（预防兽医学专业论文）金黄色葡萄球菌CHIPS基因克隆及原核表达.pdf

摘要 金黄色葡萄球菌趋化抑制蛋白( c h e m o t a x j s1 n h i b i t o r yp r o t e j no f 印垣p f 。c c 砒口骈埘， c h i p s ) 是由金黄色葡萄球菌分泌到菌体外的一种蛋白，能特异性地与中性粒细胞和单核细胞 上的c 5 a 受体( c 5 a r ) 和f m l p 受体( f p r ) 结合，从而阻止细胞的趋化作用。但是，可否将c h l p s 作为药物来治疗由c 5 a 或日订l p 诱发的炎症性疾病或将c h i p s 作为免疫原来防制金黄色葡萄球 菌感染，目前尚不清楚。 本试验设计合成了一对p c r 扩增特异性引物，分别从金黄色葡萄球n e w m a n 株和c o w a l li 株中扩增获得了c h i p s 基因，进一步将其克隆到p m d l 8 - t 载体获得重组质粒p m d - n 和 p m d - c 。并对其进行测序分析。结果，与g e n b “k 中提供的c h l p s 基因序列相比，n e w m a n 株具有1 0 0 的同源性，c o w a n 】株只有一个碱基突变r 2 9 8a g ：二者氨基酸同源性均为 1 0 0 。说明c h i p s 基因高度保守。 将p m d - n ，p m d - c 质粒和p e l 3 2 a ( + ) 表达载体进行勘mh 】和曲双酶切，回收c h l p s 基 因片段，将其插入到p e t 3 2 a ( + ) 原核表达载体并转化到b 0 2 l ( d e 3 ) e c d f f ，经筛选分别获得 p e t - n 仍e 3 和p e t - c 舰3 重组体细菌。经1 p 1 b 诱导表达和s d s p a g e 分析，结果与对照菌株 相比，诱导后的p e ：n 仍e 3 和p e t - c d e 3 表达约为3 1 8 k d a 的融合蛋白，且表达蛋白存在于菌 体超声波裂解上清中；进一步对其进行w e s t e m _ b l o t t i n g 分析证实，表达的融合蛋白为目的蛋白。 说明本试验c h i p s 得到了良好表达，且为可溶性蛋白。 用m a g n e h i s t ”蛋白纯化系统对表达的c h p s 蛋白进行纯化，并将纯化后的c h i p s 蛋白 用于人工刨伤感染韵动物模型试验，结果与对照组相比，使用c h d s 蛋白组对创伤感染愈合具 有明显的延迟作用，表明c h i p s 蛋白对炎症具有抑制或延缓作用。 关键诃：趋化抑制蛋白，基因克隆，原核表达，c 5 a 受体。f m l p 受体 a b s t r a c t c h e m o t a x i si n h j b i t o r yp r o t e j no f 所珈，d c c 淞口“m 珊( c h i p s ) i sak i n do f p r o t e i nt h a te x c r e t e d b ys 口r p 淞c h l p sc a ns p e c 雨c a l l yb i n dt oc 5 ar e c e p t o r ( c 5 a r ) a 1 1 dt h ef o r i n y l a t e dp e p t i d er e c e p t o r ( f p r ) e x i s t i n g o n t h es u r f a c e o f n e u t r o p h i l s 枷d m o n o c ”e s ，t h e r e b y b 】o c kc h e m o t a x j so f n e u t r o p h j l s a n dm o n o c y t e sm e d i a t e db yc 5 aa n df o n n y l a t e dp e p t i d e s ，r e s p e c t i v e l y b u t ，i ti s1 e s sk n o w nu pt on o w t h a tw h e m e rc h i p sc a l lb eu s e da sac a n d i d a t ed m gf o r 廿1 0 s ei n n 啪m a t o r yd i s e a s e si n d u c e db yc 5 a a n df o r i n y l a t e dp e p t i d e sa i l d 0 ra na 1 1 t i g e nf o rp m v 0 k i n gi m m u n er e s p o n s ea g a i n s t & 口w e 螂i n f e c t j o n 1 nt h j s e p o n ，t h eg e n e so fc h i p s 如m d m 淞n e w m a na n dc o w 柚ls t r a i n sw e r e 锄p l i f i e db y p c rw i t hap a i ro fp r i m e r sa n ds u c c e s s f i l l l