（分析化学专业论文）液相色谱中动力学因素对溶质分离的贡献.pdf

液相色谱中动力学因素对溶质 分离的贡献 摘要 液相色谱中对溶质组分分离条件的优化，是液相色谱理论研究与应用中最重 要热点之一。溶质组分的色谱保留行为与热力学和动力学因素都有关，而科学家 多着重于热力学因素的研究，对动力学方面的研究并不多，然而了解动力学因素 之间的定量关系，对于缩短液相色谱最佳分离条件的寻优过程、提高效率，仍然 十分重要。本文主要研究流动相流速及组成变化对分离效果的贡献。全文包括三 部分： 1 文献综述：本章概括介绍了色谱动力学发展的历史和速率理论，说明了谱带 展宽的各种影响因素以及半峰宽与保留时间之间的量的关系，同时对液相色 谱的基本理论一计量置换保留模型、短柱理论和有关收敛的研究进展做了简 要阐述。 2 动力学因素对分离小分子溶质的影响及动力学因素的收敛：以随机步进模型 为基础，从理论上推导出半峰宽与保留时间的平方根之间具有线性关系，同 时也存在动力学因素收敛。通过实验证实了：1 ) 当流动相流速一定，洗脱剂 甲醇浓度变化时半峰宽与保留时间的平方根之间具有良好的线性关系，进一 步讨论线性方程的斜率与溶质的结构参数之间关系，与传统的半峰宽与保留 时间有线性关系进行了对比，最后发现随着流动相流速的不断变化，只有半 峰宽与保留时间平方根作图所得线性方程的斜率能与组分分子结构参数之间 有密切联系，分别用其与范德华体积和范德华表面积之间的定量关系为例， 进行了探讨，发现具有收敛趋势，计算了收敛点的坐标，与理论所得坐标比 较发现两者近似相等，于是说明了动力学因素对小分子溶质的谱带展宽有着 本质的关系；2 ) 当洗脱剂浓度一定，改变流动相流速时半峰宽和保留时间的 平方根之间也存在着良好的线性关系，同时随着洗脱剂浓度的不断变化，半 峰宽与保留时间平方根作图所得线性方程的斜率与范德华体积和范德华表面 积之间也存在着收敛趋势，计算收敛点坐标，对于它的理论解释有待于进一 步研究。 3 疏水相互作用色谱中动力学因素对分离生物火分子溶质的影响：用三根不同 牲长豹蘸本穗互佟耀色谱柱，在不霹滚邃辩分裹七静蛋巍：c y t - c 、m y o 、 r n a s e 、l y s 、a - a m y 、a - c h y 和b 撼，研究了流速、柱长、糕压与分离度之间 的变化规律。发现改变流速、校长对生物大分子的分离度的影响很小，在较 短戆拣子孛七势蛋囱羲霉瑷迭戮缀努豹分褒嶷，惹诗量鬟抉缳整理论及缀桎 理论对其进行了解释，短色谱在分离分析蛋囱质所具有的许多优点可用予大 规模的生产。 关键词：高效液相色谱，动力学因索，蛋白质，柱长，半峰宽，收敛 c o n t r i b u t i o no fd y n a m i cf a c t o r st os o l u t e r e s o l u t i o ni nh p l c a b s t r a c t 瓤瓤盛p e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y ( h p l c ) ，t h ei n c r e a s i n gi nt h es o l u t e r e s o l u t i o ni so n eo f t h em o s ti m p o r t a n th o tp o i n t si nt h e o r e t i c a la n da p p l i e dr e s e a r c h e s t h eb e h a v i o ro fs o l m er e t e n t i o nr e l a t e st ob o t ho ft h e r m o d y n a m i ca n dd y m n i e f a c t o r s ，b u t s c i e n t i s t sh a v ep l a y e dm u c hm o r ea t t e n t i o nt ot h ef o r m e r t h e i n v e s t i g a t i o no f t h eq u a n t i t a t i v er e l a t i o n s h i pa m o n ga l lk i n d so f d y n a m i cf a c t o r sa l s o h a v ei m p o r t a n tt om a k et h eb e s ts o l u t er e s o l u t i o ni nh p l c t h i st h e s i so n l yc o n c e r n s w i t ht h ec o n t r i b u t i o no ft h ef l o wr a t ea n dc o m p o s i t i o no fm o b i l ep h a s et ot h e s e p a r a t i o ne f f i c i e n c yo f s o l u t e i ti n c l u d e st h r e ep a r t sa sf o l l o w ： 1 r e v i e w ：i nt h i sc h a p t