（分析化学专业论文）聚二甲基硅氧烷微流控芯片表面修饰方法研究与应用.pdf

摘要 摘要 芯片毛细管电泳是微全分析系统的一个重要分支。聚二甲基硅氧烷( p d m s ) 芯片因制作成本低、制作过程方便快速、光学透明性好等优点而得到广泛应用。 但是，p d m s 管道表面负电荷较少、疏水性强，容易吸附非极性的疏水性物质， 影响了p d m s 芯片毛细管电泳的进一步应用。为了有效抑制分析物在芯片通道 上的吸附，本文对p d m s 分离管道表面进行了相应的改性处理和修饰，开展了 以下几个方面的工作。 1 建立了一种聚电解质动态涂布p d m s 微流控芯片上分离抗坏血酸和尿酸的方 法。通过静电作用将聚阳离子p d d a 和聚阴离子p s s 交替吸附在p d m s 通道表 面。经p d d a 和p s s 修饰后的p d m s 通道，表面亲水性得到有效改善，并且获 得了稳定、提高了的电渗流。与未经修饰的p d m s 芯片相比，抗坏血酸和尿酸 在p d d a p s s 修饰p d m s 芯片上的分离时间大大缩短，分离效率得到明显提高。 系统考察了实验条件对分离检测的影响。在优化条件下，抗坏血酸和尿酸的线 性范围均为2 5 6 0 0t t m ，检测限分别为5t t m 和8t t m 。此外，修饰芯片呈现出 良好的重现性和长期的稳定性。此廉价、快速的分析方法成功用于人体尿样中 尿酸和抗坏血酸的分离测定。 2 利用动态涂层表面改性技术，以非离子表面活性剂2 ( n 吗啉) 乙磺酸( m e s ) 为电泳分离缓冲液添加剂，对电泳分离p d m s 微流控芯片通道表面进行改性。 经m e s 动态修饰的p d m s 分离通道，有效抑制了电渗流的大小，获得了稳定的、 降低的电渗流。利用m e s 修饰p d m s 芯片，结合在柱式电化学检测系统，建立 了神经递质多巴胺和肾上腺素的快速分离和测定方法。实验中对分离电压、检 测电位以及添加剂浓度等分离检测条件进行了系统探讨和优化。结果表明，经 v i e s 动态修饰修饰后的通道减少了对被测物的吸附，有效提高了多巴胺和肾上 腺素的分离效率。 3 利用层层组装技术，将壳聚糖( c h i t ) 和小牛胸腺d n a 修饰于p d m s 芯片通道 表面，建立了一种基于c h i t d n a 功能性生物分子修饰p d m s 电泳芯片的在柱式 安培检测系统。采用红外光谱对c h i t 和d n a 在p d m s 微流控芯片表面的层层 组装过程进行表征，通过接触角实验对修饰p d m s 芯片的亲水性和吸附性进行 i i 摘要 验证。以氨基酚对映异构体( 邻、间、对氨基酚) 为检验模型对c h i t d n a 修饰 p d m s 微流控芯片的性能进行研究。实验结果表明，经c h i t d n a 修饰的p d m s 芯片，表面亲水性明显增强，大大减少了对分析物的吸附，氨基酚对映异构体 在3 7 c m 长的分离通道中于6 0 s 内得到了有效分离，并且实现了在单根碳纤维电 极上的良好在柱安培检测。在优化的实验条件下，邻、间、对氨基酚的理论塔 板数分别达到9 2 6 5 8 、6 0 5 5 2 n m 1 和7 4 0 2 1 ，检测限依次为4 7 、2 5 和1 6i t m o l l ( s n = 3 ) 。 4 利用层层组装技术和纳米粒子效应，将p d d a 和二氧化钛纳米粒子交替修饰 于p d m s 芯片通道表面，构建了具有良好亲水表面的p d m s 界面。通过对电渗 流的测量、接触角测定以及电泳分离实验，对纳米粒子在微流控芯片通道表面 的修饰效果进行评价。结果表明，经二氧化钛纳米粒子修饰的p d m s 芯片，电 渗流在p h “l o 之间稳定，表面接触角为5 8 5 0 ，修饰后的通道表面不仅亲水性 大大增强，而且有效抑制了分析物的吸附，提高了分离度。 关键词：聚二甲基硅氧烷；芯片毛细管电泳；电化学检测；表面修饰；聚二烯 丙基二甲基氯化铵；聚4 一苯乙烯磺酸钠盐；2 - ( n 一吗啉) 乙磺酸；壳聚糖：脱氧核 糖核酸；纳米粒子；层层组装；尿酸；抗坏血酸；多巴胺；肾上腺素；氨基酚 异构体；对苯二酚 i a b s t r a c t a b s t r a c t m i c r o c h i pc a p i l l a r ye l e e t r o p h o r e s i s ( m c e ) h a sb e e nab r a n c ho fm i c r o t o t a l a n a l y s i ss y s t e m p o l y ( d i m e t h y l s i l o x a n e ) ( p d m s ) m i c r o e h i ph a sg r e a tp o t e n t i a li n c o n s t r u c t i n gl o w - c o s t , d i s p o s a b l ea n dm u l t i f u n e t i o n a lm i e r o f l u i d i ed e v i c e si n s t e a do f 0 a s sa n dq u a r t z h o w e v e r , p