yi n t r o d u c e dr e s p e c t j v e l yj n t op m d l 8 - tv e c t o r s 1 w o r e c o m b i n a l l tc l o n e s ，p m d - na n dp m d - c ，c a n 了i n gt l l ec h i p sg e n eo fn e 砌a i la 1 1 dc o w a l lis t r a i n w e r eo b 诅i n e da n ds e q u e n c e d t h en u c l e o t i d es e q u e n c eo f 也ec h l p sg e n e n e w m a ns t r a i nh a d l o o h o m 0 1 0 9 yt om es e q u e n c ep u b l i s h e dp r e v i o u s l yi ng e n b 卸k 锄dt h a t 疗d mc o w a n1s t r a i nh a d o n l yo n em u 协t i o n ( r 2 9 9 a _ g ) c o m p a r e dw 曲廿l es e q u e n c ep u b l i s l l e dp r e v i o u s l yi ng e n b a n k t h e d e d u c e d 啪i n oa c i ds e q u e n c e so f l l l ec h i p sf 而mn e w m a i la 1 1 dc o w a i l1s 打a j nw e r e1 0 0 h o m o l o g y t ot h es e q u e n c ep u b l i s h e dp r e v i o u s l y t h o s es u 鹊e s t e dt h a tt 1 1 ec h i p sg e n ew a sh i g h 】yc o n s e r v a 石v e t h ep _ n ，p m d cp 1 踟i da n dt h ep e t 3 2 a ( + ) e x 孵s i o nv e c 瞬w e t ed i g e s t e dw 弛b 硎h 】a i l d 踟n ，a 1 1 dm ec h i p sg e n e 舳胂e n t s 锄dp e t 3 2 a ( + ) v e c t o rw e r ep 1 】r i f i e d 锄dr e c o m b i n e dt 0b et w o e x p r e s s i o nr c c o m b i n a i l t s n e n 似oe x p r e s s i 蚰c l o n e s ，p e e 3 柚dp e t ，d e 3 ，w e r eo b t a i n e d a f t e rt h e 似oe x p r e s s i o nr e c o m b i n 柚t sw e r e 仃a n s f e c t e dt ob l - 2 1 ( 腿3 ) e 疗t h e 栅oc l o n e sw e r e i i l d u c e dw i l hi p t gt oe x p r e s sa 1 1 da n a l y z e dw 岫s d s - p a g ea n dw e s t e m b l o 札i n gw i t l lt l l ea n t i b o d y a g a i n s th i s t i d j n e a ne x p r e s s e dp r o t e j na b o u t3 1 8k d aw a sd c t e c t 。di ne a c hc 1 0 n ec o m p 撕s o nw i t l l t h en o n i n d u c e dc l o n e i ti sf o i l i l d 也a ta l m o s ta l lo f t h et w oe x p r e s s e dp r o t e i n sw e r ei nt 1 1 es u p e m 她m t a j t e r 廿l et 、v oc l o n e sw e r es o n i c a t e d a f c e rt l l ee x p r e s s e dc h l p sp r o t e i nw a sp f i e dw 油山em a 9 1 1 e h j s 7 ”p r 0 艟i np 谢f i c a t i o ns y s t e m ， w o u n do nm es “no f m o u s eb a c kw a sd a u b e dw “ht h ep 埘f i e dc h i p s 锄ds 口“憎醛t b ec h i p sc 锄 o b v i o u s l yd e l a yt l ew o u n dh e a l i n gc o m p a r e dw i t l lt i l ec o n 订o lg