e r , t h er e c e n td e v e l o p m e n to fd y n a m i e sa n dt h ev e l o c i t y t h e o r yi nc h r o m a t o g r a p h yw e r eb r i e f l yi n t r o d u c e d t h ef a c t o r se f f e e t i n go nt h e b a n de x p a n d i n gi n c l u d i n gt h eq u a n t i t a t i v er e l a t i o n s h i pb e t w e e nt h eh a l f - p e a k w i d t ha n dr e t e n t i o nt i m e , t h ef u n d a m e n t a lt h e o r yo fl c s t o i c h i o m e t r i c d i a p l a c m m e n tt h e o r yf o rr e t e n t i o n 裕d t - r ) , s h o r tc o l u m nt h e o r y , a n dc o n v e r g e n c e o f s o l u t er e t e n t i o nw e r ea l s ob r i e f l yi n t r o d u c e d 2 t h ef a e t o r se f f e c l i n go nt h er e s o l u t i o no fs m a l ls o l u t e sa n dt h ec o n v e r g e n c y o fd y n a m i cf a c t o r s ：b a s e do nr a n d o mw a l km o d e l 。al i n e a rr e l m i o n s h i pb e 淞嘲 h a l f - p e a kw i d t ha n dt h es q u a r er o o to fr e t e n t i o nt i m ew a st h e o r e t i c a l l yd e r i v e d a n dt h ed y n a m i cc o n v e r g e n c ew a sf o u n dt oe x i s ta l s o i nt h ee x p e r i m e n t , w e v e r i f i e d ： 1 ) ag o o dl i n e a rr e l a t i o n s h i pb e t w e e nh a l f - p e a kw i d t ha n dt h es q u a r er o o to f r e t e n t i o nt i m ea ld i f f e r e n tm e t h a n o lc o n c e n t r a t i o n 遗m o b i l ep h a s eu n d e ra 瓤酲 f l o w - r a t ee x i s t s t h i sl i n e a rr e l a t i o n s h i pb e t w e e nt h er 或e n f i o nt i m ea n dh a l f - p e a k w i d t hr e p o r t e di nl i t e r a t u r ew a sa l s oe x p e r i m e n t a l l yp r o v e d 协e x i s t h o w e v e r , t h e d i f f e r e n c eb e t w e e nt h eb o t hl i n e a re q u a t i o n si st h a tt h eo b t a i n e dt w os l o p e sh a v ea 邓i l cd i f f e r e n tc h a r m e r w i t he x p e r i m e n t a lt e s tf o rs m a l ls o l u t e s , b e n z e n e , t o l u e n e ，n a p h t h a l e n e ，a n db i p h e n y l ，t h eo b t a i n e d r e s u l ti n d i c a t e st h a tf o rt h e m f o r m e r , ac o n v e r g e n tp o i n te x i s t sf r o mt h ep l o to f t h eo b t a i n e ds l o p ev e l s u st h e m o l e c u l a rs t r u c t u r a lp a r a m e t e r so f t h es o l u t e , s u c ha sv a l ld