d m si si n e r ta n da n a l y t e sa l ee a s i l ya d s o r b e do n t oi t ， w h i c hh i n d e r st h ef u r t h e ra p p l i c a t i o no fp d m sm i e r o c h i p si nl i f es c i e n e 圮i no r d e rt o d i m i n a t et h ea d s o r p t i o no np d m sf a b r i c a t e dm i e r o e h i p ，w eh a v ef o c u s e do nt h e m o d i f i c a t i o no f t h ei n n e rs u r f a c eo f t h i sd a s t o m e r i cp o l y m e rc h a n n e la n dm a d es o m e a c h i e v e m e n t sa sf o l l o w s 1 p d m sm i c r o f l u i d i ec h a n n e l s a l t e r n a t e l y m o d i f i e d b yp o l y ( d i a l l y l d i m e t h y l a m m o n i u r nc h l o r i d e ) ( p d d a ) a n dp o l y ( s o d i u m4 - s t y r e n e s u l f o n a t e ) f p s s ) w g i es u c c e s s f u l l yu s e dt os e p a r a t eu r i ca c i d a n da s e o r b i ea c i d w h f f nt h e m i c r o c h a n n e lw a sc o a t e da l t e r n a t e l yb yp d d aa n dp s s t h ee o fe l l i l a n c e 8g r e a t l y a n dt h es u r f a c co ft h ec h a n n e lw a sv e r yh y d r o p h i l i c ，r e s u l t ss h o wt h a tu r i ca c i da n d a s e o r b i e a c i dc a nb ew e l ls e p a r a t e da n dd e t e c t e ds i m u l t a n e o u s l yi nm o d i f i e d m i e r o c h i p s u n d e rt h eo p t i m a lc o n d i t i o n s ，t h el i n e a rr a n g e so fu r i ca c i da n da s c o r b i c a c i dw e r eb o t hf r o m2 5t o6 0 0 p m , r e s p o e t i v d y t h ed e t e c t i o nl i m i t sw e r e8 p mf o r u r i ca c i da n d5 p mf o ra s e o r b i ca c i d f a c t o r si n f l u e n c i n gs e p a r a t i o na n dd e t e c t i o n , i n c l u d i n g b u f f e rs o l u t i o n , d e t e c t i o n p o t e n t i a l a n d s e p a r a t i o nv o l t a g e , w e r e i n v e s t i g a t e da n do p t i m i z e d i na d d i t i o n , t h ed e p e n d m a e e so ft h ec u r r e n tr e s p o n s eo n s e n s i t i v i t y , r e p r o d u c i b i l i t yw e r es t u d i e d ，a n dt h es t a b i l i t yo ft h ed e v i c ew a sa l s o e v a l u a t e di nd e t a i l t h i sm e t h o dw a ss u c c e s s f u l l yu s e dt od e t e r m i n eu r i ca c i da n d a s e o r b i ea c i di nh u m a nu f i n e 2 am e t h o df o rt h er a p i ds e p a r a t i o no f d o p a m i n ea n