间易位,10、11号染色体易发生断裂的基因(MLL)位点,小麦簇毛麦F1代染色体间易位,染色体涂染显示人染色体组,荧光标记探针不对环境构成污染灵敏度能得到保障可进行多色观察分析，可同时使用多个探针，缩短因单个探针分开使用导致的周期过长和技术障碍。,4.比较基因组杂交ComparativeGenomicHybridization(CGH),原理：在荧光原位杂交基础上，结合消减杂交技术而发展起来的技术，主要用于肿瘤的检测及其基因组分析是由Kallioniemi等在1992年首先提出的，是检测整个肿瘤基因组DNA增加或减少的强有力的工具,比较基因组杂交原理示意,肿瘤DNA和对照DNA在染色体上的相对结合量取决于两种DNA标本中相应杂交序列的多少因此可根据不同荧光強度的比率而定量分析肿瘤基因組中DNA的增加或丟失,等比混合,比较基因组杂交过程,DAPI4,6-二联脒-2-吲哚苯,FITC异硫氰酸酯,TRITC硫氰酸四甲基罗丹明,人染色体不同荧光素染色结果,数字化图像,FITC/TRITC荧光强度比率分析图RatioimageFITC/TRITC,应用：主要应用在检测肿瘤细胞的遗传变化物种间染色体同源性比较优势：可快捷检测中期、间期基因组不需预先知道DNA发生改变的部位一次实验即可检出待测样本整个基因组拷贝数的增减,1.Southern-blotting,应用于基因重排检测是1981年Korsmeyer等首先进行的。淋巴瘤DNA重排:将细胞DNA抽提出来,用限制性内切酶进行酶切，胚系DNA就会产生特征性片段。但发生过基因重排的细胞DNA的酶切位点有所改变，会产生有别于胚系的DNA酶切片段。转膜后，与标记的DNA探针杂交，如有一定数量的克隆性增殖的淋巴细胞存在(15%），克隆性的基因重排条带就可显示出来。对于正常或多克隆性的淋巴细胞增生，由于重排片段大小各异而显弥散带。,四、分子生物学技术,Figure5._SouthernblotanalysisoftheT-cellreceptor-chaingene.Threespecimensareshown,eachdigestedwithEcoRI,BamHI,andHindIIIrestrictionenzymes,runinagarosegels,transferredtoanylonmembrane,andhybridizedwitharadioactivelylabeledJprobe.Twospecimens,one(negativecontrol)inlanes2,5,and8,andthesecondinlanes3,6,and9,revealonlygermlinebandsandarepolyclonal.Thethirdspecimen,inlanes4,7,and10,hasevidenceofgenerearrangementinall3lanesandismonoclonal.Lane1showsthemarkers.Lane11isa5%sensitivitycontrol,优势：Southern分析已被应用于IgH、Igk、Igl及各种TCR(T-细胞受体)克隆性重排的检测，并以其令人满意的灵敏度和可靠性被视为基因重排检测的“金标准”。局限：需要较大量（10mg）新鲜或冰冻组织，操作复杂，若用放射性同位素标记，时间过长（约两周），易污染等缺点，仅适用于科研而不适用于临床诊断。改进：荧光素标记IgH、Igk、Igl及各种TCR探针化学发光试剂盒克服了上述缺点，以荧光素取代了同位素作为标记；缩短了曝光时间(510分钟)，并且敏感性不降低，非常有利于在临床诊断中推广、应用。,DNA发生重排后，其扩增产物条带与正常的有差异，由此可以检测DNA重排淋巴瘤诊断：淋巴瘤是细胞克隆性增生的结果，其特殊的基因重排形式占一定的数量优势，从而成为细胞克隆性的检测指标。选取IgH与TCR（T细胞受体）的V、D、J、C区基因编码中20个左右的保守核苷酸序列，人工合成一对或多对（家族基因）引物，以待测样品DNA为模板，扩增目的DNA序列片段。如果是淋巴瘤则扩增产物电泳出现单克隆性单带。而良性增生性淋巴组织或正常组织则出现弥漫涂片状，,2.常规PCR技术,不形成单带。,转基因材料外源基因的检测,1,标准分子量；2，质粒；3，对照；4-8，转基因植株,12345678,转基因黑麦草PCR检测外源Ubi启动子,(1)PCR-RFLP:多聚酶链反应(PCR)-限制性片段长度多态性(restrictionfragmentlengthPolymorphism，RFLP)原理：PCR产物限制性内切酶切多态性分析，DNA发生重排后，酶切位点发生改变。