e rw a a l sv o l u m e o rv a i l d e rw a a l sa r e a , b u tn o tf r o mt h el a t t e r i na d d i t i o n , ag o o dc o i n c i d e n c eb e t w e e n t h e e x p e r i m e n t a lr e s u l ta n dt h ee x p e c t e dc o o r d i n a t eo f t h ec o n v e r g e n c ei n d i c a t e st h a t t h el i n e a rr e l a t i o n s h i pb e t w e e nh a l f - p e a kw i d t ha n dt h es q u a r er o o to fr e t e n t i o n t i m er e a l l yr e f l e c t st h ei n t r i n s i cr e l a t i o n so f d y n a m i cf a c t o rf o rt h eb a n de x p a n d i n g o f s m a l ls o l u t e 翁a l s o , ag o o dl i n e a rr e l a t i o n s h i p 勰h a l f - p e ；a kw i d t ha n d t h es q u a r er o o t o fr e t e n t i o nt i m ea td i f f e r e n tf l o wr a t eo fm o b i l ep h a s eu n d e raf i x e dm e t h a n o l c o n c e n t r a t i o ne x i s t t h ef o r e g o i n gt w ok i n d so fc o n v e r g c n c e sw e r ef o u n dt oe x i s t a l s o h o w e v e r , t h em a g n i t u d eo ft h et w oc o o r d i n a t e sa r ed i f f e r e n t , t h er e a s o nf o r e x p l a i n i n gt h i sf a c tw i l lb ei n v e s t i g a t e df u r t h e r 3 t h ed y n a m i cf a c t o r sf o rt h es e p a r a t i o no fp r o t e i n si nh p h i c ：u s i n gt h r e e c o l t t m nl e n g t l 罄3 轨5 0a n dl o 。o e mo fh y d r o p h o b i ci n t e r a c t i o nl i q u i d c h r o m a t o g r a p h i e ( h p h i c ) c o l u m n , s e v e nk i n d so f s t a n d a r dp r o t e i n s ，c y t o c h r o m e c ，m y o g l o b i n , r i b o n u c l e a s e , l y s o z y m e ，a - c h y m o t r y p s i n , o r - a m y l a s e , a n d i n s u l i nw e r es e p a r a t e du n d e rd i f f e r e n tf l o wr a t e so fm o b i l ep h a s e , t h er e l a t i o n s a m o n gf l o wr a t e ， c o l u m nl a n g t h ，c o l u m n p r e s s u r ea n dr e s o l u t i o n w e r e i n v e s t i g a t e d i tw a sf o u n dt h a tt h es e p a r a t i o ne f f i c i e n c yo f b i o p o l y m e r si sa l m o s t i n d e p e n d e n to fc o l u m nl e n g t ha n dm o b i l ep h a s ef l o wr a t e , p r o t e i n sc o u l db e c o m p l e t e l ys e p a r a t e db yu s i n gi ns h o r tc o l u m no f3 0 c m , i tw a se x p l a i n e dw i t h s d t - ra n ds h o r