de p i n e p h r i n ew a sp r e s e n t e di n p d m sm i c r o c h i pe l e c t r o p h o r e s i si n t e g r a t e dw i t ha m p e r o m e t r i cd e t e c t i o n t h ep d m s c h a n n e l sd y n a m i c a l l ym o d i f i e db y2 - m o r p h o l i n o e t h a n e s u l f o n i ca c i do v i e s ) s h o w d e c r e a s e de o f ，l e s sa d s o r p t i o na n dm o r ee n h a n c e dt h es e p a r a t i o ne f f i c i e n c yt h a nt h a t o fu n m o d i f i e do n e s p a r a m e t e r si n f l u e n c i n gt h es e p a r a t i o ne f f i c i e n c ya n dr e s o l u t i o n , a b s t r a e t i n c l u d i n gs e p a r a t i o nv o l t a g e ，d e t e c t i o np o t e n t i a l ，a n dt h ec o n c e n t r a t i o no fa d d i t i v e , a l ea s s e s s e da n do p t i m i z e d 3 d n a ( c a l ft h y m u s ) i se m p l o y e dt oc o n s t r u c taf u n c t i o n a lf i l mo nt h ep d m s m i e r o f l u i d i cc h a n n e ls u r f a c ea n da p p l i e dt op e r f o r me l e c t r o p h o r e s i sc o u p l e dw i t h e l e c t r o c h e m i c a ld e t e c t i o n t h ef 叽o d o n a lf i l mw i l t sf o r m e d b ys e q u e n t i a l l y i m m o b i l i z i n gc h i t o s a n ( c h i 0a n dd n a t ot h ep d m sm i c r o f l u i d i cc h a n n e ls u r f a t v i al a y e r - b y - i a y e ra s s e m b l y a t r - f t - i re x p e r i m e n tw a sc o n d u c t e dt od e m o n s t r a t e c h i ta n dd n at h a th a db e e nc o a t e do np d m ss u r f a c e c o n t a c ta n g l ee x p e r i m e n t s w e r eu s e dt oe s t i m a t et h es u r f a o eh y d r o p h i l i e i t y a m i n o p h e n o li s o m e r s ( p - ，o - ，a n d m a m i n o p h e n 0 1 ) s e r v e da sas e p a r a t i o nm o d e lt oe v a l u a t et h ee f f e c to ft h ef u n c t i o n a l p d m sm i c r o f l u i d i cc h i p s t h er e s u l t sd e a r l ys h o w e dt h a tt h e s ea n a l y t e sw e r e e f f i e i e o f l ys e p a r a t e dw i t h i n6 0si na 3 7c ml o n gs e p a r a t i o nc h a n n e la n ds u c c e s s f u l l y d e t e c t e do nt h em o d i f i e dm i c r o c h i pc o u p l e dw i t hi n - c h a n n e la m p c r o m c t r i cd e t e c t i o n m o d ea tas i n # ec a r b o nf i b e re l e c t r o d e t h et h e o r e t i c a lp l