r o u pd 叫b e dw i t ho n l y 口“w 淞 t h o s er e s u l t ss u g g e s t 也a tt 1 1 ec h i p sp r o t e i nc a nb ei nv i t r oe x p r e s s e dw e l l i ns o l u b l ea n d 山a ti tc a i 】 i n h i b i t0 rd e l a yi n 玎a m m a t o r yr e s p o n s e k e yw o r d s ：c h e m o t a ) 【i s b i t o r yp r o t e i n ，g e n ec l o n i n g ，p r o k a r y o t i ce x p e s s i o n ，c 5 ar e c e p t o r ， f m l pr e c e p t o r i l 英文缩略语表 l l i 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究 成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已 经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得黑龙江八一农垦大学或其它教育机构 的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已 在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 研究生签名：易拓六涉 时间：文，衫年名月多目 关于论文使用授权的说明 本人完全了解黑龙江八一农垦大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校 有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印 或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意黑龙江八一农垦大学可以用不同方式 在不同刊物上发表，传播学位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名：易蔷穴廖 时间：们占年多月膨日 新虢启必 帆彬咖7 曰 黑龙江八一农垦大学硕士学位论文 第一章引言 第一章引言 金黄色葡萄球菌是一种引起人类和动物疾病的常见的革兰氏阳性菌，它具有很高的致病率 和致死率i ”。金黄色葡萄球菌能够产生多种致病因子，它们对金黄色葡萄球菌体内的增殖致病 起着重要作用【”。近年来发现一些产生脓血症的金黄色葡萄球菌几乎能抵抗所有的抗生素。从 而，促使人们寻找新的方法来阻止和抵御金黄色葡萄球菌感染”1 。 中性粒细胞和单核细胞等吞噬细胞在抵御病原入侵中起着关键性作用。当细菌入侵机体后， 这些吞噬细胞在趋化因子作用下产生趋化性，并从血液循环中穿过血管内皮细胞，游走到病原菌 感染部位，对其进行吞噬。许多外源性和内源性的趋化因子在这一过程中起着趋化作用，这些趋 化因子包括传统的趋化因子如f m l p ，c 5 a ，p a f 等以及选择性诱导白细胞渗透、迁移、归巢的趋 化因子超家族1 4 ”。在这些趋化因子中，姚p 和c 5 a 对炎症反应的发生起着重要作用。删l p 是 仪含有3 个氨基酸的最小趋化肽，而且是种能够诱导吞噬细胞所有主要功能的最有效的趋化物； c 5 a 具有过敏毒素和趋化作用，在刺激血管和细胞的炎症反应阶段非常活跃，是启动一系列复杂 过程导致初级炎症性刺激倍增放大的重要介质。这些趋化因子通过与中性粒细胞等吞噬细胞表面 的特异性七跨膜受体结合而发挥作用的1 6 】。这些趋化因子与靶细胞表面的相应受体结合后，激活 靶细胞，并且靶细胞发生受体脱敏反应，以维持细胞的趋化梯度反应【7 j 。 在金黄色葡萄球菌感染过程中，金黄色葡萄球菌能够分泌一些胞外蛋白来阻止中性粒细胞等 吞噬细胞的趋化作用。金黄色葡萄球菌趋化抑制蛋白( c h e m o t a ) 【j si n h i b i t o r yp m t e i no f 印 帕”p c c m 口w p m ，c h i p s ) 便是其中一种。c h l p s 的分子量约1 4 1 k d a ，能够通过与吞噬细胞 c 5 a 受体( c 5 心) 和似l p 受体( f p r ) 特异性地结合来抑制吞噬细胞的趋化作用，阻止特异性地 吞噬应答。这种作用对机体吞噬金黄色葡萄球菌是有害的，但在特定情况下，例如在炎症发生时， c h i p s 蛋白抑制吞噬细胞向炎症部位的游走就可能阻止炎症的进一步加剧。由此可见，该蛋白有 可能成为一种治疗炎症性疾病( 如风湿性关节炎等) 的候选药物。此外，对蛋白的免疫原性进行 研究也具有重要的意义。 1 1 金黄色葡萄球菌的致病因子及其致病机理 1 1 1 血浆凝固酶 血浆凝固酶( c o a g u l a s e ) 是能使含有枸椽酸钠或肝素抗凝剂的人或兔血浆发生凝固的酶类 物质，致病菌株多能产生此酶。 产生凝固酶是金黄色葡萄球菌的一个重要的表型特征。