tc o l u n mt h e o r y i nt h es e p a r a t i o na n da n a l y s i so fp r o t e i n , t h e s h o r tc o l u m nh a v em a n ya d v a n t a g e s , i tw o u l db ee x p e c t e dt h a ti tm a ya l s ob e e m p l o y e di nl a r g e s c a l em a n u f a c t u r ei nt h ef u t u r e k e yw o r d s ：h p i c , d y a a m i cf a c t o r s , p r o t e i n , c o l u m nl e n g t h , h a l f - p e a kw i d t h , c o n v e r g e n e y i v 西北大学学位论文知识产权声明书 本人完全了解学校有_ 关保护知识产权的规定，即：研究牛在校攻 读学位期间论文工作的知识产权单位属于西北大学。学校有权保留并 向国家有关部门或机构送交沦文的复印件和电子版。本人允许论文被 杏阅和借阅。学校可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据 库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学 位论文。同时，本人保证，毕业后结合学位论文研究课题再撰写的文 章一律注明作者单位为西北大学。 保密论文待解密后适用本声明。 学位论文作者签名：兰邕施 指导教师签名： 御年月s 日 饧钮够 咖印年易月f 同 i 西北大学学位论文独创性声明 本人声明：所呈交的学位论文是本人在导帅指导下进行的研究工 作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地 方外，本论文不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含 为获得西北人学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我 一同上作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文巾作了明确的 说明并表示谢意。 学位论文作者签名：禾弛 聊年月j 同 第一章文献综述 色谱起源于1 9 0 6 年俄国植物家茨维特的工作，当时他是以液体作流动相， 在碳酸钙柱上分离植物色素。虽然后来几十年间相继出现了薄层色谱、纸色谱和 气相色谱，但发展仍很缓慢。6 0 年代后期把高压泵和化学键合固定相运用于液 相色谱( 1 i q u i dc h r o m a t o g r a p h y ，l c ) 中，出现了高效液相色谱( 1 1 i g hp e r f o 衄a i l c e l i q u i dc h r o m a t o g r a p h y , h e l c ) ，使得液相色谱获得了迅猛发展f 1 - 2 1 。液相色谱作为 一种应用范围极为广泛的色谱方法，2 0 世纪7 0 年代以来由于高效色谱柱、高灵 敏度检测器以及高压泵的使用，使高效液相色谱法成为生命科学、环境科学和材 料科学研究的重要分离分析手段。历史上曾经先后有两位化学家因为在色谱领域 的突出贡献而获得诺贝尔化学奖【3 】，此外色谱分析方法还在1 2 项获得诺贝尔化 学奖的研究工作中起到关键作用。 色谱法是一种目前使用最广泛的和有效的分离技术与分析方法，自它提出 1 0 0 年来，从技术到理论，到各种分离模式，以及在各种科学领域内的应用，得 到了突飞猛进的发展，现在已经成为分析化学学科中的一个重要分支。同时也为 许多重要学科做出了极大的贡献。进入2 l 世纪，人们面临着在信息科学、生命 科学、材料科学、环境科学【4 噜领域的快速发展的挑战，而色谱技术是生命科学、 材料科学、环境科学等领域中必不可少的手段和工具。 近年来，随着生物技术和医药工业的发展，传统的分离手段已经不能满足对 大量样品高纯度分离的要求，一些新方法，新思路不断应用于多肽类物质的分离 分析研究中，分离、分析和纯化生物大分子物质是目前极为活跃的研究领域。从 现代分离科学理论得出，色谱和电泳是目前所知的分离效果最佳的两种方法【5 1 ， 而液相色谱方法因其分离效能高，分析速度快，适应性强及应用范围广，使它发 展成为实验室和工业生产上分离纯化及制备生物大分子的最有效和常用的方法 【6 】。 混合组分的液相色谱保留值的预测、分离条件的优化，是液相色谱的研究与 应用中的重要问题【7 4 0 1 。溶质组分的色谱保留行为与分离条件各种因素有关，最 重要的因素是热力学因素，在通常色谱理论研究中，一般假定组分迁移和在两相 中达到分配平衡是瞬时完成的，即忽略了动力学因素对色谱保留的贡献，然而事 实上动力学因素对色谱保留和分离的影响是很大的，但科学家对动力学方面的规 律了解的并不是很多，所以研究溶质组分在柱内的运动规律，为液相色谱分离条 件的优化提供准确的判据。