a t en u m b e r sw e r e7 4 0 2 1 9 2 6 5 8a n d6 0 5 5 2n m - l a tt h es e p a r a t i o nv o l t a g eo f9 0 0vw i t ht h ed e t e c t i o nl i m i t so f 1 6 ，4 7 a n d2 5p m ( s i n = 3 ) f o r p - ，0 一，a n dm - a m i n o p h e n o l ，r e s p e c t i v e l y 4 ah y d r o p h i l i cp d m sm i e r o c h i pw i t hs t a b l ee o fw a sp r e p a r e db yas i m p l ea n d r e p r o d u c i b l ec o a t i n gp r o c e d u r ew i mt i 0 2n a n o p a r t i c l e s t h em i e r o c h a n n e lw a l lo f p d m s c h i pw a sc o a t e d 研t l lal a y e ro f p d d a a n dt h e nc o l l e c t e dt i 0 2n a n o p a r t i e l e s e l e c t r o o s m o t i cf l o wm e a s u r e m e n t s , c o n t a c t 拍醇e ，a n de l e c t r o p h o r e t i os e p a r a t i o n e x p e r i m e n t sw e r eu s e dt oe s t i m a t et h ee f f e c ta n ds t a b i l i t yo ft h em o d i f i e ds u r f a c e s e x p e r i m e n t ss h o wt h a tt h ee o f i sm o r es t a b l ea tp h6 - 1o t h ec o n t a c ta n g l ei s5 8 5 0 p e r f e c tr e s i s t a n c et on o n s p e c i f i ca d s o r p t i o no f a n a l y t e sa n di m p r o v e dr e s o l u t i o n k e y w o r d s ：p d m sm i c r o c h i p ，e l e c t r o c h e m i c a ld e t e c t i o n , g a l f a e nm o d i f i c a t i o n , p d d a , p s s ，m e s ，c h i t ，d n a , n a n o p a r t i e l e s ，l a y e r - b y - l a y e r , u r i ca c i d , a s e n r b i ca c i d , d a ，e p ，a m i n o p h e n o li s o m e r s ，h y d r o q u i n o n e v 学位论文独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工 作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地 方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含 为获得直昌去堂或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与 我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确 的说明并表示谢意。 学位论文作者签名( 手写) 嘏昭名堑字日期：唧年硼伊日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解直昌太兰有关保留、使用学位论文 的规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁 盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权直昌态堂可以将学位论文的全 部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描 等复制手段保存、汇编本学位论文。同时授权中国科学技术信息研究 所将本学位论文收录到中国学位论文全文数据库，并通过网络向 社会公众提供信息服务。