优点：具有分辩率高，无需标记,重复性好，简便快速直观等。主要用于核酸变异性分析与比较,微生物的分群分型分亚型，癌基因分析，遗传病的诊断等。局限：只能应用突变引起限制性酶切位点改变的情况下，一次只能完成一个特定位点突变筛选，检测效率低。,3.PCR相关技术,PCR-RFLP原理示意,原理：是将经扩增的DNA片段经过变性处理，形成单链，由于序列不同，单链构象就有差异，在中性聚丙烯酰胺凝胶中电泳的迁移率不同，通过与标准物的对比，即可检测出有无变异。刚建立时是将同位素掺入PCR扩增的产物中，通过放射自显影显示结果。后用银染取代同位素显示DNA带型，大大降低了成本，具有经济、快速、灵敏等特点。1993年起用EB染色法显示DNA带型，使得SSCP操作更简单，更经济，更迅速。,（2）PCR-SSCP：聚合酶链反应一单链构象多态性(singlestrandconformationpolymorphism),聚合酶链反应一单链构象多态性（PCR-SSCP）示意,优点：检测基因变异，具有操作简便、快速、不需特殊设备，适用于大样本筛选。己广泛应用于检测各种病原体基因的点突变及缺失突变，基因的多态性分析等。,（3）PCR-southernblot及Dotblot技术：PCR-southernblot原理：是将PCR扩增产物转移到硝酸纤维膜或尼龙膜上，再与标记的特异性探针进行杂交，来检测有无特定的扩增片段及相对含量。优点：可以直接检测基因的点突变，缺失及重排，比PCR产物EB染色电泳分离法的灵敏度至少要高103以上，由于非放射性同位素标记的探针的应用，使得PCR-southernblot应用更简便，现己广泛应用于癌基因、遗传特异基因、病原体特异基因等方面的研究及检测。,PCR-Dotblot即是将PCR扩增产物变性后直接点在膜上，与标记的特异性探针进行杂交。优点：时间短，可半定量分析，一张膜上可同时检测多个样品。局限：只能看到一个斑点，必须小心控制反应条件，设立阳性及阴性对照，以便对检测标本做出正确鉴定.,原理：在扩增反应中加入不等量的两段寡核苷酸引物，引物量相差100倍，通过PCR扩增获得单链DNA，然后利用双脱氧法直接测序。应用：扩增产物的测序，可以很容易确定群体中某一特定基因的序列变异情况，这种方法是了解目的基因突变的较理想的方法。,（4）不对称PCR（asymmetricPCR）直接测序法,原理：即聚合酶原位扩增技术。将PCR技术与原位杂交技术结合起来，不改变周围组织的原有位置，直接在组织、细胞或病原体原位研究基因变化的技术。,(5)原位PCR技术,固定组织,蛋白酶K消化,PCR扩增,显微镜观察,dNTP-荧光素,或dNTP-地高辛-生物素,或荧光染料抗地高辛抗体抗生物素抗体,优点：提高了杂交的灵敏度，又能直接显微观察病变部位，且标本不需特殊处理或制备，比较省时和经济，尤其对形态学研究具有其它方法难以比拟的独到长处。应用：原位PCR自创立以来，已经在神经性疾病、肿瘤、微生物病原体等多种检测中得到广泛应用。,（6）RT-PCR(reversetranscriptase-PCR),原理：mRNA反转录后进行PCR扩增。实际上是检测基因表达产物的方法。优点：灵敏度高，可在106个正常细胞中检测出1个白血病细胞。,4.基因芯片技术检测基因突变,基因芯片（genechips)DNA芯片(DNAchips)DNA微阵列（DNAmicroarray),将数以万计的DNA探针按照一定的顺序排列固化于支持物表面上，产生二维DNA高密度的分子探针阵列，然后与标记的样品进行杂交，再利用计算机控制的信号产生、识别及图象处理系统进行结果分析来实现对生物样品快速、并行、高效地检测。基因芯片技术是分子生物学、信息科学、材料科学、微加工技术、光学检测技术、计算机技术等多学科相互结合的产物。,DNA方阵的构建芯片制作,硅片、玻璃片、瓷片或聚丙烯膜、尼龙膜等支持物,带标记样品DNA或mRNA的准备,分子杂交,杂交图谱的检测和分析,计算机控制的信号产生、识别及图象处理系统,二维DNA高密度的分子探针阵列,生物样品快速、并行、高效地检测,通常是荧光标记,PCR扩增,基因芯片突变检测原理示意,DNA芯片,应用：突变检测，基因测序，DNA重排，多态分析，基因表达，克隆选择，文库筛选，病源诊断，药物筛选等,其他：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