研究色谱保留值与各种动力学因素间的定量关系，开 始受到色谱工作者的重视，这对于缩短液相色谱最佳分离条件的寻优过程、降低 科研与生产的成本、提高效率，至关重要。 分离效能的评价，可以采用分离度或分辨率的概念。分离度( 磁) 定义为两 峰间距离的二倍与其底宽之和的商，即： b = 菩 ( 1 1 ) 这是一个无量纲的参数，它表明两个溶质蜂彼此离得越远分离就越好，且两 个峰越尖锐、越窄则分离亦越好。从上述讨论可知，两个溶质分离效果的好坏， 除热力学因素t r b l j 取决于峰间的距离之外，还受制于峰的展宽程度，因此，它必 然与热力学过程和动力学过程都有关系。 分离度( b ) 是一个决定分离的参数，要控制分离或分离度，就必须知道b 是如何随着和等参数变化的，于是，将定义式( 1 1 ) 经一系列变化推导出下 耻孚c 川x 南 ( 1 2 ) =(1-3) 其中a 表示分离指数，表示柱塔板数，七表示溶质的容量因子。为柱长， 助塔板高度。这一公式给出了分离度b 与柱效率、分离因子口以及容量因子 七等色谱基本参数的关系。从以上公式可以看出，与b 有关的参数中容量因子 属于热力学因素，e 属于动力学因素，又因为 n = 5 5 4 x ( 剞t t 2 ( 1 哪 2 于是，就得出 日= = 去c 警，2 ( 1 5 ) 可见，b 受热力学和动力学两部分因素控制的，其中研究动力学的因素对 分离度的贡献很重要，而相比而言对此研究较少。于是本文就从动力学方面入 手，研究与分离度有关的各因素之间的关系。 1 1 色谱动力学基础理论概况 色谱过程动力学( 简称色谱动力学) 是研究物质在色谱过程中运动规律的科 学，其研究的主要目的是根据物质在柱内运动的规律解释色谱流出曲线的形状； 探求影响色谱区域宽度扩张及峰形拖尾的因素和机理，从而为获得高效能色谱柱 系统提供理论上的指导，为峰形预测、重叠峰的定量解析以及为选择最佳色谱分 离方法奠定理论基础。 在色谱理论研究中，人们已提出了多种描述样品组分在柱内的运动过程的理 论。平衡理论【1 i 】、塔板理论【1 2 1 以及速率理论【1 3 l 是比较成功的几种色谱基础理论。 目前大多数色谱理论皆以m a r t i n 塔板理论的基本原理和基本概念为基础，因此 可以说塔板理论是色谱动力学理论的来源【1 4 1 。 早在1 9 4 0 年，随着液体色谱的发展，w i l s o n 提出了平衡色谱理论1 1 1 1 。该理 论解决了色谱保留值与分配系数之间的关系问题，但它忽略了传质速率有限性与 物质分子纵向扩散性的影响，未能解释色谱蜂扩散的现象。为了解释色谱分离过 程，1 9 4 1 年，m a r t i n 和s y n g e 首先提出了塔板理论【1 2 】。在此理论中，色谱过程 被比拟为蒸馏过程，色谱柱被视为一个有若干层塔板的蒸馏塔，每一个单级蒸馏 的小塔板长度很小，但允许溶质在其中有足够的时间达到两相间的平衡。它对色 谱流出曲线分布和谱带运动规律，以及柱长与理论塔板高度日对区域扩张的影 响等给予了近似的解释，但对影响日的各种因素没有从本质上考虑，它还只是 一个半经验的理论，需要对其加以补充和完善。随后，又出现了揭露影响色谱区 域宽度内在因素的纵向扩散理论和考察传质速率有限性的速率理论h q 。当物质在 两相间交换很快的情况下，如气相色谱过程中，纵向扩散理论具有一定的指导意 义；而在液相色谱中，当纵向扩散的影响允许忽略时，考虑到传质速率有限性的 速率理论就十分重要了。 1 1 1 色谱速率理论 多种溶质组分以混合物形态进样，经过色谱柱的分离作用而被检测。每一个 组分都经过了一系列的动力学过程，在这些过程中组分的谱带宽度都有所变化。 任何一个色谱过程，基本都是谱带展宽的过程。影响谱带展宽的因素很多，大体 上可分为色谱柱内和色谱柱外两大部分【l6 】。 i 柱内过程： 这是色谱动力学一直研究的过程，各组分谱带在柱内展宽的过程。1 9 5 6 年， v a nd e c m t c r 从动力学方面提出关于色谱柱效率的速率理论。此理论主要描述了 柱内色谱峰展宽的原因，以及影响峰展宽的各种参数和因素，这些都便于进行柱 及其色谱条件的优化。它不仅用于指导气相色谱的研究，而且大大推动了液相色 谱法的研究，并成为高效液相色谱法重要的理论基础【1 7 1 。 v a nd e a m t e r 方程为： 肚2 ”2 r 甜d 0 删) + 譬譬甜 ( m ) 。 甜 u u 舯z = 镨，五= 砉高 或写成简化式： 日：彳+ 里+ q + c i “( 1 - 7 ) 热心蛳脚弛吣) ，g = 警，c j = t f 2 ( k ) d z 从式( 1 7 ) 可知，引起柱内谱带扩张的因素主要有a 、b 、c ：和c j 四项，即 多路径效应、纵向扩散、流动相中的传质阻力和固定相中的传质阻力。 多路径效应4 ：在填充色谱柱中，填料粒径、形状以及填充柱床紧密程度的 不均一性，都会使柱内产生多路径效应。有时也称为涡流扩散效应，即认为由于 固定相颗粒对携带溶质的流动相的阻滞，使其产生涡流而带来的效应【l 扪。a 只与 4 粒子直径d 。和填充不规则因子x 有关。为减小涡流扩散对理论塔板高度的贡献， 应尽可能减少瘌d 。因为它与妓：间有相互制约的关系，因此现代高效液相色谱 柱一般使用5 胂或3 p m 的填料【1 6 1 。