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名强1 鹋乃r 导师签名：多7 k 辈义 一 f 3 签字日期：v w 薛f 明咱签字日期：弘唧荦f 1 月- w o 日 第1 章绪论 1 1 微全分析系统简介 第1 章绪论 微全分析系统( m i c r ot o t a la m l y s i ss y s t e m ，p - t a s ) 是随着微机电加工技术 ( m i c r o e l e c t r o m e c h a n i c a ls y s t e m ，m e m s ) 弓i 入分析学科应运而生的一门快速发展 的技术。它是将样品的预处理( 包括过滤、浓缩、衍生、样品的混合、反应) 以及 样品的进样、分离和检测等实验室操作，尽量集中在平方厘米级的芯片上完成， 所以本领域的另一个俗称为“芯片实验室”0 a b0 1 1ac h i p ) 。微全分析系统体积的 微型化使得分析速度加快，自动化和集成化程度提高。人类基因组计划的提前 完成，即归功于9 6 通道毛细管芯片电泳的运用【l 】，随后更发展为3 8 4 通道的阵 列毛细管电泳，从而实现了超高通量的基因分析【2 】。i t t a s 自诞生以来经历了起 步、酝酿和发展时期，目前已经进入蓬勃发展阶段，渗入到自然科学的各个领 域，显示了其在自然科学发展中巨大应用前景i l 。自1 9 9 4 年首届国际i j t t a s 会 议在荷兰e n c h e x i e 召开以来，至2 0 0 6 年已成功举办了l o 届，参会人数逐届增加， 会议论文水平也不断提高。i t t a s 领域科学论文逐年增多，质量逐年提高，由英 国皇家化学会出版的学术期刊“l a bo l lac h i p ”于2 0 0 1 年创刊以来，其影响力迅 速提高，到2 0 0 6 年其影响因子已达5 8 1 ；2 0 0 2 年以来，以微流控分析系统为主要 内容的u 1 a s 被列入美国化学会出版的“a n a l y t i c mc h e m i s t r y ”，每两年对该领域 的发展进行综述【 1 0 1 。这标志着它作为分析化学的一个独立领域，已被学术界承 认。我国在2 0 0 1 年启动了国家自然科学基金委的第一个十一五重大项目，至2 0 0 7 年6 月，我国已经主办了四届全国微流控系统分析会议。这些都充分反映了微流 控分析领域的巨大潜力和活力。同时也表明，我国皿a s 已从构筑平台的建设阶 段，发展到了具有创新和应用开发的发展阶段。 芯片毛细管电泳( m i c r o c h i pc a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s ) 是在硅、石英、玻璃、高 聚物等芯片的微通道中，以电场为驱动力，借助于离子或分子在电迁移或分配 行为上的差异，对复杂试样中的多种组分进行高效分离的技术。在分离原理上， 它与常规毛细管电泳相似，但是进行分离分析的硬件却有质的区别，因此产生 了一系列全新的分析技术，相关的分离理论有了新的内涵。芯片作为其硬件的 第1 章绪论 核心，是通过微加工技术，在平方厘米大小的玻璃或其它材料上加工出宽度为 微米、长度为厘米级的微通道网络和其他功能单元组成的迸样、分离、反应、 乃至传感系统的集合体，芯片并配以一定的外部设备( 如电源、光学和电化学 检测器等) 形成一个完整的芯片毛细管电泳分离分析系统，图1 1 为最简单的十 字交叉芯片毛细管电泳分析系统示意图。 图1 ，1 芯片毛细管电泳分析系统 在芯片上进行毛细管电泳分析主要具有以下特点【l l 】： ( 1 ) 采用m e m s 技术，可以方便地在硅片玻璃、石英、塑料和高聚物上加 工出微米级的进样、分离通道，或制备出诸如开口柱、填充柱和整体柱等各种 新式的毛细管电色谱柱。 ( 2 ) 以电场为流体的驱动力，通过调节场强的大小、方向，可方便地实现 小体积( p l - n l ) 进样、分离、汇流、分流等操作，无需机械泵和机械阀，满足 微型化、集成化、自动化的要求。 ( 3 ) 可采用区带电泳、凝胶电泳、等电聚焦、等速电泳、胶束电动色谱、 电色谱等不同的分离模式，实现从无机离子至生物大分子的快速分离，与激光 诱导荧光、电化学、电化学发光和质谱等高灵敏度的检测器联用，可以方便的 进行各种复杂样品的微、痕量成分的分离与测定。 ( 4 ) 借助于m e m s 等技术，还可以在芯片上加工出各种流动分析单元，形 成以电泳分离为中心的微型化、集成化和自动化的微全分析系统。 正是由于以上突出的优点，芯片毛细管电泳在p t a s 发展的前十多年中，得 到了飞快的发展，成为目前p t a s 领域中最令人瞩目的一个分枝【1 2 - 垧。尤其是近 年来，芯片毛细管电泳对d n a 、多肽、蛋白质等生物大分子所表现出来的高分 2 第1 章绪论 辨、高速、高通量的分离分析能力，使它成为后基因时代最有希望攻克蛋白质 组学研究、基因诊断临床诊断、药物筛选等难题的分离分析手段之一。 1 2 理论部分 理论上芯片毛细管电泳沿用了传统毛细管电泳的相关理论。一般用被分析 物的迁移时间t 、分离效率( 即理论塔板数n ) 和分离度来衡量和评价分析分离 性甜1 7 1 。 1 迁移时间 r 2 t = = ! l( 1 1 ) a x 式中：二。：进样点至检测点间的距离，a ：组分电渗速度和电泳速度的矢量和， v - , ：分离管道的电压降。由式( 1 一1 ) 可知，厶印降低，t 将减少。距离是原来 的十分之一，分离时间将为原来的百分之一。 