虽然这一蛋白在葡萄球菌感染中的 作用还没有完全了解，但是由于凝固酶基因3 末端的可变性可以作为分型基础，用来对感染人 或动物的金黄色葡萄球菌进行分型p ”】。 凝固酶有两种：一种是分泌至菌体外的，称为游离凝固酶，为蛋白质。作用类似凝血酶原， 可被人或兔血浆中的协同因子激活，变成凝血酶样物质，进而使液态的纤维蛋白原变成固态的 纤维蛋白，使血浆发生凝固。另一种凝固酶结合于菌体表面而不被释放，称为结合凝固酶或凝 聚因子，在该菌株的表面发挥着纤维蛋白原特异性受体作用，细菌混悬于人或兔血浆当中时， 黑龙江八一农垦大学硕士学位论文 第一章引言 纤维蛋白原与菌体受体( 即结合凝固酶) 交联而使细菌凝聚。游离凝固酶采用试管法检测，结 合凝固酶则以玻片法测试。凝固酶耐热，粗制品1 0 0 3 0 分钟或高压灭菌后仍保持部分活性， 但易被蛋白水解酶破坏。 凝固酶和葡萄球菌的毒力密切相关。凝固酶阳性菌株进入机体后，使血液或血浆中的纤维 蛋白沉积于菌体表面，阻碍体内吞噬细胞的吞噬，即使被吞噬后，也不易被杀死。同时，凝固 酶集聚在菌体四周，亦能保护病菌不受血清中杀菌物质的作用。葡萄球菌引起的感染易于局限 化和形成血栓，与凝固酶的生成有关。 凝固酶具有免疫原性，刺激机体产生的抗体对凝固酶阳性的细菌感染有一定的保护作用。 慢性感染患者血清可有凝固酶抗体存在。 1 1 2 葡萄球菌溶血素( s t a p h y o _ y s i n ) 多数致病性葡萄球菌能够致使机体产生溶血。按抗原性不同，溶血素至少有、b 、n6 、 五种，对人类起致病作用的主要是q 溶血素。它是一种“攻击因子”化学成分为蛋白质，分 子量约为3 0 ，0 0 0 ，不耐热，6 5 3 0 分钟即可破坏。如将n 溶血素注入动物皮内，能引起皮肤坏 死，如静脉注射，则导致动物迅速死亡。溶血素还能使小血管收缩，导致局部缺血和坏死， 并能引起平滑肌痉挛。- 溶血素的作用机理是毒素分子插入红细胞膜的疏水区，形成微孔，破 坏了膜的完整性，而造成细胞溶解，因此它属于穿孔毒素。溶血素是一种外毒素，具有良好 的抗原性，经甲醛处理可制成类毒素。金黄色葡萄球菌b 溶血毒素能够破坏奶牛乳房分泌上皮 细胞，并增加n 溶血毒素对机体的损害，增加金黄色葡萄球菌对奶牛上皮细胞的粘附，继而增 加了金黄色葡萄球菌在病畜体内的增殖【i ”。近来研究发现，d e l t a _ 毒素能够影响中性粒细胞自 三烯代谢以及与肠毒素联合作用可以引起氧化性爆发【1 2 】。 1 1 3 肠毒素( s t a p h y l o i t e m 删i ，观) 肠毒素为一条含有较多的赖氨酸、酪氮酸、天门冬氨酸和谷氨酸的多肽链。从临床分离的金 黄色葡萄球菌，约1 3 产生肠毒素。按抗原性和等电点等不同，葡萄球菌肠毒素分a 、b 、c 1 、c 2 、 c 3 、d 、e 和f 八个血清型，细菌能产生一种类型或两种类型及以上的肠毒素”，肠毒素可引起 急性胃肠炎，即食物中毒。其发生常常与产毒菌株污染牛奶、肉类、鱼或虾、蛋类等食品有关。 产毒菌株在2 0 以上经8 1 0 小时即可产生大量的肠毒素。肠毒素是一种可溶性蛋白质，耐热， 经1 0 0 煮沸3 0 分钟不被破坏，也不受胰蛋白酶的影响，故误食污染肠毒素的食物后，肠毒素在 肠道作用于内脂神经受体，传入并刺激呕吐神经中枢引起呕吐，产生急性胃肠炎症状。肠毒素 引起的食物中毒，发病急，病程短，恢复快。一般潜伏期为1 6 小时，出现头晕、呕吐、腹泻， 发病卜一2 日可自行恢复，预后良好。 肠毒素对t 细胞具很强的有丝分裂原作用，可非特异性地檄活多克隆t 细胞，无需预先致 敏，且无种属特异一性。s e 需结合到辅助细胞m h c - l i 类分子上，然后共同作用于t 细胞受体， 才能发挥有丝分裂原作用。肠毒素通过激活t 细胞产生一系列免疫调节作用，如诱导或抑制细 胞毒性t 细胞反应，刺激t 细胞释放干扰素和l l 2 ，并表达l l - 2 的受体，在体内外抑制体液 和细胞免疫等。 2 黑龙江八一农垦大学硕士学位论文 第一章引言 1 1 4 中毒性休克综合症毒素i ( t o i i cs h o c k 3 y d m m e t o i i n l ，t s s t l ) 丁s s t l 系噬菌体】群金黄色葡萄球菌产生，可引起发热，增加对内毒素的敏感性，增强毛 细血管通透性，引起心血管紊乱而导致休克。金黄色葡萄球菌t s s t 】型超抗原能够通过与抗原 提呈细胞表面的c i l 类分子结合以及和t 细胞受体的交互连接，在极低浓度下即可激活t 细胞”】。随着t 细胞和单核细胞被超抗原的激活，产生一系列细胞因子如t n f 和i l - 。 t s s t l 也能刺激产生细胞介导的细胞毒作用，但是不能对携带m h cl l 类分子的靶细胞发挥细 胞毒作用f 1 7 1 。 1 1 5 杀白细胞素( 1 e u k o c j d n ，l u k ) 杀白细胞素对于人类和兔的白细胞及红血球具有溶解作用( 但并不是对人类所有的红细胞 都有溶解作用) ，p a n t o n - v a l e n t i n e 样杀白细胞素( p v - l e u ) 对白细胞具有高度的特异性。p v _ l e u 对人类和兔的中性粒细胞都具有特异性杀伤活性，并能够诱导组胺、l b 一4 、i l 8 的释放和氧代 谢物的释放1 1 ”。