但对于同一色谱柱而言，其数值都是相同的， 与溶质的性质无关，因此，各组分的4 项值是相同的。 分子扩散项口：溶质进入色谱柱后，由于浓度梯度向周围的流动相内扩散， 即纵向产生扩散，造成谱带的展宽，形成高斯型的浓度分布，所以又称为纵向扩 散【r 丌，它服从爱因斯坦扩散方程流动相中的扩散和固定相中的扩散，这两相中的 扩散过程类似但时问不同。v a nd e e m t e r i j i 入了一个系数节是考虑到填料的存在 使溶质分子不能自由地轴向扩散【1 9 1 ，而引入的柱参数。纵向扩散正比于扩散系数 而反比于流动相的线速度。通常，溶质在气相中的扩散系数远大于在液相中的扩 散系数，所以纵向扩散对气相色谱来说是非常重要的因素，而在液相色谱，特别 是高效液相色谱中，则并不十分重要。但在高效液相色谱中，当流动相流速变 小时，分子扩散在峰扩展中逐步占据主导地位，严重影响分离度的好坏【2 1 1 。 流动相中的传质阻力巴：在色谱过程中，随着流动相的行进，所携带的溶 质谱带亦一同前行。一方面，溶质在流动相和固定相之问不断地进行着传质过程； 同时，受流动相流型的影响，其浓度分布，产生谱带增宽效应。通常，这种展宽 效应与流动相的流速、流型以及溶质在流动相中的扩散速度都有关系。当使用多 孔性固定相或填料时，还有一部分流动相进入到固定相或填料的孔中，形成所谓 “停滞流动相”，这种停滞流动相不随流动相的流动而流动，它们处于相对静止 的状态。流动相中的溶质，必须先进入停滞流动相，才能进而进入固定相中，实 现在流动相与固定相之间的传质，同时也带来附加的谱带展宽。减小流动相的 线速度和粒径，可以降低因流动相的传质阻力而造成的峰展宽。 固定相中的传质阻力c i ：溶质分子在固定相中的传质阻力，在谱带展宽中 占有重要的地位。溶质分子必须越过流动相与固定相的界面，才能进入或离开固 定相。在固定相中停留的时间和路径的长短，会影响谱带展宽的程度，固定相的 传质阻力所引起的谱带展宽，从形式上看与流动相传质阻力的情况相类似。流动 5 相的线速度越大，固定液或固定相层越厚，展宽亦越大；但它可随溶质在固定中 扩散系数的加大而降低。这提示我们细的固定相颗粒或薄的固定液层，有利于传 质而获得更高的分离效率。 v a nd e e m t e r 方程比较满意地描述和解释了发生于色谱过程中的谱带展宽过 程，对分离条件的选择具有指导意义。它可以说明填充均匀程度、载体粒度、载 气种类、载气流速、柱温、固定液层厚度对柱效的影响。但是，在实际应用中发 现有时实验值偏离公式口2 】。于是，许多学者继续对其进行了广泛而深入的研究， 并提出了一些修正的v a nd e e m t e r 方程【2 4 1 。其中，比较重要的有g i d d i n g s 方程， h u b e r 方程和g o l a y 方程。 2 柱外过程： 柱前柱后过程都属于柱外过程。在柱外过程中，由于分子扩散及流动阻力 涡流等因素的作用使组分展宽。柱外谱带扩张又称为“柱外效应”，指从进样点 到检测池间除色谱柱以外的所有色空间导致的谱带展宽，包括进样阀、连接管、 检测池等因素。由于液体扩散系数很低，洗脱剂流量很少，因此柱外效应在液相 色谱中十分明显，对于细内柱尤为突出。如何消除柱外效应的影响也是提高液相 色谱分离效能、改善峰形的关键【2 5 1 ，柱外效应对不同容量因子的峰影响是不同 的。总的来说，柱外效应中最主要的还是连接管引起的方差。因此，在实际工作 中必须注意尽可能使用细而短的连接管，并让可能的柱外总体积降至最低。从以 上讨论可知，柱外效应是不可避免的，我们只能尽量降低而不能根本消除它们。 那么，多大的柱外方差可以被允许呢? k l i n k e n b e r g 2 6 1 建议，可允许的柱外方差为 总方差的1 0 ，或标准偏差的5 3 末端过程 2 7 - 2 9 l ： 在研究色谱动力学过程时，往往把末端过程没有注意到，研究这个过程对于 认识整个色谱动力学过程是十分重要的。当组分谱带移动到柱末端时，由于固定 相的停滞作用，固定相里的组分还要继续在两相间分配，流动相中的组分随流动 相一起流出。流动相中的组分量是固定相中组分量的1 k ，显然k 值越大的组分 从开始流出柱外到全部流出柱外所需的时间就越长。 对于k7 较大的组分，在柱内的展宽基本相同，而组分流出色谱柱时，由于 6 固定相的停滞作用，组分流出柱外所需时间就与k 成比例关系，峰宽扩大为原来 的l + k 倍，这种情况下就会得到色谱峰的半峰宽与保留值之间存在线性关系。事 实上，由于各组分的柱内展宽不尽相同，造成了偏离线性的情况。 1 2 生物大分子的色谱分离模式 从色谱分离的基本原理上分类，至少有以下几种分离模式在生物大分子的分 离和纯化过程中常被采用： 1 反相液相色谱( r e v e r s e dp h 勰el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y , r p l c ) ：是基于溶质、 极性流动相和非极性固定相表面间的非选择性作用力特征所建立的一种色谱模 式。人们普遍认为反相高效液相色谱是分离纯化蛋白质的最有效方法之一p 0 3 1 1 ， 也是应用面最广的一种分离模式口2 捌。在生物大分子的反相液相色谱条件下，流 动相多采用酸性的、低离子强度的有机溶剂一水溶液。