2 理论塔板数 根据g - i d d i n g 方程，理论塔板数可表示为 ，2 n = 。a as e p( 1 _ 2 ) 仃 式中：，是柱内浓度梯度引起的轴向扩散、进样方式和检测引起的谱带展宽的 方差总和。假如组分的轴向分子扩散是谱带扩展的唯一因素，那么 ：丝蔓：盟( 1 - 3 ) 2 q2 0 , 式中：膳和d f 分别为f 组分的表观迁移率和扩散系数，e 为电场强度。 因此，分离效率和分离电压成正比，分析速度和分离电压成反比，即使用 高的分离电压可以获得高的分离效率和快的分离速度。然而，所能施加的最高 场强往往受制于焦耳热的影响。过高的分离电压下，分离管道中焦耳热太大， 容易产生气泡而中断分离过程。实验中，对于具有高斯型的电泳峰，采用下式 计算理论塔板数： 第l 章绪论 尉褂 c 式中为半峰宽 3 分离度 和色谱一样，分离度( 足) 是对相邻两电泳峰分离程度的度量。一般用下 式进行计算： 足2 势 c ，_ s ， 式中：k 和：分别为相邻两峰的出峰时间，和分别为两峰的底宽。 4 电渗流 电渗流( e o f ) 是毛细管电泳中最重要的参数之一，其大小与管壁的电荷 及双电层厚度有关，用电渗淌度附表示。设分离柱长度为厶。的管道中，电中 性物质的出峰时间为t ，电渗流速度为u 。f 则 2 亍 ( 卜6 ) 毛细管电泳常用单位场强e 的电渗流速度，即电渗淌度来表示e o f 的大小， 卢耐。言 ( 卜7 ) e = 鲁 ( 1 - 8 ) 式中，l ，为管道的总长度。所以 物= 争亡 c 注意：式0 - 6 ) 和( 1 - 9 ) 中t 为在实验条件下电中性物质的出峰时间。 h u a n g 等【1 8 】提出了一种测定电渗流的简单方法。测定时，分离通道首先充 4 第1 章绪论 满浓度为c 0 的背景电解质，高压下淋洗5r a i n ，随后经稀释浓度变为o 9 5 c o 的 背景电解质溶液被商电压带迸通道，在取代原有的背景电解质( b e g ) 的过程 中，管道中的分离电流随时间逐渐下降，直至趋向稳定的平台。此时，浓度为 c o 的背景电解质完全被0 9 5 c o 的电解质所取代，由所需的出峰时间t 确定电渗 流的大小。因稀释的背景电解质从缓冲溶液池开始置换原来管中的b g e ，故t 时间内浓度为o 9 5 c 0 的背景电解质流过的距离应为整个管道的长度厶，即 l 2 ( 1 1 0 ) 将式( 1 1 0 ) 和( 1 - 8 ) 代入式( 1 - 7 ) ，得 ，j 2 e o f2 巧- - t ( 1 - - 1 1 ) 1 3 芯片的制作材料及技术 芯片是微全分析系统的核心部分，而芯片上的微管道则是整个系统功能运 作的主要载体。芯片的制作研究包括芯片的微加工和芯片的键合等技术一直是 芯片毛细管电泳研究的热点1 19 删。其目标是借助于微加工技术，研究更为简单有 效的微管道制作方法，进一步降低微流控芯片的制作成本，同时对各类芯片的 制作材料进行深入研究。 早期的芯片材料主要是玻璃和石英【2 1 丑】，这类芯片和传统毛细管电泳所用融 硅毛细管的性质非常接近，具有良好的光学、表面和热学性质。玻璃和石英除 了可以利用成熟的电子微加工技术制作成芯片，还可以使用相当标准的光刻蚀 技术进行加工。这类毛细管电泳芯片的研究应用为微全分析系统的起步铺平了 道路。但是，玻璃和石英微管道的制作周期较长，导致其使用成本过高( 研究 型的玻璃石英芯片每片价格在1 0 0 到2 0 0 美元) 。同时由于芯片上的微管道尺度 在微米级，芯片的一次成型使得其在使用过程中堵塞后难以疏通，进一步增加 了研究和应用的成本。高分子材料具有易于成型、价格低廉等特点而成为人们 关注的对象，因此各种高分子材料制作的芯片应运而生。目前研究较多的有聚 二甲基硅氧烷( p o l y ( d i m c t h y l s i l o x a n e ) ，p d m s ) 2 3 】、聚甲基丙烯酸甲脂 ( p o l y m e t h y l m e t h a c r y l a t e ，p m m a ) 2 4 、聚碳酸脂( p o l y c a r b o n a t e ，p c ) 口卅和聚对苯 第1 章绪论 二甲酸乙二脂( p 0 1 ) ( e t h y l e n et e r e p h t h a l a t e ) ，p e t ) f 2 6 肄。常用的高分子材料芯片制 作方法有激光剥离法( 1 a s e ra b l a f i o n ) t 2 6 1 、注塑法( i n j e c f i o nm o l d i n g ) 1 2 7 j 、浇铸法 ( c a s t i n g ) 2 8 】和热压法( h o te m b o s s i n g ) 2 9 】等。其中激光剥离法是一种由短波长的激 光脉冲打碎高分子中的共价键、分解高分子的方法。这种方法可得到陡直和较 深的管壁，但其缺点在于难以规模生产。其他三种方法的共同特点是先要利用 特定技术制得带有阳模的模具，再将图形转移到高分子材料上，然后由带有图 形的高分子芯片和另外一片芯片组合构成微流控芯片。这三种方式都可以通过 有效的复制方式进行批量生产。 本论文使用浇铸法制备p d m s 芯 片【3 0 1 。