产生p v - l e u 的菌株通常是能够引起疗疮和脓肿以及严重的发热性感染例如皮 肤坏疽性感染的菌株l l 。l u k 和p v - i u 属于双组分蛋白质家族，该家族包括f 蛋白质家族( 例 如l u l c f 和l u k f i p v ) 和s 蛋白质家族( 例如h 1 窟2 ，l u k s 和l u k s p v ) ，在f 或s 成分内部大 约有7 0 的氨基酸同源性，f 与s 成分之间的氨基酸同源性却只有3 0 口。只有在f 成分与s 成分同时存在时才能发挥溶细胞作用，单独的f 成分或s 成分不能发挥溶细胞功能。有趣的是， f 蛋白质家族的l u k 和s 蛋白质家族中的h l g 与金萄菌的溶血素具有2 0 一3 0 的同源性j ， 并已经证实它们都参与溶细胞孔型结构的形成j 。 1 1 6 胞外粘着蛋白( e x 打a 。e u h r a d h e n n c e n 恤诅，e a p ) 胞外粘着蛋白是一种免疫调节蛋白。h a g g a r 等研究表明，e a p 蛋白能够与i c a m 1 结合， 从而抻制中性粒细胞与内皮细胞的结合以及中性粒细胞的跨内皮转移o ”。l e e 等口5 1 研究表明， l p 的存在也会干扰t 细胞的增殖。进而导致慢性感染的发生，例如关节炎、骨髓炎等。这两个 试验共同显示，t 细胞的增殖依赖t 细胞和抗原提呈细胞的结合，在此过程中，l c a m 一1 对于二者 的结合起着关键的作用。 1 1 7 其他 葡萄球菌可产生葡激酶( s 诅p h y 】0 k i n a s e ) ，亦称葡萄球菌溶纤维蛋白酶( s t a p h y l o c o c c a l 曲r i n o l y s j n ) ，还可产生耐热核酸酶( h e 孙s 馏l b l en u c l e a s e ) ，透明质酸酶( h y a i u r o n i d a s e ) 脂酶 ( l j p a s e ) 等。 1 2 吞噬细胞的作用及相关趋化因子受体 机体发生感染时，吞噬细胞从血液循环穿过血管内皮，然后游走到感染部位发挥吞噬作用， 将细菌等异物从体内清除。发挥吞噬作用的细胞主要包括中性粒细胞和单核细胞。它们在外源性 3 和内源性的趋化因子作用下，启动炎症性应答，最后清除病原微生物和异物，维护机体正常的生 理功能。f m l p 与c 5 a 是参与细胞趋化的两个十分重要的趋化因子，中性粒细胞和单核细胞表面均 具有与f m l p 和c 5 a 特异性结合的受体。下面对f m l p 与c 5 a 的受体作简要介绍。 1 2 1 m l p 受体 f m l p 为最早发现的白细胞趋化性肽，其结构由三个氨基酸残基组成，具有强大的趋化活 性。它通过与靶细胞表面的相应受体结合，可高效激活吞噬细胞发挥杀伤效应，构成机体抵抗 外源性物质侵袭的第一道防线。伽l p 的体内受体包括f p r ( n _ f o r n l y l p e 州d er e c e p t o r ) 、 f p r l l ( n - f o 帆y l p e p t i d er e c e p t o rl i k e1 ) 和f p r l 2 ( n f o h i l y j p e p t i d er e c e p c o r1 i k e2 ) ，它们同属于g 蛋白偶联的s t m 受体( s e v e nt r 柚s m e m b r er e c e p t o r ) 超家族1 ”“j 。其中f p r l 2 在体内的表达及 功能尚不清楚，而f p r 和f p r l l 均能在外源性物质的刺激下，诱导吞噬细胞发生的趋化反应、 脱颗粒反应以及脱敏反应等，在机体的炎症反应和天然免疫过程中起重要作用。 1 2 1 1f m l p 受体的基因克隆及定位 f r a n c o i s 等首先从人h l 6 0 的c d n a 文库中，克隆了f m l p r 2 6 和f m l p r 9 8 两个新基因。它 们全长均为6 k b ，含三个外显子，编码的3 5 0 个氨基酸产物仅在10 1 和3 4 6 位残基以及5 和3 ， 端非转录区有差异，且功能完全相同，此即p p r 。1 9 9 2 年。m u r p h y 等利用f p r 的简并引物， 从h l 6 0 的c d n a 文库中再次克隆出两个基因，所编码的产物即m 几p 的另两个受体f p r l l 和 f p r l 2 。其中，f p r l ld n a 全长约2 6 k b ，编码3 5 1 个氨基酸，与f p r 有6 9 的同源性。而 f p r l 2 的c d n a 全长约1 k b ，所编码的产物其氨基酸组成与f p r 有5 0 的同源性【”。它们均属 于g 蛋白偶联受体超家族，位于人染色体1 9 q 。 最近，o a o 等【j 利用以上基因的c d n a 引物，从鼠1 7 号染色体上分离出六条基因片断， 分别命名为f p r l ，f p rr s l ，f p rr s 2 ，f r pr s 3 ，f p rr s 4 和f p rr s 5 。其中f p r l 编码的一个功能性受 体与人f p r 极其相似，丙f p rr s l ，f p rr s 5 编码的受体则与f p r l l 在核苷酸水平有7 5 的同源 性。 