常用固定相为硅胶烷基键 合相【蚓，除此而外，还有多孔碳固定相，苯乙烯型共聚微球填料，氧化铝、氧化 锆等作为基质的涂层填料p 5 。3 明。 2 离子交换色谱( i o ne x c h a n g ec h r o m a t o g r a p h y , m c l 【4 0 】：作用机理是基于生物 大分子和离子交换剂之间的静电作用，导致介质表面的可交换离子与带相同电荷 的蛋白质分子发生交换。其保留次序取决于配体和蛋白质间的静电作用力，离子 交换色谱含盐的缓冲流动相系统十分类似于蛋白质稳定存在的生理液条件，有利 于增加其活性回收率。蛋白质的分离纯化在离子交换色谱上主要控制p h 值的变 化和离子强度的梯度，以使被纯化和制备的目标蛋白质具有高的柱容量、高的分 离度和高的产量【4 ”。分离生物大分子的固定相基体主要是亲水共聚物。 3 疏水作用液相色谱饵y d r o p h o b i ci n t e r a c t i o nc h r o m a t o g r a p h y , h i c ) 4 2 4 4 1 ：原理 与反相色谱有相同之处，区别在于h i c 填料表面疏水性没有r p l c 强。流动相一 般为p h 6 - 8 的盐水溶液，和普通r p l c 相比，这种表面带低密度疏水基团的填料对 蛋白质的回收率高，蛋白质变性可能性小。由于流动相中不使用有机溶剂，也有 利于蛋白质保持固有的活性。所用填料分有机聚合物和大孔硅胶键合相两类，最 新以聚糖为载体制得一种新型疏水色谱填料，有较好的机械强度，且能有效地用 7 于生物大分子的分离纯化，应用前景良好。 4 亲和色谱( a f f i n i t y c h r o m a t o g r a p h y , a f c ) ：亲和色谱法近年来被用于蛋白质 的纯化及蛋白质组学的研刭4 5 斯l ，用于蛋白质分离、纯化的有效手段，是利用生物 大分子和固定相表面存在某种特异性吸附而进行选择性分离的一种生物大分子 分离方法。其固定相的载体有陶瓷、扩孔玻璃、硅胶m 删、聚苯乙烯p 1 】和琼脂糖 微球5 2 j ，配体为与被分离的蛋白质问有一种特异生物作用的物质。 5 体积排阻色谱r s i z ee x c l u s i o nc h r o m a t o g r a p h y , s e c ) 【5 3 巧5 】：纯粹按照溶质分子 在流动相溶剂中的体积大小分离的色谱法。分离过程是将样品混合物通过多孔固 定相，样品中的大分子不能进入孔道而完全被排阻，首先从柱中被流动相洗脱出 来，中等大小的分子能进入固定相中的一些合适的孔道，较慢地从柱中洗脱出， 小分子可以进入固定相的大部分孔道，在柱中受到更强的滞留。所用的填料通常 是具有适合孔径的有机聚合填料如交联琼脂糖、高分子聚合微球等和硅胶填料。 1 3 短柱理论 传统的色谱理论认为色谱的分离度一般随理论塔板数的增大而增大，所以， 分离度也随色谱柱的长度的增大而增大。然而，研究发现将r p l c 、i e c 、h i c 和金属螯合亲和色谱( m c a c ) 用于生物大分子分离时，分离度几乎与色谱柱的柱 长无关5 筇7 】，原因是蛋白质与色谱固定相之间的吸附属于多位点吸附【5 8 弟l ，它们的 吸附与解吸行为符合计量置换模型。 分离度基本与色谱柱的长度无关，有时甚至出现短柱较长柱的分离效果还好 的情况【6 1 】，可用较短的色谱柱装填小颗粒填料，在较低柱压情况下对生物大分子 进行分离，因此，就必然产生了一个新的柱理论短柱理论，它不仅能定性地 解释上述这种现象，而且也从定量的角度对此进行计算。 1 3 1 液相色谱中溶质的计量置换模型 吸附等温线6 2 1 、平衡扩散模型嘟1 和计量置换保留模_ 型( s t o i c h i o m e t r i c d i s p l a c e m e n tm o d e lf o rr e t e n t i o n , s d m r ) 畔1 常被用来描述色谱过程中溶质的色谱 8 保留行为和洗脱曲线。研究表明：s d m r 是一个可以适合于除s e c 以外的各类 色谱模式的统一保留机理，也是唯一一个可用于表征生物大分子色谱保留行为的 模型，其核心思想可用图1 1 表示 6 4 - 6 6 。 弹 吸附溶剂化 解吸 图1 - 1 液相色谱中s d m r 的示意图 由图1 1 看出，液相色谱中的计量置换过程是由溶剂化、吸附和解吸附三部 分组成。在流动相中，蛋白分子与固定相表面的配基分别被溶剂化，当溶剂化蛋 白被溶剂化固定相表面吸附时，从二者的接触面上会有一定计量的溶剂分子释放 出来；当蛋白从固定相上表面解吸附时，流动相中又会有一定量的溶剂分子重新 回到蛋白质和固定相表面。这一模型可由两个线性方程分别表示为6 4 ，6 5 】： l o g l j ki o g - z i o 即d( 1 8 ) l o g = j z - l o g q ( 1 - 9 ) 式中七嚷示溶质的容量因子，l o g 表示与l m o l 溶质对固定相亲和势有关的常数， z 表示l m o l 溶剂化溶质被溶剂化固定相吸附时，从溶质与固定相接触面释放出 来的溶剂的摩尔数，a d 表示流动相中强溶剂的活度，_ ，表示一个与l m o l 溶剂对 固定相亲和势有关的常数，旅示柱相比。 