阳模为采用标准的微型照相平 板刷技术和蚀刻反应制作的g a a s 模 板，制备过程如图1 2 所示。p d m s 和 模板间的黏附力小，容易脱模。以阳 模制得的带管道的p d m s 芯片和以平 板玻璃为模板制得不带管道的p d m s 芯片之间的黏附力较大，可以通过简 单的直接封合方式构成p d m s 微流控 芯片。p d m s 芯片还可以用高能场如 氧等离子体【3 1 。酆、紫外灯【3 铂5 】、紫外 臭氧【3 6 】照射后，随即施加适当的压力， 形成永久封合的芯片。 么二三7 品器j 一2 = 琶虱村 一k i j 7 图1 2p d m s 芯片快速成型复制过程示意图 1 4 流体控制、通道构型和进样方式 微流控芯片分析系统是通过对微通道内微流体的有效控制，完成芯片系统 的分离分析功能。目前，微流体的驱动方式有电渗动力、电磁动力、重力、启 动动力、热气动力、表面张力、剪切力、离心力和压电动力等。 芯片毛细管电泳中常采用电渗泵控制液体的流动和流向1 3 7 】。当管壁带有一 定的电荷，在充满电解质的分离管道两端施加电压，就会产生电渗流，选择所 加电压的位点和大小，可以方便地控制电渗流的流动方向和流动速度。电渗泵 的另一优点是无需机械阀，死体积小，分离效率高，容易微型化。但电渗驱动 6 芗勰艄 第l 章绪论 方式也存在以下局限性： 电渗过程伴随着带电粒子的电泳，在某些情况下，可能影响通道内溶液 的组成，在用电渗泵控制进样时会对不同电荷粒子产生进样歧视效应。 只能驱动可产生电渗流的介质。 依靠通道双电层的存在进行驱动，而双电层易受各种因素的影响，如外 加电场、通道壁性质、介质性质、离子强度，甚至样品组分的吸附等， 因此电渗流对通道表面性质的变化较为敏感。 通道内不能有大的气泡，否则容易造成分离电流的中断，流速锐减，甚 至完全停止流动。 芯片上的管道布线，即芯片构型，定义了芯片的功能和仪器上发生操作的 次序，通过改变通道构型进行流体控制，是微芯片的一个最简单而重要的特征。 最常见的芯片毛细管电泳管道布局为十字交叉型( 图1 3 a ) 和双t 型( 图 1 3 b ) ，按一定顺序控制l 至4 位点的电压，完成进样和毛细管电泳分离等操作。 a 2 343 2 4 1 1 图1 3 常见毛细管电泳芯片构型示意图 其中：l 为样品池；2 为样品废液池；3 为缓冲溶液池：4 为电泳阴极检测池 芯片毛细管电泳中进样方式极大地影响着分离度和分离效率，因此，进样 方式研究在芯片毛细管电泳的发展中占有十分重要的地位。由于芯片毛细管电 泳的分离通道短，因此可以使用较高的分离电压实现快速分离分析。这样纵向 分子扩散对理论塔板高度的贡献相对较小，而进样速度和样品塞长度对分离速 度和分离效率的影响较明显。根据进样动力的不同，芯片毛细管电泳进样方式 主要有电驱动进样、压力进样、流动注射进样等方式，其中电驱动进样最为常 见。电驱动进样根据微管道构型的不同主要分为十字交叉进样和双t 进样两种 方式。其中，十字交叉进样是通过高压在试样通道和分离通道间的切换来实现 进样操作，具有快速、方便、迸样体积小、易于自动化等特点。十字交叉进样 7 第1 章绪论 又可细分为浮法进样【3 8 】、夹流进样3 9 柏】、门进样h 1 1 和窄样通道进样掣4 2 1 。在双 t 进样中 a 3 1 ( 如图1 3 b ) ，样品由1 流到4 ，进样带长度即为两交叉道口间的距 离，在保证样品充分流入分离通道的前提下，进样体积与进样时间及电压无关。 在足够的进样时间下，可以消除进样歧视。但是较长的样品带不利于样品分离 度的提高。 由于样品中各组分在电场下迁移速度不同，所以电驱动进样常存在进样歧 视。采用流动注射进样4 “6 】、压力进样h 7 1 等方式可避免进样歧视。方肇伦等【4 8 4 9 l 报道了芯片连续迸样模式，可以精确控制进样体积。 1 5 微流控芯片检测系统 微流控芯片检测系统的作用是测定被分析样品经微流控分析芯片系统分离 或处理后有关组分的组成及其含量。检测系统的总体性能直接影响整个分析系 统的检出限、检测速度、适用范围、体积等指标，是微流控领域的一个重点和 热点1 5 0 l 。与传统的仪器分析系统相比，微流控芯片分析系统对检测器有一些特 殊的要求：更高的灵敏度和信噪比；更快的响应速度；结构、体积、重量等方 面应利于集成化或至少有利于通道芯片系统的耦合；具有多重平行检测的功能； 性能稳定可靠、坚固耐用、体积小；低成本。基于不同检测原理的众多检测方 法被用于微流控芯片分析的研究中，芯片毛细管电泳中，常用的检测方法有光 学检测、电化学检测、质谱检测等。 1 5 1 光学检测 ( 1 ) 激光诱导荧光 荧光检测具有极高的灵敏度，微流控分析系统中的荧光检测器大多采用激 光诱导荧光检测( 觞盯i n d u c e dn u o r c c n l i f ) 。从最初运用于微流控芯片检测 的4 8 8n m 的氩离子激光器、显微镜物镜和光电倍增管组合的检测系统，到 h a r r i s o n 研究组 s l , s 2 设计的共聚焦型l i f 检测器，以及之后把n i c h i a l 5 3 】研制的发 射波长在4 0 5n t n 的半导体二极管激光器运用于传统毛细管电泳检测。都是为了 在保证检测限的前提下，减小检测器的体积。在检测器件改进方面，q i n 等人e 卅 采用一种可调波长的染料激光器激发荧光，用增强型c c d 器件作为荧光接收器 件。