1 2 1 2 盯帆p 受体的生物学功能及分布 作为删l p 的受体，f p r 能与匹克或低于纳克浓度级的m 也p 相结合；而f p r j 。1 只能与高 于纳克至毫克浓度的f 忆p 结合。在相应配体( 即f m l p ) 的刺激下，它们能通过影响细胞的 信号转导、离子流动、呼吸链的改变来调节细胞的移动和话性。而百日咳毒素能阻断这些活性， 这是因为f p r 和f p r l l 与其配涔结合能引起g 蛋白介导的信号转导，匿日咳毒索可以抑制g 蛋白的功能。f m l p 可通过f p r 诱导吞噬细胞的形态改变、黏附能力增强，并激活它的趋化活 性，还能激活n a d p h 氧化酶体系，产生超氧阴离子，进而诱导中性粒细胞脱颗粒；启动基因 转录和刺激细胞因子的产生等。以上的这些反应对机体抵抗外源性物质的侵袭是有益的但其 中超氧阴离子和一些蛋白承解产物对组织也有一定的损害。研究人员曾尾破坏了f p r l j 的小鼠 作试验，发现n l p 刺激不能引起中性粒细胞的趋化反应，这些小鼠对李斯特杆菌的易感性也 4 黑龙江八一农垦大学硕士学位论文 第一章引言 增加。用细菌注射这些小鼠，2 天后发现其脾脏有细菌生长，这恰恰发生在特异性细胞免疫产 生之前，因此推测f p r 的缺乏可能抑制天然免疫应答p “。由于没有发现f p r 的内源性配体， 对其生物学作用认识尚不十分清楚。因为f p r 最初发现于吞噬细胞表面，对其功能研究主要是 炎症免疫方面。此后发现f p r 在造血细胞、树突状细胞、星形胶质细胞、小神经胶质细胞和冠 状动脉中膜屡均有表达。最近，b e c k e r 等用f p r 的血清抗体检测其在体内的分布，发现f p r 广泛存在于不同的组织和器官，包括甲状腺、肾上腺、肺和神经系统p “。虽然还没有足够的证 据表明f p r 能行使炎症反应或天然免疫之外的功自活动，但有理由接测f p r 不仅参与机体对 细菌感染的抵御，还可能参与新陈代谢、造血、内分泌等活动。f p r l l 与f p r 样，除了表达 于单核细胞和中性粒细胞表面，在非吞噬细胞如造血干细胞、表皮细胞、淋巴细胞等也有表达。 曾有报道，在细胞因子i l 1 3 和1 f n y 的作用下，表皮细胞也能高表达该受体。因此认为，f p r l l 在局部炎症反应以及免疫中可能扮演着重要的角色p 。b i o n d i 等p ”研究表明，在妊娠过程中， 羊水中始终保持着一定水平的m l p r l ，预示着f m l p 系统在生理分娩过程中具有重要的调节 作用。 1 2 1 3 新配体的发现 最初认为，n 甲基末端的存在是其功能性配体的必要条件。但此后的研究发现，许多人工 多肽即使没有n 甲基末端，也能通过m 几p 受体有效地激活吞噬细胞，如人工合成的五聚肽 m e t i l e l e u p h e 孙e o h ，不管它连接的是一个n 甲基末端还是一个n 乙酰末端，其诱导人中性粒 细胞的趋化作用均远远强于f m l p p ”。f p r 的结构分析显示，该受体的结合部位所能容纳的氨 基末端数目耍远远多于甲基末端，这也许是它拥有如此广泛配体的原因。 最近发现的新配体均来源于一个随机肽文库。如五肽( 琊l y s 研m e l ) 和m m k l ( l e s i f r s l l f r 、，m ) ，它们通过活化单一的g 蛋白偶联受体高效激活人吞噬细胞。这种效应对f p r l l 尤 为明显，其中m m k l 是至今所发现的作用最强的f p r i 。1 功能性配体l ”j ”。五肽和m m k l 的发 现为研究f p i u j l 介导的细胞信号转导提供了新的极有价值的工具。 体内脂肪代谢产物l x a 4 ，最初是作为免疫应答的抑制剂而被发现的。进一步的研究得知， 它也能与f p r l l 以高亲和力结合，从而刺激g t p 酶活性增强和花生四烯酸的释放。l x a 4 与 f p r l l 相互作用可以引起单核细胞的趋化活性和钙离子流动，但不能引起中性粒细胞那其它转 染了f p r l l 质粒的细胞产生相应变化，这可能与l x a 4 所诱导的单核细胞和中性粒细胞后产生 不同的第二信号有关口。此外，s a a 是体内唯一专属于f p r l l 的趋化性配体，它不仅能在体 外激活人单核细胞和中性粒细胞的趋化性，也能诱导小鼠体内的吞噬细胞和t 淋巴细胞的炎性 渗透。 1 2 1 4 脱敏反应 在有关h j v l 抑制人单核细胞的机制研究中发现，h i v l 表面蛋白g p l 2 0 和g p 4 1 能使人单 核细胞对许多趋化因子的刺激处于无应答状态。这种现象能被百日咳毒素阻断因此认为h 1 v 1 表面蛋白可能利用了一个s t m 受体。通过用大量的趋化肽和趋化因子检测，发现只有在蹦l p 存在下才能引起这种明显的“脱敏反应”，提示h l v1 可能与f m l p 共享同一种受体。迸一步研 5 黑龙江八一农垦大学硕士学位论文 第一章引言 究发现，来源于g p 4 1 肽段的t 2 0d p l 7 8 正是通过f p r 起作用的，而t 2 0d p l 0 7 则依靠f p r 和f p r l l 的共同作用，其中对f p r l 】的反应更显著i ”j 。