在上述两个线性方程中，由于s t m r 中的两组线性参数第一组线性参数l o g l 和z 和第二组线性参数- ，和l o g 瑚有明确的物理意义，包含了许多关于分子构象、 溶质与固定相作用力以及色谱条件影响因素等方面的信息，可很好的用于在限定 条件下表征溶质的种类、大小和空间效应以及流动相中置换剂的强度和固定相的 特性，如z 和l 呵值用于生物大分子构想的表征裕7 0 】，j 可用来判断流动相中置 换剂参与计量置换过程的程度以及溶剂的洗脱能力，所以此理论对于研究小分子 9 和生物大分子子色谱中的性质与保留行为有很大的应用价值。有关利用这四个参 数表征溶质、固定相性质以及生物大分子构象变化的研究已有大量报道【7 6 】。 对于生物大分子的分离，还会出现另一种溶质根本无法洗脱的问题m 】，必须 采用梯度洗脱方式。由此可得出生物大分子的色谱保留行为主要由流动相中置换 剂的浓度决定的，容量因子七随置换剂浓度的微小变化会发生显著的变化。正 是由于这个原因，蛋白质在色谱柱上的保留行为表现为完全吸附或完全解吸模 式，洗脱时必须采用梯度洗脱，分离度受柱长影响较小。由于用s d m - r 对蛋白 质色谱行为的深入研究 6 4 1 和梯度理论的贡献7 粥5 1 ，在对生物大分子进行梯度洗脱 分离时，以分离度和峰容量为标准，便可对蛋白质的色谱分离条件进行优化i s l 捌。 1 3 2 研究进展 蛋白质在色谱分离过程中所表现出的与溶剂的组成的密切关系，已经用计 量置换保留模型( s d m r ) 从理论上得以解释并n t 验证。m o o r e 等人 i ；6 1 用柱长 为6 3 r a m 的色谱柱，在反相色谱( i 冲l c ) 中分离了五种蛋白，发现其分离度优于 在柱长为4 5 m m 的色谱柱上的分离度。e k s t e e n 等人【8 7 1 在离子交换色谱( i e c ) 上， 用柱长分别为2 5 0 r a m 与2 0 m m 色谱柱分离了与m o o r e 等所用相同的五种蛋白的 混合物，也得出了长度为2 0 m m 的色谱柱的分离度好于长度为2 5 0 r a m 色谱柱分 离度的结论。m b t e n n k n i k o v 等人裙1 成功地从合成的连续棒状阴离子交换棒上 切出2 m m 厚的离子交换薄片或膜用于蛋白质分离，并且认为灌注色谱固定相更 好地体现了这种“开关”机理。b e l e n k i i 等人i s 9 l 提出了膜色谱的概念( 膜色谱的 概念是指色谱柱中填料的厚度如同通常的过滤膜) ，并提出了使用极短色谱柱对 蛋白质进行分离，用e c f r e i l i n g 提出的公式【帅】和s n y d e r 经验式推导出了膜 色谱中膜厚度或最短柱长的计算公式瞰1 是柱子长度可以允许短到什么样程度而 又不影响分离度的问题。因为所推导的公式只能计算一种溶质的迁移距离，他们 推导的公式实际上是计算溶质在色谱柱上的有效迁移柱长的公式。尽管此公式可 对最短柱长进行简便的估计，但其本身存在有不足之处，预测最短柱长存在缺陷。 另外，刘p 杉 9 3 1 在溶质计量置换模型两个公式的基础上提出了预测最短柱长的理论 计算公式，并用其对溶菌酶、卵清蛋白、淀粉酶、肌红蛋白、细胞色素- c 和牛 1 0 血清蛋白在高效疏水色谱上分离时所需的最短柱长进行了计算。同时作者在柱长 为0 5 c a n 的色谱柱上对细胞色素c 、肌红蛋白、溶菌酶和淀粉酶进行了近似基 线分离，而且其公式中也没有反映分离度的参数，所以，也不够完善。 张养军等【舛】在此基础上，推导出在疏水色谱中分离蛋白质时，所需的最短柱 长的公式，从而为生物的大分子的短柱分离提供了比较系统的理论指导。该理论 假设当混合物中最难分离的两种溶质：溶质i ( 吸附弱) 和溶质2 ( 吸附强) 达 到近似基线分离时，即分离度飓= 1 时所需的柱长定义为最短柱长厶血。 工t = 善e 考础。 。 ( 1 - 1 0 ) 工t2 鲁c 羔如。 ( 1 - 1 1 ) 善e 羔如。= 善e 羔如。m 均 整个分离过程，分为四个阶段，在这四个阶段的基础上，再结合计量置换保 留模型，推导出了式( i - 1 0 ) 和式( i - i i ) ，所示的最短柱长的公式。其中锄j 和a d l 2 分别为溶质1 的起始迁移时和流出最短柱长的柱出口时流动相中置换剂的 瞬时浓度。口d 2 l 和吻分别为溶质2 起始迁移时和流出最短柱长的柱出口时流动 相中置换剂的瞬时浓度。其中a d l 2 和口d 2 2 为未知量，可通过式( i - 1 2 ) 求解。最 终可计算出所需分离蛋白的最短柱长。由于短柱理论是蛋白质色谱分离中柱长选 择的依据之一，也是解释蛋白质色谱分离时分离度基本与柱长无关现象急待解决 的问题，所以，应对此还需做更深入的研究。 1 4 收敛现象的研究 热力学研究表明，在r p l c 中，当流动相中有机溶剂的浓度升高，或者作为 溶质的同系物的碳数不断减小时，各溶质的保留值趋向于一个相同值，这种现象 叫做收敛，此点叫做收敛点。c o l i n 等 g s l 首次研究这一现象并指出：“同一种同系 物其碳数收敛点的横坐标大致相同，一般为负值”。焦庆才等9 6 1 认为碳数收敛点 的横坐标仅仅是一个理论求算的点。孙兆林等阳不仅报告了收敛点的存在，还