n a m a s i v a y a m 5 5 】等人制作了一种集成在芯片上的检测结构，采用p n n + 的光 8 第1 章绪论 电二极管，对d n a 的检测限达到0 g n g l | t l 。十多年来，在芯片毛细管电泳领域， l i f 已成功地用于氨基酬婀、d n a 片断锕、p c r ( 聚合酶链反应) 扩增物【5 8 j 、短 链低聚核苷酸5 明的分离分析。高通量、多通道的微芯片l i f 检测在大规模d n a 测序分析【朋1 和临床诊断检验睇, 6 3 1 等方面具有良好的应用前景。 ( 2 ) 化学发光 化学发光( c h e m i l u m i n e s c e n e ) 检测通过检测特殊化学反应中发光的强度来检 测被测物质。化学发光又可以分为普通化学发光和电化学发光。 电化学发光( e l e c t r oc h e m i l u m i n e s c e n e ) 检测器是化学发光和电化学检测的结 合，具有装置简单、灵敏度高及可控制反应程度等特点。电化学发光反应中采 用较多的是三联吡啶钌r u ( b p y ) 3 2 + 反应体系。a r o r a “ 5 】等在p m m a 中间夹两片 铂薄膜电极制作了体积为纳升级的电化学发光检测池，用光电倍增管进行光电 检测，对三丙胺的检测限为5 1 0 3 m o v l ，并且首次将电化学发光检测器集成在 一块电泳芯片上。q i u 等人f 删制作了一种基于r u ( b p y ) 32 + 电化学发光体的采用铟 锡氧化物电极检测系统。 1 5 2 电化学检测 电化学检测方法是以电极作为传感器，直接将溶液中待测组分的化学信号 转变为电信号的方法。和其它检测器相比，电化学检测器更符合微流控分析系 统微型化、集成化的要求。( 1 ) 通过m e m s 技术在芯片上制作微电极比加工微光 学器件容易的多；( 2 ) 电化学传感的灵敏度不会因为通道尺寸的微型化而降低； ( 3 ) 电化学检测器的检测系统等外围设备比较简单，易于微型化。因此，作为微 全分析系统的集成化检测方式，电化学检测具有独特的优势。而且，利用微电 极检测技术可提高信噪比，降低检测限。根据检测原理不同，电化学检测可分 为安培检测、电位检测、电导检测、间接安培检测等方法。 ( 1 ) 安培检测 自从1 9 9 8 年w o o l l e 一6 7 】等首次报道芯片毛细管电泳安培检测以来，该技术 在微流控芯片中的应用取得了很大的进展。安培检测灵敏度高，选择性好，是 芯片毛细管电泳电化学检测最常采用的一种方法。芯片毛细管电泳的安培检测 与毛细管电泳安培检测一样，消除或减少分离电压对检测系统的干扰是一个不 容忽视的问题。根据隔离分离电压的方式，安培检测可分为：柱端、柱内和离 9 第1 章绪论 柱检测三种方式。 目前，安培检测大多数采用三电极体系，工作电极、辅助电极和参比电极， 但也有采取两电极体系的报道 6 8 1 。柱端检测是安培检测中最为常用的一种方式。 在这种方式中，电极放置于分离通道出口处数十微米的地方。这段距离可以减 少电化学工作站受高压分离电场的耦合作用【6 9 】。但是，分离电场是在检测池处 接地，会引起工作电极上的电位的位移 7 0 1 。因此，需要做动态伏安图来确定某 种分析物的检测电位。通常，柱端检测的背景电流比其它检测方式的大，并且 由于样品在分离通道出口与工作电极之间的扩散，引起分离效率的降低。另外， 分离电压的扰动也会对检测器产生较大噪音，所以工作电极的位置也不能离管 口太近。在极端的情况下，分离电压通过电化学工作站接地，会严重破坏电子 设备f 7 1 l 。 柱端检测的一个主要缺点是因扩散引起的峰展宽和峰信号降低。为了克服 以上不足，m a t h i e s 等提出了一种新的柱端检测技术。这种技术使用鞘流支持的 c e e c 系统，在离分离管道2 5 0 “m 的地方仍可以检测到样品【7 2 1 。g a r c i a l 7 3 j 等设计 了一种利用脉冲安培法进行芯片毛细管电泳柱端电化学检测的芯片构型。以含 分离和进样通道的p d m s 芯片作为盖片，而p d m s 基片上相应的位置预留可以放 置电极的管道。这样，工作电极可以直接放置在通道的凹槽内，解决了电极与 分离通道难以对准的问题。用脉冲安培法可以直接检测碳水化合物，氨基酸和 抗生素等。 徐静娟等 7 4 1 提出了一种通用型柱内电化学检测的新方法，可对电活性和非 电活性物质进行分析检测。该技术将碳纤维工作电极伸入到p d m s 微通道内数十 微米，利用高压电场对检测电路的耦合效应实现各种分析物种的检测。其原理 是，将工作电极伸入分离通道的末端，利用样品塞与缓冲液之间的电阻差异引 起高压电场对检测电路的耦合程度的变化，这种变化影响了工作电极的真实电 位，使得氧气在工作电极上的电流发生相应的变化，实现对非电活性物质的间 接安培检测和对电活性物种的直接检测。该方法具有非常高的检测灵敏度。 另一种消除样品区带变宽的安培检测模式是离柱检测。在这种方式中，电 极的放置类似于柱内安培检测，所不同的是利用去耦合装置来隔离分离高压对 检测的影响。去耦合装置可以有效的隔离高压，建立一个无电泳区域，利用去 耦合器之前的电渗流将样品推向电极而进行检测。r