另外，n 3 6 和来源g p l 2 0 的f 肽也 是利用f p r l l 作为其功能性受体来发挥作用【4 。“j 。它们均能与f p r 或f p r l l 结合，从而下调 细胞表面其它受体的表达，使其对外源性物质的刺激无应答。而在这些受体中以c c r 5 和 c x c r 4 尤为重要。作为吞噬细胞结合h i v1 的两个关键性共受体( c o r e c e p t o r ) ，它们的下调可 能是h i v1 破坏机体免疫系统的一个重要机制。 f p r 作为强有效的第二信号启动子，参与机体对外源性物质的“脱敏反应”。删l p 与其受 体结合后，能迅速诱导c c r 5 的磷酸化及一些第二信号启始酶的活性改变，下调c c r 5 及其它 受体的表达，从而使细胞接受其它趋化性物质刺激信号的能力减弱，整个细胞处于无应答状态 m j 。另外还发现，人单核细胞经p k c 抑制剂处理后，f m l p 诱导的c c r 5 的磷酸化水平大大降 低，提示f m l p 受体介导的“脱敏反应”是依赖p k c 活性的【4 ”。 试验证明，h 1 v l 可通过其表面蛋白使吞噬细胞出现“脱敏反应”。进一步研究h i v l 表面蛋 白在引起机体免疫系统损伤中的关键作用，阐明“失敏反应”在a i d s 病发病机制中的具体作用， 将为进一步制各新的抗h i v l 抗体提供理论基础。由于f p r 和f p r l l 介导的趋化反应、细胞脱 颗粒和“脱敏反应”等生物学功能，尤其它对细胞表面c c r 5 和c x c r 4 的下调在a i d s 病发病机 制中的作用，使得它们在人体免疫系统中占有重要的地位。 随着人们认识水平的提高和研究技术方法的改进，对f p r 和f p r l l 的深入研究必将对进 一步阐明免疫调节理论和a i d s 病的发病机制产生积极的作用。同时，也将为进一步的临床诊 断和治疗提供理论依据。 1 2 2c 5 a 受体( c 5 a r ) 研究进展 1 2 2 1c s a 及c 5 a r 的分子结构 c 5 a 是动物补体系统攻膜单位中的第一个补体成分，分子量为1 9 0l o a ，由，b 两条多肽链 组成，两条多肽链间有一个二硫键。其中n 链为1 1 5 k d a ，b 链为7 5 l ( d a 。在经典途径( c l a s s i c a l p a t h w a y ) 和旁路途径( a l t e m a 吐v e p a t h w a ”的补体激活反应顺序中，产生两种不同的c 3 转化酶， 这两种不同的c 3 转化酶均可将c 3 裂解为c 3 a 和c 3 b ，并形成两种不同的c 5 转化酶，c 4 b 2 a 3 b 和 c 3 b b b 3 b ，二者作用于c 5 的n 链的n 端第7 4 7 5 氨基酸一精氨酸和亮氨酸之间的肽键，从c 5 的 n 链上裂解出一个由7 4 个氨基酸残基构成的、分子量1 】k d a 的小片段，称c 5 a 。 c 5 承共由3 5 0 个氨基酸组成，中性粒细胞上的c 5 承的分子量在4 叫9k d a 之间；而嗜酸性 粒细胞上的c 5 娥分子量较中性粒细胞多5 8k d a ，因此提出过c 5 擞可能还有亚型。 1 2 2 2c 5 a r 生物学功铑及分布 c 5 a 是粒细胞和单核细胞的强力激活剂。中性粒细胞对之发生快速定向的趋化运动卅，导 致这些细胞的脱颗粒和释放超氧阴离子。由于嗜中性粒细胞内合成黏附分子，脱颗粒使得黏附分 子在细胞表面表达，导致毛细血管中的循环嗜中性粒细胞黏附于内皮细胞而向炎症组织部位移动 h ”。单核细胞与巨嗜细胞对c 5 a 的趋化作用与嗜中性粒细胞相同。c 5 a 可与肥大细胞和嗜碱性粒 6 黑龙江八一农垦大学颂士学位论文第一章引言 细胞的表面受体结合，使这些细胞释放组织胺和其他细胞因子，间接导致毛细血管通透性增大， 此称为c 5 a 的过敏毒素作用。c 5 a 在血清中寿命较短，因为c 5 村被血清中的羧肽酶n ( 又称为过敏 毒素灭活剂) 迅速灭活，裂解掉羧基末端的精氨酸而成为去精c 5 a 。作为炎症调节因子，去精c 5 a 的活性大大降低。失去过敏毒素的作用，但仍保留趋化因子的作用，诱导远处的粒细胞的单核细 胞向炎症部位聚集。c 5 a 的免疫调节反应是通过与其受体的结合而发挥作用的。由于血清中羧肽 酶n 的广泛在，c 5 a 往往在血清中还没来得及与其受体结合就已被分解为去精c 5 a ，去精c 5 a 亦识 别c 5 a 受体，且成为c 5 a 受体的主要配体，再加上血清蛋白的共趋化因子的作用，使得去精c 5 a 与c 5 a 受体的亲和力增强。在c 5 “去精c 5 a 的所有先天性免疫功能中，c 5 “去精c 5 a 更易于限定和 消除肠黏膜损伤j 。c 5 a 在动物体内促使单核细胞分化为树突状细胞，产生炎症信号的级联放大 作用。s p m r i 等通过建立小鼠模型发现，c 5 a 与其受体结合，刺激靶细胞释放i n f m 和前列腺素， i n f m 和前列腺素启动了树突状细胞的分化与成熟，使单核细胞分化为树突状细胞，增强动物体 内抗原呈递作用，使动物的获得性免疫功能加强。 c 5 a 去精c 5 a 结构稳定，能够耐受较大的p h 变化，其氨基末端富含q 一螺旋结构，特别是分子 中有6 个半胱氨酸构成3 对二硫键，奠定了分子高度稳定性的基础，此结构与其他两种细胞因子 i l 8 和单核趋化蛋白相似。这可能与这些分子具有趋化特性和处于经常变化的微环境中有关。 对c 5 a 免疫功能的研究始于上个世纪初期，人们在动物试验中发现，c 5 a 与其他两种补体裂 解成分c 3 卿c 4 a 能够引起动物过敏性休克，遂将其命名为过敏毒素。对c 5 a 受体的研究起始于 1 9 7 5 年，j o l l i l s o 等发现c 5 a 可与大鼠的肥大细胞结合后来c h e n o w e t h 和h g l i 证实，c 5 a 与肥大细 胞的结合是由受体介导的。c 5 a 受体由3 5 0 个氨基酸残构成，分子量为s 0 2 0 0 k d a ，分子中有7 个疏水性跨膜区，属于7 次跨膜受体超家族( s t r ) 【5 “，最初分离于嗜中性粒细胞，其肽链的氨基 端在细胞外，羧基端在细胞内，七个跨膜区皆为* 螺旋，胞浆区富含丝氢酸和苏氨酸，可能是细 胞激活的磷酸化位点，它的c 5 a ，去精c 5 a 与受体结合，活化与受体相偶联g 蛋白而启动细胞内信 息的传递，进而激活细胞p l ”j 。 关于c 5 “去精c 5 a 与c 5 a 受体的结合部位，不同的研究者有不同的看法。s j c i l i a l l o 等提出，c 5 a 受体上有两个部位可供配体结合，一个是援基端的第八个氨基酸残基处，另一个是氨基酸的二硫 键i ”l 。h u b e r 等则报道，c 5 a 受体与其配体的结合位点处于c 5 a 受体的三个不连续的区域中。 一般认为，c 5 a 受体仅分布于血液中的颗粒性自细胞和单核细胞表面，如嗜中性粒细胞、嗜 酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、单核细胞和巨噬细胞，其中嗜中性粒细胞的表达量和亲和力最高， 1 0 0 嗜中性粒细胞表达c 5 a 受体，并且迅速与c 5 a 去精c 5 a 结合，表达密度可达2 0 1 0 0 万个分 子细胞，其次是嗜酸性粒细胞p “。过去一直认为，c 5 a 受体的表达仅限于上述细胞及髓细胞。但 近年来的研究证实，肝组织、肝实质细胞和肺脏的平滑肌细胞、内皮细胞、肺泡上皮细胞上也有 c 5 a 受体的表达”。 r i e d e m a r i n 等通过小鼠盲肠穿孔释放病原微生物，过量激活补体试验指出，在炎症早期，i l 西 在脂多糖存在条件下成为c 5 a 受体的主要诱生剂，上调c 5 a 受体，促进c 5 a 受体在嗜中性粒细胞、 巨嗜细胞等表面的作用p 6 j 。l l 南是嗜中性粒细胞活化后释放的细胞因子，可由脂多糖诱导产生。 此外，肺脏微血管上皮细胞也表达c 5 a 受体，每细胞大约有1 5 0 0 2 0 0 0 0 个。细胞因子i f n 叫和i l 6 均可诱导c 5 a 受体在肺微血管上皮细胞的表达，并且c 5 a 受体的表达水平与这两种细胞因子的使 用剂量有关1 5 7 】。 7 黑龙江八一农垦大学硕士学位论文 第一章引言 g u o 等p ”发现在脓毒症早期的大鼠，中性粒细胞表面的c 5 讯含量明显降低，在诱发脓毒症 后2 4 小时达到最低点，然后慢慢恢复：并通过w e s t e mb l o t 、r t p c r 和共聚焦显微镜观察等发现， 这一过程起码是部分因为c 5 舱5 a r 内陷和再循环引起的。脓毒症时大量c 5 a 与中性粒细胞表面的 c 5 a r 结合后，c 5 a c 5 a r 复合体内陷并转移到高尔基体，c 5 a 被水解，c 5 a r 再循环回到细胞表面。 体外培养的中性粒细胞，在c 5 a 存在时，3 0 分钟内细胞表面的c 5 水至少丢失半。 1 2 2 3c 5 a r 水平的调节 在炎症初期，c 5 a 的先天性免疫功能在动物抗感染过程中具有非常重要的地位。但随着炎症 的发展，补体被连续激活，在炎症部位及其周围建立起c 5 “去精c 5 a 趋化因子密度梯度，诱导白 细胞及单核细胞向炎症部位聚集。随后c 5 “去精c 5 a 与这些细胞上的c 5 a r 结合，产生不同细胞水 平的炎症调节因子，如巨噬细胞产生的趋化因子、黏附因子等，使毛细血管通透性增加，不 仅血液中的免疫细胞可以从血管中游离出来，向炎症部位聚集和发挥免疫功能，同时炎症部位的 病原微生物亦可游走入毛细血管，诱发严重创伤性脓毒血症。白细胞、单核细胞等释放超氧阴离 子及各种蛋白酶类，使炎症区域的重要功能性蛋白质被水解而导致炎症区域扩大，是造成动物死 亡的一个重要原因。为此，近年来，人们对c 5 a 的研究重点在于如何抑制炎症后期c 5 a 与c 5 a r 的 结合，阻止炎症的进一步扩大，提高发病动物的存活率。 p 耐a n a y a g a m 等i ”j 证明c 5 a ，c 5 水分别通过胞外信号调节激酶依赖的通路e 砌和p 1 3 k ，a k t 依 赖性通路细胞来延迟中性粒细胞的凋亡。试验发现，体外培养健康人体的中性粒细胞，c 5 a 经 p 1 3 科a l ( t 和e r k 两条平行的通路，诱导核转录因子c 砌狙( c y c l i cn u c l e o t i d er e s p o n s ee l e m e n t b i n d i n g